Summary
이 프로토콜은 다양한 재생 의학 응용에 사용될 수 있는 미세다공성 어닐링된 입자 스캐폴드를 위한 마이크로겔 빌딩 블록을 합성하기 위한 일련의 방법을 기술한다.
Abstract
미세다공성 어닐링된 입자(MAP) 스캐폴드 플랫폼은 과립형 하이드로젤의 서브클래스이다. 이차 광기반 화학적 가교 단계(즉, 어닐링)에 이어 계내에서 세포 규모 다공성을 갖는 구조적으로 안정한 스캐폴드를 형성할 수 있는 마이크로겔의 주사용 슬러리로 구성된다. MAP 스캐폴드는 진피 상처 치유, 보컬 폴드 증강 및 줄기 세포 전달을 포함한 다양한 재생 의학 응용 분야에서 성공을 보여주었습니다. 이 논문은 MAP 스캐폴드를 형성하기 위한 빌딩 블록으로서 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 마이크로겔의 합성 및 특성화 방법을 설명한다. 이들 방법은 맞춤형 어닐링 마크로머 (MethMAL)의 합성, 마이크로겔 전구체 겔화 동역학의 결정, 마이크로유체 장치 제조, 마이크로겔의 마이크로유체 생성, 마이크로겔 정제, 및 마이크로겔 사이징 및 스캐폴드 어닐링을 포함하는 기본 스캐폴드 특성화를 포함한다. 구체적으로, 본원에 기재된 고처리량 마이크로유체 방법은 특히 재생 의학 분야에서 임의의 원하는 적용을 위해 MAP 스캐폴드를 생성하는데 사용될 수 있는 다량의 마이크로겔을 생산할 수 있다.
Introduction
MAP 스캐폴드 플랫폼은 하이드로겔 마이크로입자(마이크로겔)로 전적으로 구성된 주사용 생체재료로서, 함께 가교결합될 때 세포 규모의 미세다공성을 제공하여 분해에 독립적인 세포 이동 및 벌크 조직 통합을 가능하게 한다(1). 숙주 조직과 신속하게 통합할 수 있는 능력과 본질적으로 낮은 면역원성으로 인해, MAP 스캐폴드 플랫폼은 진피 상처 치유 가속화를 포함하여 다양한 재생 의학 요법 2,3,4,5,6,7,8,9,10에 대한 전임상 적용가능성을 입증했습니다 1,3 ,11, 뇌졸라 뇌졸강7, 중간엽 줄기세포2 전달, 응고기능 부전 치료를 위한 조직 벌크 제공6. MAP는 또한 M2 대식세포3의 모집을 통해 숙주 조직에 항염증 효과를 전달하는 것으로 밝혀졌으며, 심지어 Th2 "조직 수복" 면역 반응을 촉진하도록 조정될 수 있다8. MAP 스캐폴드 플랫폼의 이러한 유리한 특성은 다양한 임상 적용으로 확장될 수 있게 한다.
MAP 스캐폴드 형성을 위한 마이크로겔을 생성하기 위한 이전에 공개된 방법에는 유동-집속 액적-마이크로유체학 1,4,7,9, 전기 분무 5,12, 및 배치 에멀젼 6,10을 사용한 오버헤드 방사가 포함되었다. 액적 미세 유체 방법은 높은 단분산도를 가진 입자를 생성 할 수 있지만 매우 느린 유속을 사용하여 낮은 입자 수율 (μL / h)을 생성합니다. 대안적으로, 전기 분무 및 배치 에멀젼 방법은 높은 입자 다분산도를 갖지만 많은 부피의 입자를 생성할 수 있다. 이 프로토콜은 de Rutte et al.13의 작업을 기반으로 단분산 집단을 가진 마이크로겔을 생산하기 위해 고처리량 마이크로유체 방법을 사용한다. 이 방법은 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 포토 마스크에서 폴리디메틸실록산 (PDMS) 미세 유체 장치를 만든 다음 유리 슬라이드에 결합합니다. 이 장치 설계는 대량의 마이크로겔 입자(mL/h)를 생성하기 위해 단계적 유화에 의존합니다. 이 방법으로 달성될 수 있는 단분산도는 다른 기술에 비해 다공도의 우수한 제어를 제공하는데, 이는 단분산 마이크로겔이 보다 균일한 기공 크기2를 갖는 스캐폴드를 형성할 수 있기 때문이다.
MAP 스캐폴드의 빌딩 블록으로 작용할 수 있는 개별 마이크로겔을 합성하고 특성화하는 방법은 이 원고 내에 요약되어 있으며, 특히 마이크로겔 겔화를 위한 티올 기능화 가교결합제와 함께 효율적인 마이클형 첨가에 쉽게 참여하는 말레이미드(MAL) 그룹을 갖는 PEG 백본으로 구성된 마이크로겔을 만드는 측면에서 요약되어 있다. 마이크로겔 겔화를 MAP 스캐폴드 어닐링으로부터 분리하기 위해, 이 원고는 또한 이종 작용성 메타크릴아미드/말레이미드 4-arm PEG 마크로머인 공개된14 개의 커스텀 어닐링 마크로머인 MethMAL을 합성하는 방법을 기술한다. 메타크릴아미드 작용기는 자유 라디칼 광중합(마이크로겔 어닐링의 경우)에 쉽게 참여하면서, MAL 작용기에 대한 마이클형 첨가를 촉진하는 조건에 비교적 불활성으로 남아 있다.
또한이 원고는 PDMS 미세 유체 장치를 만들고, 마이크로 겔 겔화 동역학을 결정하고, 마이크로 겔 크기를 특성화하기위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 원고의 마지막 부분은 MAP 스캐폴드 어닐링 을 상세히 설명하는데, 이는 마이크로겔이 마이크로겔의 표면을 함께 공유적으로 결합시키는 보조적인, 광개시 가교 단계를 통해 벌크 스캐폴드로 계내에서 전이될 때이다. 앞서 기술한 바와 같이 효소-매개 어닐링과 같은 광-기반 화학에 의존하지 않는 MAP 스캐폴드 시스템에서 구현될 수 있는 다른 어닐링 방법이 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다1. 전반적으로, 이들 방법은 직접 사용되거나 임의의 적용을 위한 MAP 스캐폴드를 생성하기 위해 상이한 히드로겔 제형 화학(예를 들어, 히알루론산 기반)과 함께 사용될 수 있다.
Protocol
1. 메타MAL 어닐링 마크로머 합성
참고 :이 프로토콜은 1g의 PEG-말레이미드를 수정하기위한 것이지만 더 큰 배치를 만들기 위해 확장 될 수 있습니다.
- 교반 막대가 있는 작은 유리 비이커에 10 mL의 1x 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)에 1 g의 4-arm 20 kDa PEG-말레이미드를 첨가한다. PEG가 완전히 용해될 때까지 용액을 300rpm으로 저어준다(~30분).
- 14.65 mg의 2-아미노에탄티올 (0.67:1 티올[SH] 내지 말레이미드[MAL] 몰비)을 300 rpm으로 교반하면서 반응물에 첨가한다.
참고: 2-아미노에탄티올 상의 티올기는 마이클형 첨가를 통해 PEG-MAL의 대략 세 팔에 첨가될 것이고, 아민 말단기는 남게 될 것이다.- 첨가할 2-아미노에탄티올의 양에 대한 다음 실시예 계산을 관찰한다:
참고: 매우 적은 양을 측정하지 않으려면 1 mL의 1x PBS (pH 7.4)에 100 mg의 2-아미노에탄티올을 녹이고 그 용액 146.5 μL를 반응물에 첨가하십시오.
- 첨가할 2-아미노에탄티올의 양에 대한 다음 실시예 계산을 관찰한다:
- 단계 1.2.가 지난 후 1시간 및 10분 동안 기다린 후, 160.1 mg의 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(DMTMM, PEG에 대한 12:1 몰비) 및 메타크릴산 32.77 μL(PEG에 대한 8:1 몰비)를 5 mL의 1x PBS(pH 7.4)에 혼합한 후 새로운 유리 비이커에서 50분 동안 교반하면서 반응시킨다.
참고: 이 단계에서 메타크릴산은 DMTMM과 반응하여 PEG 상의 이용가능한 아민기에 결합될 수 있는 반응성이 높은 에스테르를 형성한다.- 추가할 DMTMM의 양을 계산하기 위한 다음 예제 계산을 관찰합니다.
- 첨가할 메타크릴산의 양을 계산하기 위한 다음 예제 계산을 관찰하십시오.
- 추가할 DMTMM의 양을 계산하기 위한 다음 예제 계산을 관찰합니다.
- 메타크릴산/DMTMM 용액을 20 kDa PEG-MAL/2-아미노에탄티올 용액으로 비이커에 첨가한다.
- 53.56 μL의 트리에틸아민 (메타크릴산에 대한 1:1 몰비)을 비이커에 첨가하고, 300 rpm에서 교반하면서 밤새 반응시킨다. 비커를 호일로 덮어 먼지 및 기타 오염 물질이 비이커에 들어가는 것을 방지하십시오.
- 첨가할 트리에틸아민의 양에 대한 다음 예제 계산을 관찰하십시오.
- 첨가할 트리에틸아민의 양에 대한 다음 예제 계산을 관찰하십시오.
- 반응을 뱀가죽 투석 튜브로 옮긴다(분자량 차단: 3,500 Da).
- 투석 튜빙을 탈이온화 (DI) 물 (부피가 튜브를 완전히 덮어야 함)에 1 M NaCl을 갖는 큰 비이커에 놓고 300 rpm으로 교반하면서 3 일 동안 동안 투석 튜브를 놓는다. 총 여섯 번의 세척을 위해 매일 1 M NaCl 용액을 2x 변경하십시오.
- DI 물에서 6 시간 동안 투석하십시오. DI 물을 매 시간마다 교체하여 총 여섯 번 세척하십시오.
- 반응물을 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 -80°C에서 동결시킨다.
- 튜브를 -70°C의 시작 온도와 0.01°C/min의 온도 램프에서 0°C까지 최소 72시간 동안 동결건조합니다.
- 25 mg의 MethMAL을 700 μL의 클로로포름-d에 용해시키고 NMR 튜브로 옮겨 1H-NMR용 샘플을 제조하였다.
- 1H-NMR 스펙트럼을 획득합니다.
참고: 이 프로토콜의 스펙트럼은 스윕 폭 = 6,467.3Hz, 시간 지연 = 13.1초, 수집 시간 = 5.1초, 펄스 시간 = 5.1μs, 스캔 수 = 8과 같은 매개 변수를 가진 500MHz 분광계를 사용하여 수집되었습니다. - 분석을 위해 말레이미드 피크를 기준 (~ 6.76 ppm)으로 통합 한 다음 두 개의 메타크릴 아미드 피크 (~ 5.35 ppm 및 5.6 ppm)를 통합하십시오. 메타크릴아미드 피크 면적의 비율을 세 개의 피크 모두의 총 면적으로 나누어 메타크릴아미드로 개질된 암의 백분율을 구한다.
참고: 허용되는 변형은 67%-75% 메타크릴아미드 작용기 치환이다. MethMAL에 대한 예시적인 1H-NMR 스펙트럼이 도 1에 도시되어 있다.- 방정식 (1)을 치환도 방정식으로 사용하십시오.
(1)
- 방정식 (1)을 치환도 방정식으로 사용하십시오.
(1)
그림 1: MethMAL의 화학 구조 및 1H-NMR 스펙트럼. (a) 화학 구조: MethMAL 어닐링 마크로머는 세 개의 메타크릴아미드 암으로 개질된 20 kDa4-arm 폴리(에틸렌 글리콜)로 구성된다. (b) 이 구조는 PEG-MAL 스펙트럼에 존재하지 않는 5.36 ppm (3) 및 5.76 ppm (2)에서 피크를 생성하고, 6.71 ppm (1)에서 피크를 생성하는 하나의 말레이미드 암을 생성한다. 용매인 클로로포름은 7.26 ppm에서 피크를 생성하였고, 이 샘플 내의 잔류 물은 2.2 ppm에서 피크를 생성하였다(스펙트럼에 표지됨). MethMAL 스펙트럼에서, 말레이미드 피크는 0.27의 통합 면적을 가졌고, 메타크릴아미드 피크 영역의 합은 0.73 (0.37 + 0.36)이었다. 변형된 메타크릴아미드 백분율은 73%였다(0.73/(0.27 + 0.73)). 이 수치는 Pfaff et al.14에서 나온 것이다. 저작권 (2021) 미국 화학 학회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 마이크로겔 전구체 겔화 동역학
참고: 겔화 시간은 겔 전구체 성분을 용해시키는 데 사용되는 완충액의 pH를 조정함으로써 변형될 수 있다. PEG-말레이미드 하이드로젤의 경우, 더 산성 pH는 전형적으로 티올레이트 농도가 더 낮은 pH15에서 감소하기 때문에 더 느린 겔화 시간에 상응한다.
- 중합체, 가교결합제 및 다른 겔 전구체 성분 (즉, 펩티드, 글리코사미노글리칸)의 원하는 농도를 미리 결정한다. PEG-MAL, RGD 및 MethMAL (PEG-백본)을 10x PBS (pH 1.5)에 용해시키고 MMP-2 가교결합제를 1x PBS (pH 7.4)에 용해시킨다.
참고: 이 프로토콜에서 겔 전구체 용액은 45.88 mg/mL 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0.82 mg/mL RGD, 8.06 mg/mL MethMAL 및 4.62 mg/mL MMP-2 가교결합제 (효소적으로 분해가능한 가교결합제)로 구성된 공개된 제형3이다. - 점도계 또는 이와 동등한 계측기를 준비하여 0.4mm의 갭 크기, 1.0의 전단 변형률, 1.0Hz의 주파수 및 10,800초의 지속 시간을 사용하여 저장 및 손실 모듈리를 모니터링합니다.
- 35mm 플레이트 로터(P35/Ti) 형상을 부착합니다. 가습 챔버 또는 지오메트리 주위에 습기가 많은 스폰지를 사용하여 가습 환경을 유지하십시오.
- PEG-백본 및 MMP-가교결합제를 1:1 부피비로 혼합한다.
- 겔 전구체 용액 400 μL를 점도계 스테이지의 중심 상으로 피펫한다.
- 0.4mm의 미리 결정된 간격 크기에 도달할 때까지 지오메트리를 스테이지 위로 천천히 낮추고 실온에서 최대 6시간 동안 스토리지(G') 및 손실(G'') 모듈리를 즉시 모니터링하기 시작합니다.
참고: 겔화는 저장 모듈러스가 손실 모듈러스보다 커질 때 시작되는 것으로 간주되며, 겔화는 저장 모듈러스가 고원화될 때 완료된 것으로 간주됩니다. 대표적인 겔화 동역학 곡선을 도 2에 나타내었다.
도 2: 점도계에 의해 결정된 MAP 겔 전구체 용액(pH 4.5)의 겔화 동역학의 대표적인 곡선. 겔화는 저장 (G') 모듈러스의 급격한 증가에서 시작되고, 겔화는 G' 곡선이 고원화될 때 완료된다. G''는 손실 모듈러스를 나타낸다. 이 수치는 Pruett et al.3에서 나온 것입니다. 저작권 (2021) Wiley-VCH GmBH. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 미세 유체 장치 제작
참고: 이 프로토콜은 도 3A에서 볼 수 있는 de Rutte et al.13으로부터 적응된 미세유체 단계-유화 장치 설계의 장치 제작을 기술한다. 그러나 이 프로토콜은 SU-8 웨이퍼에 에칭되는 모든 장치 설계와 함께 사용할 수 있습니다. 적절한 클린 룸 시설을 제조할 수 없는 한 SU-8 실리콘 웨이퍼 마스터 제작을 아웃소싱하는 것이 좋습니다.
- SU-8 웨이퍼 포토마스크로부터 최초의 폴리디메틸실록산(PDMS) 미세유체 장치를 만든다.
- 베이스 및 경화제를 10:1 w/w 비율로 혼합하여 ~200g의 PDMS를 준비 합니다(재료 표 참조).
- SU-8 웨이퍼를 배양 접시에 넣고(웨이퍼의 가장자리를 접시에 테이프로 붙이고), 미세유체 설계가 위를 향하게 합니다.
- PDMS를 접시에 붓고 웨이퍼 위에 1-1.5 cm 두께의 층을 만듭니다. 접시를 진공 아래에 두어 거품을 제거하십시오.
- PDMS가 응고될 때까지 경화시킨다(실온에서 24시간 또는 60°C에서 ∼2시간).
- PDMS가 경화되면 면도날이나 메스를 조심스럽게 사용하여 PDMS를 통해 사각형을 자르면 웨이퍼 상의 설계 주위에 0.5-1cm 여백이 생깁니다.
참고: 너무 많은 압력을 사용하지 말고 웨이퍼의 손상(예: 균열, 긁힘)을 방지하기 위해 매우 부드럽습니다. - 주걱을 절단 중 하나에 쐐기고 컷을 따라 밀어 웨이퍼에서 PDMS를 분리합니다.
참고: PDMS가 웨이퍼로부터 분리됨에 따라, PDMS 하에서 기포가 형성되기 시작할 것이다( 그림 3B 참조). - 주걱을 사용하여 PDMS의 사각형을 접시에서 부드럽게 들어 올립니다.
참고: 웨이퍼 위의 PDMS에서 생성된 갭은 미세유체 장치의 주형이 될 것이다.
- SU-8 웨이퍼 포토마스크로부터 후속 PDMS 미세유체 장치를 생성한다.
- 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 몰드 당 ~ 15-20g의 PDMS를 준비하십시오.
- PDMS를 몰드의 직사각형 갭에 붓고 웨이퍼 위에 5 mm PDMS 층을 만듭니다. 금형을 진공 하에 두어 거품을 제거하십시오.
- PDMS가 완전히 응고될 때까지 경화시킨다(실온에서 24시간 또는 60°C에서 2시간).
- PDMS가 경화되면 면도날이나 메스를 사용하여 사각형의 가장자리 주위에 PDMS를 자릅니다.
참고: 너무 많은 압력을 사용하지 말고 웨이퍼의 손상(즉, 크래킹)을 피하기 위해 매우 부드럽게하십시오. - 주걱을 절단 중 하나에 쐐기고 컷을 따라 밀어 웨이퍼에서 PDMS를 분리합니다.
참고: PDMS가 웨이퍼로부터 분리됨에 따라, PDMS 하에서 기포가 형성되기 시작할 것이다. - 1.5mm 생검 펀치를 사용하여 두 개의 입구와 출구에서 PDMS 사각형을 통해 구멍을 만듭니다( 그림 3B 참조).
- 단일 웨이퍼에 여러 장치가 있는 경우 주걱 또는 면도날을 사용하여 각 장치 간에 PDMS를 가볍게 채점한 다음 PDMS를 점수가 매겨진 선을 따라 부드럽게 접어 PDMS가 자체적으로 매우 깨끗하게 분리되도록 합니다.
- PDMS 장치를 먼지가 없는 컨테이너에 저장합니다.
- PDMS 미세유체 장치를 유리 슬라이드에 결합시킨다.
- PDMS 미세유체 장치 당 하나의 유리 슬라이드를 준비하십시오. 테이프, 여과된 공기 또는 이소프로필 알코올(IPA) 세척을 사용하여 슬라이드에서 먼지를 제거합니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 슬라이드가 완전히 건조되었는지 확인합니다.
- 유리 슬라이드와 PDMS 장치, 디자인 측면을 위로 올려 놓고 작은 플라스틱 트레이 (96 웰 플레이트 뚜껑이이를 위해 잘 작동)에 서로 옆에 놓고 플라즈마 클리너에 놓습니다. 도어와 공기 흐름 밸브를 닫고 진공 펌프를 켭니다. 적어도 30 초 동안 실행 한 다음 끄십시오.
- 산소 탱크 가스 튜브를 공기 흐름 밸브에 연결하십시오. 플라즈마 챔버를 30 초 동안 산소로 채우고 산소를 끄고 공기 흐름 밸브를 닫습니다.
- 진공 펌프를 켜고 고주파(RF) 레벨을 높음으로 설정합니다. 챔버가 보라색-분홍색으로 바뀔 때까지 기다리십시오( 그림 3B 참조). 30초가 지나도록 허용합니다.
- 타이머가 꺼지면 플라즈마와 진공을 끕니다. 그런 다음 공기 흐름 밸브를 천천히 열어 진공을 방출하십시오. 플라즈마 클리너에서 트레이를 분리합니다.
- PDMS 장치를 유리 슬라이드 위로 부드럽게 뒤집어 결합합니다. 접합이 일어날 때, PDMS의 투명성에서 약간의 차이를 관찰한다.
참고: 최상의 결과를 얻으려면 사용 직전까지 접합된 장치를 60°C에 보관하십시오.
- PDMS 미세유체 장치의 표면 처리
- PFOCTS (트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸) 실란)를 Novec 오일 (1:50)에 희석하여 표면 처리를 준비한다. 3-4 장치에 1 mL를 사용하십시오. 부피를 1 mL 주사기로 옮기고 25 G 바늘을 부착한다.
참고 :이 프로토콜에 사용 된 바늘은 비스듬하므로 날카로운 것을 처리 할 때주의하십시오. 원하는 경우 무딘 바늘도 사용할 수 있습니다. - 처리 할 장치 당 10-12cm 타이곤 튜브 조각을 자릅니다.
- 길이가 ~ 7cm 인 PEEK 튜브 조각을 자릅니다. 그림 4A와 같이 몇 밀리미터의 PEEK 튜빙을 타이곤 튜빙의 끝에 삽입하여 바늘이 타이곤 튜브 입구에 구멍을 뚫는 것을 방지합니다.
- 가열된 챔버에서 장치를 꺼내 Tygon 튜브의 비 PEEK 끝을 수성 입구 구멍에 삽입합니다.
- 표면 처리 주사기의 바늘을 PEEK 튜브에 삽입하고 오일 챔버 출구 구멍을 덮습니다( 그림 3B 참조).
- 처리를 장치에 천천히 주입하고 거품없이 장치를 채우십시오. 수성 챔버가 먼저 채워질 때까지 기다렸다가 더 작은 채널을 누른 다음 오일 챔버를 채 웁니다. 장치에서 Tygon 튜브를 분리합니다. 장치가 채워지면 실온에서 10 분 동안 휴식을 취하십시오.
- 5 mL 주사기를 오일만(실란 없음)으로 채우고 25G 바늘을 부착합니다.
- 표면 처리를 입구와 출구를 통해 장치 밖으로 흡인하십시오. 타이곤 튜브를 수성 입구에 삽입하고, 오일이 있는 주사기를 PEEK 튜브에 넣고, 각 장치를 오일로 플러시합니다. 장치에서 오일을 흡인하십시오.
- 오일 플러시를 2배 더 반복하십시오. 타이곤 튜브를 분리합니다.
참고: 장치를 사용할 준비가 되었습니다.
- PFOCTS (트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸) 실란)를 Novec 오일 (1:50)에 희석하여 표면 처리를 준비한다. 3-4 장치에 1 mL를 사용하십시오. 부피를 1 mL 주사기로 옮기고 25 G 바늘을 부착한다.
그림 3: 미세유체 PDMS 장치. (A) 미세유체 장치 설계의 컴퓨터 지원 설계(AutoCAD) 도면. 마이크로겔 액적 형성은 확대된 노두에서 볼 수 있듯이 오일 채널의 양쪽에 있는 채널에서 발생합니다. (B) PDMS 장치 제작의 개요. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 마이크로겔의 마이크로유체 생성
- 중합체, 가교결합제 및 다른 겔 전구체 성분 (즉, 펩티드, 글리코사미노글리칸)의 원하는 농도를 미리 결정한다. PEG-MAL, RGD 및 MethMAL (PEG-백본)을 10x PBS (pH 1.5)에 용해시키고, MMP-2 가교결합제를 5 μM의 비오틴-말레이미드와 함께 1x PBS (pH 7.4)에 용해시킨다.
참고: 이 프로토콜에서, 겔 전구체 용액은 45.88 mg/mL 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0.82 mg/mL RGD, 8.06 mg/mL MethMAL 및 4.62 mg/mL MMP-2 가교결합제 (효소적으로 분해가능한 가교제)로 구성된 공개된 제형3 이다. 아래에 설명 된 방법은 ~ 3 mL의 마이크로 젤을 산출합니다. - 스톡 5% 플루오로계면활성제를 Novec 오일에서 적어도 1%로 희석하여 계면활성제 용액 6 mL를 준비한다. 이 용액을 10 mL 주사기에 첨가하십시오.
참고: 플루오르화 계면활성제는 물과 혼화성이 없으며, 이는 정제 단계에서 PBS 세척 동안 수성상으로의 겔 전이 동안 용이하게 제거될 수 있게 한다. - 주사기 펌프 높이에 적합한 길이인 타이곤 튜브 세 개를 자릅니다.
- PEEK 튜브 두 조각을 잘라, ~ 1 인치 길이. 그림 4A와 같이 두 밀리미터의 PEEK 튜브를 두 조각의 Tygon 튜브 끝에 삽입하여 바늘이 타이곤 튜브 입구에 구멍을 뚫지 않도록 합니다.
- Tygon 튜빙의 비 PEEK 끝을 미세 유체 장치의 입구에 삽입하십시오. 그림 4C와 같이 Tygon 튜브의 나머지 부분(끝에 PEEK 튜빙이 없음)을 미세유체 장치 출구에 삽입합니다.
- 5 mL 플라스틱 주사기에 적어도 3 mL의 오일을 첨가하고 25 G 바늘에 부착하십시오. 바늘을 타이곤 입구 중 하나에 있는 PEEK 튜브에 조심스럽게 삽입합니다. 튜브와 장치를 오일로 부드럽게 내뿜습니다. 원뿔형 튜브의 배출구에서 오일을 수집하십시오. 다른 Tygon 입구에서 오일 플러시를 반복합니다.
- 주사기 펌프를 원하는 유량으로 설정하십시오.
참고: 이 프로토콜은 수성 유량에 대해 3mL/h, 오일 유량에 대해 6mL/h를 사용합니다. 두 개의 개별 주사기 펌프를 사용해야 할 수도 있습니다. - 계면활성제를 포함하는 주사기를 25 G 바늘을 통해 오일 유입구에 연결하고( 도 4A 참조) 미세유체 장치의 튜브 및 오일 채널을 프라이밍하기에 충분한 오일을 부드럽게 분배한다.
- 장치 및 오일 유입구가 설치되면 0.5mL의 오일을 겔 전구체가 포함된 새로운 5mL 주사기에 첨가합니다. 이 소량의 오일의 목적은 마이크로 fuilidic 장치를 통해 전구체 용액을 실행의 끝쪽으로 플러시하는 것을 돕는 것입니다.
- 원뿔형 튜브에서, 1.5 mL의 PEG-백본 용액과 1.5 mL의 가교결합 용액을 결합한다. 30 s 동안 소용돌이 치고, 결합된 겔 전구체 용액을 5 mL 주사기로 신속하게 옮긴다.
- 주사기를 겔 전구체 용액과 25 G 바늘을 통해 수성 입구에 연결한다. 튜브와 수성 채널을 프라이밍하기에 충분한 용액을 부드럽게 분배하십시오.
- 주사기를 각 주사기 펌프에 클램프하고 프레스 런을 실행합니다 ( 그림 4B 참조). 수성 및 오일 채널을 통해 흐르는 액체가 있는지 확인하십시오.
참고: 현미경을 사용하여 PDMS 장치 내에서 마이크로겔 형성을 시각화하는 것이 좋습니다. - 채널에서 균일한 크기의 파티클을 찾습니다( 그림 4D 참조). 원뿔형 튜브의 출구에서 마이크로겔을 수집하십시오.
그림 4: 미세유체 설정. (A) 주사기 상의 25 G 바늘에 PEEK 튜빙(상단)과 타이곤 튜빙을 연결하는 방법(하단)을 묘사한 것이다. (B) 주사기 펌프, 튜브, 장치 및 현미경을 사용한 미세 유체 설정. (C) 두 개의 입구 (수성 및 오일)와 하나의 출구가있는 미세 유체 장치 설정의 이미지. (d) 단계-유화 장치에서 채널로부터의 예상되는 마이크로겔 형성의 대표적인 밝은 필드 이미지 및 마이크로유체 장치의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 마이크로겔의 정제 및 멸균
- 겔화가 완료되면 (겔화 동역학 특성화에서 고원 모듈러스를 저장하는 시간으로 결정됨), 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 유상을 조심스럽게 제거하십시오 ( 그림 5 참조). 이것을 불소화 폐기물에 적합한 폐기물 용기에 보관하십시오.
참고: 겔화 시간은 유기 가용성 염기를 수집 튜브에 첨가함으로써 가속화될 수 있지만(예를 들어, 트리에틸아민), 강한 염기의 첨가는 임의의 미반응 말레이미드를 가수분해할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 겔화 후 과량의 말레이미드를 통해 마이크로겔을 기능화하려는 경우, 트리에틸아민의 첨가를 생략한다. - 1:1 비율로 마이크로겔 수집 튜브에 더 많은 오일을 첨가하십시오. 수집 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합하십시오. 소용돌이치지 마십시오.
- 수집 튜브가 ~ 5 분 동안 정착하여 위상이 분리 될 수 있도록하십시오. 하단의 오일상과 상단의 수성상(마이크로겔)을 찾습니다( 그림 5 참조).
- 오일 세척을 적어도 2 배 더 반복하십시오.
- 겔과 함께 1:1 비율로 더 많은 오일을 첨가하고, 겔 비율에 4:1 PBS로 1x PBS를 첨가한다. 여러 번 혼합하도록 반전하십시오. 층을 분리하려면 튜브를 ~2,000 x g 에서 ~30초 동안 원심분리한다. 튜브 하단의 오일상, 중간에 젤, 상단의 PBS를 찾습니다( 그림 5 참조).
- 피펫으로 유상을 제거하고 폐기물 용기에 버리십시오.
참고: PBS를 제거하지 마십시오. 더 큰 원뿔형 튜브를 사용하여 원래 수집 튜브가 15mL인 경우 세척을 계속합니다. - 오일을 반복하고 PBS는 2 배 더 씻습니다. 도 5에 도시된 바와 같이, 최종 세척에 의해 불투명에서 클리어로 전이하는 겔을 살펴보면, 계면활성제가 제거되고 겔이 PBS 상에 있음을 나타낸다.
- 모든 오일을 제거하십시오. 원뿔형 튜브로부터 PBS를 제거하지 마십시오.
- 화학 흄 후드에서 유리 피펫을 사용하여 PBS와 동일한 부피로 튜브에 헥산을 첨가하십시오. 원뿔형 튜브를 30 초 동안 또는 완전히 혼합 될 때까지 소용돌이 치십시오. 4,696 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- 분리 후, 상부 층의 헥산, 중간의 PBS, 하단의 겔을 찾으십시오 ( 도 5 참조). 헥산 층을 제거하고 유기 폐기물 용기에 버립니다. PBS를 흡인한다.
- 헥산 및 PBS 세척을 적어도 2배 이상 또는 겔이 거의 반투명하게 나타날 때까지 반복한다( 도 5 참조). 겔을 PBS 1x 추가로 세척하여 임의의 잔류 헥산이 제거되도록 한다. 4,696 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. PBS 층을 흡인한다. 젤 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 마이크로겔 내의 임의의 미반응 말레이미드를 캡칭하거나 켄칭하기 위해, 1x PBS 중의 N-아세틸-L-시스테인의 100 mM 용액을 제조하고, 이 용액을 겔에 첨가한다. 튜브 회전기에 놓고 하룻밤 동안 37°C에서 PBS로 세척한 다음, 미반응 N-아세틸-L-시스테인을 제거하였다.
- 장기간 보관(최대 1년)을 위해, 마이크로겔을 70% IPA에 재현탁시키고 4°C에서 저장하여 마이크로겔 상의 박테리아의 성장을 방지한다.
- 마이크로겔을 살균하려면 70% IPA를 4:1 v/v 비율로 젤에 첨가하여 생물안전 후드에 넣으세요. 튜브를 30초 동안 소용돌이치고, 4,696 × g 에서 5분 동안 원심분리한다. IPA 상청액을 겔 펠릿으로부터 생물안전 후드에 흡인시킨다. 2x IPA 세척을 더 수행한 후 멸균 1x PBS로 3x 세척을 수행합니다.
참고 : 모든 IPA는 세포 또는 동물과 함께 젤을 사용하기 전에 제거해야합니다.
도 5: 마이크로겔 정제 절차의 개요. 약어: PBS = 포스페이트-완충 식염수; IPA = 이소프로필 알코올. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 마이크로겔 크기 특성화
참고: 사이징 전에 마이크로겔 입자가 37°C에서 하룻밤 사이에 1x PBS에서 평형화되도록 하여 최종 직경으로 팽창하도록 하는 것이 좋습니다.
- 이미지 젤 입자.
- MAP 겔을 4,696 × g 에서 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인한다.
- 포지티브 변위 피펫을 사용하여, 겔 펠릿으로부터 5 μL의 마이크로겔을 제거하고, 마이크로원심분리 튜브에서 PBS 1 mL로 희석하였다(1:200 희석). 필요에 따라이 희석액을 조정하십시오.
참고: 겔 전구체 용액의 제형화 동안, 5 μM의 비오틴-말레이미드가 첨가되어 형광단으로 마이크로겔을 표지하는 대안으로 사용될 수 있다. 이 경우, 스트렙타비딘-형광단은 1:300 희석액(1mg/mL 스톡으로부터)으로 첨가될 수 있다. 영상화 전에 적어도 15분 동안 스트렙타비딘으로 인큐베이션을 허용하십시오. - 포지티브 변위 피펫을 사용하여, 희석된 마이크로겔 100 μL를 투명한 96-웰 플레이트의 웰로 옮긴다.
- 와이드필드 또는 공초점 현미경을 사용하여 마이크로젤을 10x 목표로 시각화합니다. 분석을 위해 마이크로겔의 이미지를 획득한다.
- 마이크로겔의 대표적인 공초점 이미지에 대해서는 도 6 을 참조한다.
- ImageJ가 있는 크기 조정 파티클
- ImageJ의 현미경에서 이미지 파일을 엽니다.
- | 분석 선택 스케일을 설정하고 현미경 목표에 따라 이미지 스케일을 설정합니다.
- 이미지 | 선택 유형 | 8비트.
- 이미지 | 선택 | 조정 임계값을 선택한 다음 드롭다운 상자에서 "Otsu" 자동 임계값 옵션을 선택합니다.
- | 분석을 클릭하십시오. 측정값을 설정하고 Feret의 지름을 선택하고 임계값으로 제한합니다.
- | 분석을 클릭하십시오. 입자를 분석하고 마이크로겔에 대해 예상되는 면적 크기 범위(픽셀^2)를 입력합니다(작은 파편이 분석되지 않도록 제외). 원형을 0.75-1.00으로 변경하고 | 표시를 선택합니다. 윤곽선. 결과 표시를 확인하고 가장자리에서 제외합니다.
참고: 원형 모양 필터는 부정확한 직경 측정을 생성할 수 있는 이미지 경계의 마이크로겔을 제외합니다. - 파티클 분석 모듈을 실행합니다.
- 각 파티클의 Feret의 지름인 출력이 나올 때까지 기다렸다가 이러한 결과를 스프레드시트로 내보냅니다.
- 이 프로토콜에서, 마이크로겔 크기에서 이질성을 결정하기 위해 다분산 지수 (PDI)를 계산한다. 적어도 100개의 마이크로겔을 분석하여 집단을 정의한다: 1.00-1.05의 PDI 범위는 단분산 집단을 정의하고, 1.05보다 큰 PDI는 다분산 집단을 정의한다. 후술하는 대로 수학식 2, 수학식 3 및 수학식 4를 사용하여 PDI를 계산한다.
(2)
(3)
(4)
(2)
(3)
(4)
도 6: 마이크로겔의 대표적인 이미지. (A) 마이크로겔 집단 A의 형광 공초점 이미지, (B) 임계치 마이크로겔의 이미지, 및 (C) ImageJ 분석 후의 입자 윤곽선. (d) 마이크로겔 집단 B의 형광 공초점 이미지 및 (E) 마이크로겔의 투과광 이미지(마이크로겔은 거의 반투명함). (F) 이 프로토콜에 요약된 ImageJ 분석으로부터의 대표적인 결과의 묘사. 두 마이크로겔 집단 모두 비교적 단분산 PDI를 갖는다. 마이크로겔의 두 집단 모두 3 mL/h 수성 유량 및 6 mL/h 오일 유량으로 합성되었다. 그러나, 마이크로겔 크기의 차이는 마이크로유체 장치 단계 크기의 차이에 기인한다. 예를 들어, 마이크로겔 집단 A는 11 μm의 채널 스텝 크기를 갖는 마이크로유체 장치로 합성되었고, 마이크로겔 집단 B는 40 μm의 스텝 크기를 갖는 디바이스에서 합성되었다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: PDI = 다분산 지수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
7. 미세다공성 어닐링 입자 (MAP) 스캐폴드 어닐링
- 1x PBS (pH 7.4)에 2 mM 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 (LAP)의 원액을 생성한다.
- LAP 원액을 겔 부피와 동등한 1x PBS의 부피로 0.2 mM로 희석한다. 세포 연구 또는 동물 연구를 위해 LAP 광개시제를 사용하는 경우, 사용하기 전에 용액을 멸균하십시오.
- MAP 겔을 4,696 × g 에서 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인한다.
- 포지티브 변위 피펫을 사용하여 원하는 부피의 겔을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 0.2 mM LAP를 1:1 부피비로 겔에 첨가한다 (최종 LAP 농도는 0.1 mM이다).
- 혼합물을 소용돌이치고, 어둠 속에서 적어도 15분 동안 인큐베이션한다.
- 혼합물을 18,000 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 겔을 펠릿화한다.
- 조심스럽게 겔 펠릿에서 상청액을 제거하십시오.
- MAP 겔을 포지티브 변위 피펫으로 대상 위치로 옮깁니다.
- 스캐폴드를 어닐링하기 위해 113초 동안 시료에 집속광(365nm, 8.66mW/cm2)을 적용합니다.
참고: 113s의 어닐링 시간은 0.1mM14의 LAP 농도에 대해 이전에 발표된 바와 같이 최적화되었지만, 상이한 광개시제 농도에 대한 추가적인 최적화가 필요할 수 있다.
도 7: MAP 스캐폴드 어닐링. (A) MAP 스캐폴드 어닐링의 개략도. 광개시제 및 광에 노출될 때, MethMAL 마크로머 상의 메타크릴아미드 작용기는 클릭된 광중합 반응을 겪고, 이는 마이크로겔의 표면을 함께 결합시킨다. (B) 모공에 덱스트란(빨간색)이 있는 3D 퍽 모양으로 함께 어닐링된 MAP 마이크로젤(녹색)의 이광자 현미경 이미지의 3D 렌더링(Imaris)을 묘사합니다. (C) 형광 70 kDa 덱스트란(적색)으로 관류된 MAP 스캐폴드의 다공성을 보여주는 이광자 현미경 이미지의 3D 렌더링(Imaris)의 묘사. 스케일 바 = (B) 100 μm, (C) 70 μm. 약어: MAP = 미세다공성 어닐링된 입자; MethMAL = 사용자 정의 어닐링 매크로머. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
이 프로토콜의 목적은 MAP 스캐폴드에 사용되는 마이크로겔 빌딩 블록을 합성하는 데 필요한 모든 단계를 개략적으로 설명하는 것입니다. MethMAL 어닐링 마크로머는 매우 선택적이고 효율적이며 다수의 폴리머 백본(14)과 양립가능하다. 높은 어닐링 효율을 보장하기 위해 20 kDa PEG-말레이미드의 적어도 67%-75%가 메타크릴아미드 작용기로 개질되는 것이 중요하다. 퍼센트 수정은 그림 1과 같이 1H-NMR 스펙트럼 피크를 분석하여 가장 쉽게 결정할 수 있습니다. 점도계에 의해 결정되는 겔화 동역학은 각 겔 제형에 대해 고려해야 할 중요한 지표입니다. 이 프로토콜은 마이크로겔 겔화를 위해 티올 기능화 가교결합제와 효율적으로 반응하는 MAL 그룹을 갖는 PEG 백본으로 구성된 겔 전구체 용액을 사용한다. 그러나, 많은 히드로겔 화학이 본원에 기재된 고처리량 마이크로유체 방법을 통해 마이크로겔을 제조하는데 사용될 수 있다. 겔화의 개시까지의 시간은 마이크로유체 마이크로겔 생성의 지속기간에 대한 통찰력을 제공할 것이다. 30분(그림 2)에서 2시간 사이에 겔화를 시작할 수 있는 겔 전구체 pH를 선택하는 것이 좋습니다.
겔화 시간이 너무 빠르면 겔 전구체 용액이 미세 유체 장치 내에서 중합되기 시작하고 채널을 막히게됩니다. 추가적으로, 티올화 리간드 농도 (예를 들어, RGD)의 변화는 겔화 동안 네트워크 형성에 영향을 미칠 수 있고, 제형을 조정함으로써 설명될 필요가 있을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 미세유체 장치 제조 단계는 지루할 수 있지만 성공적으로 접합된 장치의 대표적인 결과는 그림 3에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 de Rutte et al.13의 설계에서 채택 된 고처리량, 병렬화, 단계 유화 미세 유체 장치를 사용하며 실리콘 웨이퍼 제조는 마이크로 유체 기술 회사에 아웃소싱되었습니다. 그러나 이 프로토콜에 요약된 단계는 SU-8 실리콘 웨이퍼 포토마스크에 에칭된 모든 장치 설계와 함께 사용할 수 있습니다. 포토 마스크 상의 채널의 스텝 크기는 마이크로겔 입자의 크기에 영향을 미치기 때문에 장치 제조 중에 최적화되어야 한다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
마이크로겔의 마이크로유체 생성을 위한 유속은 겔화 시간, 원하는 입자 크기 및 마이크로유체 장치 설계와 같은 인자에 기초하여 각 겔 제형에 대해 최적화되어야 한다. 고처리량 장치를 사용하는 경우 성상의 유속은 최대 5mL/h까지 올라갈 수 있습니다. 그림 4B는 이 프로토콜에 사용되는 고처리량 장치의 설정을 보여줍니다. 장치가 올바르게 작동하는 경우 마이크로겔 형성은 그림 4D에 표시된 것과 유사하게 보일 것입니다. 정제 전에, 마이크로겔은 불투명할 것이다. 다양한 오일, PBS, 및 헥산 세척을 완료한 후, 겔은 도 5의 대표 이미지처럼 선명하게 보일 것이다. 형광단을 마이크로겔에 혼입시키는 경우, 정제된 생성물은 약간의 착색된 색조를 가질 수 있지만, 여전히 반투명에 근접해야 한다. 정제 및 팽윤 후, 마이크로겔은 크기가 매우 균일해야 하고, 도 6에 도시된 바와 같이 1.00 내지 1.05 사이의 PDI를 가져야 한다. 다양한 광개시제가 MAP 스캐폴드를 포토어닐링하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 LAP에 대한 대안을 사용하는 경우, 앞서 기술된 바와 같이 어닐링 동역학을 결정해야 한다(14). 추가적으로, 광원이 광개시제와 대응하는 한, 다양한 광원이 광어닐링에 사용될 수 있다. 광원을 보정하고 초점을 맞추어야합니다. 어닐링 시간 및 광강도는 겔 제형 및 광개시제 농도에 기초하여 최적화될 필요가 있을 수 있다. 이 프로토콜에 요약된 어닐링 방법은 시험관내 및 생체내 연구에 사용될 수 있다. 어닐링 후, 마이크로겔은 이광자 현미경으로 시각화될 수 있는 다공성 스캐폴드를 형성할 것이다(도 7B-C).
Discussion
이 프로토콜은 미세다공성 어닐링된 입자(MAP) 스캐폴드의 빌딩 블록으로서 작용하는 마이크로겔을 합성하고 특성화하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 고처리량 마이크로유체 접근법을 사용하여 대량의 균일한 마이크로겔을 생성하는데, 이는 유동 집속 마이크로유체학 1,4,7,9 (높은 단일분면, 낮은 수율), 배치 에멀젼6,10 및 전기 분무 5,12와 같은 다른 방법으로는 달성될 수 없다. (낮은 단분산도, 높은 수율). 본원에 기재된 방법에 의해, 단분산 마이크로겔은 다양한 재생 의학 용도(예를 들어, 세포 전달, 상처 치유)에 사용될 수 있는 MAP 스캐폴드에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 PDMS 미세유체 장치의 생성이다. 장치가 올바르게 만들어지지 않으면 마이크로 겔 형성 및 단분산도에 부정적인 하류 영향을 줄 수 있습니다. 경화되기 전에 PDMS에 아티팩트 (즉, 거품, 먼지)가 도입되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.이 방법은 채널을 막히고 마이크로 겔 형성에 큰 영향을 줄 수 있기 때문입니다. 이를 최대한 완화하려면 테이프를 사용하여 먼지를 제거하고 장치를 먼지가없는 컨테이너에 보관하고 가능한 경우 먼지가없는 후드에서 작업해야합니다. 또한 표면 처리로 최상의 결과를 얻기 위해 장치를 60 °C에 보관하는 것이 좋습니다.
PDMS 장치를 붓을 때, 생검 펀치의 길이와 거의 같거나 작은 균일한 두께를 유지하는 것이 중요하다. 장치가 너무 두꺼우면 생검 펀치가 끝까지 침투 할 수 없습니다. 또한 생검 펀치로 펀칭하거나 튜브를 삽입하는 동안 PDMS 장치 입구 / 출구를 찢지 않는 것이 중요합니다. PDMS 장치의 찢어짐은 입구 / 출구에서 누출되어 젤 전구체 용액이 손실 될 수 있습니다. PDMS 장치에 누출이 있는 경우 가장 좋은 해결책은 가능한 한 빨리 새 장치로 교체하는 것입니다.
플라즈마-디바이스를 처리할 때, 순수한 산소 및 플라즈마-처리를 30초 동안 사용하는 것은 PDMS를 유리 슬라이드에 부착하기 위한 최상의 결과를 생성하였다. 장치가 올바르게 결합되지 않는 경우 (즉, 플라즈마 처리 후 PDMS를 유리 슬라이드에서 들어 올릴 수 있음) 플라즈마 처리기가 올바르게 작동하고 장치 및 슬라이드가 철저히 청소되었는지 다시 확인해야합니다. 또한 올바른 실란 표면 처리를 사용하는 것이 중요하며, 최상의 결과를 얻으려면 PDMS 장치를 사용 전에 직접 표면 처리해야 합니다. 화학 기상 증착과 같은 표면 처리의 다른 방법도 또한 사용될 수 있다.
또 다른 중요한 단계는 마이크로겔 형성을 위해 PDMS 마이크로유체 장치를 올바르게 사용하는 것이다. 최소 2:1의 유속비(이 프로토콜은 6mL/h 오일 유량과 3mL/h 수성 유량을 사용함)를 사용하는 것이 좋지만 원하는 마이크로겔 크기를 달성하도록 조정할 수 있습니다. 마이크로겔 전구체 용액의 pH는 또한 장치의 막힘을 방지하기 위해 최적화하기 위한 중요한 메트릭이다. 포스페이트 완충 식염수 (PBS)는 마이클 타입 첨가 화학에서 티올레이트 형성을 가속화하고, 이 프로토콜에 사용된 PBS 농도는 마이크로유체 장치에서 마이크로겔 겔화에 대한 최상의 결과를 산출한다. 주사기 펌프가 시작되면 미세 유체 채널에 약간의 기포가있을 수 있지만 몇 분 후에 평형을 이루어야합니다. 현미경으로 마이크로 겔 형성을 모니터링하는 것이 좋습니다. 흐름이 이 비디오에서와 유사하게 보이지 않거나 큰 입자를 생성하는 채널이 몇 개 있는 경우, 이는 표면 처리 단계의 문제로 인한 것일 수 있습니다. 가장 좋은 해결책은 장치를 갓 표면 처리 된 장치로 교체하는 것입니다.
마이크로겔이 합착되는 것으로 보인다면, 이는 FluoroSurfactant의 불충분한 농도 때문일 수 있다. 권장되는 해결책은 오일상에서 계면활성제의 wt%를 증가시키는 것이다. 그러나, 고농도의 계면활성제를 사용하는 것의 한 가지 한계는 정제 단계 동안 제거하기가 더 어려울 수 있다는 것이다. 미세 유체 장치를 한 번만 사용하는 것이 좋지만 사용 직후에 Novec 오일로 플러시하면 장치에서 겔화되어 채널을 막힐 수있는 수용액을 제거하면 장치를 재사용할 수 있습니다. 하나의 마이크로유체 장치가 높은 처리량의 마이크로겔(mL/h)을 생산할 수 있지만, 이 생산 속도는 여러 마이크로유체 장치를 병렬로 사용하여 확장할 수 있습니다.
MAP 스캐폴드 어셈블리의 어닐링 단계는 라디칼 중합의 광활성화 광개시제의 사용에 의존하며, 광개시제는 원하는 용도에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, LAP 광개시제는 장파 자외선을 사용할 때 빠른 어닐링 시간(<30초)을 가지며, 이는 시험관내14에서 세포 생존력에 최소한의 영향을 미친다. 그러나, 이러한 파장은 조직(16 )에 의해 고도로 흡수되고, 생체 내에서 시험관내만큼 높은 어닐링 효능을 갖지 않을 수 있다.
Eosin Y는 가시 파장 (505 nm)에 의해 활성화 된 또 다른 광개시제이며 조직으로 더 깊이 침투하여 조직 아래에 어닐링되는 MAP 스캐폴드의 능력을 향상시킵니다. 그러나, Eosin Y 어닐링에 필요한 긴 광 노출 시간은 자유 라디칼에 대한 세포 노출을 연장시키고 시험관내14에서 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있다. 매우 균일 한 마이크로 겔 빌딩 블록의 고처리량 생성을 위해 이러한 방법을 사용하면 MAP 스캐폴드 중심의 연구를 가속화하고 재생 의학을위한 주사 가능한 다공성 물질 분야의 지식을 향상시킬 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학의 Joe de Rutte와 Di Carlo Lab이보고 된 장치가 개발 된 원래의 미세 유체 장치 설계와 PDMS 장치 제조 및 문제 해결에 대한 초기 지침에 대한 도움을 인정하고자합니다. 그림 회로도는 Biorender.com 로 작성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
| 35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
| 4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
| 4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
| Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
| Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
| Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
| DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
| Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
| FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
| HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
| ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
| KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
| LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
| Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
| Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
| MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
| Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
| Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
| Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
| Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
| PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
| Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
| Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
| Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
| Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
| Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
| Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
| Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337 (2021).
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