Summary
本稿では、精密制御手術と二光子顕微鏡を用いて、マウス海馬CA1の静止ミクログリアをin vivo で慢性的に観察する方法について述べる。
Abstract
ミクログリアは、脳内に常在する唯一の免疫細胞であり、シナプスや神経細胞の興奮性を改変することで神経回路の維持に積極的に関与しています。最近の研究では、異なる脳領域におけるミクログリアの遺伝子発現の違いと機能的不均一性が明らかになりました。学習と記憶における海馬ニューラルネットワークのユニークな機能は、シナプスリモデリングにおけるミクログリアの積極的な役割に関連している可能性があります。しかし、海馬ミクログリアの2光子顕微鏡解析では、外科的処置によって誘発される炎症反応が問題となっていた。ここでは、イメージングウィンドウを通して海馬CA1の全層のミクログリアの慢性観察を可能にする方法を提示する。この方法は、ミクログリア過程における形態学的変化を1ヶ月以上解析することを可能にする。安静時のミクログリアの長期的かつ高解像度のイメージングには、低侵襲の外科的処置、適切な対物レンズの選択、および最適化されたイメージング技術が必要です。海馬ミクログリアの一過性の炎症反応は、手術直後の画像化を妨げる可能性がありますが、ミクログリアは数週間以内に静止形態を回復します。さらに、ミクログリアと同時に神経細胞をイメージングすることで、海馬における複数の細胞種の相互作用を解析することができます。この技術は、海馬におけるミクログリア機能に関する重要な情報を提供する可能性がある。
Introduction
ミクログリアは、脳内に常在する唯一の免疫細胞および組織マクロファージである。炎症に対する迅速な応答などの免疫細胞としての機能に加えて、シナプスの剪定、シナプス可塑性の調節、神経活動の制御など、神経回路の維持とリモデリングにおいてさまざまな生理学的役割を果たすことが示されています1,2,3,4,5 .ミクログリアとニューロンの間の生理学的相互作用は、神経回路の発達と疾患神経生物学の両方においてますます関心が高まっています。ミクログリアの生理機能を生体内で解析するには、組織損傷や炎症反応を伴わずにミクログリアを観察する方法が必要です。しかし、ミクログリアは炎症に敏感であり、組織の損傷に応じてその形状と機能を劇的に変化させます6,7。
二光子in vivoイメージングは、ミクログリア8の生理動態を捉えるための理想的なツールです。 in vivo二光子イメージングの初期適用により、成体マウス皮質における環境監視のためのミクログリアプロセスの動的な動きが明らかになりました9,10。以下の2光子イメージング研究は、ニューロンとの機能的および構造的相互作用の分析のためにミクログリアのin vivoモニタリングをさらに拡張しました5、11、12、13、14。しかしながら、従来の2光子顕微鏡の撮像深度は、脳表面から1mm未満に制限されていた15,16。この制約は、海馬などの脳深部領域におけるミクログリアの挙動を報告する以前の研究の不足を説明しています。
最近のRNAシーケンシング研究は、ミクログリアのかなりの局所的不均一性を明らかにし、明確な機能的役割の可能性を高めています17、18、19、20、21。そのため、様々な脳領域の神経細胞とのミクログリア相互作用を記録する必要がありますが、技術的な困難がそのような研究を妨げていました。特に、シナプスリモデリングにおけるミクログリアの活発な関与は、海馬ニューラルネットワークとその記憶関連機能の開発において重要であることが報告されている22,23。しかしながら、未挑戦の海馬ミクログリアを生体内で観察するための有効な方法は利用できなかった。
このプロトコルは、正確に制御された外科的技術を使用して、背側海馬のCA1における静止ミクログリアの慢性的なin vivo観察の手順を説明しています。ミクログリア24でGFPを発現するCX3CR1-GFPマウス(CX3CR1+/GFP)のCA1領域の2光子イメージングにより、CA1の全層で分岐したミクログリアを十分な分解能で観察することができました。プロトコルには、観察ウィンドウと適切なイメージング条件の移植を成功させるためのいくつかのヒントが含まれています。また、CA1における錐体神経細胞とミクログリアの同時可視化を応用例として紹介する。この手法の利点、制限、および可能性についても説明します。
Protocol
すべての動物実験は、東京大学動物倫理委員会および遺伝子組換え実験安全委員会の方針に従って承認され、実施されました。生後2〜4ヶ月の雄および雌両方のCX3CR1−GFPマウスを実験に使用した。実験者の安全と無菌状態の維持のために、すべての手順は白衣、マスク、および滅菌手袋で行われました。すべての器具は使用前に滅菌されました。
1.器具や動物の準備
- ガラス底の金属管を組み立てます(図1A)。
- カスタムメイドのステンレスチューブ(外径3.0mm、内径2.8mm、高さ1.7mm)の一端にUV硬化型光学用接着剤を少量塗布します。チューブの円形の端に接着剤を均一に広げます。
注意: チューブの端全体を覆うのに十分な量の接着剤を使用する必要があります。 - 円形のガラスカバースリップ(直径3.0 mm、厚さ0.15 ± 0.02 mm)を金属管の接着剤で覆われた端に置き、チューブとガラスの間の隙間が接着剤で満たされるようにカバーガラスをチューブに軽く押し付けます。次に、金属管の外縁内に収まるようにガラスの位置を調整します。
- 接着剤を硬化させるのに十分な時間、ガラスにUV光を照射します。
注意: ガラスとチューブが完全に取り付けられていることを確認してください。接着が不十分な場合、手術後にガラスが剥がれ、画像化の失敗や脳脊髄液(CSF)の漏出を引き起こす可能性があります。 - 組み立てたガラス底金属管を70%エタノールで消毒し、滅菌生理食塩水で洗浄して破片を取り除きます。
- カスタムメイドのステンレスチューブ(外径3.0mm、内径2.8mm、高さ1.7mm)の一端にUV硬化型光学用接着剤を少量塗布します。チューブの円形の端に接着剤を均一に広げます。
- 乾熱滅菌器ですべての手術器具を滅菌します。
- 窓植え替えの手術のためにマウスを準備します。
注:マウスは適切な年齢である必要があります。CA1および歯状回(DG)において蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作されていることが好ましい。これらの点については、「ディスカッション」セクションで詳しく説明します。
2.麻酔と頭の固定
- ケタミン-キシラジン(100 mg / kgケタミンおよび10 mg / kgキシラジン)の腹腔内注射によってマウスを麻酔します。.術前鎮痛のためにメロキシカム(2 mg / kg)を皮下注射で投与します。.適切な麻酔深度を確保するために、尾をつまむなどの痛みを伴う刺激に対する反応の消失を確認します。手術中に麻酔が切れるたびに、通常は最初の投与から1時間後、その後30分ごとに、ケタミン-キシラジンの半分の用量を追加します。.体の下に加熱パッドを使用して熱サポートを提供し、眼科用軟膏を目に塗布して麻酔下での乾燥を防ぎます。
注:手術のための麻酔の選択は不可欠です。この点については、「ディスカッション」セクションで詳しく説明します。 - 頭皮から髪を取り除くために脱毛クリームを適用します。ポビドンヨードスクラブとそれに続くアルコールで頭皮を円を描くように数回消毒します。滅菌防水パッドで準備された手術プラットフォームにマウスを置き、滅菌ドレープを適用して手術部位を固定します。その後、頭頂骨と後頭骨が手術側で完全に露出するようにメスで頭皮を円形に切断して除去します。
- 皮下結合組織を綿棒でこすりながら、滅菌生理食塩水を塗布して出血を取り除きます。丸い先端のミニチュアナイフで頭蓋表面をそっとこすり、骨膜を取り除き、セメントと骨の間の接着を強化するのに役立ちます(ステップ2.6を参照)。
- 歯科用エッチング材料を全面に塗布し、数十秒間待ってから、十分な滅菌生理食塩水ですすいでください。
- 防水インクを使用して、除去する骨の領域(直径3.0 mmの円形の領域、ブレグマの後方約2.5 mm、横方向2.5 mmを中心に)をマークします。マーキング後、頭蓋骨の表面を完全に乾かします。
注:開頭術の位置は海馬のサイズに依存し、さまざまな年齢に合わせて最適化する必要があります。開頭術の位置に関する有用な指標を以下に示します(ステップ3.4.5、注を参照)。 - 厚さ1.0mm、中央に直径5.0mmの穴が開いた長方形のアルミ板を、製造元の指示に従って歯科用レジンセメントを使用して頭蓋骨に取り付けます。
- プレートの中央にある穴をペンでマークされた円形の領域に注意深く合わせ(手順2.5を参照)、アルミニウムプレートが頭蓋骨のマークされた表面と平行になるようにします(図1B)。セメントがプレートと骨の間のすべての隙間をしっかりと密閉していることを確認してください。セメントが十分に硬化するまで約5分間待ちます。
- 付属のプレートを介して、角度調整器付きのヘッド保持装置 に マウスを置きます。
3.観察窓の埋め込み
注:以下の外科的処置は、実体顕微鏡下で実行する必要があります。
- 直径3.0 mmの真皮パンチを使用して頭蓋骨に円形の溝を作ります。円形の溝と手順2.5でペンでマークされた領域を揃えます。溝の深さが徐々に増加するように、穏やかな圧力でダーマルパンチをひねります。溝の深さが全周にわたって一定であることを頻繁に確認してください。
- 真皮パンチが頭蓋骨の最内層に到達したら、下にある硬膜に触れる前に、30 Gの針を使用して中央の骨島をそっと持ち上げます。
注意: 溝の底からのわずかな液体の漏れは、溝がデュラに近いことを示しています。 - 硬膜ピッカーを使用して硬膜を取り除きます。
注:頭蓋窓内の硬膜を完全に除去する必要があり、細かい鉗子を使用して末梢の残留硬膜を慎重に切除する必要があります。 - 組織を穏やかに吸引して、吸引器に接続された23 Gまたは25 Gの鈍い針で海馬の肺胞を露出させます。
注意: この手順は、イメージングを成功させるために最も重要です。組織吸引のための重要な技術的ポイントは、ディスカッションセクションで詳細に説明されています。- ピアとピアル血管を吸引します。
- 皮質組織を表面から吸引します。露出した組織表面の深さを頭蓋窓全体で均一に保ちます。外部カプセルの繊維が露出するまで、吸引を徐々に深めます。
- 吸引チップを、頭蓋窓の吻側端にある側脳室(LV)近くの外部カプセルに慎重に配置します。尾側から吻側方向に走る外嚢の表層を取り除き、次に中外側方向に走る内層を取り除きます。
注:LV近くの外部カプセルは、下にある構造から簡単に取り外すことができます。 - 肺胞の表面と背側海馬交連(DHC)の完全な露出をチェックして、外部カプセル全体の除去を確認します。
注意: DHCはCA1の尾側部分をカバーしています。肺胞とDHCは、繊維配向によって外部カプセルと区別できます。すなわち、肺胞およびDHC内の繊維は、吻内側から尾側方向に走り、外部カプセル内の線維と区別することができる。肺胞とDHCはCA1にしっかりと取り付けられており、損傷してはなりません。残っている破片はガラスカバーガラスが肺胞に直接接触するのを妨げるので、外部カプセルのすべての破片は取り除かれるべきです。 - 出血が完全に止まったことを確認し、頭蓋骨表面の高さまで滅菌生理食塩水で穴を埋めます。
注意: ここでの視野は、穴がマウスの特定の年齢に適した位置にあるかどうかを判断するのに役立ちます。理想的には、肺胞とその基盤となるCA1が中央領域の大部分を占める必要があります。DHCの一部は尾状領域に見えます。LVの開口部は吻側端で検出可能です(図3A)。
- ガラス底部が肺胞を軽く押して下にあるCA1を部分的に平らになるまで、管の側面から溢れる余分な水を吸引しながら、ガラス底の金属管(手順1.1を参照)を穴に垂直に挿入します。
注意: この圧力は適切に調整する必要があります。強すぎると、CA1が損傷します。弱すぎると、CA1の曲率による球面収差により、深部構造物の撮像分解能が低下します。 - 歯科用レジンセメントを使用して、挿入したチューブの壁を周囲の頭蓋骨に固定します(図1C)。全周がしっかりと密閉されており、空気やCSFの漏れがないことを確認してください。セメントが固まるまで約5分待ちます。
注:粘度が低いときにセメントを配置すると、チューブと頭蓋骨の間の隙間から脳実質に漏れ、脳に損傷を与える可能性があります。したがって、セメントは重合開始後に塗布する必要があり、これにより粘度が上昇し、隙間からの漏れが減少します。 - プレート全体、頭蓋骨、およびチューブの内側を滅菌生理食塩水で洗浄して、破片を取り除きます。
4. 手術の質チェックのための手術直後の二光子顕微鏡
- マウスを2光子顕微鏡の対物レンズの下にあるヘッド保持装置と電動XYスキャンステージにセットします。熱サポートには加熱パッドを使用してください。この品質チェックには最大30分かかる場合があるため、ステップ2.1で説明されているように麻酔の深さを監視および調整します。
注:作動距離(WD)が3mmより長く、開口数(NA)が高い水浸対物レンズをお勧めします。対物レンズの補正環は、ガラスと生体材料との間の屈折率の不一致を補正することによって解像度を向上させることができる。 - ガラスと対物レンズの間のスペースを水で満たし、気泡が入らないように特別な注意を払ってください。必要に応じて、より多くの水を保持するプラスチックフィルムを使用して金属板の領域を拡大し、対物レンズのフロントレンズ全体を覆います。
- 脳内で発現する蛍光プローブの励起のために波長920nmのフェムト秒パルスレーザーをオンにし、画像取得ソフトウェアを起動します。
- 電動ステージと電動フォーカスシステムを使用して、CA1にフォーカスを調整します。パルスレーザーによる連続照明下で、脳実質から放出される蛍光と金属管の端からの反射光のガイダンスでターゲット構造を配置します。
- 電動フォーカスシステムで焦点を調整することにより、ガラス底に触れる脳実質の深さを測定します。異なる水平位置の深さを比較して、ガラス底面と撮像面の位置合わせを判断します。
- ガラス底部が撮像面と平行になるようにヘッド保持装置を傾けて、マウスヘッドの角度を調整します。
- 対物レンズの補正環を調整して、CA1のターゲット構造の深さで最高の解像度を達成します。
- ガラス底面から500μmの深さにあるDG上羽根の分子層(ML)中の蛍光細胞が全視野で撮像できることを確認します。
注:このステップは、手術の質を判断する上で重要です。CA1が損傷している場合、限局性脳浮腫は表面から200μm以上の深さで蛍光検出を妨げます。CA1に損傷がなく、CA1層の湾曲が上にあるカバーガラスによって適切に平坦化されている場合にのみ、DG信号を手術直後に検出できます(図2A-D)。代表結果セクションでは、CA1 と DG の境界を簡単に判別できます。
5.術後ケア
- チューブ内の水を吸引し、破片が入らないようにプラスチックシールで覆います。
- マウスを暖かく保ち、麻酔からの回復を待ちます。
- マウスが痛みに関連する行動を示す限り、24時間ごとにメロキシカム(2 mg / kg)を皮下投与します。.
- 術後マウスを個々の住居で数週間飼育します。
6. CX3CR1-GFPマウスを用いたミクログリアのin vivo 慢性二光子イメージング
- 麻酔導入後、金属管内を滅菌生理食塩水で洗浄し、ゴミを取り除きます。海馬の白い肺胞がガラスを通して見え(図3A)、術後出血などの合併症がないことを確認してください。
- 手順4.1から4.6に従って、マウスを2光子顕微鏡の下に置きます。
- 海馬の2光子励起によって得られた画像の品質と強度を確認します(図3B)。術後浮腫の減少後に撮影された画像が、手術当日に撮影されたものと同等またはそれ以上であることを確認してください(図2A、ステップ4.5を参照)。
注:画像の劣化は、脳内の組織損傷の存在を示します。 - ミクログリアがすでに分岐形態を回復していることを確認してください(図3C)。
注:ミクログリアのイメージングデータは、ミクログリアが基底状態に戻るには少なくとも3〜4週間かかることを示しています。 - 実験の特定の目的のためにCA1の任意の層で in vivo イメージングを実行します。
Representative Results
この技術を使用すると、特に炎症が治まる手術後3〜4週間で、背側CA1のすべての層(SO)、ピラミデール層(SP)、放射状層(SR)、ラクノサム分子層(SLM)を含む背側CA1のすべての層で、分岐および静止したミクログリアを慢性的に観察できます。手術が適切に行われれば、手術後数ヶ月までイメージングを行うことができます。このセクションには、生体内イメージングの評価に役立つ3つのトピックが含まれています。まず、手術直後および慢性期のサンプル画像を、適切な外科的および画像的処置の参考として提供します。第二に、ミクログリアの明確な形態、それらの蛍光強度、および特定の海馬層における血管分布が説明され、読者が肺胞からDGまでのイメージング深度を推定するのに役立ちます。第3に、ニューロンとミクログリアの同時イメージングを示す応用例を提供する。
手術直後のCX3CR1-GFPマウスにおけるミクログリアの代表的な画像を図2に示す。CA1に明らかな損傷がなく、CA1層の曲率が上にあるカバーガラスによって適切に平坦化されている場合、ミクログリアの2光子イメージング深度はCA1層全体を超え、DGのMLまたは顆粒細胞層(GCL)が存在する手術表面から500μmに達します(図2A;ステップ4.7および図4Eを参照)。).ミクログリアは、無傷の海馬の層と比較して、特に手術表面に近い層では、わずかに枝分かれが少ない。それにもかかわらず、それらは顕著な活性化を示さず、適切な外科的処置を示唆しています(図2B)。一方、組織損傷によって誘発されるCA1の浮腫は、イメージング深度を200μmに制限します(図2C)。組織損傷はまた、遊離組織表面に向かう膨らみプロセスの蓄積などの異常なミクログリア活性化を誘発する(図2D;図2Bの上図と比較)。これらは不適切な手術の兆候です。
術後3週間以上の慢性期におけるミクログリアの代表的な画像を図3に示す。ミクログリアは、CA1を超えてDGのより深い層まで、より高い蛍光強度と分解能、より均一な分布で再びイメージングすることができます(ステップ6.3、図3Bを参照)。画像品質は手術直後よりも優れています(図2A)。この違いは、浮腫と炎症の減少によって説明できます。ミクログリアは、すべての層の分岐形態をすでに回復しており(図3C)、術後の外観とは異なります(図2B)。CA1のミクログリアのタイムラプスイメージングにより、不動の細胞体とサーベイランスのための運動性の高いプロセスが明らかになりました(ビデオ1-2)。それらの運動挙動は、皮質9におけるミクログリアプロセスダイナミクスの以前の報告と類似している。
海馬ニューロン25,26,27に蛍光プローブを発現するマウスを用いて、ニューロン細胞の分布と深さに基づいて画像化された海馬層を特定するのは簡単です。ニューロン細胞体に関する位置情報の助けを借りなくても、蛍光ミクログリアからのシグナルだけで海馬層の同定にいくつかの手がかりを提供します(図3B)。肺胞のミクログリアは、軸索路に沿って伸びる傾向がある細長い細胞体と突起を持っています(図4A)。他の層のミクログリアは、それらの丸い細胞体および好ましい方向なしに放射するプロセスによって区別することができる。SPのミクログリアは密集した錐体ニューロンの一つであり、ミクログリア突起の密度が低いことで区別できます。SPの上と下の層は、それぞれSOとSRとして識別されます(図4B)。ミクログリア特性のみに基づいてSRとSLMを区別することは不可能です。CA1とDGの境界は、境界に沿って走る太い血管によって認識されます(図4C)。これらの血管は、スルホローダミン101(SR101;5 mM、4 μL/g体重)などの色素を腹腔内注射することで血管をよりよく認識できます(図4D)。ミクログリアからの蛍光シグナルは、おそらくこれらの構造の屈折率の違いのために、上にあるCA1と比較してDGで急激に低下します。蛍光強度のこのギャップは、DGとCA1の境界を特定するのにも役立ちます。応用例として、GFP陽性ミクログリアとtdTomato標識錐体ニューロンの同時イメージングが示されている(図4E)。この実験では、CX3CR1-GFPマウスは、海馬錐体ニューロンにおけるtdTomatoの発現のためにアデノ随伴ウイルス(AAV)の注射を受けた。ニューロンの標識は、CA1の正確な層構造を理解するのに役立ちます。
図1:観察窓の埋め込みの模式図 。 (A)組み立てたガラス底金属管の断面図。円形のガラスカバーガラスが円筒形のステンレスチューブの一端に付着します。(b)頭蓋骨に取り付けられたアルミニウム板の断面図。プレートは、焦点を合わせるためにプレートの近くに配置された対物レンズと干渉しないように、頭蓋骨のマークされた表面に平行でなければなりません。(C)埋め込みチューブの断面図。ガラス底部を海馬の肺胞にしっかりと取り付けて、CA1の表面を静かに押して平らにする必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:手術直後のCX3CR1-GFPマウスにおけるミクログリアのin vivo イメージング。 (A)術後1日目のCX3CR1-GFPマウスの in vivoCA1 イメージングからの代表的な3D再構成(POD)0(幅:511 μm、高さ:511 μm、深さ:550 μm)。ガラス底部から500μmの深さにあるDGのML中の蛍光ミクログリアは、CA1全体を通して画像化することができる。(B)(A)で得られた典型的なGFP充填ミクログリアを、ガラス底面から100、300、520μmの深さにおける厚さ20μmの画像スタックの最大強度投影(MIP)として示す。ミクログリアの形態は、DGの表在性CA1からMLまで検出可能ですが、DGでは明らかな画像劣化があります。特に手術表面に近い層のミクログリアは、あまり枝分かれしていませんが、明らかな活性化を示さない。スケールバー、50μm。 (C)外科的に損傷したCA1の代表的な3D画像再構成。データは、POD 0(幅:399 μm、高さ:399 μm、深さ:450 μm)でCX3CR1-GFPマウスから取得されました。ミクログリア蛍光は、深さ500 μmで検出された蛍光ミクログリアを有する損傷していないCA1(A)とは対照的に、深さ200 μmまでしか検出できない。 (D)(C)における異常に活性化されたミクログリアの典型的な画像。厚さ20 μm、深さ60 μmのGFP画像スタックのMIPは、外科的に露出した組織表面に向かって広がるミクログリア膨らみプロセスを示しています。全体的なミクログリア形態は、(B)に示す画像とは異なる。スケールバー、100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:慢性期のCX3CR1-GFPマウスにおけるミクログリアの in vivo イメージング 。 (A)慢性期における右背側CA1移植窓の代表的な外観。ガラス底部を通して、術後の出血なしに肺胞の白い繊維がはっきりと観察されます。DHCとLVは、それぞれ尾状領域と吻側縁に部分的に見えます。スケールバー、1 mm。 (B)POD 24(幅:511 μm、高さ:511 μm、深さ:670 μm)でのCX3CR1-GFPマウスの in vivo 慢性CA1イメージングからの代表的な3D再構成。手術直後の画像(図2A)と比較して、ミクログリアはより均一な分布を示し、浮腫と炎症が軽減されるため、DGのより深い層でより明確に観察できます。(C)(B)のミクログリアの典型的な像を、手術面から100、280、500μmの深さで厚さ20μmのGFP画像スタックとして示した。スケールバー、50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4: in vivo イメージング時の海馬の各層を特定するための手がかりと、この方法の適用例。 (a)慢性期のCX3CR1-GFPマウスの肺胞におけるミクログリアの典型的な画像。軸索路に沿って伸びるミクログリア細胞体および突起は、深さ15μmで厚さ10μmのGFP画像スタックのMIPに示されています。スケールバー、50μm。 (B)慢性期のSO、SP、SRのミクログリアの代表的な画像を、厚さ5μmのGFP画像スタックのMIPとして示した。SPの微小グリア突起の局所密度は、SPに密集した錐体ニューロンのために、周囲のSOまたはSRよりもSPの方が低くなります。 スケールバー、100μm。 (C)CA1とDGの境界に沿って走る太い血管は、ミクログリア蛍光によってのみ認識できます。約500μmの深さの慢性期における厚さ90μmのタイル状GFP画像スタックの平均強度投影が示されている。GFP信号のボイドは厚い血管に対応する。スケールバー、500μm。 (D)(上段)SR101の腹腔内注射後のCと同じ視野の画像。スケールバー、500 μm。 (下)SR101注入後のタイリング画像の3D再構成(幅:2.60 mm、高さ:1.73 mm、深さ:0.69 mm)。CA1とDGの境界に沿って走る太い血管は、血管内SR101蛍光によって容易に認識することができる。(E)(左)CA1とDG(幅255 μm、高さ255 μm、深さ730 μm)の3D再構成と(右)厚さ20 μmの画像スタックから作成したSPのGFPとtdTomatoes蛍光のMIP。手術の1週間前に、AAV1-CAG-FLEX-tdトマト(5.0 x 10 12 vg/mL)とAAV1-hSyn-Cre(1.0 x10 9 vg/mL)の混合物1.5 μLをCX3CR1-GFPマウスの海馬に注射し、ニューロンをまばらに標識しました。撮像はPOD 0で行った。SPとGCLは、神経細胞体の位置によって容易に認識されます。スケールバー、50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:慢性期におけるSOミクログリアのタイムラプスイメージング。 GFP画像のMIPは、SOミクログリアのタイムラプスイメージングで20μmの厚さでスタックし、1秒で28分再生するようにアニメーション化します。スケールバー、50 μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:慢性期におけるSRミクログリアのタイムラプスイメージング。 GFP画像のMIPは、SRミクログリアのタイムラプスイメージングで厚さ20μmでスタックし、1秒で28分再生するようにアニメーション化します。スケールバー、50 μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
この方法には精巧な外科的処置が含まれていますが、適切に準備すれば、CA1全体に長期間にわたって高解像度の画像を提供できます。数匹のマウスを用いた実験により、慢性術後期の画質が急性術後イメージングよりも優れていることが確認された。より良い画質は2ヶ月以上維持されました。失敗の最も一般的な原因は、術後の品質チェックで特定される手術中のCA1への意図しない損傷です(ステップ4を参照)。これは、誤嚥による直接的な損傷、脳の乾燥、ガラスによる過度の圧力、または最終ステップでの歯科用セメントからの毒性が原因である可能性があります。失敗のもう一つの原因は術後出血であり、これは手術後1週間以内にガラス底の窓を通して確認することができます(ステップ6.1を参照)。プロトコルを注意深く読み、このようなトラブルを回避するためにすべての予防措置を講じてください。
実験室でGaAsP検出器を備えた2光子顕微鏡の現在のセットアップでも、皮質を通して背側CA1を画像化しようとすると、無視できない光の散乱により解像度が大幅に低下します。したがって、CA1におけるニューロンのミクログリア突起の動きや樹状突起スパインの形成を観察するのに十分な分解能を得るためには、本方法のように、上にある皮質の一部を除去することが避けられない。高い画像解像度を維持しながら皮質除去の程度を減らす唯一の代替方法は、勾配屈折率(GRIN)レンズなどのリレーレンズを埋め込むことです。このアプローチでは、慢性CA1イメージングのためにCA1の真上に埋め込まれたガイドチューブ内にGRINレンズが配置されている28,29。ガイドチューブの外径は1.8mmと、本論文の3.0mmよりも小さいが、本論文のシステムに匹敵する高解像度(NA;0.82)を実現した(実効NA;0.88)。しかし、GRINレンズを用いたアプローチは、高解像度観察のための視野が狭く、GRINレンズのWDによって制限される短い結像深度を有する。したがって、高解像度で広い視野ですべての海馬層をイメージングすることは、この論文の方法の特定の利点です。
この手順の制限は、皮質および炎症の部分的な除去が海馬にいくつかの有害な影響を与える可能性があることである。しかし、除去された皮質は海馬に直接入力されておらず、嗅内皮質は損傷を受けておらず、海馬自体は直接損傷していないため、全体的な評価は海馬の機能障害は有意ではないということです。いくつかの以前の研究では、学習や記憶を含む海馬機能が海馬窓移植後も保存されることが確認されています25,26,27,30,31,32,33,34。したがって、ここで説明するイメージングアプローチは、十分な術後期間の後に海馬機能を忠実に報告することが期待されます。
このイメージング技術に基づく今後の研究課題としては、ミクログリアとニューロンの同時イメージングによるシナプスプルーニングの検出5、シナプスとの学習関連ミクログリア相互作用35、海馬の神経活動によって調節されるミクログリア運動36、末梢炎症や組織損傷に対するミクログリア応答7などが考えられます。.この方法は、神経変性疾患の進行の解明にも役立ちます。例えば、アルツハイマー病(AD)では、アミロイドβおよびタウタンパク質が神経細胞死および海馬萎縮と並行して蓄積し、認知機能障害を引き起こす。ミクログリアがこのプロセスに関与していることが報告されている37,38。ADマウスモデルを用いたミクログリアや神経細胞のin vivo慢性イメージングにより、ADマウスモデルの海馬におけるミクログリア機能と神経病理との相関をモニタリングすることができます。
この論文はミクログリアイメージングに焦点を当てていますが、同じイメージング手順がCA1の他の神経細胞およびグリア細胞タイプに適用できます。さらに、プロトコルは麻酔をかけたマウスのイメージングに限定されていますが、この技術は覚醒マウスの海馬ミクログリアのモニタリングにも拡張できます。呼吸、心拍、体の動きによって引き起こされる運動アーチファクトは、特にガラス窓から離れた海馬の深部層に、覚醒マウスの実験に存在する可能性があります。したがって、ミクログリアの形態とダイナミクスをキャプチャするために、適切な動き補正システムが必要となる場合があります。
議定書に関する議論
時間的および空間的特異性を有する蛍光プローブの発現のために、適切な年齢および遺伝的改変のマウスを選択することをお勧めします(ステップ1.3を参照)。生後1ヶ月のマウスを実験に使用できますが、生後2ヶ月以上のマウスは体格が大きく、手術ストレスに強いため扱いやすいです。さらに、海馬の外部被膜と肺胞は、若いマウスでは分離するのがより困難です。したがって、若いマウスで外部カプセルを除去するには、外科的スキルが必要です(ステップ3.4.3-4を参照)。手術とその後のイメージングの評価は、CA1とDGで蛍光タンパク質を再現性よく均一に発現するマウスでより簡単になります(ステップ4.7を参照)。したがって、手術の初期試験では、Thy1-YFPやThy1-GFPマウス39などのまばらに標識されたニューロンを持つトランスジェニックマウス、またはCX3CR1-GFPマウス24などの標識されたミクログリアを持つマウスを使用することをお勧めします。
手術を成功させるには、麻酔の選択が重要です(ステップ2.1を参照)。さまざまな種類の麻酔は、さまざまな程度の術中脳浮腫を引き起こす可能性があり、手術の難しさ、埋め込まれた金属管の相対位置、およびガラス窓による脳圧迫の程度に影響を与えます。これらの要因は、手術後の海馬ニューロンの生存にも影響を与える可能性があります。
海馬を露出させる吸引プロセス(ステップ3.4を参照)では、脳への損傷を最小限に抑え、イメージングを成功させるために、次の点に注意する必要があります。頭蓋窓の側面に出口を配置することにより、組織表面に滅菌生理食塩水を絶えず供給します。吸引中に組織表面が空気にさらされないようにしてください。組織吸引の基本原理は、吸引チップへの液体の流れによって組織表面を除去することです。吸引チップが組織に直接接触することは避けてください。吸引チューブにかかる負圧を最小に調整します。組織を段階的に吸引し、各ステップで出血が制御されていることを確認します。出血が長引く場合は、出血が自然に止まるまで待ちます。出血スポットから短い距離から吸引を保ち、滅菌生理食塩水を一定に流します。組織を吸引して、ガラス底の金属管に適合するサイズの円筒形の空間を作成します(手順1.1を参照)。太い柱の血管や大きな組織片を吸引するには23 Gの針を選択し、小さな組織の破片を吸引するには25 Gの針を選択します。
Disclosures
どの著者も利益相反を持っていません。
Acknowledgments
XLPLN25XSVMP対物レンズを貸してくださった近藤雅之さん、松崎さんに感謝いたします。本研究は、日本学術振興会(JSPS)から日本学術振興会特別研究員(18J21331から韓国)および科学研究費助成事業(20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895からS.O.)、日本医療研究開発機構(JP19gm1310003およびJP17gm5010003からS.O.)および科学技術振興機構ムーンショットR&D(JPMJMS2024からH.M.)の助成を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G blunt needles | NIPRO | 02-166 | Suction tips for aspiration. |
| 25 G blunt needles | NIPRO | 02-167 | Suction tips for aspiration. |
| 3 mm dermal punches (DermaPunch) | Maruho | 213001610 | Tools for craniotomy. |
| 30 G needles | Dentronics | Disposable needle No. 30 | Tools for craniotomy. |
| A femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | MaiTai Deep See | A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength. |
| A two-photon microscope | Nikon | A1R MP+ | Microscope for the CA1 imaging. |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| AAV1-hSyn-Cre | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| An objective lens for two-photon imaging | Olympus | XLPLN25XSVMP | 25× objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar |
| Aspirators | Shin-ei Industries | KS-500 | Tools for aspiration. |
| Aluminum plates | Narishige | CP-1 | Plates made of alminum for head fixation. |
| Chemical depilatory cream | YANAGIYA | Cream for hair removal around the surgical site. | |
| Circular glass coverslips | Matsunami Glass | 3φ No.1 | Coverslips bonded to stainless steel tubes. |
| CX3CR1-GFP mice | The Jackson Laboratory | 008451 | Transgenic mice for microglial imaging. |
| Cylindrical stainless steel tubes | MORISHITA | Custom-made | Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm. |
| Dental etching material | Sun Medical | 204610461 | Used to etch the skull bones. |
| Dental resin cement (Super-Bond C&B) | Sun Medical | 204610555 | Dental cement. |
| Dura pickers (Micro Points) | Fine Science Tools | 10063-15 | Tools for dura removal. |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11252-20 | Surgical tools. |
| Forceps | Bio Research Center | PRI13-3374 | Used to disinfect the surgical site. |
| Head holding device | Narishige | MAG-2 | The head holding device of mice with angle adjusters |
| Heating pad | Bio Research Center | BWT-100A and HB-10 | Tools to provide thermal support for the mouse during surgery. |
| Heating pad | ALA Scientific | HEATINGPAD-1 and Hot-1 | Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device. |
| Ketamine (Ketalar) | Daiichi Sankyo Company | S9-001665 | Anesthesia during surgery. |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | Analgesia during surgery. |
| Ophthalmic ointment | Sato Pharmaceutical | Used to prevent eye dryness during surgery. | |
| Povidone-iodine scrub solution | Meiji Seika Pharma | 2612701Q1137 | Used to disinfect the surgical site. |
| Round-tipped miniature knives | Surgistar | 4769 | Surgical tools. |
| Scalpel | MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS | 450-098-67 | Disposable surgical tool. |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | S8 APO | Microscopes for surgery. |
| Sterile saline | Otsuka Pharmaceutical Factory | 3311401A2026 | Washing solution during surgery. |
| Sterile waterproof pad | AS ONE | 8-5945-01 | Surgical platform. |
| Sulforhodamine 101 | Sigma-Aldrich | S7635 | A dye for in vivo vessel imaging. |
| Surgical drape | Medline Industries | MP-0606F6T | Perforated drape for surgery. |
| UV light | Toshiba | GL15 | Used to cure the adhesives. |
| UV-curing optical adhesives | Thorlabs | NOA81 | Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes. |
| Xylazine (Celactal 2%) | Bayer | Anesthesia during surgery. |
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