Summary
يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق لتوليف لبنات بناء microgel لسقالات الجسيمات الملدنة المسامية الدقيقة ، والتي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من تطبيقات الطب التجديدي.
Abstract
منصة سقالة الجسيمات المصلبة المسامية الدقيقة (MAP) هي فئة فرعية من الهلاميات المائية الحبيبية. وهو يتألف من ملاط قابل للحقن من المواد الهلامية الدقيقة التي يمكن أن تشكل سقالة مستقرة هيكليا مع مسامية على نطاق الخلية في الموقع بعد خطوة ربط كيميائية ثانوية قائمة على الضوء (أي التلدين). أظهرت سقالة MAP نجاحا في مجموعة متنوعة من تطبيقات الطب التجديدي ، بما في ذلك التئام الجروح الجلدية ، وتكبير الطية الصوتية ، وتوصيل الخلايا الجذعية. تصف هذه الورقة طرق توليف وتوصيف المواد الهلامية الدقيقة متعددة (الإيثيلين جلايكول) (PEG) باعتبارها اللبنات الأساسية لتشكيل سقالة MAP. وتشمل هذه الطرق تخليق ماكرومر التلدين المخصص (MethMAL) ، وتحديد حركيات هلام السلائف الدقيقة ، وتصنيع جهاز الموائع الدقيقة ، وتوليد الموائع الدقيقة من microgels ، وتنقية microgel ، وتوصيف السقالة الأساسية ، بما في ذلك تحجيم microgel وتلدين السقالة. على وجه التحديد ، يمكن لطرق الموائع الدقيقة عالية الإنتاجية الموضحة هنا إنتاج كميات كبيرة من المواد الهلامية الدقيقة التي يمكن استخدامها لتوليد سقالات MAP لأي تطبيق مرغوب فيه ، خاصة في مجال الطب التجديدي.
Introduction
منصة سقالة MAP هي مادة حيوية قابلة للحقن تتكون بالكامل من جسيمات هيدروجيل دقيقة (microgels) توفر المسامية الدقيقة على نطاق الخلية عند تقاطعها معا ، مما يسمح بهجرة الخلايا المستقلة عن التدهور وتكامل الأنسجة السائبة1. نظرا لقدرتها على الاندماج بسرعة مع الأنسجة المضيفة وانخفاض المناعة بطبيعتها ، فقد أثبتت منصة سقالة MAP قابلية التطبيق قبل السريري لمجموعة واسعة من علاجات الطب التجديدي2،3،4،5،6،7،8،9،10 ، بما في ذلك تسريع التئام الجروح الجلدية 1،3 ، 11 ، إعادة توعي تجويف السكتة الدماغيةالدماغية 7 ، وتقديم الخلايا الجذعية الوسيطة2 ، وتوفير تضخيم الأنسجة لعلاج القصور6. وقد ثبت أيضا أن MAP ينقل التأثيرات المضادة للالتهابات إلى الأنسجة المضيفة من خلال توظيف البلاعم M23 ويمكن حتى ضبطها لتعزيز الاستجابة المناعية ل Th2 "إصلاح الأنسجة"8. هذه الخصائص المواتية لمنصة سقالة MAP تسمح بتوسيعها إلى مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية.
شملت الطرق المنشورة سابقا لتوليد الهلاميات الدقيقة لتشكيل سقالة MAP قطرات التركيز على التدفق1،4،7،9 ، والرش الكهربائي5،12 ، والغزل العلوي مع مستحلب دفعة6،10. يمكن أن تنتج طريقة الموائع الدقيقة للقطرات جزيئات ذات تشتت أحادي مرتفع ولكنها تستخدم معدلات تدفق بطيئة للغاية تنتج غلات منخفضة من الجسيمات (μL / h). بدلا من ذلك ، يمكن أن تنتج طرق الرش الكهربائي ومستحلب الدفعات كمية كبيرة من الجسيمات ، ولكن مع تعدد الجسيمات العالي. يستخدم هذا البروتوكول طريقة الموائع الدقيقة عالية الإنتاجية لإنتاج المواد الهلامية الدقيقة مع مجموعة أحادية التشتت ، استنادا إلى عمل de Rutte et al13. تستخدم هذه الطريقة تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة لصنع جهاز الموائع الدقيقة متعدد الميثيل سيلوكسان (PDMS) من قناع ضوئي ، والذي يتم ربطه بعد ذلك بشريحة زجاجية. يعتمد تصميم الجهاز على الاستحلاب التدريجي لتوليد كمية كبيرة من جزيئات الميكروجيل (مل / ساعة). يوفر التشتت الأحادي الذي يمكن تحقيقه باستخدام هذه الطريقة تحكما فائقا في المسامية مقارنة بالتقنيات الأخرى ، حيث يمكن أن تشكل الهلاميات الدقيقة أحادية التشتت سقالات بأحجام مسام أكثر اتساقا2.
تم تحديد طرق توليف وتوصيف الهلاميات الدقيقة الفردية التي يمكن أن تكون بمثابة لبنات بناء لسقالات MAP في هذه المخطوطة ، وتحديدا من حيث إنشاء microgels التي تتكون من العمود الفقري PEG مع مجموعة ماليميد (MAL) ، والتي تشارك بسهولة في إضافة فعالة من نوع مايكل مع روابط متقاطعة وظيفية من الثيول لجيلات الدقيقة. لفصل هلام الميكروجيل عن تلدين سقالة MAP ، تصف هذه المخطوطة أيضا كيفية توليف14 ماكرومر تلدين مخصص منشور ، MethMAL ، وهو ميثاكريلاميد / ماليميد غير متجانس الوظائف 4-arm PEG macromer. وتشارك المجموعات الوظيفية للميثاكريلاميد بسهولة في البلمرة الضوئية القائمة على الجذور الحرة (للتلدين الهلامي الدقيق)، بينما تظل خاملة نسبيا للظروف التي تشجع على إضافة نوع مايكل للمجموعات الوظيفية لجيش تحرير ليبريا.
بالإضافة إلى ذلك ، تحدد هذه المخطوطة بروتوكولات إنشاء أجهزة الموائع الدقيقة PDMS ، وتحديد حركيات الهلام المجهري ، وتوصيف حجم microgel. يفصل الجزء الأخير من المخطوطة تلدين سقالة MAP ، وهو عندما يتم نقل الهلاميات الدقيقة في الموقع إلى سقالة سائبة من خلال خطوة ربط متقاطعة ثانوية بدأتها الصور تربط تساهميا أسطح الهلاميات الدقيقة معا. من المهم ملاحظة أن هناك طرق تلدين أخرى يمكن تنفيذها في أنظمة سقالات MAP التي لا تعتمد على الكيميائيات القائمة على الضوء ، مثل التلدين بوساطة الإنزيم ، كما هو موضح سابقا1. بشكل عام ، يمكن استخدام هذه الطرق مباشرة أو استخدامها مع كيمياء صياغة هيدروجيل مختلفة (على سبيل المثال ، تعتمد على حمض الهيالورونيك) لإنشاء سقالات MAP لأي تطبيق.
Protocol
1. الميثامال تلدين توليف الماكرومر
ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص خصيصا لتعديل 1 غرام من PEG-maleimide ولكن يمكن توسيعه لعمل دفعات أكبر.
- أضف 1 غرام من 4 أذرع 20 كيلو دالتون PEG-maleimide إلى 10 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4) في كوب زجاجي صغير مع شريط تحريك. حرك المحلول عند 300 دورة في الدقيقة حتى يذوب PEG بالكامل (~ 30 دقيقة).
- أضف 14.65 ملغ من 2-aminoethanethiol (0.67: 1 ثيول [SH] إلى نسبة موليميد [MAL]) إلى التفاعل مع التحريك عند 300 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: ستضاف مجموعات الثيول على 2-aminoethanethiol إلى ما يقرب من ثلاثة أذرع من PEG-MAL عن طريق إضافة من نوع مايكل ، تاركة مجموعات نهاية الأمين.- لاحظ حساب المثال التالي لمقدار 2-aminoethanethiol لإضافته:
ملاحظة: لتجنب قياس كمية صغيرة جدا، قم بإذابة 100 ملغ من 2-أمينو إيثانيثيول في 1 مل من 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) وإضافة 146.5 ميكرولتر من هذا المحلول إلى التفاعل.
- لاحظ حساب المثال التالي لمقدار 2-aminoethanethiol لإضافته:
- انتظر لمدة 1 ساعة و 10 دقائق بعد الخطوة 1.2.، ثم امزج 160.1 ملغ من 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM، 12:1 نسبة مولارية إلى PEG) و 32.77 ميكرولتر من حمض الميثاكريليك (8:1 نسبة مولية إلى PEG) في 5 مل من 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) في كوب زجاجي جديد وتفاعل لمدة 50 دقيقة مع التحريك عند 300 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يتفاعل حمض الميثاكريليك مع DMTMM لتشكيل استر شديد التفاعل يمكن بعد ذلك أن يقترن بمجموعات الأمين المتاحة على PEG.- لاحظ المثال التالي للحساب لحساب مقدار DMTMM المراد إضافته:
- لاحظ حساب المثال التالي لحساب كمية حمض الميثاكريليك لإضافتها:
- لاحظ المثال التالي للحساب لحساب مقدار DMTMM المراد إضافته:
- أضف محلول حمض الميثاكريليك / DMTMM إلى الكأس باستخدام محلول 20 kDa PEG-MAL / 2-aminoethanethiol.
- أضف 53.56 ميكرولتر من ثلاثي إيثيلامين (1:1 نسبة مولية إلى حمض الميثاكريليك) إلى الكوب واتركه يتفاعل بين عشية وضحاها مع التحريك عند 300 دورة في الدقيقة. قم بتغطية الكأس بورق القصدير لمنع الغبار والملوثات الأخرى من دخول الدورق.
- لاحظ حساب المثال التالي لكمية ثلاثي إيثيلامين المراد إضافتها:
- لاحظ حساب المثال التالي لكمية ثلاثي إيثيلامين المراد إضافتها:
- نقل التفاعل إلى أنابيب غسيل الكلى جلد الثعبان (قطع الوزن الجزيئي: 3500 Da).
- ضع أنبوب غسيل الكلى في كوب كبير مع 1 مليون كلوريد الصوديوم في ماء منزوع الأيونات (DI) (يجب أن يغطي الحجم الأنابيب بالكامل) لمدة 3 أيام مع التحريك عند 300 دورة في الدقيقة. قم بتغيير محلول كلوريد الصوديوم 1M 2x يوميا لما مجموعه ست غسلات.
- انزع الديالي لمدة 6 ساعات في ماء DI. قم بتغيير مياه DI كل ساعة لما مجموعه ست غسلات.
- انقل التفاعل إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتجمد عند -80 درجة مئوية.
- قم بتجميف الأنبوب لمدة 72 ساعة على الأقل عند درجة حرارة بدء -70 درجة مئوية ومنحدر درجة حرارة 0.01 درجة مئوية / دقيقة حتى 0 درجة مئوية.
- تحضير العينة ل 1H-NMR عن طريق إذابة 25 ملغ من MethMAL في 700 ميكرولتر من الكلوروفورم د ونقلها إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي.
- الحصول على أطياف 1H-NMR.
ملاحظة: تم الحصول على الأطياف في هذا البروتوكول باستخدام مطياف 500 ميجاهرتز مع المعلمات التالية: عرض الاجتياح = 6467.3 هرتز، وتأخير الوقت = 13.1 ثانية، ووقت الاكتساب = 5.1 ثانية، ووقت النبض = 5.1 ميكروثانية، وعدد عمليات المسح = 8. - للتحليل ، قم بدمج ذروة ماليميد كمرجع (~ 6.76 جزء في المليون) ثم دمج قمتي ميثاكريلاميد (~ 5.35 جزء في المليون و 5.6 جزء في المليون). قسمة نسبة مناطق ذروة الميثاكريلاميد على المساحة الإجمالية لجميع القمم الثلاث للحصول على النسبة المئوية للأذرع المعدلة بالميثاكريلاميد.
ملاحظة: التعديل المقبول هو استبدال المجموعة الوظيفية للميثاكريلاميد بنسبة 67٪ -75٪. ويبين الشكل 1 مثال 1طيف H-NMR للميثمال.- استخدم المعادلة (1) كدرجة معادلة الاستبدال:
(1)
- استخدم المعادلة (1) كدرجة معادلة الاستبدال:
(1)
الشكل 1: التركيب الكيميائي وطيف H-NMR 1ل MethMAL. (أ) التركيب الكيميائي: يتكون ماكرومر التلدين من 20 كيلو دالتون 4 ذراع بولي (جلايكول الإيثيلين) المعدل بثلاثة أذرع ميثاكريلاميد. (ب) يولد هذا الهيكل قمم عند 5.36 جزء في المليون (3) و 5.76 جزء في المليون (2) غير موجودة في أطياف PEG-MAL ، وذراع ماليميد واحد ، يولد ذروة عند 6.71 جزء في المليون (1). ولد المذيب ، الكلوروفورم ، ذروة عند 7.26 جزء في المليون ، وولدت المياه المتبقية في هذه العينة ذروة عند 2.2 جزء في المليون (موسومة على الأطياف). في أطياف MethMAL ، كان لقمة ماليميد مساحة متكاملة قدرها 0.27 ، وكان مجموع مناطق قمم الميثاكريلاميد 0.73 (0.37 + 0.36). كانت النسبة المئوية لتعديل الميثاكريلاميد 73٪ (0.73 / (0.27 + 0.73)). وهذا الرقم مأخوذ من Pfaff et al.14. حقوق الطبع والنشر (2021) الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. حركية الهلام السلائف ميكروجيل
ملاحظة: يمكن تعديل وقت الهلام عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت المستخدم لإذابة مكونات السلائف الهلامية. بالنسبة للهيدروجيل PEG-maleimide ، فإن الرقم الهيدروجيني الأكثر حمضية يتوافق عادة مع وقت الهلام الأبطأ حيث ينخفض تركيز الثيولات عند درجة الحموضةالمنخفضة 15.
- حدد مسبقا التركيزات المطلوبة من البوليمر ، و crosslinker ، وغيرها من مكونات السلائف الهلامية (أي الببتيدات ، glycosaminoglycans). قم بإذابة PEG-MAL ، RGD ، و MethMAL (PEG-backbone) في 10x PBS (الرقم الهيدروجيني 1.5) و MMP-2 crosslinker في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4).
ملاحظة: في هذا البروتوكول، يكون محلول السلائف الهلامية عبارة عن تركيبة منشورة3، تتكون من 45.88 ملغم/مل من 4 أذرع PEG-MAL (10 كيلوداد)، و0.82 ملغم/مل RGD، و8.06 ملغم/مل ميثمال، و4.62 مغ/مل MMP-2 (رابط متقاطع قابل للتحلل إنزيميا). - قم بإعداد مقياس لزوجة، أو أداة مكافئة، لمراقبة معامل التخزين والفقدان باستخدام حجم فجوة يبلغ 0.4 مم، وإجهاد قص يبلغ 1.0، وتردد 1.0 هرتز، ومدة 10800 ثانية.
- قم بتوصيل هندسة دوار لوحة 35 مم (P35 / Ti). استخدم غرفة رطبة أو إسفنجة رطبة حول الهندسة للحفاظ على بيئة رطبة.
- امزج العمود الفقري PEG و MMP-crosslinker بنسبة حجمية 1: 1.
- ماصة 400 ميكرولتر من محلول السلائف الهلامية على وسط مرحلة مقياس اللزوجة.
- اخفض الهندسة ببطء على المسرح حتى تصل إلى حجم الفجوة المحدد مسبقا البالغ 0.4 مم وابدأ على الفور في مراقبة وحدات التخزين (G) والفقدان (G'') لمدة تصل إلى 6 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يعتبر الهلام يبدأ عندما يصبح معامل التخزين أكبر من معامل الفقدان، ويعتبر الهلام كاملا عندما يكون معامل التخزين هضابا. يظهر منحنى حركية الهلام التمثيلي في الشكل 2.
الشكل 2: المنحنى التمثيلي لحركية الهلام لمحلول سلائف هلام MAP (الرقم الهيدروجيني 4.5) الذي يحدده مقياس اللزوجة. يبدأ الهلام عند الزيادة السريعة في معامل التخزين (G) ، ويكتمل الهلام عندما تهدر منحنى G. G'' يشير إلى معامل الخسارة. هذا الرقم مأخوذ من Pruett et al.3. حقوق الطبع والنشر (2021) Wiley-VCH GmBH. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. تصنيع جهاز الموائع الدقيقة
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تصنيع الجهاز لتصميم جهاز استحلاب خطوة الموائع الدقيقة المقتبس من de Rutte et al.13 ، والذي يمكن رؤيته في الشكل 3A. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع أي تصميم جهاز محفور في رقاقة SU-8. يوصى بالاستعانة بمصادر خارجية لتصنيع رقاقة السيليكون الرئيسية SU-8 ، ما لم تكن مرافق غرف الأبحاث المناسبة متاحة للتصنيع.
- قم بإنشاء أول جهاز متعدد الميثيل سيلوكسان (PDMS) من قناع ضوئي رقاقة SU-8.
- تحضير ~ 200 غرام من PDMS عن طريق خلط القاعدة وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 ث / ث (انظر جدول المواد).
- ضع رقاقة SU-8 في طبق استزراع (قم بربط حواف الرقاقة بالطبق) ، مع توجيه تصميم الموائع الدقيقة لأعلى.
- صب PDMS في الطبق لإنشاء طبقة بسماكة 1-1.5 سم فوق الرقاقة. ضع الطبق تحت الفراغ لإزالة أي فقاعات.
- دع PDMS يشفى حتى يتصلب (24 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو ~ 2 ساعة عند 60 درجة مئوية).
- بمجرد شفاء PDMS ، استخدم بعناية شفرة حلاقة أو مشرط لقطع مستطيل من خلال PDMS ، بحيث يكون هناك هامش 0.5-1 سم حول التصميم على الرقاقة.
ملاحظة: لا تستخدم الكثير من الضغط وكن لطيفا جدا لتجنب إتلاف (على سبيل المثال ، التشقق ، الخدش) الرقاقة. - إسفين ملعقة في واحدة من القطع وتحريكها على طول التخفيضات لفصل PDMS عن رقاقة.
ملاحظة: عندما ينفصل PDMS عن الرقاقة ، ستبدأ فقاعة الهواء في التكون تحت PDMS (راجع الشكل 3B). - استخدم الملعقة لرفع مستطيل PDMS بلطف خارج الطبق.
ملاحظة: ستكون الفجوة الناتجة في PDMS فوق الرقاقة هي القالب لأجهزة الموائع الدقيقة.
- قم بإنشاء أجهزة PDMS microfluidic اللاحقة من قناع ضوئي رقاقة SU-8.
- تحضير ~ 15-20 غرام من PDMS لكل قالب عن طريق خلط القاعدة وعامل المعالجة بنسبة 10: 1.
- صب PDMS في الفجوة المستطيلة في القالب لإنشاء طبقة 5 مم من PDMS فوق الرقاقة. ضع القالب تحت الفراغ لإزالة أي فقاعات.
- دع PDMS يشفى حتى يتصلب تماما (24 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو 2 ساعة عند 60 درجة مئوية).
- بمجرد شفاء PDMS ، استخدم شفرة حلاقة أو مشرط لقطع PDMS حول حواف المستطيل.
ملاحظة: لا تستخدم الكثير من الضغط وكن لطيفا جدا لتجنب إتلاف (أي تكسير) الرقاقة. - إسفين ملعقة في واحدة من القطع وتحريكها على طول التخفيضات لفصل PDMS عن رقاقة.
ملاحظة: عندما ينفصل PDMS عن الرقاقة ، ستبدأ فقاعة الهواء في التكون تحت PDMS. - استخدم لكمة خزعة 1.5 مم لإنشاء ثقوب من خلال مستطيل PDMS عند المدخلين والمخرج (راجع الشكل 3B).
- إذا كانت هناك أجهزة متعددة على رقاقة واحدة ، فاستخدم ملعقة أو شفرة حلاقة لتسجيل PDMS برفق بين كل جهاز ، ثم قم بطي PDMS بلطف على طول الخطوط المسجلة بحيث ينفصل PDMS بشكل نظيف للغاية من تلقاء نفسه.
- قم بتخزين أجهزة PDMS في حاوية خالية من الغبار.
- ربط أجهزة PDMS microfluidic بالشرائح الزجاجية.
- قم بإعداد شريحة زجاجية واحدة لكل جهاز PDMS ميكروفلويديكس. استخدم الشريط أو الهواء المصفى أو غسولات كحول الأيزوبروبيل (IPA) لإزالة أي غبار من الشريحة. تأكد من أن الشرائح جافة تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- ضع شريحة زجاجية وجهاز PDMS ، جانب التصميم لأعلى ، بجانب بعضهما البعض على صينية بلاستيكية صغيرة (غطاء لوحة 96 بئر يعمل بشكل جيد لهذا الغرض) وضعه في منظف البلازما. أغلق الباب وصمام تدفق الهواء وقم بتشغيل مضخة التفريغ. اتركه يعمل لمدة 30 ثانية على الأقل ، ثم قم بإيقاف تشغيله.
- قم بتوصيل أنبوب غاز خزان الأكسجين بصمام تدفق الهواء. دع غرفة البلازما تملأ بالأكسجين لمدة 30 ثانية ، ثم أطفئ الأكسجين ، وأغلق صمام تدفق الهواء.
- قم بتشغيل مضخة التفريغ واضبط مستوى الترددات الراديوية (RF) على عالي. انتظر حتى تتحول الغرفة إلى لون بنفسجي وردي (راجع الشكل 3B). السماح 30 ثانية لتمرير.
- عندما ينطفئ المؤقت ، قم بإيقاف تشغيل البلازما والفراغ. ثم افتح صمام تدفق الهواء ببطء لتحرير الفراغ. قم بإزالة الدرج من منظف البلازما.
- اقلب جهاز PDMS برفق على الشريحة الزجاجية لربطه. عندما يحدث الترابط ، لاحظ الاختلاف الطفيف في شفافية PDMS.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بتخزين الأجهزة المستعبدة على درجة حرارة 60 درجة مئوية حتى قبل الاستخدام مباشرة.
- معالجة السطح لأجهزة الموائع الدقيقة PDMS
- تحضير المعالجة السطحية عن طريق تخفيف PFOCTS (ثلاثي الكلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane) في زيت Novec (1:50). استخدم 1 مل ل 3-4 أجهزة. انقل وحدة التخزين إلى حقنة 1 مل وأرفق إبرة 25 جم.
ملاحظة: الإبر المستخدمة في هذا البروتوكول مشطوفة، لذا انتبه عند التعامل مع الأدوات الحادة. يمكن أيضا استخدام الإبر الحادة إذا رغبت في ذلك. - قطع قطعة 10-12 سم من أنابيب Tygon لكل جهاز سيتم معالجتها.
- قطع قطعة من أنابيب PEEK ، ~ 7 سم في الطول. أدخل بضعة ملليمترات من أنبوب PEEK في نهاية أنابيب Tygon ، كما هو موضح في الشكل 4A ، للمساعدة في منع الإبرة من ثقب مداخل أنابيب Tygon.
- أخرج الجهاز (الأجهزة) من الغرفة المسخنة وأدخل الطرف غير PEEK لأنبوب Tygon في فتحة المدخل المائي.
- أدخل إبرة حقنة المعالجة السطحية في أنبوب PEEK وقم بتغطية فتحة مخرج غرفة الزيت (راجع الشكل 3B).
- حقن العلاج في الجهاز ببطء وتأكد من أنه يملأ الجهاز ، دون فقاعات. انتظر حتى تمتلئ الغرف المائية أولا ، تليها القنوات الأصغر ، ثم غرفة النفط. قم بإزالة أنبوب Tygon من الجهاز. بمجرد ملء الجهاز ، اتركه يرتاح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- املأ حقنة 5 مل بالزيت فقط (بدون سيلان) وأرفق إبرة 25 جم.
- قم بشفط المعالجة السطحية من الجهاز من خلال المداخل والمخرجات. أدخل أنابيب Tygon في المدخل المائي ، وأدخل المحقنة بالزيت في أنابيب PEEK ، واغسل كل جهاز بالزيت. شفط الزيت من الجهاز.
- كرر تدفق الزيت 2x أكثر. قم بإزالة أنابيب Tygon.
ملاحظة: الجهاز جاهز للاستخدام.
- تحضير المعالجة السطحية عن طريق تخفيف PFOCTS (ثلاثي الكلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane) في زيت Novec (1:50). استخدم 1 مل ل 3-4 أجهزة. انقل وحدة التخزين إلى حقنة 1 مل وأرفق إبرة 25 جم.
الشكل 3: جهاز PDMS الموائع الدقيقة. (أ) التصميم بمساعدة الكمبيوتر (AutoCAD) رسم تصميم جهاز الموائع الدقيقة. يحدث تكوين قطرات Microgel في القنوات الموجودة على جانبي قناة الزيت ، كما هو موضح في النتوء المكبر. (ب) نظرة عامة على تصنيع أجهزة PDMS. اختصار: PDMS = بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. توليد الموائع الدقيقة من microgels
- حدد مسبقا التركيزات المطلوبة من البوليمر ، و crosslinker ، وغيرها من مكونات السلائف الهلامية (أي الببتيدات ، glycosaminoglycans). قم بإذابة PEG-MAL ، RGD ، و MethMAL (PEG-backbone) في 10x PBS (الرقم الهيدروجيني 1.5) و MMP-2 crosslinker جنبا إلى جنب مع 5 ميكرومتر من البيوتين-ماليميد في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4).
ملاحظة: في هذا البروتوكول، يكون محلول السلائف الهلامية عبارة عن تركيبة منشورة3 تتكون من 45.88 ملغم/مل من 4 أذرع PEG-MAL (10 كيلودادبايت)، و0.82 ملغم/مل RGD، و8.06 ملغم/مل ميثمال، و4.62 ملغم/مل MMP-2 (رابط متقاطع قابل للتحلل إنزيميا). الطرق الموضحة أدناه سوف تنتج ~ 3 مل من microgels. - تحضير 6 مل من محلول الفاعل بالسطح عن طريق تخفيف المخزون 5 ٪ FluoroSurfactant إلى 1 ٪ على الأقل في زيت نوفيك. أضف هذا الحل إلى حقنة 10 مل.
ملاحظة: الفاعل بالسطح المفلور غير قابل للامتزاج بالماء ، مما يسمح بإزالته بسهولة أثناء انتقال الجل إلى المرحلة المائية أثناء غسل PBS في خطوة التنقية. - قطع ثلاث قطع من أنابيب Tygon التي هي طول مناسب لارتفاع مضخة حقنة.
- قطع قطعتين من أنابيب PEEK ، ~ 1 بوصة في الطول. أدخل بضعة ملليمترات من أنبوب PEEK في نهاية قطعتين من أنابيب Tygon ، كما هو موضح في الشكل 4A ، للمساعدة في منع الإبرة من ثقب مداخل أنابيب Tygon.
- أدخل الطرف غير PEEK لأنبوب Tygon في مداخل أجهزة الموائع الدقيقة. أدخل القطعة المتبقية من أنابيب Tygon (بدون أنابيب PEEK في النهاية) في منفذ جهاز الموائع الدقيقة ، كما هو موضح في الشكل 4C.
- أضف ما لا يقل عن 3 مل من الزيت إلى حقنة بلاستيكية سعة 5 مل وقم بإرفاقها بإبرة 25 جم. أدخل الإبرة بعناية في أنبوب PEEK على أحد مداخل Tygon. اغسل الأنابيب والجهاز بالزيت برفق. جمع الزيت من المخرج في أنبوب مخروطي. كرر تدفق الزيت على مدخل Tygon الآخر.
- اضبط مضخات المحاقن على معدلات التدفق المطلوبة.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول 3 مل/ساعة لمعدل التدفق المائي و6 مل/ساعة لمعدل تدفق الزيت. قد تكون هناك حاجة لاستخدام مضختين حقنتين منفصلتين. - قم بتوصيل المحقنة التي تحتوي على الفاعل بالسطح بمدخل الزيت عبر إبرة 25 جم (راجع الشكل 4A) وقم بتوزيع ما يكفي من الزيت بلطف لتشغيل الأنابيب وقناة الزيت الخاصة بجهاز الموائع الدقيقة.
- بمجرد إعداد الجهاز ومداخل الزيت ، أضف 0.5 مل من الزيت إلى حقنة جديدة سعة 5 مل ، والتي ستحتوي على السلائف الهلامية. الغرض من هذه الكمية الصغيرة من الزيت هو المساعدة في طرد محلول السلائف من خلال جهاز microfuilidic في نهاية التشغيل.
- في أنبوب مخروطي ، اجمع 1.5 مل من محلول العمود الفقري PEG و 1.5 مل من محلول الوصلة المتقاطعة. دوامة لمدة 30 ثانية ونقل بسرعة حل السلائف هلام مجتمعة إلى حقنة 5 مل.
- قم بتوصيل المحقنة بمحلول السلائف الهلامية بالمدخل المائي عبر إبرة 25 جم. قم بتوزيع محلول كاف بلطف لتشغيل الأنابيب والقناة المائية.
- قم بتثبيت المحاقن على مضخات المحاقن المعنية واضغط على تشغيلها (راجع الشكل 4B). تأكد من وجود سائل يتدفق عبر كل من القنوات المائية والزيتية.
ملاحظة: يوصى باستخدام المجهر لتصور تكوين microgel داخل جهاز PDMS. - ابحث عن جزيئات ذات حجم موحد من القنوات (راجع الشكل 4D). جمع microgels من مخرج في أنبوب مخروطي.
الشكل 4: إعداد الموائع الدقيقة. (أ) تصوير طريقة توصيل أنابيب PEEK (أعلى) وأنابيب Tygon بإبرة 25 G على حقنة (أسفل). (ب) إعداد الموائع الدقيقة باستخدام مضخات المحاقن والأنابيب والجهاز والمجهر. (ج) صورة لإعداد جهاز الموائع الدقيقة ، مع مدخلين (مائي وزيتي) ومنفذ واحد. (د) مخطط لجهاز الموائع الدقيقة وصورة تمثيلية لحقل ساطع لتكوين ميكروجيل متوقع من القنوات في جهاز استحلاب الخطوة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. تنقية وتعقيم الهلام الدقيق
- بمجرد اكتمال الهلام (يتم تحديده كوقت لتخزين معامل الهضبة في توصيف حركية الهلام) ، استخدم ماصة لإزالة مرحلة الزيت بعناية من أسفل الأنبوب (راجع الشكل 5). قم بإيداع هذا في حاوية نفايات مناسبة للنفايات المفلورة.
ملاحظة: يمكن تسريع وقت التبلور عن طريق إضافة قاعدة عضوية قابلة للذوبان إلى أنبوب التجميع (على سبيل المثال ، ثلاثي إيثيلامين) ، ولكن من المهم ملاحظة أن إضافة قاعدة قوية قد تحلل أي ماليميدات غير متفاعلة. إذا كان من المرغوب فيه تشغيل microgels من خلال malimides الزائدة بعد التبلور ، تخطي إضافة ثلاثي إيثيلامين. - أضف المزيد من الزيت إلى أنبوب تجميع microgel بنسبة 1: 1. اخلطي عن طريق قلب أنبوب التجميع برفق. لا دوامة.
- دع أنبوب التجميع يستقر لمدة 5 دقائق تقريبا للسماح للمراحل بالفصل. ابحث عن الطور النفطي في الأسفل والطور المائي (الهلاميات الدقيقة) في الأعلى (راجع الشكل 5).
- كرر غسل الزيت 2x على الأقل أكثر.
- أضف المزيد من الزيت بنسبة 1: 1 مع الجل وأضف 1x PBS بنسبة 4: 1 PBS إلى الهلام. عكس للخلط عدة مرات. لفصل الطبقات ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند ~ 2000 × g ل ~ 30 ثانية. ابحث عن مرحلة الزيت في أسفل الأنبوب ، والجل في الوسط ، و PBS في الأعلى (راجع الشكل 5).
- قم بإزالة مرحلة الزيت باستخدام ماصة وتخلص منها في حاوية نفايات.
ملاحظة: لا تقم بإزالة PBS. استخدم أنبوبا مخروطيا أكبر لمواصلة الغسيل إذا كان أنبوب التجميع الأصلي 15 مل. - كرر الزيت ويغسل PBS 2x أكثر. ابحث عن الجل للانتقال من غير شفاف إلى واضح عن طريق الغسيل النهائي ، كما هو موضح في الشكل 5 ، مما يشير إلى أنه تمت إزالة الفاعل بالسطح وأن الجل في مرحلة PBS.
- إزالة كل النفط. لا تقم بإزالة PBS من الأنبوب المخروطي.
- في غطاء الدخان الكيميائي ، استخدم ماصة زجاجية لإضافة الهكسانات إلى الأنبوب بحجم مساو ل PBS. دوامة الأنبوب المخروطي لمدة 30 ثانية أو حتى تخلط جيدا. جهاز طرد مركزي عند 4,696 × جم لمدة 5 دقائق.
- بعد الانفصال ، ابحث عن الهكسانات في الطبقة العليا ، PBS في الوسط ، والجل في الأسفل (راجع الشكل 5). قم بإزالة طبقة الهكسان وتخلص منها في حاوية للنفايات العضوية. شفط PBS.
- كرر الهكسان و PBS يغسل ما لا يقل عن 2x أكثر أو حتى يبدو الجل شفافا تقريبا (راجع الشكل 5). اغسل الجل باستخدام PBS 1x أكثر حتى تتم إزالة أي هيكسانات متبقية. جهاز طرد مركزي عند 4,696 × جم لمدة 5 دقائق. شفط طبقة PBS. احرص على عدم إزعاج حبيبات الهلام.
- لتغطية أو إخماد أي ماليميدات غير متفاعلة في الهلام الدقيق ، قم بإعداد محلول 100 mM من N-acetyl-L-cysteine في 1x PBS وأضف هذا المحلول إلى الجل. ضعه على دوار أنبوب عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، متبوعا بالعديد من الغسلات باستخدام PBS لإزالة N-acetyl-L-cysteine غير المتفاعل.
- للتخزين على المدى الطويل (حتى 1 سنة) ، أعد تعليق microgels في 70٪ IPA وتخزينها في 4 درجات مئوية للمساعدة في منع نمو البكتيريا على microgels.
- لتعقيم المواد الهلامية الدقيقة ، أضف 70٪ IPA إلى الجل بنسبة 4: 1 v / v في غطاء السلامة الأحيائية. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية ، ثم جهاز الطرد المركزي في 4,696 × غرام لمدة 5 دقائق. شفط IPA supernatant من بيليه هلام في غطاء السلامة الأحيائية. قم بإجراء غسلات IPA أكثر بمقدار 2 ضعفا متبوعة بغسلات 3x مع 1x PBS معقمة.
ملاحظة: يجب إزالة جميع IPA قبل استخدام الجل مع الخلايا أو الحيوانات.
الشكل 5: نظرة عامة على إجراء تنقية الميكروجيل. الاختصارات: PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. IPA = كحول الأيزوبروبيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. توصيف حجم ميكروجيل
ملاحظة: يوصى بالسماح لجزيئات microgel بالتوازن في 1x PBS بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية لتنتفخ إلى قطرها النهائي قبل التحجيم.
- صورة جسيمات هلام.
- قم بتدوير جل MAP عند 4,696 × جم لمدة 5 دقائق وقم بشفط السوبرناتانت.
- باستخدام ماصة إزاحة إيجابية ، قم بإزالة 5 ميكرولتر من microgels من حبيبات الجل وتمييعها في 1 مل من PBS في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق (تخفيف 1:200). اضبط هذا التخفيف حسب الحاجة.
ملاحظة: أثناء صياغة محلول السلائف الهلامية ، يمكن إضافة 5 ميكرومتر من البيوتين-ماليميد واستخدامها كبديل لوضع العلامات على المواد الهلامية الدقيقة باستخدام الفلوروفور. في هذه الحالة ، يمكن إضافة الستربتافيدين فلوروفور عند تخفيف 1:300 (من مخزون 1 ملغ / مل). السماح بالحضانة مع الستربتافيدين لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل التصوير. - باستخدام ماصة إزاحة إيجابية ، انقل 100 ميكرولتر من المواد الهلامية الدقيقة المخففة إلى آبار صفيحة شفافة من 96 بئرا.
- استخدم مجهرا عريض المجال أو متحد البؤرة لتصور الهلاميات الدقيقة بهدف 10x. الحصول على صور من microgels لتحليلها.
- انظر الشكل 6 للحصول على صور متحدة البؤرة تمثيلية للميكروجيلات.
- تحجيم الجسيمات باستخدام ImageJ
- افتح ملفات الصور من المجهر في ImageJ.
- حدد تحليل | اضبط المقياس واضبط مقياس الصورة وفقا لهدف المجهر.
- حدد صورة | النوع | 8 بت.
- حدد | الصورة ضبط | العتبة ثم حدد خيار العتبة التلقائية "Otsu" من المربع المنسدل.
- انقر على تحليل | اضبط القياسات وحدد قطر Feret والحد منه إلى العتبة.
- انقر على تحليل | قم بتحليل الجسيمات وأدخل نطاق حجم المنطقة (بالبكسل ^ 2) المتوقع للميكروجيل (لاستبعاد الحطام الصغير من التحليل). تغيير التعميم إلى 0.75-1.00 وحدد إظهار | الخطوط العريضة. تحقق من عرض النتائج واستبعادها على الحواف.
ملاحظة: يستبعد مرشح الشكل الدائري المواد الهلامية الدقيقة الموجودة على حد الصورة والتي قد تسفر عن قياس قطر غير دقيق. - قم بتشغيل وحدة تحليل الجسيمات .
- انتظر الإخراج ، وهو قطر Feret لكل جسيم ، وقم بتصدير هذه النتائج إلى جدول بيانات.
- في هذا البروتوكول ، احسب مؤشر تعدد التشتت (PDI) لتحديد عدم التجانس في حجم microgel. قم بتحليل ما لا يقل عن 100 ميكروجيل لتحديد السكان: نطاق PDI من 1.00-1.05 يحدد مجموعة أحادية التشتت ، و PDI أكبر من 1.05 يحدد مجموعة متعددة التشتت. استخدم المعادلة (2) والمعادلة (3) والمعادلة (4) لحساب PDI ، كما هو موضح أدناه.
(2)
(3)
(4)
(2)
(3)
(4)
الشكل 6: الصور التمثيلية للميكروجيلات . (أ) الصورة البؤرية الفلورية لمجموعات الهلام الدقيقة أ ، (ب) صورة الهلاميات الدقيقة المتدرجة ، و (ج) الخطوط العريضة للجسيمات بعد تحليل ImageJ. (د) الصورة البؤرية الفلورية لمجموعة الميكروجيل B و (E) الصورة الضوئية المنقولة للهلاميات الدقيقة (microgels شبه شفافة). (و) تصوير النتائج التمثيلية من تحليل ImageJ المبين في هذا البروتوكول. كل من مجموعات microgel لديها PDIs أحادية الانتشار نسبيا. تم تصنيع كل من مجموعات microgels بمعدل تدفق مائي 3 مل / ساعة ومعدل تدفق زيت 6 مل / ساعة. ومع ذلك ، فإن الفرق في حجم microgel يرجع إلى الاختلافات في حجم خطوة جهاز microfluidic. على سبيل المثال ، تم تصنيع مجموعة microgel A مع جهاز microfluidic بحجم خطوة قناة 11 ميكرومتر ، وتم تصنيع مجموعة microgel B في جهاز بحجم خطوة 40 ميكرومتر. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: PDI = مؤشر تعدد التشتت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
7. الجسيمات المسامية الدقيقة الملدنة (MAP) سقالة التلدين
- إنشاء محلول مخزون من 2 mM ليثيوم فينيل-2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP) في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4).
- قم بتخفيف محلول مخزون LAP إلى 0.2 mM بحجم 1x PBS يعادل حجم الهلام. إذا كنت تستخدم البادئ الضوئي LAP لدراسات الخلايا أو الدراسات الحيوانية ، فتأكد من تعقيم المحلول قبل الاستخدام.
- قم بتدوير جل MAP عند 4,696 × جم لمدة 5 دقائق وقم بشفط السوبرناتانت.
- باستخدام ماصة إزاحة إيجابية ، انقل الحجم المطلوب من الجل إلى أنبوب طرد مركزي صغير.
- أضف 0.2 mM LAP إلى الجل بنسبة حجمية 1: 1 (تركيز LAP النهائي هو 0.1 mM).
- دوامة الخليط واحتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في الظلام.
- الطرد المركزي للخليط في 18000 × غرام لمدة 5 دقائق لتكوير الجل.
- قم بإزالة supernatant بعناية من بيليه الجل.
- انقل هلام MAP إلى الموقع المستهدف باستخدام ماصة إزاحة إيجابية.
- ضع ضوءا مركزا (365 نانومتر، 8.66 ميجاوات/سم2) على العينة لمدة 113 ثانية لصلب السقالة.
ملاحظة: تم تحسين وقت التلدين البالغ 113 ثانية كما هو منشور سابقا لتركيز LAP البالغ 0.1 mM14 ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى تحسين إضافي لتركيزات البادئ الضوئي المختلفة.
الشكل 7: تلدين سقالة MAP. (أ) مخطط تلدين سقالة MAP. عند التعرض لبادئ ضوئي وضوء ، تخضع المجموعات الوظيفية للميثاكريلاميد على ماكرومر MethMAL لتفاعل البلمرة الضوئية بنقرة ، والذي يربط أسطح المواد الهلامية الدقيقة معا. (ب) تصوير تجسيد ثلاثي الأبعاد (Imaris) لصورة مجهرية ثنائية الفوتون للهلام المجهري MAP (الأخضر) الملدن معا في شكل عفريت 3D ، مع ديكستران (أحمر) في المسام. (ج) تصوير تجسيد ثلاثي الأبعاد (Imaris) لصورة مجهرية ثنائية الفوتون تظهر مسامية سقالة MAP التي تم اختراقها مع الفلورسنت 70 kDa dextran (أحمر). أشرطة المقياس = (B) 100 ميكرومتر ، (C) 70 ميكرومتر. الاختصارات: MAP = جسيمات صلبة مسامية دقيقة; MethMAL = ماكرومر التلدين المخصص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد جميع الخطوات اللازمة لتوليف كتل بناء microgel لاستخدامها في سقالة MAP. إن ماكرومر التلدين MethMAL انتقائي وفعال للغاية ومتوافق مع العمود الفقري البوليمر المتعدد14. من المهم أن يتم تعديل ما لا يقل عن 67٪ -75٪ من 20 kDa PEG-maleimide مع مجموعات وظيفية من الميثاكريلاميد لضمان كفاءة تلدين عالية. يمكن تحديد النسبة المئوية للتعديل بسهولة أكبر من خلال تحليل قممأطياف H-NMR 1 ، كما هو موضح في الشكل 1. تعتبر حركيات الهلام ، التي يحددها مقياس اللزوجة ، مقياسا مهما يجب مراعاته لكل تركيبة هلامية. يستخدم هذا البروتوكول محلول سلائف هلامية يتكون من العمود الفقري PEG مع مجموعة MAL ، والتي تتفاعل بكفاءة مع الروابط المتقاطعة الوظيفية للثيول من أجل هلام microgelation. ومع ذلك ، يمكن استخدام العديد من كيمياء الهيدروجيل لتصنيع microgels عبر طريقة الموائع الدقيقة عالية الإنتاجية الموضحة هنا. سيوفر وقت ظهور الهلام نظرة ثاقبة على مدة توليد microgelic microfluidic. يوصى باختيار درجة الحموضة السلائف الهلامية التي يمكن أن تبدأ الهلام بين 30 دقيقة (الشكل 2) و 2 ساعة.
إذا كان وقت الهلام سريعا جدا ، فسيبدأ محلول السلائف الهلامية في البلمرة داخل جهاز الموائع الدقيقة ويسد القنوات. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم ملاحظة أن تغيير تركيزات الرباط الثيولودي (على سبيل المثال ، RGD) قد يكون له تأثيرات على تكوين الشبكة أثناء الهلام وقد يحتاج إلى حسابه عن طريق ضبط الصيغة. يمكن أن تكون خطوات تصنيع جهاز الموائع الدقيقة مملة ، ولكن تظهر النتائج التمثيلية لجهاز مرتبط بنجاح في الشكل 3. يستخدم هذا البروتوكول جهازا عالي الإنتاجية ومتوازيا ومستحلبا للموجات الدقيقة تم تكييفه من تصميم de Rutte et al.13 ، وتم الاستعانة بمصادر خارجية لتصنيع رقاقة السيليكون لشركة تكنولوجيا الموائع الدقيقة. ومع ذلك ، يمكن استخدام الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول مع أي تصميم جهاز محفور على قناع ضوئي من رقاقة السيليكون SU-8. من المهم ملاحظة أنه يجب تحسين حجم خطوة القنوات الموجودة على القناع الضوئي أثناء تصنيع الجهاز ، لأنه سيؤثر على حجم جزيئات microgel.
يجب تحسين معدلات التدفق لتوليد الموائع الدقيقة من الهلاميات الدقيقة لكل تركيبة هلامية بناء على عوامل مثل وقت الهلام وحجم الجسيمات المطلوب وتصميم جهاز الموائع الدقيقة. في حالة استخدام الجهاز عالي الإنتاجية ، يمكن أن تصل معدلات التدفق للمرحلة المائية إلى 5 مل / ساعة. يوضح الشكل 4B الإعداد للأجهزة عالية الإنتاجية المستخدمة في هذا البروتوكول. إذا كان الجهاز يعمل بشكل صحيح ، فيجب أن يبدو تكوين microgel مشابها لتلك الموضحة في الشكل 4D. قبل التنقية ، ستكون المواد الهلامية الدقيقة غير شفافة. بعد الانتهاء من غسل الزيت و PBS والهكسان المختلفة ، يجب أن يبدو الجل واضحا مثل الصورة التمثيلية في الشكل 5. في حالة دمج الفلوروفور في الهلاميات الدقيقة ، قد يكون للمنتج النقي لون طفيف ولكن يجب أن يظل قريبا من الشفاف. بعد التنقية والتورم ، يجب أن تكون المواد الهلامية الدقيقة موحدة جدا في الحجم وأن يكون لها PDI بين 1.00 و 1.05 ، كما هو موضح في الشكل 6. يمكن استخدام العديد من المحفزات الضوئية لسقالات MAP الملدنة الضوئية. إذا كنت تستخدم بديلا ل LAT ، الموضح هنا ، فيجب على المرء تحديد حركية التلدين كما هو موضح سابقا14. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام مصادر الضوء المختلفة للتلدين الضوئي ، طالما أن مصدر الضوء يتوافق مع البادئ الضوئي. يجب على المرء التأكد من معايرة وتركيز مصدر الضوء. قد تحتاج إلى تحسين وقت التلدين وشدة الضوء بناء على تركيبة الجل وتركيز البادئ الضوئي. يمكن استخدام طريقة التلدين الموضحة في هذا البروتوكول للدراسات في المختبر وفي الجسم الحي. بعد التلدين ، ستشكل الهلاميات الدقيقة سقالة مسامية يمكن تصورها باستخدام المجهر ثنائي الفوتون (الشكل 7B-C).
Discussion
يصف هذا البروتوكول طرق توليف وتوصيف المواد الهلامية الدقيقة ، والتي تعمل بمثابة لبنات بناء لسقالات الجسيمات الملدنة المسامية الدقيقة (MAP). يستخدم هذا البروتوكول نهج الموائع الدقيقة عالي الإنتاجية لتوليد كميات كبيرة من الهلاميات الدقيقة الموحدة ، والتي لا يمكن تحقيقها بطرق أخرى مثل الموائع الدقيقة التي تركز على التدفق1،4،7،9 (أحادية عالية ، منخفضة الغلة) ، مستحلب دفعة6،10 ، والرش الكهربائي5،12 (انخفاض أحادية التشتت ، غلة عالية). باستخدام الطرق الموضحة هنا ، يمكن صنع microgels monodisperse للاستخدام في سقالات MAP التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من تطبيقات الطب التجديدي (على سبيل المثال ، توصيل الخلايا ، التئام الجروح).
الخطوة الحاسمة لهذا البروتوكول هي إنشاء أجهزة PDMS microfluidic. إذا لم يتم تصنيع الأجهزة بشكل صحيح ، فقد يكون لذلك آثار سلبية في اتجاه مجرى النهر على تكوين microgel والتشتت الأحادي. من المهم منع إدخال القطع الأثرية (أي الفقاعات والغبار) في PDMS قبل أن يشفى ، لأن هذا يمكن أن يسد القنوات ويؤثر بشكل كبير على تكوين microgel. للتخفيف من هذا قدر الإمكان ، يجب على المرء استخدام الشريط لإزالة أي غبار ، وتخزين الأجهزة في حاوية خالية من الغبار ، والعمل في غطاء خال من الغبار ، إن أمكن. يوصى أيضا بتخزين الأجهزة عند 60 درجة مئوية للحصول على أفضل النتائج مع المعالجة السطحية.
عند صب أجهزة PDMS ، من المهم الحفاظ على سمك موحد يساوي أو يقل عن طول لكمة الخزعة. إذا كان الجهاز سميكا جدا ، فلن تتمكن لكمة الخزعة من الاختراق طوال الطريق. من المهم أيضا عدم تمزيق مداخل / مخرج جهاز PDMS أثناء اللكم باستخدام لكمة الخزعة و / أو إدخال الأنابيب. سيؤدي تمزق جهاز PDMS إلى تسرب من المداخل / المخرج ، مما قد يتسبب في فقدان محلول السلائف الهلامية. إذا كان هناك تسرب في جهاز PDMS ، فإن أفضل حل هو استبداله بجهاز جديد في أسرع وقت ممكن.
عند معالجة الجهاز بالبلازما ، أدى استخدام الأكسجين النقي ومعالجة البلازما لمدة 30 ثانية إلى أفضل النتائج للصق PDMS بالشريحة الزجاجية. إذا لم يرتبط الجهاز بشكل صحيح (أي أنه لا يزال من الممكن رفع PDMS من الشريحة الزجاجية بعد معالجة البلازما) ، فيجب على المرء التحقق مرة أخرى من أن معالج البلازما يعمل بشكل صحيح وأن الجهاز والشرائح قد تم تنظيفها جيدا. من المهم أيضا استخدام المعالجة السطحية السيلان الصحيحة ، وللحصول على أفضل النتائج ، يجب معالجة أجهزة PDMS السطحية مباشرة قبل الاستخدام. ويمكن أيضا استخدام طرق أخرى للمعالجة السطحية، مثل ترسب البخار الكيميائي.
خطوة أخرى حاسمة هي استخدام أجهزة PDMS microfluidic بشكل صحيح لتشكيل microgel. يوصى باستخدام نسبة معدل تدفق لا تقل عن 2: 1 (يستخدم هذا البروتوكول معدل تدفق زيت 6 مل / ساعة ومعدل تدفق مائي 3 مل / ساعة) ، ولكن يمكن ضبط ذلك لتحقيق حجم microgel المطلوب. الرقم الهيدروجيني لمحلول سلائف microgel هو أيضا مقياس مهم لتحسين لمنع انسداد الجهاز. تعمل المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) على تسريع تكوين الثيولات في كيمياء الإضافة من نوع مايكل ، وتؤدي تركيزات PBS المستخدمة في هذا البروتوكول إلى أفضل النتائج لجل الميكروجيل في أجهزة الموائع الدقيقة. بمجرد بدء تشغيل مضخات المحاقن ، قد يكون هناك بعض الفقاعات في قنوات الموائع الدقيقة ، ولكن يجب أن يتوازن هذا بعد بضع دقائق. يوصى بمراقبة تكوين microgel باستخدام المجهر. إذا كان التدفق لا يبدو مشابها كما في هذا الفيديو و / أو كان هناك عدد قليل من القنوات التي تنتج جزيئات كبيرة ، فمن المحتمل أن يكون هذا بسبب مشكلات في خطوة المعالجة السطحية. أفضل حل هو استبدال الجهاز بجهاز تمت معالجته حديثا على السطح.
إذا بدا أن المواد الهلامية الدقيقة تتلاحم ، فقد يرجع ذلك إلى عدم كفاية تركيز FluoroSurfactant. الحل الموصى به هو زيادة الوزن ٪ من الفاعل بالسطح في مرحلة النفط. ومع ذلك ، فإن أحد القيود المفروضة على استخدام تركيزات عالية من الفاعل بالسطح هو أنه قد يكون من الصعب إزالته أثناء خطوة التنقية. يوصى باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة مرة واحدة فقط ، ولكن يمكن إعادة استخدام الأجهزة إذا تم غسلها بزيت Novec مباشرة بعد الاستخدام لإزالة أي محلول مائي يمكن أن يهلام في الجهاز ويسد القنوات. في حين أن أحد أجهزة الموائع الدقيقة يمكن أن ينتج حجما عالي الإنتاجية من المواد الهلامية الدقيقة (مل / ساعة) ، يمكن قياس معدل الإنتاج هذا باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة المتعددة بالتوازي.
تعتمد خطوة التلدين لتجميع سقالة MAP على استخدام بادئ ضوئي منشط بالضوء للبلمرة الجذرية ، ويمكن اختيار البادئ الضوئي بناء على التطبيق المطلوب. على سبيل المثال ، لدى LAP photoinitiator أوقات تلدين سريعة (<30 ثانية) عند استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية طويل الموجة ، والذي له تأثير ضئيل على صلاحية الخلية في المختبر14. ومع ذلك ، يتم امتصاص هذا الطول الموجي بشكل كبير بواسطة الأنسجة16 وقد لا يكون له فعالية تلدين عالية في الجسم الحي كما هو الحال في المختبر.
Eosin Y هو بادئ ضوئي آخر يتم تنشيطه بواسطة أطوال موجية مرئية (505 نانومتر) وله اختراق أعمق في الأنسجة ، مما يعزز قدرة سقالة MAP على التلدين تحت الأنسجة. ومع ذلك ، فإن أوقات التعرض الطويلة للضوء اللازمة لتلدين Eosin Y قد تطيل من تعرض الخلايا للجذور الحرة وتؤثر على بقاء الخلايا في المختبر14. إن استخدام هذه الأساليب لتوليد عالي الإنتاجية من لبنات بناء microgel موحدة للغاية سيسرع البحث الذي يركز على سقالات MAP ويتقدم المعرفة في مجال المواد المسامية القابلة للحقن للطب التجديدي.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم لجو دي روته ومختبر دي كارلو في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، لمساعدتهم في تصميم جهاز الموائع الدقيقة الأصلي الذي تم تطوير الجهاز المبلغ عنه منه ، بالإضافة إلى إرشادهم المبكر في تصنيع جهاز PDMS واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تم إنشاء مخططات الشكل باستخدام Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
| 35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
| 4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
| 4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
| Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
| Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
| Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
| DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
| Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
| FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
| HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
| ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
| KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
| LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
| Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
| Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
| MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
| Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
| Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
| Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
| Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
| PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
| Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
| Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
| Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
| Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
| Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
| Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
| Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1801046 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Pruett, L., et al. Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation. Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advanced Materials. 29 (32), (2017).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Schaeffer, C., et al. Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration. Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Jivan, F., Alge, D. L. Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering. Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148 (2020).
- de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 101, 199-206 (2016).
- Sandell, J. L., Zhu, T. C. A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT. Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).
