Summary
이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.
Abstract
뇌에 존재하는 유일한 면역 세포인 미세아교세포는 시냅스와 신경 흥분성을 수정하여 신경 회로 유지에 적극적으로 참여합니다. 최근 연구에 따르면 서로 다른 뇌 영역에서 미세아교세포의 차등 유전자 발현과 기능적 이질성이 밝혀졌습니다. 학습과 기억에서 해마 신경망의 독특한 기능은 시냅스 리모델링에서 미세아교세포의 활성 역할과 관련될 수 있습니다. 그러나 외과적 시술에 의해 유도된 염증 반응은 해마 미세아교세포의 이광자 현미경 분석에서 문제가 되었습니다. 여기에서는 이미징 창을 통해 해마 CA1의 모든 층에서 미세아교세포를 만성적으로 관찰할 수 있는 방법이 제시됩니다. 이 방법을 사용하면 1 개월 이상 소교 세포의 형태 학적 변화를 분석 할 수 있습니다. 휴지기 미세아교세포의 장기 고해상도 이미징에는 최소 침습 수술 절차, 적절한 대물 렌즈 선택 및 최적화된 이미징 기술이 필요합니다. 해마 미세아교세포의 일시적인 염증 반응은 수술 직후 영상을 방해할 수 있지만 미세아교세포는 몇 주 이내에 정지 형태를 회복합니다. 또한 미세아교세포와 동시에 뉴런을 이미징하면 해마에서 여러 세포 유형의 상호 작용을 분석할 수 있습니다. 이 기술은 해마의 소교세포 기능에 대한 필수 정보를 제공할 수 있습니다.
Introduction
Microglia는 뇌에 존재하는 유일한 면역 세포와 조직 대 식세포입니다. 염증에 대한 신속한 반응과 같은 면역 세포로서의 기능 외에도 시냅스 가지치기, 시냅스 가소성 조절, 신경 활동 조절과 같은 신경 회로의 유지 및 리모델링에 다양한 생리학적 역할을 하는 것으로 나타났습니다 1,2,3,4,5 . 미세아교세포와 뉴런 사이의 생리학적 상호작용은 신경 회로 발달과 질병 신경생물학 모두에서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 생체 내에서 미세아교세포의 생리를 분석하기 위해서는 조직 손상 및 염증 반응 없이 미세아교세포를 관찰할 수 있는 방법이 필요하다. 그러나 미세아교세포는 염증에 민감하며 조직 손상에 반응하여 모양과 기능을 극적으로 변화시킵니다 6,7.
이광자 생체 내 이미징은 미세아교세포의 생리학적 역학을 포착하기 위한 이상적인 도구이다8. 생체 내 이광자 이미징의 초기 적용은 성인 마우스 피질에서 환경 감시를 위한 소교세포 과정의 동적 움직임을 밝혀냈습니다 9,10. 다음의 이광자 이미징 연구는 뉴런과의 기능적 및 구조적 상호작용 분석을 위해 미세아교세포의 생체 내 모니터링을 추가로 확장했습니다 5,11,12,13,14. 그러나, 종래의 이광자 현미경의 이미징 깊이는 뇌 표면으로부터 1 mm 미만으로 제한되었다(15,16). 이 제약은 해마와 같은 심부 뇌 영역에서 미세아교세포의 행동을 보고한 이전 연구의 부족을 설명합니다.
최근의 RNA 시퀀싱 연구는 미세아교세포의 상당한 지역적 이질성을 밝혀냈고, 뚜렷한 기능적 역할의 가능성을 높였다 17,18,19,20,21. 따라서 다양한 뇌 영역의 뉴런과의 소교세포 상호작용을 기록할 필요가 있지만 기술적인 어려움으로 인해 이러한 연구가 방해를 받고 있습니다. 특히, 시냅스 리모델링에 소교세포의 적극적인 관여는 해마 신경망과 그 기억 관련 기능의 발달에 중요한 것으로 보고되었습니다22,23. 그러나 생체 내에서 도전받지 않은 해마 미세아교세포를 관찰하기 위한 효과적인 방법은 없었습니다.
이 프로토콜은 정밀하게 제어된 수술 기술을 사용하여 등쪽 해마의 CA1에서 휴식 미세아교세포의 만성 생체 내 관찰 절차를 설명합니다. 미세아교세포에서 GFP를 발현하는 CX3CR1-GFP 마우스(CX3CR1+/GFP)의 CA1 영역의 이광자 이미징24는 충분한 분해능으로 CA1의 모든 층에서 분급된 미세아교세포를 관찰할 수 있게 했습니다. 이 프로토콜에는 관찰 창과 적절한 이미징 조건의 성공적인 이식을 위한 몇 가지 팁이 포함되어 있습니다. 또한, CA1에서 피라미드 뉴런과 미세아교세포의 동시 시각화가 응용 사례로 제시됩니다. 이 기술의 장점, 한계 및 잠재력에 대해서도 설명합니다.
Protocol
모든 동물 실험은 도쿄 대학의 동물 윤리위원회와 유전자 재조합 실험 안전위원회의 정책에 따라 승인되고 수행되었습니다. 생후 2-4개월의 수컷과 암컷 CX3CR1-GFP 마우스를 모두 실험에 사용했습니다. 실험자의 안전과 멸균 상태의 유지를 위해 모든 절차는 흰색 코트, 마스크 및 멸균 장갑으로 수행되었습니다. 모든 기구는 사용 전에 멸균되었습니다.
1. 기구 및 동물 준비
- 유리 바닥 금속 튜브를 조립합니다(그림 1A).
- 맞춤형 스테인리스 튜브(외경 3.0mm, 내경 2.8mm, 높이 1.7mm)의 한쪽 끝에 UV 경화 광학 접착제를 소량 떨어뜨립니다. 튜브의 원형 가장자리에 접착제를 균일하게 펴 바릅니다.
알림: 튜브의 전체 가장자리를 덮을 수 있도록 충분한 양의 접착제를 사용해야 합니다. - 금속 튜브의 접착제로 덮인 끝에 원형 유리 커버슬립(직경 3.0mm, 두께 0.15± 0.02mm)을 놓고 커버슬립을 튜브에 가볍게 눌러 튜브와 유리 사이의 틈이 접착제로 채워지도록 합니다. 그런 다음 금속 튜브의 바깥쪽 가장자리에 맞도록 유리의 위치를 조정합니다.
- 접착제를 경화시키기에 충분한 시간 동안 유리에 UV 광을 조사합니다.
알림: 유리와 튜브가 완전히 부착되었는지 확인하십시오. 유착이 불충분하면 수술 후 유리가 떨어져 영상이 나오지 않거나 뇌척수액(CSF)이 누출될 수 있습니다. - 조립된 유리 바닥 금속 튜브를 70% 에탄올로 소독하고 멸균 식염수로 세척하여 이물질을 제거합니다.
- 맞춤형 스테인리스 튜브(외경 3.0mm, 내경 2.8mm, 높이 1.7mm)의 한쪽 끝에 UV 경화 광학 접착제를 소량 떨어뜨립니다. 튜브의 원형 가장자리에 접착제를 균일하게 펴 바릅니다.
- 모든 수술 기구는 건열 살균기로 소독하십시오.
- 창문 이식 수술을 위해 생쥐를 준비하십시오.
참고: 마우스는 적절한 연령이어야 합니다. CA1 및 치아이랑(DG)에서 형광 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된 것이 바람직합니다. 이러한 사항은 토론 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.
2. 마취 및 머리 고정
- 케타민-자일라진(100mg/kg 케타민 및 10mg/kg 자일라진)을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 멜록시캄(2mg/kg)을 수술 전 진통을 위해 피하주사로 투여한다. 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 꼬리 꼬집기와 같은 고통스러운 자극에 대한 반응이 사라지는 것을 확인하십시오. 수술 중 마취가 닳을 때마다, 일반적으로 초기 투여 후 1시간 및 그 후 30분마다 케타민-자일라진을 절반 용량으로 추가합니다. 몸 아래에 가열 패드를 사용하여 열 지원을 제공하고 마취하에 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.
참고: 수술을 위한 마취의 선택은 필수적입니다. 이 점은 토론 섹션에서 자세히 설명합니다. - 두피에서 머리카락을 제거하기 위해 제모 크림을 바르십시오. 포비돈 요오드 스크럽과 알코올로 두피를 원을 그리며 여러 번 소독합니다. 멸균 방수 패드로 준비된 수술 플랫폼에 마우스를 놓고 멸균 커튼을 적용하여 수술 부위를 고정합니다. 그런 다음 메스로 두피를 원형으로 잘라내어 제거하여 정수리와 후두골이 수술 쪽에 완전히 노출되도록 합니다.
- 출혈을 제거하기 위해 멸균 식염수를 바르면서 면봉으로 문질러 피하 결합 조직을 제거합니다. 끝이 둥근 미니어처 나이프로 두개골 표면을 부드럽게 긁어 골막을 제거하면 시멘트와 뼈 사이의 접착력을 강화하는 데 도움이 됩니다(2.6단계 참조).
- 치과용 에칭 재료를 전체 표면에 바르고 수십 초 동안 기다린 다음 충분한 멸균 식염수로 헹굽니다.
- 방수 잉크를 사용하여 제거 할 뼈 영역 (직경 3.0mm, 뒤쪽 약 2.5mm, 브레그마 측면 2.5mm 중심의 원형 영역)을 표시하십시오. 마킹 후 두개골 표면을 완전히 말리십시오.
참고: 개두술의 위치는 해마의 크기에 따라 다르며 다양한 연령대에 맞게 최적화되어야 합니다. 개두술의 위치에 대한 유용한 지표가 아래에 제시됩니다 (3.4.5 단계, 참고 참조). - 두께 1.0mm, 중앙에 직경 5.0mm의 구멍이 있는 직사각형 알루미늄 판을 제조업체의 지침에 따라 치과용 수지 시멘트를 사용하여 두개골에 부착합니다.
- 알루미늄 판이 두개골의 표시된 표면과 평행이 되도록 판 중앙의 구멍을 펜으로 표시된 원형 영역(2.5단계 참조)에 조심스럽게 맞춥니다(그림 1B). 시멘트가 플레이트와 뼈 사이의 모든 틈을 단단히 밀봉하는지 확인하십시오. 시멘트가 충분히 굳을 때까지 약 5분 동안 기다립니다.
- 부착된 플레이트를 통해 각도 조절 장치가 있는 헤드 고정 장치에 마우스를 놓습니다.
3. 관찰 창 이식
알림: 다음 수술 절차는 실체 현미경으로 수행해야 합니다.
- 직경 3.0mm의 피부 펀치를 사용하여 두개골에 원형 홈을 만듭니다. 2.5단계에서 원형 홈과 펜으로 표시된 영역을 맞춥니다. 홈 깊이가 점차 증가하도록 피부 펀치를 부드러운 압력으로 비틀십시오. 홈 깊이가 전체 둘레에 걸쳐 일정한지 자주 확인하십시오.
- 피부 펀치가 두개골의 가장 안쪽 층에 도달하면 밑에 있는 경막을 만지기 전에 30G 바늘을 사용하여 중앙 뼈 섬을 부드럽게 들어 올립니다.
알림: 홈 바닥에서 약간의 액체 누출은 홈이 경막에 가깝다는 것을 나타냅니다. - 경막 피커를 사용하여 경막을 제거합니다.
알림: 두개골 창 내의 경막을 완전히 제거해야 하며 미세 집게를 사용하여 주변의 잔여 경막을 조심스럽게 절제해야 합니다. - 조직을 부드럽게 흡인하여 흡인기에 연결된 23G 또는 25G 무딘 바늘로 해마의 치골을 노출시킵니다.
참고: 이 단계는 성공적인 이미징을 위해 가장 중요합니다. 조직 흡인에 대한 주요 기술적 사항은 토론 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.- 피아와 피알 혈관을 흡인하십시오.
- 표면에서 피질 조직을 흡인합니다. 노출된 조직 표면의 깊이를 전체 두개골 창에서 균일하게 유지하십시오. 외부 캡슐의 섬유가 노출 될 때까지 점차적으로 흡인을 깊게하십시오.
- 흡입 팁을 두개골 창의 외측 끝에 있는 외측 심실(LV) 근처의 외부 캡슐에 조심스럽게 배치합니다. 꼬리 내측에서 외측 방향으로 달리는 외부 캡슐의 표면층을 제거한 다음 내측 방향으로 달리는 내부 층을 제거합니다.
알림: LV 근처의 외부 캡슐은 기본 구조에서 쉽게 제거할 수 있습니다. - 폐포 표면과 등쪽 해마 commissure (DHC)의 전체 노출을 확인하여 전체 외부 캡슐의 제거를 확인하십시오.
알림: DHC는 CA1의 꼬리 내측 부분을 덮습니다. alveus와 DHC는 섬유 방향에 의해 외부 캡슐과 구별 될 수 있습니다. 즉, alveus 및 DHC 내의 섬유는 rostromedial에서 caudolateral 방향으로 달리고, 외부 캡슐의 섬유와 구별 될 수있다. alveus와 DHC는 CA1에 단단히 부착되어 있으며 손상되지 않아야 합니다. 외부 캡슐의 모든 파편은 잔여 파편이 유리 커버 슬립과 alveus에 직접 접촉하는 것을 방지하므로 제거해야합니다. - 출혈이 완전히 멈췄는지 확인하고 두개골 표면 높이까지 멸균 식염수로 구멍을 채 웁니다.
알림: 여기서 시야는 구멍이 마우스의 특정 나이에 적합한 위치에 있는지 판단하는 데 도움이 됩니다. 이상적으로, alveus와 기본 CA1은 중앙 영역의 대부분을 차지해야합니다. DHC의 일부는 꼬리 내측 영역에서 볼 수 있습니다. 좌심실의 개방은 외측 가장자리에서 감지할 수 있습니다(그림 3A).
- 유리 바닥 금속 튜브(1.1단계 참조)를 구멍에 수직으로 삽입하면서 유리 바닥이 폐포를 가볍게 누르고 기본 CA1을 부분적으로 평평하게 할 때까지 튜브 측면에서 넘쳐나는 과도한 물을 흡입합니다.
알림: 이 압력은 적절하게 조정해야 합니다. 너무 강하면 CA1이 손상됩니다. 너무 약하면 CA1의 곡률로 인한 구면 수차가 깊은 구조에서 이미징 해상도를 손상시킵니다. - 치과용 수지 시멘트를 사용하여 삽입된 튜브의 벽을 주변 두개골에 고정합니다(그림 1C). 전체 둘레가 단단히 밀봉되어 있고 공기나 CSF가 누출되지 않았는지 확인하십시오. 시멘트가 굳을 때까지 약 5분 동안 기다립니다.
참고: 점도가 낮을 때 시멘트를 놓으면 튜브와 두개골 사이의 틈을 통해 뇌 실질로 누출되어 뇌가 손상될 수 있습니다. 따라서 시멘트는 중합 개시 후에 도포되어야 하며, 이는 점도를 증가시키고 갭을 통한 누출을 감소시킵니다. - 플레이트 전체, 두개골 및 튜브 내부를 멸균 식염수로 세척하여 이물질을 제거합니다.
4. 수술 직후 이광자 현미경 검사로 수술 품질 검사
- 마우스를 이광자 현미경의 대물 렌즈 아래에 있는 헤드 홀딩 장치에 놓고 전동 XY 스캐닝 스테이지에 놓습니다. 열 지원을 위해 가열 패드를 사용하십시오. 이 품질 검사는 최대 2.1분이 소요될 수 있으므로 30단계에 설명된 대로 마취 깊이를 모니터링하고 조정합니다.
알림: 작동 거리(WD)가 3mm보다 길고 개구수(NA)가 높은 침수 대물 렌즈를 사용하는 것이 좋습니다. 대물 렌즈의 보정 칼라는 유리와 생체 재료 사이의 굴절률 불일치를 보상하여 해상도를 향상시킬 수 있습니다. - 유리와 대물 렌즈 사이의 공간을 물로 채우고 기포가 발생하지 않도록 각별히 주의하십시오. 필요한 경우 대물렌즈의 전면 렌즈 전체를 덮을 수 있도록 더 많은 물을 담고 있는 플라스틱 필름을 사용하여 금속판의 면적을 확장합니다.
- 뇌에서 발현되는 형광 프로브의 여기를 위해 920nm 파장의 펨토초 펄스 레이저를 켜고 이미지 획득 소프트웨어를 시작합니다.
- 전동 스테이지와 전동 초점 시스템을 사용하여 CA1에 초점을 맞춥니다. 펄스 레이저에 의한 지속적인 조명 아래 뇌 실질에서 방출되는 형광과 금속 튜브 가장자리에서 반사된 빛의 안내로 대상 구조를 배치합니다.
- 전동식 초점 시스템으로 초점을 조정하여 유리 바닥에 닿는 뇌 실질의 깊이를 측정합니다. 서로 다른 수평 위치의 깊이를 비교하여 유리 바닥과 이미징 평면의 정렬을 판단합니다.
- 유리 바닥이 이미징 평면과 평행하게 설정될 때까지 헤드 고정 장치를 기울여 마우스 헤드의 각도를 조정합니다.
- 대물렌즈의 보정환을 조정하여 CA1의 대상 구조 깊이에서 가장 높은 해상도를 달성합니다.
- 유리 바닥에서 500 μm의 깊이에서 DG 상부 블레이드의 분자층(ML)에 있는 형광 세포가 전체 시야에서 이미지화될 수 있음을 확인합니다.
참고: 이 단계는 수술의 질을 판단하는 데 중요합니다. CA1이 손상되면 국소 뇌 부종으로 인해 표면에서 200μm 이상의 깊이에서 형광 검출이 방지됩니다. CA1에 손상이 없고 CA1 층의 곡률이 위에 놓인 커버슬립에 의해 적절하게 평평해진 경우에만 수술 직후 DG 신호를 감지할 수 있습니다(그림 2A-D). 대표 결과 섹션에서는 CA1과 DG 사이의 경계를 결정하는 간단한 방법을 제공합니다.
5. 수술 후 관리
- 튜브 내부의 물을 흡입하고 이물질이 들어가지 않도록 플라스틱 씰로 덮습니다.
- 마우스를 따뜻하게 유지하고 마취에서 회복 될 때까지 기다리십시오.
- 마우스가 통증 관련 행동을 보이는 한 24시간마다 멜록시캄(2mg/kg)을 피하 투여합니다.
- 몇 주 동안 개별 하우징에서 수술 후 마우스를 들어 올립니다.
6. CX3CR1-GFP 마우스를 사용한 미세아교세포의 생체 내 만성 이광자 이미징
- 마취 유도 후 금속 튜브 내부를 멸균 식염수로 세척하여 이물질을 제거합니다. 해마의 흰색 폐포가 유리를 통해 보이는지(그림 3A) 수술 후 출혈과 같은 합병증이 없는지 확인합니다.
- 4.1-4.6단계에 따라 이광자 현미경 아래에서 마우스를 설정합니다.
- 해마의 이광자 여기로 얻은 이미지의 품질과 강도를 확인합니다(그림 3B). 수술 후 부종이 감소한 후 촬영한 이미지가 수술 당일에 촬영한 이미지와 비슷하거나 더 나은지 확인합니다(그림 2A, 4.5단계 참조).
참고: 이미지 열화는 뇌 내부의 조직 손상이 있음을 나타냅니다. - 미세아교세포가 이미 파급된 형태를 회복했는지 확인합니다(그림 3C).
참고: 미세아교세포의 영상 데이터는 미세아교세포가 기저 상태로 돌아가는 데 최소 3-4주가 필요함을 나타냅니다. - 실험의 특정 목적을 위해 CA1의 임의의 층에서 생체 내 이미징을 수행한다.
Representative Results
이 기술을 사용하면 특히 염증이 가라앉는 수술 후 3-4주 후에 오리엔스층(SO), 피라미드층(SP), 라디아툼층(SR) 및 라쿠노섬-몰라큘라어층(SLM)을 포함한 등쪽 CA1의 모든 층에서 분출 및 정지 미세아교세포를 만성적으로 관찰할 수 있습니다. 수술이 적절하게 수행되면 수술 후 최대 몇 개월까지 영상을 촬영할 수 있습니다. 이 섹션에는 생체 내 영상 평가에 유용한 세 가지 주제가 포함되어 있습니다. 첫째, 수술 직후와 만성 단계의 샘플 이미지가 적절한 수술 및 이미징 절차에 대한 참조로 제공됩니다. 둘째, 미세아교세포의 뚜렷한 형태, 형광 강도 및 특정 해마층의 혈관 분포를 설명하여 독자가 폐포에서 DG에 이르는 이미징 깊이를 추정하는 데 도움이 됩니다. 셋째, 뉴런과 미세아교세포의 동시 이미징을 보여주는 응용 예가 제공됩니다.
수술 직후 CX3CR1-GFP 마우스에서 미세아교세포의 대표 이미지를 그림 2에 나타내었다. CA1에 명백한 손상이 없고 CA1 층의 곡률이 위에 놓인 커버슬립에 의해 적절하게 평평해지면 미세아교세포의 이광자 이미징 깊이가 전체 CA1 층을 초과하고 DG의 ML 또는 과립 세포층(GCL)이 존재하는 수술 표면에서 500μm에 도달합니다(그림 2A, 단계 4.7 및 그림 4E 참조)). Microglia는 특히 손상되지 않은 해마에 있는 층과 비교하여 수술 표면에 가까운 층에서 약간 덜 파급됩니다. 그럼에도 불구하고 눈에 띄는 활성화를 나타내지 않아 적절한 수술 절차를 시사합니다(그림 2B). 한편, 조직 손상에 의해 유도된 CA1의 부종은 영상 깊이를 200 μm로 제한한다(도 2C). 조직 손상은 또한 유리 조직 표면을 향한 부풀어 오른 과정의 축적과 같은 비정상적인 소교세포 활성화를 유도합니다(그림 2D, 그림 2B의 상단 이미지와 비교). 이것은 부적절한 수술의 징후입니다.
수술 후 3주 이상 경과한 만성기의 미세아교세포의 대표적인 이미지를 도 3에 나타내었다. Microglia는 CA1을 넘어 더 높은 형광 강도와 분해능과 더 균일한 분포로 DG의 더 깊은 층으로 다시 이미지화할 수 있습니다(6.3단계, 그림 3B 참조). 영상 품질은 수술 직후보다 우수합니다(그림 2A). 이 차이는 부종과 염증 감소로 설명 될 수 있습니다. 모든 층의 미세아교세포는 이미 수술 후 모습과 다른 파급 형태(그림 3C)를 복원했습니다(그림 2B). CA1에서 미세아교세포의 타임랩스 이미징은 움직이지 않는 세포체와 감시를 위한 운동성이 높은 과정을 보여줍니다(비디오 1-2). 그들의 운동성 행동은 피질의 소교세포 과정 역학에 대한 이전 보고와 유사합니다9.
해마 뉴런25,26,27에서 형광 프로브를 발현하는 마우스를 사용하여 뉴런 세포체의 분포와 깊이에 따라 이미지화 된 해마 층을 지정하는 것은 간단합니다. 뉴런 세포체에 대한 위치 정보의 도움 없이, 형광 미세아교세포의 신호만으로도 해마층 식별에 대한 몇 가지 단서를 제공합니다(그림 3B). alveus의 Microglia는 축삭 관을 따라 확장되는 경향이있는 길쭉한 세포체와 과정을 가지고 있습니다 (그림 4A). 다른 층의 미세 아교 세포는 둥근 세포체와 선호하는 방향없이 방사되는 과정으로 구별 될 수 있습니다. SP의 미세 아교 세포는 조밀하게 채워진 피라미드 뉴런 중 하나이며 미세 아교 세포의 밀도가 낮기 때문에 구별 할 수 있습니다. SP의 위와 아래의 레이어는 각각 SO 및 SR로 식별됩니다 (그림 4B). 소교세포 특성만으로는 SR과 SLM을 구별할 수 없습니다. CA1과 DG 사이의 경계는 경계를 따라 흐르는 두꺼운 혈관에 의해 인식됩니다(그림 4C). 이러한 혈관은 복강 주사된 설포로다민 101(SR101, 5mM, 4μL/g 체중)과 같은 염료로 용기를 라벨링하여 더 잘 인식할 수 있습니다(그림 4D). 미세아교세포의 형광 신호는 위에 있는 CA1에 비해 DG에서 급격히 떨어지는데, 이는 아마도 이러한 구조의 굴절률 차이 때문일 것입니다. 형광 강도의 이러한 차이는 DG와 CA1 사이의 경계를 지정하는 데에도 도움이 될 수 있습니다. 응용 사례로서, GFP 양성 미세아교세포와 tdTomato로 표지된 피라미드 뉴런의 동시 이미징이 표시됩니다(그림 4E). 이 실험에서 CX3CR1-GFP 마우스는 해마 피라미드 뉴런에서 tdTomato의 발현을 위해 아데노 관련 바이러스(AAV)를 주사했습니다. 뉴런 라벨링은 CA1의 정확한 층 구조를 이해하는 데 도움이 됩니다.
그림 1: 관찰 창 이식을 위한 개략 도. (A) 조립된 유리 바닥 금속 튜브의 단면도. 원형 유리 커버슬립이 원통형 스테인리스 튜브의 한쪽 끝에 부착됩니다. (B) 두개골에 부착된 알루미늄 판의 단면도. 플레이트는 초점을 맞추기 위해 플레이트 가까이에 위치한 대물 렌즈를 방해하지 않도록 두개골의 표시된 표면과 평행해야 합니다. (C) 이식된 튜브의 단면도. 유리 바닥은 해마의 폐포에 밀접하게 부착되어 CA1의 표면을 부드럽게 누르고 평평하게 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수술 직후 CX3CR1-GFP 마우스에서 미세아교세포의 생체 내 이미징. (A) 수술 후 (POD) 0 (너비: 511 μm, 높이: 511 μm, 깊이: 550 μm)에 CX3CR1-GFP 마우스의 생체 내 CA1 이미징으로부터의 대표적인 3D 재구성. 유리 바닥으로부터 500 μm의 깊이에 있는 DG의 ML에 있는 형광 미세아교세포는 전체 CA1을 통해 이미지화될 수 있다. (B) (A)에서 얻은 일반적인 GFP 충전 미세아교세포는 유리 바닥에서 100, 300 및 520μm 깊이에서 20μm 두께의 이미지 스택의 최대 강도 투영(MIP)으로 표시됩니다. 소교세포 형태는 DG의 표면 CA1에서 ML까지 감지할 수 있지만 DG에서 명백한 이미지 열화가 있습니다. 특히 수술 표면에 가까운 층의 미세아교세포는 덜 파쇄되지만 뚜렷한 활성화를 나타내지 않습니다. 스케일 바, 50 μm. (C) 외과적으로 손상된 CA1의 대표적인 3D 이미지 재구성. 데이터는 POD 0(너비: 399μm, 높이: 399μm, 깊이: 450μm)의 CX3CR1-GFP 마우스에서 수집되었습니다. 소교세포 형광은 500μm 깊이에서 형광 미세아교세포가 검출된 손상되지 않은 CA1(A)과 달리 200μm 깊이까지만 검출할 수 있습니다. (D) (C)에서 비정상적으로 활성화된 미세아교세포의 전형적인 이미지. 60μm 깊이에서 20μm 두께의 GFP 이미지 스택의 MIP는 외과적으로 노출된 조직 표면으로 확장되는 소교세포 돌출 과정을 보여줍니다. 전체적인 소교세포 형태는 (B)에 도시된 이미지와 상이하다. 스케일 바, 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 만성기의 CX3CR1-GFP 마우스에서 미세아교세포의 생체 내 이미징. (A) 만성기의 오른쪽 등쪽 CA1에 이식된 창의 대표적인 모습. 유리 바닥을 통해 alveus의 흰색 섬유가 수술 후 출혈없이 명확하게 관찰됩니다. DHC와 LV는 각각 꼬리내측 영역과 외측 가장자리에서 부분적으로 볼 수 있습니다. 스케일 바, 1mm. (B) POD 24에서 CX3CR1-GFP 마우스의 생체 내 만성 CA1 이미징의 대표적인 3D 재구성(너비: 511μm, 높이: 511μm, 깊이: 670μm). 수술 직후의 이미지(그림 2A)와 비교하여 미세아교세포는 부종과 염증의 감소로 인해 DG의 더 깊은 층에서 더 균일한 분포를 보여주고 더 명확하게 관찰할 수 있습니다. (C) 완전히 복원된 파급 형태가 있는 (B)의 미세아교세포의 일반적인 이미지는 수술 표면에서 100, 280 및 500μm 깊이에서 20μm 두께의 GFP 이미지 스택의 MIP로 표시됩니다. 스케일 바, 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 생체 내 이미징 중 해마의 각 층을 식별하기 위한 단서 및 이 방법의 적용 예. (A) 만성기의 CX3CR1-GFP 마우스의 폐포에서 미세아교세포의 전형적인 이미지. 축삭 관을 따라 확장되는 소교세포 세포체 및 과정은 15μm 깊이에서 10μm 두께의 GFP 이미지 스택의 MIP에 표시됩니다. 스케일 바, 50μm. (B) 5μm 두께의 GFP 이미지 스택의 MIP로 표시된 만성기의 SO, SP 및 SR에서 미세아교세포의 대표 이미지. 소교 세포의 국소 밀도는 SP의 조밀하게 채워진 피라미드 뉴런으로 인해 주변 SO 또는 SR보다 SP에서 더 낮습니다. 스케일 바, 100 μm. (C) CA1과 DG 사이의 경계를 따라 흐르는 두꺼운 혈관은 소교 형광에 의해서만 인식 될 수 있습니다. 약 500μm 깊이의 만성 단계에서 90μm 두께의 타일링된 GFP 이미지 스택의 평균 강도 투영이 표시됩니다. GFP 신호의 공극은 두꺼운 용기에 해당합니다. 스케일 바, 500 μm. (D) (위) SR101의 복강 주사 후 C와 동일한 시야의 이미지. 스케일 바, 500 μm. (아래) SR101 주입 후 타일링 이미지의 3D 재구성(너비: 2.60mm, 높이: 1.73mm, 깊이: 0.69mm). CA1과 DG 사이의 경계를 따라 흐르는 두꺼운 혈관은 혈관 내 SR101 형광으로 쉽게 인식할 수 있습니다. (E) (왼쪽) CA1 및 DG(폭: 255μm, 높이: 255μm, 깊이: 730μm)의 3D 재구성 및 (오른쪽) 20μm 두께의 이미지 스택으로 만든 SP에서 GFP 및 tdTomato 형광의 MIP. 수술 1주일 전, AAV1-CAG-FLEX-tdTomato(5.0 x 10 12 vg/mL)와 AAV1-hSyn-Cre(1.0 x10 9 vg/mL)의 혼합물 1.5μL를 CX3CR1-GFP 마우스의 해마에 주입하여 뉴런을 드물게 라벨링했습니다. 이미징은 POD 0에서 수행되었습니다. SP와 GCL은 신경 세포체의 위치에 의해 쉽게 인식됩니다. 스케일 바, 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 만성기에서 SO 미세아교세포의 타임랩스 영상. GFP 이미지의 MIP는 SO 미세아교세포의 타임랩스 영상에서 20μm 두께로 쌓여 28분이 1초에 재생되도록 애니메이션화되었습니다. 스케일 바, 50 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 만성기에서 SR 미세아교세포의 타임랩스 영상. GFP 이미지의 MIP는 SR 미세아교세포의 타임랩스 영상에서 20μm 두께로 쌓여 28분이 1초에 재생되도록 애니메이션되었습니다. 스케일 바, 50 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 방법에는 정교한 수술 절차가 포함되어 있지만 적절하게 준비하면 오랜 기간 동안 전체 CA1에 걸쳐 고해상도 이미지를 제공할 수 있습니다. 여러 생쥐를 대상으로 한 실험에서 만성 수술 후 단계의 이미지 품질이 급성 수술 후 영상보다 우수하다는 것이 확인되었습니다. 더 나은 이미지 품질은 2 개월 이상 유지되었습니다. 실패의 가장 흔한 원인은 수술 중 CA1의 의도하지 않은 손상이며, 이는 수술 후 품질 검사에서 확인됩니다(4단계 참조). 이것은 흡인에 의한 직접적인 손상, 뇌의 건조, 유리에 의한 과도한 압력 또는 최종 단계에서 치과용 시멘트의 독성 때문일 수 있습니다. 실패의 또 다른 원인은 수술 후 출혈이며, 수술 후 1 주일 이내에 유리 바닥 창을 통해 확인할 수 있습니다 (6.1 단계 참조). 프로토콜을 주의 깊게 읽고 이러한 문제를 피하기 위해 모든 예방 조치를 취하십시오.
현재 실험실에서 GaAsP 검출기를 사용하는 이광자 현미경을 설정하더라도 피질을 통해 등쪽 CA1을 이미지화하려는 시도는 무시할 수 없는 빛의 산란으로 인해 해상도가 크게 손실됩니다. 따라서, CA1에서 소교 세포의 움직임 또는 뉴런의 수지상 가시의 형성을 관찰하기에 충분한 해상도를 얻기 위해, 본 방법에서와 같이 위에 놓인 피질의 일부를 제거하는 것이 불가피하다. 높은 이미지 해상도를 유지하면서 피질 제거 정도를 줄이는 유일한 대안은 GRIN(Gradient Refractive Index) 렌즈와 같은 릴레이 렌즈를 내장하는 것입니다. 이 접근법에서, GRIN 렌즈는 만성 CA1 이미징28,29을 위해 CA1 바로 위에 이식된 가이드 튜브 내부에 배치되었습니다. 가이드 튜브의 외경은 1.8mm로 본 논문의 3.0mm보다 작으면서도 여기 시스템에 필적하는 고해상도(NA; 0.82)를 생성했습니다(유효 NA; 0.88). 그러나 GRIN 렌즈를 사용한 접근 방식은 고해상도 관찰을 위한 좁은 시야와 GRIN 렌즈의 WD에 의해 제한되는 짧은 이미징 깊이를 가지고 있습니다. 따라서 넓은 시야에서 모든 해마층을 고해상도로 이미징하는 것이 이 논문의 방법의 구체적인 장점입니다.
이 절차의 한계는 피질과 염증의 부분적 제거가 해마에 해로운 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 그러나 제거 된 피질은 해마에 직접적인 입력이 없기 때문에 내후각 피질이 손상되지 않고 해마 자체가 직접 손상되지 않기 때문에 전반적인 평가는 해마의 기능 손상이 크지 않다는 것입니다. 이전의 여러 연구에서 학습과 기억을 포함한 해마 기능이 해마 창 이식 후 보존된다는 것이 확인되었습니다 25,26,27,30,31,32,33,34. 따라서 여기에 설명된 이미징 접근법은 수술 후 충분한 기간 후에 해마 기능을 충실하게 보고할 것으로 예상됩니다.
이 영상화 기법을 기반으로 한 연구 대상의 향후 방향에는 미세아교세포와 뉴런의 동시 영상화에 의해 검출되는 시냅스 가지치기(synaptic pruning)5, 시냅스(synapses)와 학습과 관련된 소교세포(microglial interaction)35, 해마(hippocampal) 신경활동(hippocampal neural activity)36에 의해 조절되는 소교세포 운동성(microglial motility)36, 말초 염증 또는 조직 손상에 대한 소교세포반응(microglial responses to peripheral inflammation to peripheral retins)7 등이 있다. 이 방법은 또한 신경 퇴행성 질환의 진행을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 알츠하이머 병 (AD)에서 아밀로이드 β 및 타우 단백질은 신경 세포 사멸 및 해마 위축과 병행하여 축적되어인지 기능 장애를 유발합니다. 미세아교세포는 이 과정에 관여하는 것으로 보고되었다37,38. AD 마우스 모델을 사용한 미세아교세포 및 뉴런의 생체 내 만성 이미징을 통해 AD 마우스 모델의 해마에서 소교세포 기능과 뉴런 병리 사이의 상관관계를 모니터링할 수 있습니다.
이 논문은 소교세포 이미징에 초점을 맞추고 있지만 동일한 이미징 절차가 CA1의 다른 신경 및 신경교 세포 유형에도 적용됩니다. 또한, 프로토콜은 마취된 마우스의 이미징으로 제한되지만, 이 기술은 깨어 있는 마우스에서 해마 미세아교세포를 모니터링하는 데까지 확장될 수도 있습니다. 호흡, 심장 박동 및 신체 움직임에 의해 유도 된 운동 인공물, 특히 유리창에서 멀리 떨어진 깊은 해마 층에서 깨어있는 쥐를 대상으로 한 실험에 존재할 수 있습니다. 따라서 소교세포의 형태와 역학을 포착하기 위해 적절한 동작 보정 시스템이 필요할 수 있습니다.
의정서 관련 논의
시간적 및 공간적 특이성을 갖는 형광 프로브의 발현을 위해 적절한 연령과 유전자 변형을 가진 마우스를 선택하는 것이 좋습니다 (1.3 단계 참조). 생후 1개월의 마우스는 실험에 사용할 수 있지만 2개월 이상 된 마우스는 몸집이 크고 수술 스트레스에 대한 저항력이 있어 다루기가 더 쉽습니다. 또한, 외부 캡슐과 해마의 폐포는 어린 생쥐에서 분리하기가 더 어렵습니다. 따라서 어린 생쥐에서 외부 캡슐을 제거하려면 수술 기술이 필요합니다 (3.4.3-4 단계 참조). 수술 및 후속 이미징의 평가는 CA1 및 DG에서 형광 단백질을 재현 가능하고 균일하게 발현하는 마우스로 더 간단할 것입니다(4.7단계 참조). 따라서, 수술의 초기 시험에서, Thy1-YFP 또는 Thy1-GFP 마우스(39)와 같이 드물게 표지된 뉴런을 가진 형질전환 마우스를 사용하는 것이 바람직하며, CX3CR1-GFP 마우스(24)와 같이 표지된 미세아교세포를 갖는 마우스를 사용하는 것이 바람직하다.
성공적인 수술을 위해서는 마취의 선택이 중요합니다 (2.1 단계 참조). 다양한 유형의 마취는 수술의 난이도, 이식된 금속관의 상대적 위치, 유리창에 의한 뇌 압박 정도에 영향을 미치는 다양한 정도의 수술 중 뇌부종을 유발할 수 있습니다. 이러한 요인은 또한 수술 후 해마 뉴런의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다.
해마를 노출시키는 흡인 과정(3.4단계 참조)에서 뇌 손상을 최소화하고 성공적인 이미징을 보장하기 위해 다음 사항에 유의해야 합니다. 두개골 창 측면에 배출구를 배치하여 조직 표면에 멸균 식염수를 지속적으로 공급하십시오. 흡인 중에 조직 표면이 공기에 노출되는 것을 방지하십시오. 조직 흡인의 기본 원리는 흡입 팁으로의 액체 흐름에 의해 조직 표면을 제거하는 것입니다. 흡입 팁이 조직에 직접 닿지 않도록 해야 합니다. 흡입 튜브에 가해지는 음압을 최소로 조정하십시오. 조직을 단계별로 흡인하고 각 단계에서 출혈이 조절되는지 확인합니다. 출혈이 길어지면 출혈이 자발적으로 멈출 때까지 기다리십시오. 멸균 식염수의 일정한 흐름으로 출혈 부위에서 가까운 거리에서 흡인을 유지하십시오. 조직을 흡인하여 유리 바닥 금속 튜브에 크기가 맞는 원통형 공간을 만듭니다(1.1단계 참조). 두꺼운 피알 혈관이나 큰 조직 조각을 흡인하려면 23G 바늘을, 작은 조직 파편을 흡입하려면 25G 바늘을 선택하십시오.
Disclosures
저자 중 누구도 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
XLPLN25XSVMP 대물렌즈를 빌려주신 M. Kondo와 M. Matsuzaki에게 감사드립니다. 이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (JSPS)의 재정 지원을 받았으며 JSPS 연구원 (18J21331에서 R.K.로) 및 과학 연구 보조금 (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895에서 SO), 일본 의학 연구 개발기구 (JP19gm1310003 및 JP17gm5010003에서 SO), 그리고 Moonshot R & D (JPMJMS2024에서 H.M.)의 일본 과학 기술기구.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G blunt needles | NIPRO | 02-166 | Suction tips for aspiration. |
| 25 G blunt needles | NIPRO | 02-167 | Suction tips for aspiration. |
| 3 mm dermal punches (DermaPunch) | Maruho | 213001610 | Tools for craniotomy. |
| 30 G needles | Dentronics | Disposable needle No. 30 | Tools for craniotomy. |
| A femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | MaiTai Deep See | A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength. |
| A two-photon microscope | Nikon | A1R MP+ | Microscope for the CA1 imaging. |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| AAV1-hSyn-Cre | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| An objective lens for two-photon imaging | Olympus | XLPLN25XSVMP | 25× objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar |
| Aspirators | Shin-ei Industries | KS-500 | Tools for aspiration. |
| Aluminum plates | Narishige | CP-1 | Plates made of alminum for head fixation. |
| Chemical depilatory cream | YANAGIYA | Cream for hair removal around the surgical site. | |
| Circular glass coverslips | Matsunami Glass | 3φ No.1 | Coverslips bonded to stainless steel tubes. |
| CX3CR1-GFP mice | The Jackson Laboratory | 008451 | Transgenic mice for microglial imaging. |
| Cylindrical stainless steel tubes | MORISHITA | Custom-made | Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm. |
| Dental etching material | Sun Medical | 204610461 | Used to etch the skull bones. |
| Dental resin cement (Super-Bond C&B) | Sun Medical | 204610555 | Dental cement. |
| Dura pickers (Micro Points) | Fine Science Tools | 10063-15 | Tools for dura removal. |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11252-20 | Surgical tools. |
| Forceps | Bio Research Center | PRI13-3374 | Used to disinfect the surgical site. |
| Head holding device | Narishige | MAG-2 | The head holding device of mice with angle adjusters |
| Heating pad | Bio Research Center | BWT-100A and HB-10 | Tools to provide thermal support for the mouse during surgery. |
| Heating pad | ALA Scientific | HEATINGPAD-1 and Hot-1 | Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device. |
| Ketamine (Ketalar) | Daiichi Sankyo Company | S9-001665 | Anesthesia during surgery. |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | Analgesia during surgery. |
| Ophthalmic ointment | Sato Pharmaceutical | Used to prevent eye dryness during surgery. | |
| Povidone-iodine scrub solution | Meiji Seika Pharma | 2612701Q1137 | Used to disinfect the surgical site. |
| Round-tipped miniature knives | Surgistar | 4769 | Surgical tools. |
| Scalpel | MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS | 450-098-67 | Disposable surgical tool. |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | S8 APO | Microscopes for surgery. |
| Sterile saline | Otsuka Pharmaceutical Factory | 3311401A2026 | Washing solution during surgery. |
| Sterile waterproof pad | AS ONE | 8-5945-01 | Surgical platform. |
| Sulforhodamine 101 | Sigma-Aldrich | S7635 | A dye for in vivo vessel imaging. |
| Surgical drape | Medline Industries | MP-0606F6T | Perforated drape for surgery. |
| UV light | Toshiba | GL15 | Used to cure the adhesives. |
| UV-curing optical adhesives | Thorlabs | NOA81 | Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes. |
| Xylazine (Celactal 2%) | Bayer | Anesthesia during surgery. |
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