Summary
Mikro ve nanoplastiklerin (sırasıyla MP'ler ve NP'ler) oluşumunu ve boyutsal karakterizasyonunu, kademeli bir mekanik frezeleme, taşlama ve görüntüleme analizi süreci kullanarak gösteriyoruz.
Abstract
Tarımsal ekosistemlerde dağılmış mikroplastikler (MP'ler) ve nanoplastikler (NP'ler) toprakta ve yakındaki su yollarında biyota için ciddi bir tehdit oluşturabilir. Ek olarak, NP'ler tarafından adsorbe edilen pestisitler gibi kimyasallar toprak organizmalarına zarar verebilir ve potansiyel olarak besin zincirine girebilir. Bu bağlamda, plastik malç filmleri gibi tarımsal olarak kullanılan plastikler, tarımsal ekosistemlerdeki plastik kirliliğine önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır. Bununla birlikte, kader ve ekotoksisite ile ilgili en temel çalışmalar, polistiren mikrosferleri gibi idealize edilmiş ve zayıf temsili MP malzemeleri kullanmaktadır.
Bu nedenle, burada açıklandığı gibi, bu tür çalışmalar için temsili milletvekilleri ve NP'leri mekanik olarak oluşturmak için laboratuvar ölçeğinde çok adımlı bir prosedür geliştirdik. Plastik malzeme, kriyojenik arıtma (CRYO) veya çevresel ayrışma (W) yoluyla kırılganlaştırılan polibütirat adipat-ko-tereftalatın (PBAT) ticari olarak temin edilebilen plastik malç filmlerinden ve işlenmemiş PBAT peletlerinden hazırlanmıştır. Plastik malzemeler daha sonra 46-840 μm boyutunda milletvekilleri oluşturmak için mekanik frezeleme ile işlendi ve plastik parçaların rüzgar ve mekanik makineler tarafından aşınmasını taklit etti. Milletvekilleri daha sonra daha fazla analiz sağlamak için birkaç boyut fraksiyonuna elendi. Son olarak, 106 μm elek fraksiyonu, karasal milletvekilleri için yavaş boyut küçültme işlemini taklit eden bir işlem olan 20-900 nm'lik NP'ler üretmek için ıslak taşlamaya tabi tutuldu. Milletvekilleri için boyutlar ve şekil, stereomikrografların görüntü analizi ile belirlendi ve NP'ler için parçacık boyutunu değerlendirmek için dinamik ışık saçılması (DLS) kullanıldı. Bu süreçle oluşturulan milletvekilleri ve NP'ler, tarım alanlarından kurtarılan milletvekillerinin geometrik özelliklerine uygun düzensiz şekillere sahipti. Genel olarak, bu boyut küçültme yöntemi, tarımsal özel mahsul üretimi için kullanılan malç malzemelerini temsil eden polibütilen adipat-ko-tereftalat (PBAT) gibi biyolojik olarak parçalanabilen plastiklerden oluşan milletvekilleri ve NP'ler oluşturmak için etkili olduğunu kanıtladı.
Introduction
Son yıllarda, hızla artan küresel plastik üretimi ve plastik atıkların uygun olmayan şekilde bertaraf edilmesi ve geri dönüşüm eksikliği, deniz ve karasal ekosistemleri etkileyen çevre kirliliğine yol açmıştır 1,2,3. Plastik malzemeler, çağdaş tarım için, özellikle sebzeleri, küçük meyveleri ve diğer özel mahsulleri yetiştirmek için gereklidir. Malç filmleri, yüksek ve alçak tünel kaplamaları, damlama bandı ve diğer uygulamalar olarak kullanımları, mahsul verimini ve kalitesini artırmayı, üretim maliyetlerini düşürmeyi ve sürdürülebilir tarım yöntemlerini teşvik etmeyi amaçlamaktadır 4,5. Bununla birlikte, "plastikültür" ün artan istihdamı, plastik parçaların tarımsal ortamlarda oluşumu, dağıtımı ve tutulması ile ilgili endişeleri artırmıştır. Hizmet ömrü boyunca çevresel bozulma yoluyla gevrekleşmenin neden olduğu sürekli bir parçalanma işleminden sonra, daha büyük plastik parçaları, toprakta devam eden veya su akışı ve rüzgar yoluyla bitişik su yollarına göç eden mikro ve nanoplastikler (MNP'ler) oluşturur 6,7,8. Güneş ışığı yoluyla ultraviyole (UV) radyasyonu, suyun mekanik kuvvetleri ve biyolojik faktörler gibi çevresel faktörler, çevresel olarak dağılmış plastiklerin plastik gevrekleşmesini tetikler ve bu da daha büyük plastik parçaların makro veya mezo-plastik parçacıklara parçalanmasına neden olur 9,10. Daha fazla birleştirme, ortalama büyüklükteki parçacıkları (nominal çap; dp) sırasıyla 1-5000 μm ve 1-1000 nm,11. Bununla birlikte, NP'ler için üst dp sınırı (yani, milletvekilleri için bir alt sınır) evrensel olarak kabul edilmemiştir ve birkaç makalede bu 100 nm12 olarak listelenmiştir.
Plastik atıklardan elde edilen MNP'ler, toprak sağlığı ve ekosistem hizmetleri için ortaya çıkan küresel bir tehdit oluşturmaktadır. Ağır metallerin tatlı sudan milletvekilleri tarafından adsorpsiyonu, çevredeki ortama kıyasla 800 kat daha yüksek ağır metal konsantrasyonuna yol açtı13. Ayrıca, sucul ekosistemlerdeki milletvekilleri, ışık penetrasyonunu değiştirerek, oksijen tükenmesine neden olarak ve sucul organizmalarda penetrasyon ve birikim de dahil olmak üzere çeşitli biyotalara yapışmaya neden olarak çoklu stres faktörleri ve kirleticiler oluşturur14.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, MNP'lerin mikrobiyal topluluklar ve bitkiler de dahil olmak üzere toprak jeokimyasını ve biyotasını etkileyebileceğini göstermektedir15,16,17. Dahası, NP'ler gıda ağını tehdit ediyor17,18,19,20. MNP'ler toprakta kolayca dikey ve yatay taşımaya maruz kaldıklarından, pestisitler, plastikleştiriciler ve mikroorganizmalar gibi emilen kirleticileri topraktan yeraltı sularına veya nehirler ve akarsular gibi sucul ekosistemlere taşıyabilirler21,22,23,24. Malç filmleri gibi geleneksel tarım plastikleri, kullanımdan sonra tarladan çıkarılması ve çöp sahalarında atılması gereken polietilenden yapılır. Bununla birlikte, eksik kaldırma, topraklarda önemli miktarda plastik döküntü birikimine yol açar 9,25,26. Alternatif olarak, toprak-biyobozunur plastik malçlar (BDM'ler), kullanımdan sonra toprağa sürülecek ve zamanla parçalanacakları şekilde tasarlanmıştır. Bununla birlikte, BDM'ler toprakta geçici olarak devam eder ve yavaş yavaş bozulur ve milletvekillerine ve NP'lereayrılır 9,27.
Mevcut birçok çevresel ekotoksikolojik ve kader çalışması, idealize edilmiş ve temsili olmayan milletvekilleri ve NP'ler model materyalleri kullanmaktadır. En yaygın kullanılan vekil MNP'ler,12,28 ortamında bulunan gerçek MNP'leri yansıtmayan monodispers polistiren mikro veya nanosferlerdir. Sonuç olarak, temsili olmayan milletvekillerinin ve NP'lerin seçimi yanlış ölçümlere ve sonuçlara neden olabilir. Karasal çevre çalışmaları için uygun model ΜNP'lerin eksikliğine dayanarak, yazarlar bu tür modelleri tarımsal plastiklerden hazırlamak için motive olmuşlardır. Daha önce BDM'lerden ve polietilen peletlerden MNP'lerin oluşumunu, plastik peletlerin ve film malzemelerinin mekanik frezelenmesi ve taşlanması yoluyla ve MNP'lerin boyutsal ve moleküler özelliklerini bildirmiştik29. Mevcut makale, malç filmleri veya peletlenmiş hammaddeleri gibi tüm tarımsal plastiklere daha geniş bir şekilde uygulanabilecek MNP'lerin hazırlanması için daha ayrıntılı bir protokol sunmaktadır (Şekil 1). Burada, örnek olması için, tarımsal plastikleri temsil etmek için biyolojik olarak parçalanabilen polimer polibütilen adipat tereftalatın (PBAT) bir malç filmi ve küresel peletlerini seçtik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Milletvekillerinin plastik peletlerden kriyojenik ön işlem ve frezeleme yoluyla işlenmesi
NOT: Bu metodoloji, sunulan bu çalışma29 için kullanılan aynı malzemeden oluşan bir PBAT filmi kullanan başka bir yerde açıklanan bir prosedüre dayanmaktadır.
- ~1 g'lık polimer pelet numunelerini tartın ve 50 mL'lik bir cam kavanoza aktarın.
- "Dikdörtgen teslimat" tüpünü, döner kesme değirmeninin önündeki yuvaya 20 ağ (840 μm) elek ile yerleştirin ve dağıtım borusunu durdurma pimine çarpana kadar kaldırın.
- Cam plakayı freze odasının yüzünün üzerine yerleştirin ve ayarlanabilir kelepçe ile sabitleyin. Ardından, değirmen çıkışının altına 50 mL'lik bir cam kavanoz yerleştirin (Şekil 2).
- Kayar yan kol desteğini ön camın ortasındaki değirmene (sağ üst tarafta bulunur) yerleştirin ve tırtıllı cıvata ile sıkın. Değirmenin ön camının güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 2a).
- Hazne hunisini değirmenin üstüne üst freze odasının açıklığına yerleştirin.
- Değirmenin çalışmasını başlatmak için bir hat kablosunu elektrik prizine ve basın kablosu anahtarını takın.
NOT: Sıkışmayı önlemek için, malzemeyi yalnızca değirmen açıldıktan ve döndükten sonra besleyin. Ayrıca, tüm frezeleme prosedürü boyunca göz ve kulak koruması kullanın. - Yavaşlamayı veya sıkışmayı önlemek için numuneyi yavaşça hazneye (yaklaşık 10 pelet / dak) besleyin. Duyulabilir gürültü azaldıktan sonra, bir sonraki pelet grubunu (~ 10 adet) ekleyin. Peletleri (1 g) işledikten sonra, soğuması için değirmenin çalışmasını ~ 20 dakika durdurmak için kablo anahtarına basın. Numuneyi beslemek ve parçacıkların besleme haznesi içinde dışarı atılmasını ve yığılmasını önlemek için ahşap bir piston kullanın.
DİKKAT: Optimum besleme hızı, işleme malzemesinin türüne bağlı olarak değişir. Kesme odasındaki partikül sürtünmesi nedeniyle işlem hızı azalırsa veya cam plakada erimiş polimer oluşumu gözlenirse, polimer parçacıklarının aşırı ısınmasını ve daha fazla erimesini önlemek için değirmeni derhal kapatın. - 20 ağ (840 μm) dağıtım tüpünü çıkarın ve ilk partinin tamamlanmasının ardından 60 ağ (250 μm) dağıtım tüpü ile değiştirin (Şekil 2b).
- Toplanan malzemeyi değirmen haznesine tekrar yerleştirin. 250 μm frezeleme fraksiyonu için 1,1 ve 1,7 numaralı adımları izleyin.
- Toplanan 250 μm fraksiyonları üç kata kadar yeniden besleyin.
- Odadaki kalan parçacıkları geri kazanın ve toplanan ana fraksiyona ekleyin.
2. Plastik filmlerin kriyojenik ön işlem ve frezeleme ile işlenmesi
- Rulodan bir film örneği alın ve numuneyi bir kağıt kesici ile ~ 120 mm (çapraz yön) x 20 mm (makine yönü) şeritler halinde kesin.
- Parçaları (~1 g) 800 mL deiyonize (DI) suda 1000 mL'lik bir cam kabda 10 dakika bekletin. Bu adım, polimeri önceden ıslatarak sonraki kriyojenik soğutma prosedürü için gevrekleşmeyi iyileştirir.
DİKKAT: Kriyojenik eldivenler ve güvenlik gözlükleri takarak sıvı azotu güvenlik ekipmanlarıyla birlikte kullanın. - Kriyojenik bir kaba yavaşça 200 mL sıvı azot (N2) ekleyin.
- Önceden ıslatılmış film parçacıklarını çelik cımbızla kriyojenik kaba dikkatlice aktarın. SıvıN2'de 3 dakika bekletin.
- Dondurulmuş film parçalarını 200 W, 14 vitesli bir karıştırıcıya aktarın.
- Dondurulmuş cam film yapısını kırmak için dondurulmuş malzemeyi 10 s hız seviyesi 3'te işleyin. Boyutun daha da küçültülmesini teşvik etmek için 400 mL DI su ekleyin ve film suyu bulamacını 5 dakika boyunca karıştırın.
- Bulamacı filtreli (1 μm ağ) bir Büchner hunisine aktarın ve en az 1 saat boyunca vakum uygulayın.
- Katı partikülleri 30 °C'de alüminyum bir kapta en az 48 saat vakumla kurutun.
- Kuru parçacıkları cımbızla değirmene besleyin. Frezeleme için 1.1-1.11 arasındaki adımları izleyin.
3. Çevresel yaşlandırma ve frezeleme yoluyla ön işlemden geçirilmiş plastik filmlerin işlenmesi
- Tarladan geri kazanılan plastik film parçalarını pürüzsüz bir yüzeye (laboratuvar tezgahı) yerleştirin. Emilen toprak parçacıklarını ve bitki kalıntılarını yumuşak kıllı fırça ile dikkatlice çıkarın.
- Filmi makasla ~4cm2 ~1,0 g'lık numuneler halinde kesin.
- Film parçalarını, 500 mL DI suyuyla doldurulmuş 1000 mL'lik bir beherin içine ekleyin. 1 saat boyunca 20 mm karıştırma çubuğu ile 300 dakika-1 oranında karıştırın.
- Beherin hafif bir çalkalanması altında DI suyunu bir lavaboya veya plastik kovaya boşaltarak ve tekrar sokarak çözünmüş toprak parçacıklarını temizleyin. Bu adımı üç kez yineleyin. Sürekli ajitasyon, toprak parçacıklarının suda dağılmasını sağlar ve daha kolay dökülebilir.
- Numuneleri beherden alüminyum bir kaba aktarın. Plastik numuneleri 12 saat boyunca hava ile kurutun ve ardından 30 °C'de 24 saat vakumlu fırında aktarın ve kurutun. Frezeleme için 1.1-1.11 arasındaki adımları izleyin.
4. Basamaklı eleklerle eleme prosedürü
- Elekleri (çapı 3 inç) alttaki tavadan başlayarak, ardından en ince elek (#325; 45 μm) ve ardından giderek daha kaba eleklerle (#140; 106 μm ve #60; 250 μm gibi, #20; 840 μm elek en kaba olanıdır) istifleyin ve kapağı üstüne yerleştirin.
- Elek çalkalayıcının açıklıklarına dört pim yerleştirerek dört eleğin tümünü çalkalayıcıya monte edin.
- Adım 1, 2 veya 3'te toplanan tek tek fraksiyonları dört basamaklı eleğin üzerine aktarın. 300 dakika-1'de 10 dakika çalkalayın.
- Daha büyük (üst) fraksiyonu ayrı ayrı geri kazanın, bu da daha fazla frezelemeye tabi tutulacaktır.
NOT: Çalkalayıcıdaki sallanma hızını gerektiği gibi ayarlayın. Alternatif olarak, elekleri elle sallamak mümkündür. Örgü #20 elek ile başlayarak bir seferde yalnızca bir elek kullanın: alt kısmı ve kapağı elek karşısında elle sıkıca tutun ve 5 dakika boyunca eksenel ve yatay olarak sallayın. - 1.6-1.10 adımlarında açıklandığı gibi 106 μm'nin elenmiş dp > partiküllerini döner kesme değirmenine yeniden takın.
- Alt fraksiyonları tavadan geri kazanın ve parçacıkları bir sonraki küçük elek boyutuna yeniden ekleyin. 106 μm parçacıkları ana fraksiyonu temsil edene kadar prosedürü tekrarlayın.
- Toplanan 106 μm fraksiyonları birleştirin ve parçacıkları kuru bir alanda (kurutucu veya hava geçirmez plastik torba) saklayın.
NOT: 45 μm fraksiyonu, 106 μm fraksiyonunun bir parçasıdır; Bununla birlikte, önceki fraksiyon izole edilmemiş ve verim genellikle çok düşük olduğu için ayrı ayrı analiz edilmiştir. Tek tek fraksiyonların verim geri kazanımları ve partikül boyutu fraksiyonları, yüksek hassasiyetli bir mikro terazi kullanılarak ilk besleme fraksiyonuna göre her bir eleme fraksiyonu (mesh #20 - mesh #325) için ağırlıkça %cinsinden gravimetrik ölçümlerle belirlenebilir.
5. Islak öğütme için sulu bir NP bulamacının hazırlanması
- 1000 mL cam beherin içine 800 mL damıtılmış su ekleyerek ve bir karıştırma çubuğu (çap = 8 mm, uzunluk = 50,8 mm) yerleştirerek DI suyuna dağılmış bir milletvekili bulamacı hazırlayın.
- Adım 1, 2, 3 veya 4'teki 106 μm plastik fraksiyonun 8 gramını DI suyuna sokun ve ağırlıkça% 1'lik bir bulamaç üretin.
- Cam kabı bir karıştırma plakasına yerleştirin ve parçacık yumuşamasını teşvik etmek için parçacıkları suya batırmak için 400 dakika-1'de 24 saat boyunca manyetik olarak karıştırın.
- Partikülleri 1000 mL'lik plastik bir kaba aktarın.
- Ek iki adet 1000 mL plastik kabı, taşlama işlemi sırasında öğütücünün haznesindeki yapışan parçacıkları durulamak için kullanılacak DI suyuyla doldurun.
6. NP üretimi için ıslak taşlama makinesinin hazırlanması
- Islak sürtünmeli taşlama makinesine 46 tane büyüklüğünde (taşlama taşı kumu= 297-420 μm) taşlar yerleştirin ve orta somunları 17 mm'lik bir anahtarla elle sıkıca sabitleyin.
- Hazneyi üstüne ekleyin ve üç somun ve cıvatayı 17 mm'lik anahtarla sabitleyin.
- Çarpıştırıcının çıkışının altına 1 L'lik bir plastik toplama kavanozu yerleştirin. İşleme sırasında değişim için kullanılacak olan prizin yanına ikinci bir boş 1 L kova yerleştirin.
- Gösterge boşluğunu, sıfır konumundan pozitif 0,10 μm kaymaya karşılık gelen + 1,0 olarak ayarlayın.
- Gücü açın ve taşlama taşlarının dokunuşunu duyana kadar ayar tekerleğini saat yönünde dikkatlice çevirin. Ardından, esnek ölçüm halkasını sıfıra ayarlayın ve tekerleği hemen saat yönünün tersine çevirin. Varsayılan olarak, hız 1500 dk-1'e ayarlanır.
NOT: Taşların "kuru öğütülmesinden" kaçının, çünkü bu taşlama taşlarında aşırı ısı yaratır. - Taşlar temas edene kadar ayar tekerleğini saat yönünde çevirin ve su-NP bulamacını hazneye yavaşça doldurun. Boşluğu sürekli olarak -2,0'lık bir boşluk göstergesine düşürün, bulamaç tanıtıldıktan sonra sıfır konumundan negatif 0,20 μm'lik bir kaymaya karşılık gelir. İki taş disk arasındaki plastik parçacık-su bulamaçları, milletvekillerinden NP'lere dönüşümü teşvik eder ve taşlama taşları arasında doğrudan sürtünmeyi önler.
- Kovadaki dolum seviyesi 0,5 L'yi aştığında toplama kovalarını değiştirerek bulamacı toplayın.
- Partikülleri toplayın ve öğütücüye 30-60 kez tekrar yerleştirin; daha yüksek geçişler (yeniden giriş sayısı) daha küçük parçacık boyutlarıyla sonuçlanır.
- İşleme sırasında uygun bulamaç karıştırmaya izin vermek için hazneye yapışan parçacıkları hazırlanan DI su şişesi ile yıkayın.
NOT: İşlem sırasında ara numunelerin toplanması, çıkış akışına 20 mL cam şişelerin tutulmasıyla mümkündür. Bireysel adımlar, proses şiddeti (geçiş sayısı) artarken parçacık parçalanma mekanizmalarını değerlendirecektir. Bulamacı geri kazanın ve iyi karıştırma için 25 ° C'de 400 dakika-1'de 4 saat karıştırın; bulamacın stabilize olması için 48 saat bekletin.
7. NP'lerin bulamaçtan geri kazanımı ve kurutulması
- Bulamaçta birden fazla katman gözlenirse, bulamacı yavaşça ek bir 1000 mL cam kabın içine dökerek alt fraksiyonu (veya en yüksek NP konsantrasyonuna sahip fazı) izole edin.
- Fraksiyonları santrifüj şişelerine (50 mL) ve 10 dakika boyunca santrifüje aktarın (göreceli santrifüj kuvveti [RCF] = 20 x 102 g). RCF (ayrıca g-kuvveti olarak da adlandırılır), rotor yarıçapının ve rotor hızının bir fonksiyonu olarak üretilen radyal kuvvettir ve bu da daha ağır parçacıkların ve bulamacın suyunun ayrılmasına neden olur.
- Şeffaf üst tabakayı ayrı bir alüminyum tavaya boşaltarak çıkarın.
- Kalan alt tabakayı (NP bulamacı içeren) ek bir alüminyum kaba aktarın ve 48 saat boyunca 30 ° C'de vakumlu bir fırına yerleştirin.
- Solunum maskesi takarken duman başlığı veya torpido gözü altında bir spatula ile kurutulmuş malzemeyi geri kazanın. Kurutulmuş içeriği 100 mL'lik bir cam kaba aktarın ve bir kapakla kapatın.
- NP'leri bir şişede bulundurun ve hava geçirmez, kuru ve serin bir yerde (örneğin, bir kurutucu) saklayın.
NOT: Üretim sürecinde çevreye salınan MNP'ler (burada, ıslak öğütme işlemi sırasında veya kurutulmuş parçacıklar olarak) sucul ve karasal ekosistemler için ciddi bir tehdit oluşturabilir. Özellikle, düzenleyici önlemler, mühendislik nanomalzemeleri için üretim ve kullanım riskini en aza indirmek için tasarlanmıştır30. Bu nedenle, MNP'lerin oluşumu, bir duman başlığında veya torpido gözünde malzeme taşıma gibi özel ihtiyati adımlar gerektirir. Ayrıca, NP'lerin izolasyonu sırasında oluşan sulu atık çözeltileri (adım 6.7-6.9), Çevre Sağlığı ve Güvenliği Departmanı tarafından gerçekleştirilen bir kullanım ömrü sonu bertaraf prosedürüne tabi tutulacaktır.
8. Stereo mikroskopi ile MP görüntüleme
- ~4 cm2'lik bir alana ~ 20 mg parçacık (adım 4'te toplanan) dağıtın. Beyaz veya yarı saydam milletvekillerini karanlık bir yüzeye yayın, arka plan kontrastını en üst düzeye çıkarmak için siyah veya koyu renkli milletvekillerini beyaz bir arka plana (kağıt sayfası) yayın.
- Mümkün olan en büyük alanı (parçacık alanının ortası) yakalamak için mikroskopu en düşük büyütmeye ayarlayın. Ardından, ilgilenilen bölgelerde aydınlatma elde etmek için harici lambayı odak merkezine yönlendirin.
- Görüş alanının ortasında >50 parçacığın algılanmasını sağlayan bir büyütme uygulayın. Bu miktar, sağlam istatistiksel değerlendirme sonuçları elde etmek için önerilir.
- Parçacık örtüşmesi olmayan veya küçük olan alanlara ve iyi renk kontrastına odaklanın.
- Dış parçacık şekillerine odaklanarak en az beş temsili görüntü yakalayın. Görüntüleme için kullanılan yerel bilgisayar, yüksek çözünürlüklü görüntüleri yazılıma bitmap olarak kaydeder.
- Aşağıdaki nicel veri analizi için stereomikroskopla kaydedilen görüntüleri ImageJ (bitmap, tiff veya jpeg) tarafından tanınan bir dosya biçiminde kaydedin.
NOT: Ana görüntünün bir cetvel veya görüntüde kayıtlı başka bir referans nesnesi kullanılarak çekildiği tam büyütme ayarlarında bir referans görüntü alın. Bu prosedür, ImageJ yazılımı aracılığıyla hazırlanırken ve analiz edilirken görüntülerin kolay kalibrasyonunu sağlayacaktır.
9. ImageJ ile görüntü analizi
- ImageJ yazılımı31'i açın ve Komut bulucuyu açmak için (CTRL + L) girerek dosya içe aktarmayı hazırlayın. Ardından sağ alt köşeye Bio-Formats yazın. Bu işlev, Dosya > İçe Aktar > Bio formatları menü yolunu etkinleştirir (> yazılım içindeki gezinme adımlarını ifade eder). Depolanan resim dosyalarının dizinini arayın.
NOT: Bio-Formats paketi Command finder'da görünmüyorsa, Bio-Formats ImageJ altında çevrimiçi arama yapın. ImageJ'yi indirmek ve yüklemek için talimatları izleyin. Bio-Formats içe aktarıcı, ImageJ içindeki resim dosyalarını içe / dışa aktarmanın ve komutları aramanın basit bir şekilde işlenmesini sağlar. - Adım 4.7'de toplanan dosya konumundaki parçacık görüntüsünü ve adım 1.6'da açıklanan cetvel referanslı görüntüyü seçmek > Dosya > Aç'ı tıklatarak görüntüyü açın (alternatif olarak adım 9.1'de açıklandığı gibi Biyo-Biçimler içe aktarma). Kopya görüntünün eşik ayarları yapılırken orijinal görüntüyle karşılaştırmak için Üst Karakter + Command + D tuşlarına basılarak yinelenen bir görüntü oluşturulması önerilir.
NOT: Dosya > Aç komutu, adım 8.7'de açıklandığı gibi ImageJ tarafından yerel olarak desteklenen çeşitli biçimleri açar. Alternatif olarak, bilgisayardaki görüntü konumunu seçin ve dosyayı ana ImageJ pencere durum çubuğuna sürükleyip bırakın. Görüntü dosyası otomatik olarak ayrı bir pencerede açılır. - Sırasıyla CTRL + ve CTRL - kullanarak görüntüyü yakınlaştırın ve uzaklaştırın.
- Analiz Et'i > Ölçümleri Ayarla'yı tıklayarak ölçümleri ayarlayın, ardından varsayılan değerler olarak Alan ve Şekil Tanımlayıcıları'nı seçin.
- Adım 8'de açıklandığı gibi cetvel referans görüntüsünü kullanarak ölçek çubuğunun uzunluğunun üzerine düz bir çizgi çizerek ölçek çubuğunu tanımlayın. Ölçeği Ayarla'> Çözümle'ye basın ve Bilinen mesafe altında çubuk uzunluğunun sayısal değerini ve karşılık gelen uzunluğun birimini girin.
- Ölçek Çubuğu'> Analiz Et > Araçları'nı tıklatarak görüntüdeki ölçek çubuğunu görselleştirin ve görüntüde net kontrast gösterme gibi ayarları yapın. Görüntüde, ölçek çubuğu ayarları için ölçek çubuğunun yerleştirilmesi gereken bir konum seçin. Çubuğu kalibre edilmiş birimlerde, çubuğun piksel cinsinden yüksekliğini ve ölçek çubuğu etiketinin Yazı Tipi Boyutu'nu ayarlamak için Genişlik'i seçin. Etiket metin kutusunun doldurma rengini ayarlamak için arka planı seçin.
NOT: Mikrometreler için μm girişi yeterlidir; program μm'yi veri çıkışında otomatik olarak uyarlar. - Görüntü > Türü > 8 bit'i seçerek görüntüyü 8 bitlik bir görüntüye dönüştürün.
- Görüntü > Türü > 8 bit'i seçerek kopyalanan görüntüyü 8 bit'e dönüştürün.
- Görüntü > > Eşiğini Ayarla > Ayarla'yı seçerek ayarlayın (boyutu orijinal görüntüyle karşılaştırın).
- Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'yı seçerek hangi ölçümlerin alınacağını belirleyin.
- Parçacıkları analiz et > 0-sonsuz'u seçin, Sonuçları görüntüle'yi ve yerinde göster'i tıklatın.
- Yatırım getirisi (.zip) sonuçlarını Ölçümleri Kaydet ve Klasör Seç altında saklayın.
- Sonuçları Kaydet (*.csv) altında Dosya > Farklı Kaydet > Klasör Seç altında.
10. Elektronik tablo yazılımında partikül çapı (dp) ve şekil faktörü hesaplama
NOT: Partikül çapı ve şekil faktörlerinin bilgisi, ortamdaki parçacık davranışı (kader, taşıma) ve yüzey alanının belirlenmesi için gereklidir. Bu nedenle, milletvekilleri çevresel çalışmalar için kullanıldığında geometri esastır. Örneğin, milletvekillerinin boyutlarına ve şekillerine bağlı olarak, topraktaki parçacık hareketini etkileyen MP-MP ve MP-toprak aglomerasyonları gibi toprakla farklı etkileşim mekanizmaları gözlenmiştir 15,32. Bu nedenle, d p-parçacık boyutu dağılımını ve geometrik parametresini belirlemek için aşağıdaki adımlar önerilmektedir.
- ImageJ analizinden (adım 9.13) elde edilen ve kaydedilen ilgili *.csv dosyasını elektronik tablo yazılımına aktarın.
NOT: Her sütun çizgisindeki sayısal değerler, denklem 1 ve denklem 2'ye göre her parçacık için ayrı ayrı hesaplamaları yansıtır. - Döngüsellik (CIR) ve en boy oranı (AR) gibi ortalama şekil parametre değerlerini, her sütunun altına = ortalama (x,y) girerek, burada x'in sütunun ilk satırını ve y son satırını temsil ettiği yerde değerlendirin ve ardından Enter tuşuna basın. CIR değerleri, yansıtılan alan ile tek bir parçacığın CIR = 1 (denklem 1) ile mükemmel daire arasındaki ilişkiyi tanımlar. AR, denklem 2 tarafından tanımlanan parçacık uzunluğu / genişliği oranını temsil eder.
- Ortalama AR'nin 2,5 < belirleyin, ardından denklem 3'ü kullanarak yeni bir sütundaki dp değerlerini hesaplayın. AR 2.5 ≥, denklem 4'ü yansıtan dp değerlerini hesaplayın. ImageJ çıktısından alınan alan sütununa göre dp'yi hesaplamak için yeni bir sütun ekleyin.
NOT: AR eşik değerlerinin seçimi ≥ 2.5 daha fazla dikdörtgen şekilli parçacığı temsil ederken, AR < 2.5 daha yuvarlak şekilli parçacıkları yansıtır. Bu seçim, mikroskopi ile ölçülen ve ImageJ ile belirlenen alandan türetilen dp hesaplama hatasını en aza indirmeye izin verir.
(1)
(2)
(3)
(4)
11. Milletvekilleri ve NP'ler için istatistiksel analiz
- *.csv veri dosyasını istatistiksel yazılımla birlikte açın > Dosya > 9.13'te oluşturulan ilgili dosyanın dosya konumunu seçin .
NOT: Alternatif olarak, tablo kopyala-yapıştır özelliği aracılığıyla doğrudan istatistiksel yazılıma aktarılabilir. Sütun adlarıyla Düzenle ve Yapıştır istatistik yazılımının markası ve sürümü için Malzeme Tablosu> na bakın. - > Dağılımını Analiz Et'i seçerek dp verilerini değerlendirin.
- Sütunun verilerini yansıtan dp öğesini seçin, Y sütunlarına sürükleyip bırakın ve OK düğmesine basın. Bu özellik, ayrı bir pencerede Özet İstatistikler, Ortalama ve Std Geliştirme değerlerini içeren istatistiksel bir çıktıya sahip bir histogram oluşturur.
- Sürekli Sığdırma > d p'nin yanındaki üçgeni seçerek histogramın en iyi uyum eğrisine sahip normal bir dağılımı (veya dp için en uygun olanı) izleyip izlemediğini değerlendirin ve ardından en uygun olarak alınan eğriyi seçin (örneğin, Normal Sığdır). Bu adım, histogramı normal olarak dağıtılmış bir uyumla üst üste bindirir.
- Ortalama şekil parametresi değerlerinin döngüsellik (Cir), en boy oranı (AR), yuvarlaklık (Yuvarlak) ve sağlamlık (Sol) değerlerinin özet istatistik çıktılarından ortalama ve standart sapma değerlerini belirleyin ve raporlayın.
NOT: α = 0.05 istatistiksel anlamlılık düzeyi önerilir ve tüm değerlendirmeler için kullanılmıştır. Anlamlılık düzeyi, sayısal sonuçları karşılaştırırken doğru olduğunda sıfır hipotezini reddetme olasılığıdır.
12. d p boyut dağılımı ve parçacık şekli faktörlerinin en iyi uyumu
- Veri kümesini istatistiksel yazılıma yükleyin ve adım 10'da hesaplandığı gibi dp'nin dağıtımı için aynı *.csv veri kümesini kullanın.
- Yaşam Dağılımı > Güvenilirliğini ve Hayatta Kalma > Analiz Et'i seçin.
- dp sütununu Y, Etkinlik Zamanı alanına sürükleyin ve Tamam'ı seçin. Bu özellik, dp'nin bir fonksiyonu olarak olasılık grafiğine sahip bir çıktı oluşturur.
- Nonparametrik, Lognormal, Weibull, Loglojistik ve Normal'i işaretleyerek Dağılımları Karşılaştır altında optimum dağılımı belirleyin.
- Modelin kalitesini, grafiğin altındaki İstatistik Modeli Karşılaştırma Tablosunda en düşük BIC sayılarına göre Akaike ve Bayes bilgi ölçütleri (sırasıyla AIC ve BIC) için en düşük sayısal değerlere göre değerlendirin. En uygun model varsayılan olarak ilk satırda sunulur. Her dağıtım değerlendirmesi için parametrik veya parametrik olmayan tahmin çıktı alanları, Dağılımları Karşılaştır grafiğinin altında bulunur.
- Save Script > To Data Table (Veri Tablosuna Komut Dosyasını Kaydet) tarafından sol üst köşedeki kırmızı açılır üçgeni seçerek çıktı komut dosyasını veri tablosuna kaydedin. Ardından, Dosya > > *.jmp dosyasını seçerek orijinal Veri Tablosunu istediğiniz dosya konumuna kaydedin.
13. Dinamik ışık saçılması yoluyla NP'lerin boyutsal karakterizasyonu
- Masaüstü simgesine çift tıklayarak dinamik ışık saçılımı (DLS) yazılımını başlatın. Dosya > Yeni > SÇP'yi seçin. DLS yazılımında Numune Kurulumu altında damıtılmış su için 1,33'e ve polimerler33'e numune adı ekleyin ve malzeme kırılma indisini seçin. Açılır menüde Malzeme'yi seçin ve Tamam'a tıklayın.
NOT: Açılır menüye tıklandığında, Kırılma indisini ve Emilimini değiştirerek yeni numuneler eklemeyi veya mevcut numuneleri değiştirmeyi öneren Malzeme Yöneticisi açılır. Dispersan Su olarak seçin. - Hücre > Hücre Türü altında uygun hücreyi seçin ve her ölçümden sonra hangi çıktının sunulacağını belirlemek için Raporlar'ı seçin.
- Cihazın kapağını kapatarak ve kapağı kapatarak (açıksa) ve ON düğmesine basarak sistemi açarak cihazı çalıştırın. İlk bip sesinden sonra bekleyin ve ışının stabilizasyonuna izin vermek için yaklaşık 30 dakika bekleyin.
- Başlatma rutini tamamlanana kadar bekleyin ve önceden ayarlanmış sıcaklığa (genellikle 25 ° C) ulaşıldığını gösteren ikinci bir bip sesi bekleyin.
- NP'lerden (adım 7'de alındığı gibi) ve DI suyundan oluşan bir numune bulamacını, iyi karışmasına izin vermek için ~ 1 saat boyunca manyetik olarak karıştırarak ağırlıkça% 0.1 konsantrasyonda ~% 0.1 konsantrasyonda hazırlayın.
- 4,5 mL kuvars küvete ~1,0 mL aktarmadan önce bulamacı çalkalayın ve kapağı açın. Ardından, numune hücresini DLS cihazının numune tutucusuna dikkatlice yerleştirin.
NOT: Aynı bulamaç partisinden, adım 13.5'te açıklandığı gibi aynı konsantrasyonda üç numune hazırlayın. - Her numune için üç ölçüm (DLS yazılımında seçim) gerçekleştirin. Ölçümler arasında, numune hücresini çıkarın ve numunenin karıştırılmasına izin vermek için numuneleri 5 s boyunca hafifçe sallayın.
- DLS yazılımı aracılığıyla verileri ayıklayın ve dışa aktarın, veri kümesini elektronik tablo yazılımına aktarın ve 11.1-11.5 adımlarında açıklandığı gibi milletvekilleri ve NP'ler için histogramlar oluşturun (Şekil 1). Kayıt Görünümü Sekmesinden, elektronik tablo yazılımı gibi başka bir uygulamaya yapıştırılabilen Düzenle-kopyala'yı seçerek bir Tablo veya Grafik kopyalayın.
14. Fourier transformasyon kızılötesi (FTIR) spektrometrisi ile zayıflatılmış toplam yansıma (ATR) kullanılarak MNP'lerin kimyasal analizi
NOT: MNP'lerin Fourier transformasyon kızılötesi (FTIR) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopileri ile kimyasal analizleri, ıslak öğütmenin kimyasal bağlanma özellikleri üzerindeki etkisinin yanı sıra ana bileşenlerin ve polimerlerin monomerik bileşenlerinin nispi miktarlarını değerlendirmek için çok uygun araçlardır, sırasıyla10. Ek olarak, MNP'lerin polimerik bileşenlerinin termal özellikleri ve stabilitesi, sırasıyla diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) ve termogravimetrik analiz (TGA) ile değerlendirilebilir29.
- Algılama sistemini (ATR kristal yüzeyi) etanol ve tüy bırakmayan bir bezle temizleyin.
- Yazılımı başlatın ve cihazın ışın yolunu temizleyerek havada bir Arka Plan Taraması gerçekleştirmek için komut çubuğundaki Arka Plan Düğmesine basın. Arka plan spektrumu, koleksiyondan kısa bir süre sonra görüntülenir.
- Cihaz ayarları araç çubuğuna Örnek Kimliği ve Örnek Açıklaması girin.
- Spektral dalga sayısını 4000 cm-1 ile 600 cm-1 arasında ayarlayın ve absorbans modunda 2,0 cm-1 çözünürlük seçin. Spektrum başına 32 tarama seçin ve başlayın.
- Kristal yüzeye, iç çapı ~10 mm veya eşdeğeri olan bir çelik yıkayıcının içine plastik bir numune (~20 mg veya ~ 1-3mm 3) MP (106 μm) ve NP'ler (~ 300 nm) yerleştirin.
NOT: Yıkayıcı, numune tutucu numuneyi sıkıştırdığında kristal üzerinde dağılmayı önler, bu da tutarsız ölçümler nedeniyle malzeme homojensizliklerine ve veri yanlılığına neden olur. - Yıkayıcıyı ATR kristalinin ortasına yerleştirin ve polimer numunesini yıkayıcı açıklığının ortasına bir spatula ile ekleyin.
- Yukarıdaki numune kolunu numunenin merkezine doğru döndürün ve Kuvvet Ölçer kuvvetini 50-90 arasında izleyerek düğmeyi saat yönünde çevirin. Örnek ön spektrumları göstermektedir. Spektrumu toplamak için Tara düğmesine ikinci kez basın.
- Tara düğmesine tıklayarak 8-10 spektrum arasında toplayın ve temsili sonuçların toplanmasına izin vermek için her ölçümden sonra numuneleri bir spatula ile dikkatlice karıştırın.
- Görüntüleme alanında üst üste bindirilmiş toplanan tüm örnekleri görüntülemek için Veri Gezgini'ndeki Örnek Görünüm klasörüne tıklayın. İlk olarak, aykırı değerleri temsil eden önemli ölçüde sapan spektrumları kaldırın. Ardından, araç çubuğunda Absorbans veya Transmittance modunu seçin.
- Spektrumları içeren Örnek Görünüm klasörünü ve dosya menüsünden Farklı Kaydet'i seçerek spektrumları kaydedin. İletişim penceresi dosya adını, hedef dizini ve tüm spektrumlar için varsayılan konum değişikliğini etkinleştirir.
NOT: Alternatif olarak, spektrumlar bir spektrum seçilerek ve İkili seçeneği görüntülemek için sağ tıklatılarak *.sp dosyası olarak kaydedilebilir. İkili Kaydet'i seçin ve son Kaydet konumuna göz atın. - Yazılım aracılığıyla veya bir sonraki adımda menüden İşlem ve Normalleştirme'yi seçerek Veri Gezgini'nde tek bir spektrum seçerek taban çizgisi düzeltmesi >ve ortalama normalleştirme gerçekleştirin.
NOT: Ortalama normalleştirme, numunedeki kalınlık veya malzeme varyasyonundan kaynaklanan spektral hataları telafi eder. - Veri toplama işlemini tamamladıktan sonra kristal alanı etanol ve tüy bırakmayan bezle temizleyin.
- Milletvekilleri ve NP'ler arasındaki farkları, atanmış FTIR titreşim bantlarına göre yorumlayın, önceki bir yayında atanan ve değerlendirilen10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel prosedür yöntemini ve analizini doğrulamak için, milletvekilleri ve NP'ler pelet ve film malzemelerinden oluşturuldu ve mikroskobik görüntüler kullanılarak boyut ve şekle göre karşılaştırıldı. Şekil 1'de açıklanan yöntem, biyolojik olarak parçalanabilen plastik peletlerden ve filmlerden verimli bir şekilde milletvekilleri ve NP'ler oluşturmuştur; bu, kriyojenik soğutma, frezeleme ve ıslak taşlama ve karakterizasyon yoluyla elde edildi. İlk adım, çevresel olarak yıpranmış filmler için gereksizdi, çünkü hava koşulları, gevrekleşmeye neden oldu (Astner ve ark., yayınlanmamış). Peletler ayrıca kriyojenik ön işlem yapılmadan doğrudan frezelemeye tabi tutuldu. Frezelemeden sonra, parçacıklar eleme yoluyla dört boyut fraksiyonuna bölündü: protokol adım 4'te açıklandığı gibi 840 μm, 250 μm, 106 μm ve 45 μm. Son üç fraksiyon sadece milletvekillerinden oluşuyordu. Daha sonra, her fraksiyon için parçacık karakterizasyonu, 8.1-8.6 adımlarında verilen ImageJ yazılımı kullanılarak toplanan stereomikroskobik görüntülerin boyut (dp) ve şekil faktörlerinin (yani dairesellik ve en boy oranı) dağılımı belirlenerek değerlendirildi. Bir stereomikroskop tarafından elde edilen görüntü örnekleri, PBAT peletleri için 106 μm eleme fraksiyonu (Şekil 3a,c) ve 250 μm elek fraksiyonu ve kriyojenik maruz kalma ile muamele edilmiş yıpranmamış PBAT filmi için gösterilmiştir (Şekil 3b,d).
Partikül boyutlarının istatistiksel analizi, PBAT peleti için nominal elek boyutundan (106 μm) 41 μm daha küçük ve PBAT filmi için 137 μm daha küçük (250 μm nominal boyut) olan ortalama bir d p olduğunu göstermiştir, bu da daha küçük elek fraksiyonunun daha homojen bir parçacık boyutu dağılımını temsil ettiğini düşündürmektedir (Tablo 1). Bu gözlem ayrıca, başlangıç malzemelerinin farklı özelliklerine (yoğunluğuna) atfedilebilecek film malzemesine kıyasla işlenmiş peletler için dairesellikte daha büyük bir değer ve daha düşük en boy oranları (daha yuvarlak şekilli parçacıklar öneren) ile doğrulanmıştır. Normal bir dağılım, her iki fraksiyon için parçacık boyutu dağılımını tanımlamak için en iyi modeldi. Bununla birlikte, dairesellik ve en boy oranının belirlenmesi için Weibull ve Lognormal modelleri optimaldi (Şekil 4a-d; Tablo 1). Her iki hammadde için de, 106 μm MP elek fraksiyonlarına uygulanan ıslak öğütme işlemi NP'leri oluşturdu ve partikül boyutu dağılımları DLS ile ölçüldü. Sayısal analiz, her iki hammaddeden üretilen NP'ler için bimodal parçacık boyutu dağılımını ortaya koymuştur (Şekil 5). PBAT peletlerinden NP'ler için ana parçacık popülasyonları ~ 80 nm ve 531 nm'deydi ve karşılık gelen sayı yoğunluğu frekansı (NDF) değerleri sırasıyla% 25 ve% 5 idi. Öte yandan, PBAT filmlerinden türetilen NP'ler, sırasıyla %11 ve %10 NDF değerlerine karşılık gelen ~50 nm ve 106 nm boyutlarında maksimuma sahipti. Gözlemler, PBAT peletlerinden elde edilen NP'lerin PBAT filmlerinden daha düzgün dp değerleri (~ 50-110 nm) verdiğini göstermektedir; Bununla birlikte, 300 nm ile 700 nm arasında, maksimum 531 nm olan bir parçacık alt popülasyonu da bir arada var olmuştur (Şekil 5).
PBAT filminin kimyasal bağlanma özellikleri FITR spektroskopisi ile değerlendirildi. Spectra, 1300 ila 700 cm-1 arasındaki bölgelerde milletvekilleri için frezeleme ve NP'ler için ıslak taşlama nedeniyle sadece küçük değişiklikler gösterdi. Bununla birlikte, nişasta bileşeni10'un emilimini yansıtan nişastaların C-O gerilmesinde, malç filmi için önemli bir azalma gözlenmiştir. Bununla birlikte, 1800 cm-1 ile 1230 cm-1 arasında C-H ve C-O germe gibi PBAT'ı temsil eden bantlar için küçük değişiklikler gözlenmiştir, bu da ıslak taşlama işlemine atfedilen polyester için yapıda önemsiz değişiklikler olduğunu düşündürmektedir (Şekil 6).
Resim 1: Mikro ve nanoplastikleri oluşturmak ve karakterize etmek için akış diyagramı. Gösterim, oluşum sürecini ve ardından geometrik ve kimyasal parçacık değerlendirmesini gösterir. Geometrik özellikler, stereomikroskopi ve görüntü analizi (ImageJ) birleştirilerek belirlendi ve ardından sayısal istatistiksel analiz yapıldı. Moleküler bağlanma gibi kimyasal karakterizasyon, zayıflatılmış toplam yansıma (FTIR-ATR) kullanılarak Fourier transformasyon kızılötesi spektrometrisi yoluyla gerçekleştirildi. Polimerlerin moleküler yapısı, tamamlayıcı bir yöntem olarak nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ile değerlendirilebilir (bu çalışmada tanımlanmamıştır). Her adım için, anahtar noktalar aşağıdaki yordamda vurgulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Döner kesme değirmeni aparatı. (a) besleme haznesi, ön cam plaka ve elek yuvası dahil olmak üzere döner değirmen tertibatının görüntüleri; (b) Elek boyutları #20 (840 μm) ve #60 (250 μm) olan münferit dağıtım boruları, kaba elek ile başlayarak değirmen elek yuvasına takılır; ve (c) çift katmanlı cam ön plaka taşlama odasının önüne tutturulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yazılım tarafından işlenmiş görüntüler de dahil olmak üzere mikroplastiklerin (MP) stereomikrografları. Görüntüler, (a) PBAT peletlerinden (106 μm elek fraksiyonu) ve (b) kriyojenik maruziyet ve ardından mekanik frezeleme ile hazırlanan PBAT filminden (250 μm elek fraksiyonu) türetilen MP'lere aitti. Beyaz PBAT parçacıklarını (a) görüntülemek için siyah bir arka plan seçildi ve siyah PBAT filmi (b) için beyaz bir arka plan seçildi. İlgili görüntüler sırasıyla ImageJ yazılımı31 (c) ve (d) tarafından işlenmiştir. (e) PBAT peletlerinin ve (f) PBAT filminin stereograflarından türetilen parçacıkların histogramlarında gösterilen dp dağılımının en uygun modeli, normal bir dağılımla temsil edilir. Hata çubukları bir standart sapmayı yansıtır. Bir stereomikroskop, entegre bir kamera kafasına sahip stereomikrografları topladı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Üst üste bindirilmiş en iyi eğri uyumuna sahip parçacık şekli faktör dağılımı histogramları. Görüntü milletvekillerini temsil eder: (a) PBAT peletleri için dairesellik ve (c) en boy oranı ve (b) PBAT filmi için dairesellik ve (d) en boy oranı, ImageJ analizi31'e dayanmaktadır. Stereomikrograflar, PBAT peletlerinin (106 μm) ve PBAT BDM MP'lerinin (250 μm) iki elek fraksiyonu parçacıklarına dayanmaktadır. Sayısal analiz V 15 istatistik yazılımında yapılmıştır. Stereograflar ve histogramlar karşılık gelen görüntüleri temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: NP'ler için parçacık boyutunun histogramları (dp). Şekil, PBAT filminden türetilen partikül dağılımlarını ve 106 μm MP elek fraksiyonunun ıslak öğütme işleminden oluşan PBAT peletlerini temsil etmektedir. Eğriler, istatistiksel yazılım kullanılarak yürütülen boyut dağılımına uyan iki parametreli Weibull modelini temsil eder. Veri ölçümleri dinamik ışık saçılması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. MNP'nin temsili FTIR spektrumları, farklı işleme adımları arasında karşılaştırılır. Şekil, PBAT filminin, PBAT-milletvekillerinin ve PBAT-NP'lerin başlangıç koşulları arasındaki karşılaştırmayı göstermektedir. PBAT filmi, kuru öğütülmüş plastiklerin 106 μm elek fraksiyonundan oluşan milletvekillerinin mekanik frezelenmesinden önce kriyojenik olarak işlendi; NP'ler, kuru frezeleme ve eleme işleminden sonra 106 μm elek fraksiyonu milletvekillerinin ıslak öğütülmesiyle üretilmiştir. Spektral veriler, elmas zayıflatılmış toplam yansıtma (ATR) bağlantısı ile donatılmış bir spektrometre kullanılarak toplandı. Spektral veri analizi FTIR spektrum analiz yazılımı kullanılarak yapılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| PBAT peletleri | PBAT filmi | |
| Elek fraksiyonu, μm | 106 | 250 |
| Normal dp, μm | 65 | 113 |
| Std Dev, μm | 24 | 58 |
| Döngüsellik | 0.68 | 0.47 |
| En Boy Oranı | 1.73 | 2.33 |
| En uygun, dp | Normal | Normal |
| En uygun, Döngüsellik | Weibull Belediyesi | Weibull Belediyesi |
| En iyi uyum, En Boy Oranı | Lognormal | Lognormal |
| N | 83 | 125 |
Tablo 1: Temsili parçacık boyutu ve şekil parametreleri. Sonuçlar, Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterilen PBAT peletleri ve PBAT filminden işlenen milletvekilleri için istatistiksel analizlerden elde edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, başlangıçta önceki bir yayın29'da tanımlanan, çevresel çalışmalar için pelet ve malç filmlerinden elde edilen MNP'leri hazırlamak için etkili bir süreci tanımlamaktadır. Boyut küçültme işlemi, model MNP'leri üretmek için kriyojenik soğutma (yalnızca film için), kuru frezeleme ve ıslak taşlama aşamalarını içeriyordu. Bu yöntemi, düşük yoğunluklu polietilen (LDPE), polibütirat adipat-ko-tereftalat (PBAT) ve polilaktik asit (PLA)29 (Astner ve ark., hazırlık aşamasında makale) dahil olmak üzere çok çeşitli polimerik hammaddelerden MNP'ler hazırlamak için uyguladık. Bununla birlikte, LDPE için, yalnızca peletler hammadde olarak hizmet edebilir; malç filmleri, önceki bir yayında açıklandığı gibi, ekstrüzyon sırasında filme dahil edilen bir takviye ızgarası nedeniyle işlenemedi29.
Protokoldeki kritik adımlar arasında a) genel olarak esnek filmin gevrekleştirilmesini sağlayan kriyojenik ön işlem, b) tarımsal uygulamalar (çiftçilik, toprak işleme) yoluyla mekanik etkiyi simüle etmek için frezeleme ve c) MP-toprak çarpışmaları arasındaki çevresel kesme olaylarını taklit eden ıslak öğütme yer almaktadır. Bu yöntemle oluşturulan MNP'lerin, tarım topraklarında meydana gelen parçacıkları polistiren mikro ve nanosferlerden daha fazla temsil etme olasılığı daha yüksektir. Bununla birlikte, ikincisi, toprak mikrobiyal toplulukları34,35,36, bitkiler 37 ve toprak faunası38 üzerindeki etkisini araştıran çevresel çalışmalarda sıklıkla mühendislik model malzemeleri olarak kullanılmaktadır.
Çeşitli yöntemler, döner ve bilyalı değirmenler39,40,41,42 kullanılarak kriyojenik frezeleme ve taşlama dahil olmak üzere vekil NP'ler üretmiştir. Ek olarak, sıvı azot ile birlikte frezeleme, MNP'leri40,41,42,43,44,45 oluşturmak için sıklıkla kullanılmıştır. Buna karşılık, sırasıyla MPs ve NPs39 üretmek için ıslak bilyalı frezeleme ile birlikte ultrasantrifüjlü kuru frezeleme prosedürü (kriyojenik işlem olmadan) kullanılmıştır. Buna karşılık, bu makalede açıklanan yöntem, hava koşullarına maruz kalma ve mekanik kesme kuvvetleri gibi çevresel etkileri taklit etmek için plastik filmlerden MNP'ler üretmek için kriyojenik ıslatma-karıştırma-frezeleme-taşlamanın ucuz bir kombinasyonunu kullanır. Bu nedenle, yakın tarihli bir çalışma, kriyojenik olarak oluşturulmuş çevresel olarak yıpranmış tarımsal plastik filmler arasındaki mekanik ve kimyasal özellik değişikliklerini karşılaştırmıştır. Sonuçlar, oluşan MNP'lerin geometrik özellikleri, fizikokimyasal özellikleri ve biyolojik parçalanabilirliğinde istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermiştir (Astner ve ark., yayınlanmamış).
Mekanik-kriyojenik frezeleme yönteminin bir sınırlaması, fraksiyonların ilk frezeleme geçişinden (~% 10 ağırlıkça) sonra nispeten düşük eleme verimidir <840 μm, bu da iki geçiş daha gerektirir ve bu da >840 μm29'luk daha büyük fraksiyonlara kıyasla daha uzun bir işleme süresine neden olur. 46 μm fraksiyon verimi ağırlıkça% 1 ila% 2 arasında olduğundan, NP'leri oluşturmak için ıslak taşlama prosedürü için 106 μm partikül fraksiyonu kullanılmıştır. Ek olarak, frezeleme işlemi sırasındaki sürtünme, işleme odasının aşırı ısınmasına neden olabilir, bu da diğer çalışmalarda açıklandığı gibi frezeleme işlemi sırasında parçacıkların veya film parçalarının aglomerasyonuna ve termal bozulmasına neden olur29,46. Bu makalede açıklanan kriyojenik frezeleme yönteminin bir başka kısıtlaması, zayıf termal özelliklere (yani, düşük cam geçiş sıcaklıkları) sahip LDPE filmleri veya PBS peletleri gibi plastikler için sınırlı bir uygulamadır. LDPE filmlerinin lifli yapısı nedeniyle eski plastiklerin işlenmesi imkansızdı. Ek olarak, ikincisi değirmeni tıkadı, çünkü mekanik kesme freze odasındaki sıcaklığı arttırdı. Buna karşılık, LDPE peletlerinin kriyojenik soğutma kullanılmadan frezeleme yoluyla işlenmesi kolaydı. Milletvekilleri için d p s'nin karşılaştırılması, nominal elek boyutundan 250 μm fraksiyon için 106 μm dp fraksiyonundan daha büyük bir sapma göstermektedir. Bununla birlikte, her iki eleme fraksiyonu da monodispers normal dağılımı izlemiştir (Şekil 3e, f ve Tablo 1), film veya pelet hammaddeleri için benzer bozulma mekanizmalarını düşündürmektedir. Buna karşılık, NP boyut analizi, PBAT filmleri için, önceki bir yayın29'a benzer şekilde, bimodal bir dağılım ve temsili boyut dağılımına sahip PBAT peletleri 50 nm ve 107 nm'de zirveye ulaştı. Bununla birlikte, pelet dağılım verileri yaklaşık 80 nm ve 531 nm'de zirveler sergiledi, bu da bozulmanın filmlerden daha az düzgün bir şekilde gerçekleştiğini gösteriyor. Daha önce kurulmuş olan yöntemin önemi, kriyojenik ön işlem, frezeleme ve ıslak taşlama gibi işleme adımlarının verimli ve ucuz kombinasyonunda yatmaktadır. Bu çalışmada PBAT filminden NP'ler için partikül boyutu dağılımları, ~ 50 nm ve ~ 200 nm'de zirveye ulaşan parçacık alt popülasyonları ile bimodal bir dağılım ile karakterize edilen, biyolojik olarak parçalanabilir plastiklerin NP oluşumu29 üzerinde yapılan bir ön çalışmaya benzer; Bununla birlikte, ikincisi, daha önce Astner ve ark. tarafından gerçekleştirilen 27 geçişe kıyasla, bu çalışmadaki daha yüksek geçiş sayısına (60) dayanarak, Şekil 5'te gösterildiği gibi biraz daha küçük parçacıklarla (106 nm) sonuçlanmıştır. 29. Bu çalışma, PBAT filmlerinden türetilen NP oluşumunun ön çalışma sonuçlarını takip ettiğini göstermektedir.
Bu yöntemin sağlamlığının bir başka kanıtı, kimyasal bileşimin kriyojenik işlem, frezeleme ve ıslak öğütme nedeniyle önemli ölçüde değişmemesidir (Şekil 6). Ek olarak, pelet ve film (partikül boyutu dağılımları), ortalama dp veya şekil parametreleri gibi hammadde stokları arasındaki farklar anlamlı olarak farklılık göstermemiştir (Şekil 3 ve Şekil 4). Çevresel olarak dağılmış MNP'ler ve bunların karasal organizmalar üzerindeki ekotoksik etkileri47,48 ve deniz biyotası 49,50 yaygın olarak bildirilmiştir. Bununla birlikte, topraklar MNP translokasyonu, bozunması ve biyobirikim için en belirgin küresel çevresel rezervuarı sunarken, bu malzemeler için sağlam ve tekdüze analitik yöntemlerin eksikliği, karasal ekosistemlerde milletvekillerinin ve NP'lerin önemli risk değerlendirme bilgi boşluklarına neden olmaktadır51. Sonuç olarak, bu yöntemin gelecekteki uygulamaları, piyasaya sürülmeden önce MNP'lerin çevresel kaderini ve ekotoksisitesini değerlendirmek için tarımsal polimer filmler için yeni geliştirilen plastik malzemelerin MNP'lerinin (örneğin, lignin ile birleştirilmiş PBAT) hazırlanmasını ve karakterize edilmesini içerebilir. Bu nedenle, bu protokol, kriyojenik frezeleme yoluyla milletvekilleri ve ıslak öğütme yoluyla NP'ler üretmek ve sonuçta ortaya çıkan MNP'lerin boyutsal ve kimyasal karakterizasyonu için standartlaştırılmış bir protokol olarak çevresel çalışmalara hizmet edebilir. Ek olarak, türetilmiş parçacıklar karasal ve deniz ortamlarında kader, ekotoksisite, ulaşım ve biyolojik bozunma gibi çevresel çalışmalarda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma Herbert Ziraat Koleji, Biyosistem Mühendisliği ve Toprak Bölümü ve Tennessee Üniversitesi, Knoxville'deki Bilim İttifakı tarafından finanse edildi. Ayrıca, yazarlar bu araştırma için USDA Hibe 2020-67019-31167 aracılığıyla sağlanan finansal desteği minnetle kabul etmektedir. PBAT bazlı biyobozunur malç filminin MNP'lerini hazırlamak için ilk hammaddeler BioBag Americas, Inc. (Dunevin, FL, ABD) ve PBAT peletleri Mobius, LLC (Lenoir City, TN) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum dish, 150 mL | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 08-732-103 | Drying of collected NPs |
| Aluminum dish, 500 mL | VWR International, Radnor, PA, USA | 25433-018 | Collecting NPs after wet-grinding |
| Centrifuge | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Centrific 228 | Container for centrifugation |
| Delivery tube, #20, 840 µm | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3383M30 | Sieving of the first fraction during milling |
| Delivery tube, #60, 250 µm | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3383M45 | Sieving of the second fraction (3x) during milling |
| Thermomixer, 5350 Mixer | Eppendorf North America, Enfield, CT, USA | 05-400-200 | Analysis of sieving experiments |
| FT-IR Spectrum Two, spectrometer with attenuated total reflectance (ATR) | Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | L1050228 | Measuring FTIR spectra |
| Glass beaker, 1000 mL | DWK Life Sciences, Milville, NJ, USA | 02-555-113 | Stirring of MPs-water slurry before grinding |
| Glass front plate | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3383N55 | Front cover plaste for Wiley Mini Mill |
| Glass jar, 50 mL | Uline, Pleasant Prairie, WI, USA | S-15846P | Collective MPs after milling |
| Glove Box, neoprene | Bel-Art-SP Scienceware, Wayne, NJ, USA | BEL-H500290000 | 22-Inch, Size 10 |
| Zetasizer Nano ZS 90 size analyzer | Malvern Panalytical, Worcestershire, UK | Zetasizer Nano ZS | Measuring nanoplastics dispersed in DI-water |
| Microscope camera | Nikon, Tokyo, 108-6290, Japan | Nikon Digital Sight 10 | Combined with Olympus microscope to receive digital images |
| Microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | Model SZ 61 | Imaging of MPs |
| Nitrogen jar, low form dewar flasks | Cole-Palmer, Vernon Hills, IL, USA | UX-03771-23 | Storage of liquid nitrogen during cryogenic cooling |
| Accurate Blend 200, 12-speed blender | Oster, Boca Raton, FL, USA | 6684 | Initiating the size reduction of cryogenically treated plastic film |
| PBAT film, - BioAgri™ (Mater-Bi®) | BioBag Americas, Inc, Dunedin, FL, USA | 0.7 mm thick | Feedstock to form MPs and NPs, agricultural mulch film |
| PBAT pellets | Mobius, LLC, Lenoir City, TN, USA | Diameter 3 mm | Feedstock to form microplastics (MPs) and nanoplastics (NPs) trough milling and grinding |
| Plastic centrifuge tubes, 50 mL | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 06-443-18 | Centrifugation of slurry after wet-grinding |
| Plastic jar, 1000 mL, pre-cleaned, straight sided | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 05-719-733 | Collection of NPs during and after wet grinding |
| Polygon stir bars, diameterø=8 mm, length=50.8 mm | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14-512-127 | Stirring of MPs slurry prior to wet-grinding |
| Scissors, titanium bonded | Westcott, Shelton, CT, USA | 13901 | Cutting of initial PBAT film feedstocks |
| Square glass cell with square aperture and cap, 12 mm O.D. | Malvern Panalytical, Worcestershire, UK | PCS1115 | Measuring of NPs particle size |
| Stainless steel bottom, 3 inch, pan | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 8401 | For sieving after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 140 (106 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1308 | For sieving after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 20 (850 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1296 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 325 (45 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1313 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel sieve, 3 inch, No. 60 (250 µm) | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 1303 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel top cover, 3 inch | Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA | 8406 | Sieving of MPs after Wiley-milling |
| Stainless steel tweezers | Global Industrial, Port Washington, NY, USA | T9FB2264892 | Transferring of frozen film particles from jar into blender |
| Vacuum oven, model 281A | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 13-262-50 | Vacuum oven to dry NPs after wet-grinding |
| Friction grinding machine, Supermass Colloider | Masuko Sangyo, Tokyo, Japan | MKCA6-2J | Grinding machine to form NPs from MPs |
| Wet-grinding stone, grit size: 297 μm -420 μm | Masuko Sangyo, Tokyo, Japan | MKE6-46DD | Grinding stone to form NPs from MPs |
| Wiley Mini Mill, rotary cutting mill | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | NC1346618 | Size reduction of pellets and film into MPs and NPs |
| Software | |||
| FTIR-Spectroscopy software | Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | Spectrum 10 | Collection of spectra from the initial plastic, MPs and NPs |
| Image J, image processing program | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.53n | Analysis of digital images received from microscopy |
| Microscope software, ds-fi1 software | Malvern Panalytical , Malvern, UK | Firmware DS-U1 Ver3.10 | Recording of digital images |
| Microsoft, Windows, Excel 365, spreadsheet software | Microsoft, Redmond, WA, USA | Office 365 | Calculating the average particle size and creating FTIR spectra images |
| JMP software, statistical software | SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2021 | Version 15 | Statistical analysis of particle size and perform best fit of data set |
| Unscrambler software | Camo Analytics, Oslo, Norway | Version 9.2 | Normalizing and converting FTIR spectra into .csv fromat |
References
- Jin, Z., Dan, L. Review on the occurrence, analysis methods, toxicity and health effects of micro-and nano-plastics in the environment. Environmental Chemistry. (1), 28-40 (2021).
- Kumar, M., et al. Current research trends on micro-and nano-plastics as an emerging threat to global environment: a review. Journal of Hazardous Materials. 409, 124967 (2021).
- Alimba, C. G., Faggio, C., Sivanesan, S., Ogunkanmi, A. L., Krishnamurthi, K. Micro (nano)-plastics in the environment and risk of carcinogenesis: Insight into possible mechanisms. Journal of Hazardous Materials. 416, 126143 (2021).
- Serrano-Ruiz, H., Martin-Closas, L., Pelacho, A. M. Biodegradable plastic mulches: Impact on the agricultural biotic environment. Science of The Total Environment. 750, 141228 (2021).
- Hayes, D. G., et al. Biodegradable plastic mulch films for sustainable specialty crop production. Polymers for Agri-Food Applications. , Springer. Cham. 183-213 (2019).
- Viaroli, S., Lancia, M., Re, V. Microplastics contamination of groundwater: Current evidence and future perspectives. A review. Science of The Total Environment. , 153851 (2022).
- Rillig, M. C., Lehmann, A.
- Anunciado, M. B., et al. Effect of environmental weathering on biodegradation of biodegradable plastic mulch films under ambient soil and composting conditions. Journal of Polymers and the Environment. 29 (9), 2916-2931 (2021).
- Yang, Y., et al. Kinetics of microplastic generation from different types of mulch films in agricultural soil. Science of The Total Environment. 814, 152572 (2022).
- Hayes, D. G., et al. Effect of diverse weathering conditions on the physicochemical properties of biodegradable plastic mulches. Polymer Testing. 62, 454-467 (2017).
- Schwaferts, C., Niessner, R., Elsner, M., Ivleva, N. P. Methods for the analysis of submicrometer-and nanoplastic particles in the environment. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 112, 52-65 (2019).
- Gigault, J., et al. Current opinion: what is a nanoplastic. Environmental Pollution. 235, 1030-1034 (2018).
- Naqash, N., Prakash, S., Kapoor, D., Singh, R. Interaction of freshwater microplastics with biota and heavy metals: a review. Environmental Chemistry Letters. 18 (6), 1813-1824 (2020).
- Manzoor, S., Naqash, N., Rashid, G., Singh, R. Plastic material degradation and formation of microplastic in the environment: A review. Materials Today: Proceedings. , 3254-3260 (2022).
- de Souza Machado, A. A., et al. Impacts of microplastics on the soil biophysical environment. Environmental Science & Technology. 52 (17), 9656-9665 (2018).
- Jacques, O., Prosser, R. A probabilistic risk assessment of microplastics in soil ecosystems. Science of The Total Environment. 757, 143987 (2021).
- Kwak, J. I., An, Y. -J. Microplastic digestion generates fragmented nanoplastics in soils and damages earthworm spermatogenesis and coelomocyte viability. Journal of Hazardous Materials. 402, 124034 (2021).
- Wahl, A., et al. Nanoplastic occurrence in a soil amended with plastic debris. Chemosphere. 262, 127784 (2021).
- Vighi, M., et al. Micro and nano-plastics in the environment: research priorities for the near future. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology Volume 257. , 163-218 (2021).
- Pironti, C., et al. Microplastics in the environment: intake through the food web, human exposure and toxicological effects. Toxics. 9 (9), 224 (2021).
- Zurier, H. S., Goddard, J. M. Biodegradation of microplastics in food and agriculture. Current Opinion in Food Science. 37, 37-44 (2021).
- Horton, A. A., Dixon, S. J. Microplastics: An introduction to environmental transport processes. Wiley Interdisciplinary Reviews: Water. 5 (2), 1268 (2018).
- Panno, S. V., et al. Microplastic contamination in karst groundwater systems. Groundwater. 57 (2), 189-196 (2019).
- Su, Y., et al. Delivery, uptake, fate, an transport of engineered nanoparticles in plants: a critical review and data analysis. Environmental Science: Nano. 6 (8), 2311-2331 (2019).
- Yu, Y., Griffin-LaHue, D. E., Miles, C. A., Hayes, D. G., Flury, M. Are micro-and nanoplastics from soil-biodegradable plastic mulches an environmental concern. Journal of Hazardous Materials Advances. 4, 100024 (2021).
- Hayes, D. G. Enhanced end-of-life performance for biodegradable plastic mulch films through improving standards and addressing research gaps. Current Opinion in Chemical Engineering. 33, 100695 (2021).
- Qin, M., et al. A review of biodegradable plastics to biodegradable microplastics: Another ecological threat to soil environments. Journal of Cleaner Production. 312, 127816 (2021).
- Phuong, N. N., et al. Is there any consistency between the microplastics found in the field and those used in laboratory experiments. Environmental Pollution. 211, 111-123 (2016).
- Astner, A., et al. Mechanical formation of micro-and nano-plastic materials for environmental studies in agricultural ecosystems. Science of The Total Environment. 685, 1097-1106 (2019).
- Rist, S., Hartmann, N. B. Aquatic ecotoxicity of microplastics and nanoplastics: lessons learned from engineered nanomaterials. Freshwater Microplastics. , Springer. Cham. 25-49 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Raju, S., et al. Improved methodology to determine the fate and transport of microplastics in a secondary wastewater treatment plant. Water Research. 173, 115549 (2020).
- Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution and mass concentration of nanoplastics and microplastics: addressing some analytical challenges in the sub-micron size range. Journal of Colloid and Interface Science. 588, 401-417 (2021).
- Xu, M., et al. Polystyrene microplastics alleviate the effects of sulfamethazine on soil microbial communities at different CO2 concentrations. Journal of Hazardous Materials. 413, 125286 (2021).
- Ding, L., et al. Insight into interactions of polystyrene microplastics with different types and compositions of dissolved organic matter. Science of The Total Environment. 824, 153883 (2022).
- Abbasimaedeh, P., Ghanbari, A., O'Kelly, B. C., Tavanafar, M., Irdmoosa, K. G. Geomechanical behaviour of uncemented expanded polystyrene (EPS) beads-clayey soil mixtures as lightweight fill. Geotechnics. 1 (1), 38-58 (2021).
- Li, Z., Li, Q., Li, R., Zhou, J., Wang, G. The distribution and impact of polystyrene nanoplastics on cucumber plants. Environmental Science and Pollution Research. 28 (13), 16042-16053 (2021).
- Sobhani, Z., Panneerselvan, L., Fang, C., Naidu, R., Megharaj, M. Chronic and transgenerational effects of polystyrene microplastics at environmentally relevant concentrations in earthworms (Eisenia fetida). Environmental Toxicology and Chemistry. 40 (8), 2240-2246 (2021).
- Lionetto, F., Esposito Corcione, C., Rizzo, A., Maffezzoli, A. Production and characterization of polyethylene terephthalate nanoparticles. Polymers. 13 (21), 3745 (2021).
- Dümichen, E., et al. Analysis of polyethylene microplastics in environmental samples, using a thermal decomposition method. Water Research. 85, 451-457 (2015).
- Robotti, M., et al. Attrition and cryogenic milling production for low pressure cold gas spray and composite coatings characterization. Advanced Powder Technology. 27 (4), 1257-1264 (2016).
- Ducoli, S., et al. A different protein corona cloaks "true-to-life" nanoplastics with respect to synthetic polystyrene nanobeads. Environmental Science: Nano. 9 (4), 1414-1426 (2022).
- El Hadri, H., Gigault, J., Maxit, B., Grassl, B., Reynaud, S. Nanoplastic from mechanically degraded primary and secondary microplastics for environmental assessments. NanoImpact. 17, 100206 (2020).
- Eitzen, L., et al. The challenge in preparing particle suspensions for aquatic microplastic research. Environmental research. 168, 490-495 (2019).
- Ekvall, M. T., et al. Nanoplastics formed during the mechanical breakdown of daily-use polystyrene products. Nanoscale advances. 1 (3), 1055-1061 (2019).
- Caldwell, J., et al. Fluorescent plastic nanoparticles to track their interaction and fate in physiological environments. Environmental Science: Nano. 8 (2), 502-513 (2021).
- Zeb, A., et al. Evaluating the knowledge structure of micro-and nanoplastics in terrestrial environment through scientometric assessment. Applied Soil Ecology. 177, 104507 (2022).
- Ji, Z., et al. Effects of pristine microplastics and nanoplastics on soil invertebrates: A systematic review and meta-analysis of available data. Science of The Total Environment. 788, 147784 (2021).
- de Alkimin, G. D., Gonçalves, J. M., Nathan, J., Bebianno, M. J. Impact of micro and nanoplastics in the marine environment. Assessing the Effects of Emerging Plastics on the Environment and Public Health. , IGI Global. 172-225 (2022).
- Pires, A., Cuccaro, A., Sole, M., Freitas, R. Micro (nano) plastics and plastic additives effects in marine annelids: A literature review. Environmental Research. , 113642 (2022).
- Hurley, R. R., Nizzetto, L. Fate and occurrence of micro (nano) plastics in soils: Knowledge gaps and possible risks. Current Opinion in Environmental Science & Health. 1, 6-11 (2018).
