Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Generering af en reproducerbar model af mid-gestational maternal immunaktivering ved hjælp af Poly (I: C) for at studere modtagelighed og modstandsdygtighed hos afkom

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64095
Automatic Translation
1, 1
1Center for Neuroscience, UC Davis

Summary

Moderens infektion er en risikofaktor for neurodevelopmental lidelser. Musemodeller af moderens immunaktivering (MIA) kan belyse infektionens indvirkning på hjernens udvikling og funktion. Her gives generelle retningslinjer og en procedure til at producere pålideligt elastiske og modtagelige afkom udsat for MIA.

Abstract

Maternal immunaktivering (MIA) under graviditet er konsekvent forbundet med øget risiko for neurodevelopmental og neuropsykiatriske lidelser hos afkom. Dyremodeller af MIA bruges til at teste årsagssammenhæng, undersøge mekanismer og udvikle diagnostik og behandlinger for disse lidelser. På trods af deres udbredte anvendelse lider mange MIA-modeller af manglende reproducerbarhed, og næsten alle ignorerer to vigtige aspekter af denne risikofaktor: (i) mange afkom er modstandsdygtige over for MIA, og (ii) modtagelige afkom kan udvise forskellige kombinationer af fænotyper. For at øge reproducerbarheden og modellere både modtagelighed og modstandsdygtighed over for MIA bruges baseline immunoreaktivitet (BIR) hos hunmus før graviditet til at forudsige, hvilke graviditeter der vil resultere i enten elastiske afkom eller afkom med definerede adfærdsmæssige og molekylære abnormiteter efter eksponering for MIA. Her tilvejebringes en detaljeret metode til inducering af MIA via intraperitoneal (i.p.) injektion af det dobbeltstrengede RNA (dsRNA) virale efterligningspoly (I: C) ved 12,5 dages drægtighed. Denne metode inducerer en akut inflammatorisk reaktion i dæmningen, hvilket resulterer i forstyrrelser i hjernens udvikling hos mus, der kortlægger lignende påvirkede domæner i humane psykiatriske og neuroudviklingsforstyrrelser (NDD'er).

Introduction

Epidemiologiske beviser forbinder moderens infektion med øget risiko for psykiatriske og NDD'er, herunder skizofreni (SZ) og autismespektrumforstyrrelse (ASD) 1,2,3,4,5,6,7. MIA-musemodellen blev udviklet til at teste kausalitet og MIA's mekanistiske rolle i ætiologien af disse lidelser samt til at identificere molekylære biomarkører og udvikle både diagnostiske og terapeutiske værktøjer 4,6. På trods af nytten af denne model og dens stigende popularitet er der betydelig variation i MIA induktionsprotokoller inden for feltet, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne resultater på tværs af undersøgelser og replikere fund 8,9. Derudover undersøger de fleste iterationer af modellen ikke to vigtige translationelle aspekter af MIA: (i) mange afkom er modstandsdygtige over for MIA, og (ii) modtagelige afkom kan udvise forskellige kombinationer af fænotyper8.

For at generere en reproducerbar MIA-model skal investigatorer rapportere mindst ét kvantitativt mål for størrelsen af MIA induceret i dæmninger. For at inducere MIA under drægtighed udfører vores laboratorium intraperitoneale (i.p.) injektioner af den dobbeltstrengede RNA-virale efterligning polyinositisk: polycytidilsyre [poly (I: C)]. Poly (I: C) inducerer en immunkaskade svarende til influenzavirus, da den genkendes af toll-lignende receptor 3 (TLR3)10. Som et resultat aktiverer poly (I: C) det akutte faserespons, der resulterer i hurtig forhøjelse af proinflammatoriske cytokiner 8,11,12. Tidligere undersøgelser har vist, at forhøjelsen af proinflammatoriske cytokiner, herunder interleukin-6 (IL-6), er nødvendig for at producere adfærdsmæssige abnormiteter og neuropatologi hos afkom som følge af MIA11,12,13. Således er niveauet af IL-6 i moderens serum indsamlet under dets højdepunkt ved 2,5 timer efter poly (I: C) injektion et overbevisende kvantitativt mål for MIA, der kan bruges til at sammenligne resultater på tværs af laboratorier inden for feltet.

For at generere en MIA-model, der adresserer de translationelt væsentlige elementer af modstandsdygtighed og modtagelighed med en enkelt induktionsprotokol 8,14, kan forskere kombinere typiske induktionsmetoder med karakterisering af moderens baseline immunreaktivitet (BIR) før graviditet8. For nylig blev det opdaget, at jomfru kvindelig C57BL / 6 mus viser en bred vifte af IL-6 svar på en lavdosis eksponering for poly (I: C) før graviditet8. Det er kun en delmængde af disse hunner, der fortsætter med at producere modtagelige afkom, og kun ved visse størrelser af immunaktivering som dikteret af kombinationen af BIR og poly (I: C) dosis8. MIA inducerer fænotyper i et omvendt U-mønster; Afkom viser de største adfærdsmæssige og molekylære aberrationer, når dæmninger er moderat immunoreaktive, og størrelsen af moderens inflammation når, men overstiger ikke, et kritisk område8. Her tilvejebringes en detaljeret metode til, hvordan man pålideligt skaber både elastiske og modtagelige afkom med divergerende adfærdsmæssige fænotyper som følge af mid-svangerskabsinjektion af poly (I: C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller udføres under godkendelse af University of California-Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Tilberedning af dyr

  1. Når du anskaffer dyr, skal du holde følgende parametre konsistente for at sikre maksimal reproducerbarhed.
    1. Leverandørens og leverandørens placering: Som tidligere rapporteret udviser mus af vildtypen C57BL/6J forskellige reaktioner på den samme dosis poly(I:C) afhængigt af sælgeren8. Vælg en leverandør og musestamme, der viser et ensartet svar. Til eksperimenterne her udviste C57BL/6-mus opnået fra Charles River konsekvente ændringer i adfærd efter eksponering for MIA midt i svangerskabet, mens de købte fra Taconic viser et større størrelsesrespons med nogle forskelle på tværs af behandlingsgrupper sammenlignet med Charles River-mus8.
    2. Stamme: C57BL/6J-mus er de mest almindeligt anvendte, men BTBR-mus og andre stammer viser differentielle reaktioner på MIA9 midt i svangerskabet. Bemærk disse differentielle responser, da disse forbedrer metodens reproducerbarhed og kan være en potentiel variabel til at bidrage til differentielle resultater hos afkom.
    3. For at sikre minimal variabilitet skal du kun bruge jomfruhunner til MIA-undersøgelser8 og tydeligt notere detaljer i metoderne.
    4. Alder ved forsendelse og akklimatiseringsperiode: mus afsendt før 7 uger viser dysregulerede endokrine systemer15. Lad dyrene akklimatisere sig i mindst 48 timer16,17. Bestil mus, der skal sendes efter 7 uger (± 2 dage) og injicere til BIR efter 8 uger (± 2 dage).
    5. Alder ved parring: dyrs immunsystem er dynamisk over deres levetid. Sørg for at minimere variabilitet ved at holde alderen ved parring/injektion så konsistent som muligt18,19,20. Mate hunmus efter 9 uger (± 2 dage). Brug ikke mænd over 6 måneder til parring.

2. Poly(I:C)-partiafprøvning og forberedelse

  1. Der fremstilles poly(I:C) med høj molekylvægt som beskrevet nedenfor.
    1. Autoklave 1,5 ml mikrocentrifugerør til opbevaring. Resuspenderet poly (I: C) kan opbevares ved -20 ° C, men gentagne frysetøer kan påvirke styrken. Varm vandbad op til 70 °C.
    2. Brug steril teknik til at tilsætte 10 ml sterilt fysiologisk saltvand (NaCl 0,9%) til frysetørret poly(I:C) ved hjælp af en sprøjte. Opvarm i 70 °C vandbad i 15 min for at tillade fuld glødning. Fjern og lad afkøle til stuetemperatur.
    3. I en steril hætte tilsættes yderligere 40 ml fysiologisk saltvand til flasken og inverteres flere gange for at blande. Fjern toppen af poly(I:C)-flasken, eller brug en sprøjte til at alikvote i 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Opbevares ved -20 °C.
  2. Der fremstilles poly(I:C) med blandet molekylvægt som beskrevet nedenfor.
    1. Autoklave 1,5 ml mikrocentrifugerør til opbevaring. Resuspenderet poly (I: C) kan opbevares ved -20 ° C, men gentagne frysetøer kan påvirke styrken. Indstil vandbadet til 50 °C.
    2. Brug steril teknik til at tilsætte 10 ml steril 0,9% NaCl til frysetørret poly(I:C) og fastgør låget. Opvarm i 50 °C vandbad i 25 min for at tillade fuld glødning. Fjern og lad afkøle til stuetemperatur.
    3. Ved hjælp af steril teknik alikvote i 1,5 ml mikrocentrifugeglas og opbevares ved -20 °C.
  3. Administrer poly(I:C) gennem intraperitoneale (i.p.) injektioner som beskrevet nedenfor.
    1. Vej musen for at bestemme nøjagtig dosering. Brug en 0,5 cc insulinnål til at trække resuspenderet poly (I: C). Skrub musen og vend, så maven er udsat.
    2. Brug den anden hånd til at indsætte nålen i en dybde på ca. 0,5 cm mellem de forreste to brystvorter i en vinkel på ca. 45°.
    3. Tegn op for at bestemme, at der ikke kommer blod eller urin ind i sprøjten før injektion. Hvis en af delene opstår, skal nålen placeres igen og prøve igen. Injicer langsomt. Hvis poly(I:C) bobler ud, var injektionen sandsynligvis subkutan. En vellykket injektionsplacering vil resultere i, at der ikke trækkes noget, når nålen er indsat, og ingen lækage, når den er fjernet.
  4. Test MMW poly(I:C) partistyrke som beskrevet nedenfor8.
    1. Få den ønskede form for poly (I: C). Nogle producenter vil tillade forskere at holde fast i et helt eller delvist parti, mens styrken testes, så flere flasker kan fås senere samtidigt. Disse kan typisk opbevares frysetørret ved -20 °C i flere år, hvis fryse-optøning undgås.
    2. Få eller opdræt 30 gravide mødre til testning. Ved E12.5 udføres i.p. injektioner på 20, 30 og 40 mg/kg i mindst 10 mus pr. dosis.
    3. 2,5 timer efter injektionen opsamles blod via haleblødning. Bemærk, at perifert blod og bagagerumsblod kan variere i cytokinniveauer, så hold indsamlingsmetoden konsistent inden for en undersøgelse.
    4. Lad blodet størkne natten over ved stuetemperatur. Efter 12-24 timer centrifugeres blodprøver ned ved 3.768 x g ved 4 °C i 8 minutter. Serumet opsamles og opbevares ved -80 °C, indtil det er analyseret.
    5. Isoler serum og mål IL-6 niveauer via ELISA eller Luminex. Hold måleværktøjerne konsistente, da der er betydelig variation i den samlede koncentration målt med forskellige modaliteter og producenter. Bestem størrelsen af IL-6-respons, der er nødvendig for at inducere fænotyper ved hjælp af en pilotkohorte.

3. Baseline immunreaktivitet (BIR) test

BEMÆRK: Figur 1 viser trinnenes skema. Brug en anden molekylvægt poly (I: C) til BIR-test sammenlignet med svangerskab for at sænke sandsynligheden for adaptive immunresponser på forbindelsen.

  1. Bestil jomfruelige hunmus, der skal sendes, når de er 7 uger gamle. Ved ankomsten skal du gruppere og huse fire til fem mus i et bur og holde gruppen opstaldet, indtil den er parret. Brug ørehak eller ethvert andet identifikationssystem.
  2. Injicer hunner intraperitonealt med 5 mg/kg poly(I:C) 1 uge efter ankomst. Ved 2,5 timer efter injektion, når cirkulerende IL-6 er højest6, indsamle fuldblod fra injicerede dyr via hale snip.
  3. Lad blodet størkne natten over ved stuetemperatur. Efter 12-24 timer centrifugeres blodprøver ned ved 3.768 x g ved 4 °C i 8 minutter.
  4. Der indsamles mindst 32 μL serum fra hver prøve. Der fryses ved -80 °C, indtil det er klar til at teste for cytokiner. For at måle IL-6-niveauer mest konsekvent skal du bruge et multiplex-assay som Luminex. Hold måleværktøjerne konsistente, da der er betydelig variation i den samlede koncentration målt med forskellige modaliteter og producenter.
    1. For Luminex-analyseprotokol henvises til Bruce et al.21.
  5. Brug relative IL-6-niveauer til at opdele dyr i lave (nederste kvartil), mellemstore (midterste to kvartiler) og høje (højeste kvartil) BIR-grupper.

4. Haleblødningsmetode til blodindsamling

BEMÆRK: For at undgå brug af potentielt immunmodulerende beroligende midler skal du bruge haleblødningsmetoden til blodindsamling.

  1. For at opsætte skal du placere et loddestativ og fastholdelseskop på en overflade på siden af den ikke-dominerende hånd. I en 35 mm petriskål tilsættes 1-2 ml spiselig olie af fødevarekvalitet. Fjern hætten fra den hurtige blodprop, og placer den i nærheden af opsætningen.
  2. Placer et par lag køkkenrulle på loddestativet og det første kapillarrør i et klip, og placer det i nærheden af, hvor musens halespids holdes og holdes parallelt med bordets overflade. Hav et barberblad ved hånden.
  3. For at indsamle blodet skal du udføre følgende trin.
    1. På det ønskede tidspunkt skal du fjerne musen fra buret og placere under koppen med halen, der kommer ud af hakket ved bunden. Brug et frisk barberblad til at klippe den helt ende (1-2 mm) af halen af og samle den første dråbe blod i kapillarrøret, der er klippet til loddestativet.
    2. Dyp fingrene på den dominerende hånd i den spiselige olie og brug den til at klemme fra bunden af halen til spidsen, og før halespidsen til kapillarrøret for at opsamle resulterende bloddråber. Fortsæt indtil ~ 200 μL blod er blevet opsamlet.
    3. Sæt en lille endehætte på den koniske ende af kapillarrøret før tophætten. Hvis tophætten sættes på først, vil prøven blive udvist fra den koniske ende af røret. Sæt røret i beskyttende ydre skal.
    4. Lad det størkne natten over ved stuetemperatur. En mikrocentrifuge afkøles til 4 °C, og blodet centrifugeres ned som angivet i trin 3.3.

Figure 1
Figur 1. Tidslinjen for test af jomfruhunners baseline immunreaktivitet og parring. Bestil mus til at ankomme til 7 uger gamle og lad det akklimatisere sig til anlægget i 1 uge. Injicer dyr med 5 mg/kg poly(I:C) og 2,5 timer senere tappe blod. Lad blodet størkne natten over, og centrifuger derefter ved 3.768 x g, 4 °C i 8 minutter. Indsamle serum og vurdere relative IL-6 niveauer via ELISA eller Multiplex. Ved 9 uger gammel skal du oprette parringspar. Oprettet ved hjælp af BioRender.com Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Vægtbaseret metode til parring og svangerskabsinjektion E12.5

BEMÆRK: Figur 2 viser trinnenes skema. To metoder kan bruges til at oprette parringspar og bestemme E12.5-tidspunktet. Den første, tidsbestemt parring, er beskrevet andetsteds22. Vægtbaserede beregninger kan også bruges til at vurdere for en E12.5 graviditet23. Fordelen ved denne tilgang er, at den tillader tidslåsning af moderens alder ved parring, hvilket reducerer variabiliteten i immunresponset. Denne procedure bruges her.

  1. Placer hannerne i rene bure og lad dem akklimatisere sig i mindst 2 timer. Dette mindsker sandsynligheden for kvindelig aggression, da mænd allerede vil danne en dominerende duft i buret.
  2. Opret enlige han, enlige kvindelige avlspar ved at tilføje hunnen til hannens bur. Før du placerer hende i buret, vejer du hende og registrerer vægten. Tilsæt en lille håndfuld solsikkefrø til hvert bur for at øge parringseffektiviteten.
  3. Udfør følgende trin for at bestemme vægtforøgelsesområdet.
    1. Få en testgruppe af hunner og opsæt parringspar, der registrerer vægt på parringstidspunktet.
    2. Når kvinder begynder at fremstå synligt gravide, vejer de dem og opdeles i delmængder på 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g og 11,5 g vægtforøgelse. Fostre på E12.5 er lige begyndt at udvikle tydelige cifre i poterne. Brug føtal morfologi til at bestemme gennemsnitlig vægtøgning for at nå E12.5.
  4. På 12 dage efter parring vejer kvinder og bestemmer vægtforøgelse. I en testfacilitet får kvinder konsekvent 9,5-10,5 g fra parringstidspunktet til E12,5. Injicer via i.p. den dosis opløseligt poly(I:C), der er bestemt i trin 2.3.2, når hunnens vægtøgning ligger inden for det forudbestemte interval.
  5. Overhold svaret på MIA i dæmninger ved hjælp af følgende parametre.
    1. Sygdomsadfærd: Indsaml subjektive scorer på en skala fra 1-3 for, hvor aktive dæmninger bliver som reaktion på at blive håndteret, hvor 1 er ringe eller ingen bevægelse som reaktion på at blive håndteret, og 3 er en normal reaktion på indfangning og fastholdelse. Dyr med større immunrespons vil vise mindre modstand mod håndtering8.
    2. Febril respons: Brug et IR-termometer til at opsamle temperaturer før injektion og 2,5 timer efter injektion. Dyr med større immunrespons viser ofte hypotermi som reaktion på større immunaktivitet8.
    3. Vægtændring: Dyrene vejes 24 timer efter injektionen. Dyr med større størrelse immunresponser taber generelt mere vægt8.
    4. Mål svangerskabsmæssige IL-6 niveauer som følger8.
      1. 2,5 timer efter injektion opsamles blod med den foretrukne metode. Lad blodet størkne natten over ved stuetemperatur. Efter 12-24 timer centrifugeres blodprøver ned ved 3.768 x g ved 4 °C i 8 minutter.
      2. Serumet opsamles og opbevares ved -80 °C, indtil det er analyseret. Isoler serum og mål IL-6 niveauer via ELISA eller Luminex. Hold måleværktøjerne konsistente, da der er betydelig variation i den samlede koncentration målt med forskellige modaliteter og producenter.
      3. Enkeltvis hus dæmningen efter injektion med passende berigelse som nestlets og berigelsesanordninger. Hold al berigelse konsistent, da ændringer i berigelse kan have betydelige virkninger på gnaveradfærd 24,25,26,27,28,29.
  6. Drægtighedstiden for C57-mus varierer fra 18,5-20,5 dage. Udfør kuldkontrol for at afgøre, om dyr blev født inden for dette interval for at sikre, at injektionen blev udført på det korrekte tidspunkt. Når du kontrollerer for kuld, skal du forstyrre buret så lidt som muligt. Stress umiddelbart efter kuldet er født kan øge risikoen for kannibalisering.

Figure 2
Figur 2. MIA induktion. MIA induktion kræver vurdering af graviditet, i.p. injektion af poly(I:C) og kuldkontrol for at sikre korrekt timing af moderens inflammation. Efter vurdering af drægtighedsdagen enten via tidsbestemt parring eller vægtforøgelsesmetoden, leveres en i.p. injektion af poly(I:C) ved E12.5. Indsamle en blodprøve 2,5 timer efter injektion for at bekræfte immunaktivering og bestemme niveauet af IL-6 aktivering. Kuld fødes ca. E18.5-E20.5. Oprettet ved hjælp af BioRender.com Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Undersøgelse af ændringer i adfærd hos voksne MIA og kontrolafkom (valgfrit)

  1. Fra P60 og før udførelse af adfærdstest skal dyrene vænnes til menneskelig kontakt med skånsom håndtering i 1 min om dagen i 3 på hinanden følgende dage. Sørg for, at burskiftedage ikke forekommer samme dag, som adfærdstest udføres.
  2. Lad altid mus akklimatisere sig til testrummet i 30-60 minutter, før du starter adfærdstest. Brug svagt oplyste (15-20 lux) rum for at minimere angst.
  3. For gentagen pleje skal du placere mus alene i rene, strøelsesfrie bure med låg. Brug et kamera til at optage musene i disse bure i 20 minutter. De første 10 min fungerer som akklimatiseringsperiode, de sidste 10 minutter er testperioden.
  4. Brug gemte videoer og et stopur til at score kumulativ plejetid for hver mus i løbet af testperioden på 10 minutter. Andre adfærd, der kan scores fra disse videoer, inkluderer opdræt (stående på bagben), frysning og spring8.
  5. Brug andre almindelige tests til MIA-modellen, såsom præpulshæmning (PPI) 14,30,31,32, åbent felt12,33,34, 3-kammer social tilgang 13,35,36, ny objektgenkendelse 37, y-labyrint 30, forhøjet plus labyrint33 og kontekst / cued frygtkonditionering 38.
  6. Postnatal immunblotting8 (valgfrit)
    1. Ved P0 halshugges hurtigt og dissekeres føtalt hjernevæv i HBSS, fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
    2. Afbryd prøver ved hjælp af en sondesonicator med en amplitude på 20% i 5 s i 2x Laemmli buffer, og denature derefter ved 85 ° C i 5 minutter. Centrifuger lysat ved 16.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten opsamles og opbevares ved -80 °C.
    3. Mål det samlede proteinindhold ved hjælp af et kommercielt BCA-proteinanalysesæt efter producentens anvisninger, og brug bovint serumalbumin som kalibreringsstandard.
    4. Der tilsættes dithiothreitol som reduktionsmiddel til prøverne som en slutkoncentration på 100 mM. Opvarm til 85 °C i 2 minutter, før du lægger på en gel.
    5. Kør 5 μg/bane protein under reducerende forhold på 7,5% TGS-geler og overfør elektroforetisk til PVDF-membraner. Bloker membraner med blokerende buffer og inkuber med udvalgte antistoffer.
    6. Vask tre gange med TBS + 0,05% Tween 20 og inkuber membraner i 45 minutter med fluorescerende mærkede sekundære antistoffer.
    7. Vask yderligere fire gange i TBS/Tween 20 og billedresultater. Standardiser resultater ved hjælp af β-tubulin, detekteret ved hjælp af anti-β-tubulin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ikke alle dyr, der udsættes for 30 mg/kg poly(I:C) ved E12,5, producerer afkom med konsistente adfærdsmæssige abnormiteter 8,31. Selvom både 30 mg / kg og 40 mg / kg poly (I: C) pålideligt producerer sygdomsadfærd hos dæmninger, herunder nedsat aktivitetsniveau, hypotermiske reaktioner og vægttab og også forårsager betydelige stigninger i IL-6, vil kun en delmængde af kuld udsat for MIA fortsætte med at udvikle adfærdsmæssige abnormiteter i domæner svarende til dem, der observeres i humane psykiatriske og NDD'er (figur 3A-C)8 . En lavere dosis på 20 mg / kg poly (I: C) fremkalder også sygdomsadfærd og vægttab, men i modsætning til højere doser producerer det ikke konsekvent IL-6-responser højt nok i størrelse til at fremkalde adfærdsmæssige aberrationer hos afkom, selvom IL-6-responserne er forhøjet langt over dem fra dæmninger injiceret med saltvand (figur 3D)8.

Figure 3
Figur 3. Forskellige doser af poly (I: C) fører til differentielle virkninger i dæmninger. (A) Moderdyr, der blev udsat for 20 mg/kg, 30 mg/kg eller 40 mg/kg poly(I:C), oplevede nedsat aktivitet i en subjektiv skala (envejs ANOVA; P < 0,0001). (B) Moderdyr, der kun blev udsat for 30 mg/kg poly(I:C), viste signifikant ændret temperatur i form af en hypotermisk reaktion (envejs ANOVA; F3,35 = 4,289, P < 0,05). (C) Både 30 mg/kg poly(I:C) og 40 mg/kg poly(I:C) inducerede signifikant vægttab (envejs ANOVA; F7,187 = 26,93, P < 0,0001) og (D) viste forhøjede IL-6-niveauer over den tærskel, der kræves for at fremkalde adfærdsændringer (envejs ANOVA; F3,35 = 25,54, P < 0,0001). (E) Baseline immunreaktivitet hos isogene kvindelige C57BL/6J dyr er meget variabel, og kategorisering af hunner BIR i lave, mellemstore og høje grupper giver forskere mulighed for at forudsige, hvilke afkom der mest sandsynligt vil være modtagelige for virkningen af MIA. Søjler repræsenterer gennemsnitlig ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Estes et al.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Uventet udviser jomfrumus C57BL/6-hunmus ret variabel baseline immunreaktivitet (BIR) til en lav dosis poly(I:C) (5 mg/kg poly(I:C)) før graviditet, selvom de er isogene, og denne variation er ikke forbundet med vægt (figur 3E, supplerende figur 1)8. Dæmninger injiceret med 5 mg / kg poly (I: C) før graviditet, hvis IL-6-responser er i midten 50% (mellemstore BIR-dæmninger) producerer voksne mandlige afkom med ændringer i STAT3, MEF2 og tyrosinhydroxylaseproteinniveauer i P0-striatalvæv (figur 4C-E)8. Hanafkom af mellemstore BIR-dæmninger udsat for 30 mg / kg poly (I: C) udviser også nedsat synapsetæthed og forhøjet større histokompatibilitetskompleks I (MHCI) i dissocieret neuronal kultur (figur 4A, B) 8. Moderdyr injiceret med 5 mg / kg poly (I: C) før graviditet, hvis IL-6-responser er i midten 50% (mellemstore BIR-dæmninger), producerer pålideligt voksne mandlige afkom med forhøjet gentagen adfærd og nedsat sonderende adfærd, når de udsættes for 30 mg / kg poly (I: C) ved E12.5 (figur 5A-F)8.

Omvendt producerer mus fra gruppen med høj BIR (med IL-6-niveauer i de øverste 25%, når de udsættes for 5 mg / kg poly (I: C) før graviditet) pålideligt afkom uden gentagne adfærdsændringer efter MIA. Imidlertid udviser mandlige afkom af disse høje BIR-dæmninger forhøjet sonderende adfærd efter MIA (figur 5D)8. Tilsammen indikerer disse resultater, at MIA kan forårsage differentielle resultater hos afkom, afhængigt af dæmningens BIR8.

Figure 4
Figur 4. En mellemliggende dosis af poly (I: C) og BIR fører til de største resultater i MIA-modeller. (A) Kortikale neuroner fra afkom udsat for mid-gestational maternal immunaktivering viste kun signifikant øget MHCI-præsentation, når moderdyr fik 30 mg/kg poly(I:C) (envejs ANOVA; F3,19 = 5,156, P < 0,01). (B) I modsætning hertil resulterede alle doser (20 mg / kg, 30 mg / kg og 40 mg / kg) i signifikant nedsat synapsetæthed i dissocieret neuronal kultur (envejs ANOVA; F3,43 = 11,01, P < 0,0001). (C-E) P0 striatal western blots viser kun forhøjet STAT3, MEF2A og TH hos dyr, hvis mødre havde mellemstore BIR og blev udsat for 30 mg/kg poly(I:C) (One-way ANOVA; MEF2A: F3,24 = 3,968, P < 0,05; STAT3: F3,24 = 6,401, P < 0,01; TH: F3,24 = 3,668, P < 0,05). Søjler repræsenterer gennemsnitlig ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Estes et al.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Modtagelige dyr i grupperne med middel BIR 30 mg/kg og høj BIR 30 mg/kg kan ikke kun sammenlignes med kontroller, men også med modstandsdygtige dyr. Injektion af mellemstore BIR-moderdyr med en endnu højere dosis på 40 mg/kg poly(I:C) producerer afkom uden signifikante adfærdsændringer identificeret ved hjælp af de analyser, der er anvendt til dato (figur 5A-F)8. Dette tyder på et omvendt U-forhold mellem immunaktivering og modtagelighed for MIA.

Figure 5
Figur 5. Hanafkom fra moderdyr udsat for en mellemliggende dosis poly (I: C) udviser de største ændringer i adfærd. (A-F) Hanafkom fra moderdyr, der udsættes for 30 mg/kg poly(I:C) (indlejret envejs ANOVA; F3,27 = 8,775; Lav: P = 0,0427; Medium: P = 0,0062; Høj: (P = 0,9568), men ikke 20 mg/kg eller 40 mg/kg poly(I:C) viser ændringer i gentagen pleje og sonderende opdrætsadfærd. Derudover viser dyr i 30 mg / kg poly (I: C) behandlingsgruppen forskellige former for modtagelighed, og mandlige afkom af mellemstore BIR-mødre viser øget gentagen adfærd og nedsat udforskning, mens mandlige afkom af høje BIR-mødre ikke viser nogen ændring i gentagen adfærd, men havde øget udforskende adfærd (A, D ; Indlejret envejs ANOVA; F3,15 = 9,407, Lav: P = 0,4910; Medium: P < 0,001; Høj: P = 0,0117). Afkom udsat for 20 mg / kg poly (I: C) syntes ikke at opfylde tærsklen for immunaktivering, der kræves for at ændre neuronal udvikling, da de ikke viste nogen ændringer i den testede adfærd, mens afkom udsat for 40 mg / kg poly (I: C) også for det meste var modstandsdygtige over for dets virkninger (B, C, E, F). Søjler repræsenterer gennemsnitlig ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Estes et al.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1. Baseline immunreaktivitet er ikke korreleret med dyrevægt. Jomfrumushunmus udviser et stort udvalg af IL-6-responser på 5 mg/kg Poly(I:C) injiceret før graviditet på en vægtuafhængig måde,R2 = 0,0086, P = 0,9. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Moderens infektion ændrer hjernens udvikling hos mennesker og hos både gnavere og ikke-menneskelige primater 4,5,7. Her skitseres en procedure til at inducere MIA i mus på et mid-drægtighedstidspunkt ved hjælp af poly (I: C). Denne metode inkorporerer vurdering af BIR før graviditet, hvilket øger reproducerbarheden og giver mulighed for mekanisk at undersøge mekanismer, der fører til afkommets modstandsdygtighed og modtagelighed for MIA8. Efter MIA genererer dæmninger fra medium BIR-gruppen (med IL-6-niveauer i midten 50%) pålideligt voksne afkom med ændringer i gentagen adfærd, ændringer i MHCI-niveauer på neuroner fra nyfødte afkom som bestemt af immuncytokemi og forhøjede niveauer af striatal tyrosinhydroxylase, MEF2 og STAT3-protein fra nyfødte afkom bestemt af Western blot8.

Brugen af MIA som miljømodel giver øget translationel relevans, da den opfylder kriterierne for en sygdomsmodel: konstruktion, ansigt og prædiktiv validitet7. Men som med enhver miljømodel skal der udvises stor omhu for at minimere eksterne variabler. Mange faktorer såsom leverandør, poly (I: C) parti, tidspunkt for injektion, alder af dæmninger og endda bursystemet kan ændre virkningen af MIA på afkom 8,9,39. Som tidligere rapporteret er styrken af poly (I: C) inkonsekvent mellem producenter, partier og endda flasker inden for et parti på grund af høj variabilitet i dsRNA-koncentrationerne og molekylvægte 8,40. Fordi denne variabilitet kan øge heterogeniteten i moderens immunrespons, er det afgørende, at laboratorier bestemmer den effektive dosis for hvert parti for at opretholde maksimal reproducerbarhed i observerbare fænotyper. For eksempel er det blevet bemærket, at Charles River-mus, der udsættes for MIA, producerer konsistente BIR og dosisafhængige fænotyper hos afkom, og mus fra Taconic kan også blive påvirket på en lignende måde med nogle forskelle på tværs af behandlingsgrupper8. Derudover er det vigtigt, at forskere standardiserer opdrætspraksis og fører detaljerede optegnelser for at øge modellens reproducerbarhed. Publikationen forfattet af Kentner et al. skitserede de mange detaljer, der skal medtages i eksperimentelle rapporter og kan også fungere som en tjekliste for forskere, når de færdiggør deres protokoller9.

BIR vurderes ved hjælp af relative serum interleukin-6 (IL-6) niveauer fra jomfruelige hunmus. Opdeling af disse mus i tre grupper (lav, medium og høj) afslører reproducerbare, elastiske og modtagelige modeller8. Fordi BIR er et spørgsmål om relativ koncentration af IL-6, er det ikke afgørende at grundigt teste højmolekylær poly (I: C) styrke, som det er nødvendigt med den blandede molekylvægt poly (I: C), der bruges til at inducere moderens immunaktivering under drægtighed. BIR er et relativt nyt mål, der muligvis ikke reducerer alle variable resultater.

Moderdyrs immunrespons under deres første eksponering for svangerskabsdoser af poly (I: C) kan afvige fra deres respons under efterfølgende graviditeter og eksponeringer. Til dette formål reducerer brugen af jomfruhunner potentialet for variabilitet, som ændringer i immunrespons som følge af flere graviditeter kan præsentere. Den vægtbaserede metode til estimering af graviditetstidspunkt er nødvendig, fordi mus ofte ikke bliver gravide inden for de første 24 timer efter parring.

Det er vigtigt at bemærke, at der er statistiske udfordringer med denne model. Fordi MIA induceres i dæmningerne, kan afkomene ikke randomiseres til behandlingsbetingelser. Hvert kuld skal således betragtes som et n på 1 9,41,42, og individer inden for dette kuld skal beregnes som gennemsnit for at oprette hvert datapunkt. Det mest hensigtsmæssige statistiske design for disse data anvender derfor indlejrede analyser8. Mindst seks kuld pr. Gruppe (BIR x dosis) er nødvendig for pålideligt at detektere ændringer i adfærdsmæssige og molekylære mål. Signifikante kønsforskelle er blevet bemærket udførligt i MIA-litteraturen, og derfor bør køn aldrig samles i analyser 8,9,43,44.

BIR er et relativt nyt prædiktivt værktøj, og det er endnu ikke defineret med hensyn til mekanistisk effekt. Det er stadig ukendt, om BIR er forbundet med specifikke svangerskabsimmunresponser, men musens IL-6-respons før graviditet svarer ikke til deres respons under graviditet8. BIR repræsenterer derfor et korrelativt prædiktivt mål, og mere forskning er i gang for at bestemme dets oprindelse.

På trods af den variation, der er forbundet med MIA-modellen, kan ingen anden miljømodel for neuropsykiatriske lidelser og NDD'er til dato give det samme niveau af translationel relevans. Forberedelse og omfattende pilottest er nødvendige for at skabe konsistens i MIA-modellen, men robustheden af fænotypiske resultater kompenserer for denne initialinvestering. I sidste ende tilbyder MIA-dyremodeller enestående potentiale til at undersøge en enkelt risikofaktor, der skaber divergerende og forskellige klynger af adfærdsmæssige og molekylære ændringer hos afkom, svarende til dem, der observeres i menneskelige populationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Myka Estes for hendes vedholdenhed med at adressere variabilitet i musens MIA-model og alle bidragyderne i Estes et al.8 for deres arbejde, der førte til udviklingen af metodeprotokollen beskrevet her. Den forskning, der blev rapporteret her, blev støttet af NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) og NIMH T32MH112507 (K.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% NaCl physiological endotoxin free saline Sigma-Aldrich 7647-14-5 Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish Thomas Scientific 1219Z45 Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels Bio-rad 4561084 Optional
Ancare Nestlets Fisher Scientific NC9365966 Optional
anti-β-tubulin Millipore MAB3408 Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I Bio-rad 171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate Bio-rad 171304070M
Bovine Serum Albumin ThermoFisher 23209 Optional
Centrifuge Eppendorf 5810R Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle Spectrum 552-58457-083
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779-10G Optional
Environmental enrichment Bio-serv K3327 and K3322 Optional
Ethovision Noldus Ethovision Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies Li-cor 925-32213 and 925-68072 Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed) Various vendors Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS ThermoFisher 14060040 Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Invivogen #tlrl-pic-5 Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer AIMS 1000 Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software Licor 5.2 Optional
Laemmli buffer Bio-rad 1610737EDU Optional
Luminex200 ThermoFisher APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube Sarstedt 16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Sigma-Aldrich #P0913 Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A AbCam ab76063 Optional
monoclonal anti-STAT3 Cell signaling 12640S Optional
Observer Noldus Observer Optional
Odyssey blocking buffer (TBS) Li-cor 927-50003 Optional
Odyssey CLx imaging system Li-cor 9140 Optional
Omnipure PBS Millipore 65054L Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23227 Optional
polyclonal anti_TH Pel-Freez P4101-150 Optional
PVDF membrane Bio-rad 162-0177 Optional
Qsonica Sonicator Q500 Fisher Scientific 15-338-282 Optional
Quick blood stopper Petco 17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile USA Scientific 1615-5500
Soldering stand Amazon B08Y12QC73 Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds Bio-serv S5137-1 Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set, Bio-rad 171G5007M
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Optional
Tween 20 Bio-rad 23209 Optional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adams, W., Kendell, R. E., Hare, E. H., Munk-Jørgensen, P. Epidemiological evidence that maternal influenza contributes to the aetiology of schizophrenia. An analysis of Scottish, English, and Danish data. The British Journal of Psychiatry: The Journal of Mental Science. 163 (4), 522-534 (1993).
  2. Brown, A. S., et al. Serologic evidence of prenatal influenza in the etiology of schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 61 (8), 774-780 (2004).
  3. Brown, A. S., Derkits, E. J. Prenatal infection and schizophrenia: a review of epidemiologic and translational studies. The American Journal of Psychiatry. 167 (3), 261-280 (2010).
  4. Patterson, P. H. Immune involvement in schizophrenia and autism: etiology, pathology and animal models. Behavioural Brain Research. 204 (2), 313-321 (2009).
  5. Patterson, P. H. Maternal infection and immune involvement in autism. Trends in Molecular Medicine. 17 (7), 389-394 (2011).
  6. Estes, M. L., McAllister, A. K. Immune mediators in the brain and peripheral tissues in autism spectrum disorder. Nature Reviews. Neuroscience. 16 (8), 469-486 (2015).
  7. Estes, M. L., McAllister, A. K. Maternal immune activation: Implications for neuropsychiatric disorders. Science. 353 (6301), 772-777 (2016).
  8. Estes, M. L., et al. Baseline immunoreactivity before pregnancy and poly(I:C) dose combine to dictate susceptibility and resilience of offspring to maternal immune activation. Brain, Behavior and Immunity. 88, 619-630 (2020).
  9. Kentner, A. C., et al. Maternal immune activation: reporting guidelines to improve the rigor, reproducibility, and transparency of the model. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 245-258 (2019).
  10. Zhou, Y., et al. TLR3 activation efficiency by high or low molecular mass poly I:C. Innate Immunity. 19 (2), 184-192 (2013).
  11. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain, Behavior and Immunity. 25 (4), 604-615 (2011).
  12. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  13. Choi, G. B., et al. The maternal interleukin-17a pathway in mice promotes autism-like phenotypes in offspring. Science. 351 (6276), 933-939 (2016).
  14. Meyer, U. Neurodevelopmental resilience and susceptibility to maternal immune activation. Trends in Neurosciences. 42 (11), 793-806 (2019).
  15. Laroche, J., Gasbarro, L., Herman, J. P., Blaustein, J. D. Reduced behavioral response to gonadal hormones in mice shipped during the peripubertal/adolescent period. Endocrinology. 150 (5), 2351-2358 (2009).
  16. Aguila, H. N., Pakes, S. P., Lai, W. C., Lu, Y. S. The effect of transportation stress on splenic natural killer cell activity in C57BL/6J mice. Laboratory Animal Science. 38 (2), 148-151 (1988).
  17. Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. American Journal of Veterinary Research. 43 (9), 1654-1657 (1982).
  18. Menees, K. B., et al. Sex- and age-dependent alterations of splenic immune cell profile and NK cell phenotypes and function in C57BL/6J mice. Immunity & Ageing. 18 (1), 3 (2021).
  19. Shaw, A. C., Goldstein, D. R., Montgomery, R. R. Age-dependent dysregulation of innate immunity. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 875-887 (2013).
  20. Starr, M. E., Saito, M., Evers, B. M., Saito, H. Age-associated increase in Cytokine production during systemic inflammation-II: the role of IL-1beta in age-dependent IL-6 upregulation in adipose tissue. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 70 (12), 1508-1515 (2015).
  21. Bruce, M., et al. Acute peripheral immune activation alters cytokine expression and glial activation in the early postnatal rat brain. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 200 (2019).
  22. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  23. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
  24. Hutchinson, E., Avery, A., VandeWoude, S. Environmental enrichment for laboratory rodents. ILAR Journal. 46 (2), 148-161 (2005).
  25. Bayne, K. Environmental enrichment and mouse models: Current perspectives. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (2), 82-90 (2018).
  26. Toth, L. A., Kregel, K., Leon, L., Musch, T. I. Environmental enrichment of laboratory rodents: the answer depends on the question. Comparative Medicine. 61 (4), 314-321 (2011).
  27. Sparling, J. E., Barbeau, K., Boileau, K., Konkle, A. T. M. Environmental enrichment and its influence on rodent offspring and maternal behaviours, a scoping style review of indices of depression and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 197, 172997 (2020).
  28. Xiao, R., Ali, S., Caligiuri, M. A., Cao, L. Enhancing effects of environmental enrichment on the functions of natural killer cells in mice. Frontiers in Immunology. 12, 695859 (2021).
  29. Girbovan, C., Plamondon, H. Environmental enrichment in female rodents: considerations in the effects on behavior and biochemical markers. Behavioural Brain Research. 253, 178-190 (2013).
  30. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  31. Mueller, F. S., et al. neuroanatomical, and molecular correlates of resilience and susceptibility to maternal immune activation. Molecular Psychiatry. 26 (2), 396-410 (2021).
  32. Nyffeler, M., Meyer, U., Yee, B. K., Feldon, J., Knuesel, I. Maternal immune activation during pregnancy increases limbic GABAA receptor immunoreactivity in the adult offspring: implications for schizophrenia. Neuroscience. 143 (1), 51-62 (2006).
  33. Babri, S., Doosti, M. H., Salari, A. A. Strain-dependent effects of prenatal maternal immune activation on anxiety- and depression-like behaviors in offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 164-176 (2014).
  34. Vigli, D., et al. Maternal immune activation in mice only partially recapitulates the autism spectrum disorders symptomatology. Neuroscience. 445, 109-119 (2020).
  35. Malkova, N. V., Yu, C. Z., Hsiao, E. Y., Moore, M. J., Patterson, P. H. Maternal immune activation yields offspring displaying mouse versions of the three core symptoms of autism. Brain, Behavior, and Immunity. 26 (4), 607-616 (2012).
  36. Shin Yim, Y., et al. Reversing behavioural abnormalities in mice exposed to maternal inflammation. Nature. 549 (7673), 482-487 (2017).
  37. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 930-941 (2010).
  38. Zuckerman, L., Weiner, I. Maternal immune activation leads to behavioral and pharmacological changes in the adult offspring. Journal of Psychiatric Research. 39 (3), 311-323 (2005).
  39. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  40. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biological Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  41. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neuroscience. 14, 37 (2013).
  42. Spencer, S. J., Meyer, U. Perinatal programming by inflammation. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 1-7 (2017).
  43. Mouihate, A., Kalakh, S. Maternal Interleukin-6 hampers hippocampal neurogenesis in adult rat offspring in a sex-dependent manner. Developmental Neuroscience. 43 (2), 106-115 (2021).
  44. Zhang, Z., van Praag, H. Maternal immune activation differentially impacts mature and adult-born hippocampal neurons in male mice. Brain, Behavior, and Immunity. 45, 60-70 (2015).

Tags

Neurovidenskab udgave 186
Generering af en reproducerbar model af mid-gestational maternal immunaktivering ved hjælp af Poly (I: C) for at studere modtagelighed og modstandsdygtighed hos afkom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prendergast, K., McAllister, A. K.… More

Prendergast, K., McAllister, A. K. Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring. J. Vis. Exp. (186), e64095, doi:10.3791/64095 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter