Summary
该协议描述了一组用于合成用于微孔退火颗粒支架的微凝胶构建块的方法，其可用于各种再生医学应用。
Abstract
微孔退火颗粒（MAP）脚手架平台是颗粒水凝胶的一个亚类。它由可注射的微凝胶浆料组成，可以在二次光基化学交联步骤（即退火）之后形成结构稳定的支架， 原位 具有细胞规模的孔隙率。MAP支架在各种再生医学应用中取得了成功，包括真皮伤口愈合，声带增大和干细胞递送。本文介绍了聚乙二醇（PEG）微凝胶作为形成MAP支架的构建块的合成和表征方法。这些方法包括合成定制退火大分子体（MethMAL），测定微凝胶前体凝胶动力学，微流体装置制造，微流体生成微凝胶，微凝胶纯化和基本支架表征，包括微凝胶施胶和支架退火。具体而言，本文描述的高通量微流体方法可以产生大量的微凝胶，这些微凝胶可用于产生MAP支架用于任何所需的应用，特别是在再生医学领域。
Introduction
MAP支架平台是一种可注射的生物材料，完全由水凝胶微粒（微凝胶）组成，当交联在一起时提供细胞规模的微孔隙率，这允许降解无关的细胞迁移和本体组织整合1。由于其能够快速与宿主组织整合并且固有的低免疫原性，MAP支架平台已被证明适用于各种再生医学疗法2，3，4，5，6，7，8，9，10，包括加速真皮伤口愈合1，3，11，脑卒中腔7血运重建，递送间充质干细胞2，并提供组织膨胀治疗声门功能不全6。MAP还被证明可以通过招募M2巨噬细胞3向宿主组织传递抗炎作用，甚至可以调节以促进Th2“组织修复”免疫反应8。MAP支架平台的这些有利特性使其能够扩展到各种临床应用。
以前发表的用于生成用于MAP支架形成的微凝胶的方法包括流动聚焦液滴 - 微流体1，4，7，9，电喷雾5，12和用批量乳液6，10的架空纺丝。液滴微流体法可以产生具有高单分散性的颗粒，但使用非常慢的流速，产生低产量的颗粒（μL / h）。或者，电喷雾和间歇乳液方法可以产生高体积的颗粒，但具有高颗粒多分散性。该协议使用高通量微流体方法生产具有单分散群体的微凝胶，基于de Rutte等人的工作13。该方法利用软光刻技术从光掩模制造聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流体器件，然后将其粘合到载玻片上。设备设计依靠分步乳化来产生大量微凝胶颗粒（mL / h）。与其他技术相比，使用该方法可以实现的单分散性提供了更好的孔隙率控制，因为单分散微凝胶可以形成孔径更均匀的支架2。
本手稿概述了合成和表征可用作MAP支架构建块的单个微凝胶的方法，特别是关于创建由PEG骨架和马来酰亚胺（MAL）基团组成的微凝胶，其易于参与用于微凝胶凝胶化的硫醇官能化交联剂的高效迈克尔型添加。为了将微凝胶凝胶与MAP支架退火分离，该手稿还描述了如何合成已发表的14 种定制退火大分子MethMAL，这是一种异官能甲基丙烯酰胺/马来酰亚胺4-arm PEG大分子体。甲基丙烯酰胺官能团容易参与自由基光聚合（用于微凝胶退火），同时对促进MAL官能团的迈克尔型添加的条件保持相对惰性。
此外，该手稿还概述了用于创建PDMS微流体装置，确定微凝胶动力学和表征微凝胶尺寸的方案。手稿的最后一部分详细介绍了MAP支架退火，即当微凝胶通过二次光启动交联步骤 原位 过渡到散装支架时，该步骤将微凝胶的表面共价粘合在一起。重要的是要注意，在MAP支架系统中可以实现其他退火方法，这些方法不依赖于光基化学，例如酶介导的退火，如前所述1。总体而言，这些方法可以直接使用或与不同的水凝胶制剂化学成分（例如，透明质酸基）一起使用，以产生用于任何应用的MAP支架。
Protocol
1. 甲基氨法退火大分子聚合物合成
注意：该协议专门用于修改1g PEG-马来酰亚胺，但可以按比例放大以制造更大的批次。
- 将 1 g 4 臂 20 kDa PEG-马来酰亚胺加入 10 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS， pH 7.4） 中，放入带有搅拌棒的小玻璃烧杯中。以300rpm搅拌溶液，直到PEG完全溶解（约30分钟）。
- 加入14.65mg 2-氨基乙硫醇（0.67∶1硫醇[SH]与马来酰亚胺[MAL]摩尔比）到300rpm搅拌反应中。
注意：2-氨基乙硫醇上的硫醇基团将通过迈克尔型添加物添加到PEG-MAL的大约三个臂中，留下胺端基。- 观察以下示例计算要添加的2-氨基乙硫醇的量：
注意：为避免测量非常少量，将100mg 2-氨基乙硫醇溶解在1 mL 1x PBS（pH 7.4）中，并向反应中加入146.5μL该溶液。
- 观察以下示例计算要添加的2-氨基乙硫醇的量：
- 在步骤1.2.后等待1小时和10分钟，然后在新的玻璃烧杯中混合160.1mg 4-（4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基）-4-甲基吗啉氯化物（DMTMM，12：1摩尔与PEG的比例）和32.77μL甲基丙烯酸（与PEG的摩尔比为8：1）在5mL的1x PBS（pH 7.4）中混合，并在300rpm的搅拌下反应50分钟。
注意：在此步骤中，甲基丙烯酸与DMTMM反应形成高反应性酯，然后可以偶联到PEG上的可用胺基团。- 观察以下示例计算，以计算要添加的 DMTMM 量：
- 观察以下示例计算要添加的甲基丙烯酸量：
- 观察以下示例计算，以计算要添加的 DMTMM 量：
- 将甲基丙烯酸/ DMTMM溶液加入带有20 kDa PEG-MAL / 2-氨基乙硫醇溶液的烧杯中。
- 向烧杯中加入53.56μL三乙胺（与甲基丙烯酸的摩尔比为1：1），并在300rpm的搅拌下反应过夜。用铝箔覆盖烧杯，以防止灰尘和其他污染物进入烧杯。
- 观察以下示例计算要添加的三乙胺量：
- 观察以下示例计算要添加的三乙胺量：
- 将反应转移到蛇皮透析管（分子量截止：3，500 Da）。
- 将透析管置于装有1M NaCl的大烧杯中去离子（DI）水（体积应完全覆盖管子）中3天，搅拌300rpm。每天更换1M NaCl溶液2次，共洗涤六次。
- 在去离子水中透析6小时。每小时更换去离子水，共洗涤六次。
- 将反应转移到50 mL锥形管中并在-80°C下冷冻。
- 在−70°C的起始温度和0.01°C / min的温度斜坡下将试管冻干至少72小时，直到0°C。
- 通过将25mg甲基MAL溶解在700μL氯仿-d中并转移到NMR管中来制备 1H-NMR样品。
- 获取 1个 H-NMR 光谱。
注意：该协议中的光谱是使用具有以下参数的500 MHz光谱仪采集的：扫描宽度= 6，467.3 Hz，时间延迟= 13.1 s，采集时间= 5.1 s，脉冲时间= 5.1 μs，扫描次数= 8。 - 对于分析，将马来酰亚胺峰作为参考（~6.76 ppm），然后对两个甲基丙烯酰胺峰（~5.35 ppm和5.6 ppm）进行积分。将甲基丙烯酰胺峰面积的比值除以所有三个峰的总面积，得到用甲基丙烯酰胺修饰的臂的百分比。
注意：可接受的修饰是67%-75%甲基丙烯酰胺官能团取代。甲基吡喃的 H-NMR 谱示例 1如图 1 所示。- 使用等式（1）作为替换次数等式：
（1）
- 使用等式（1）作为替换次数等式：
（1）
图 1：甲基丙氨分析的化学结构和 1个 H-NMR 谱。 （A）化学结构：甲基丙烯醛退火大分子由20 kDa 4-臂聚乙二醇与三个甲基丙烯酰胺臂修饰而成。（B）该结构在PEG-MAL光谱中不存在的5.36 ppm（3）和5.76 ppm（2）处产生峰，并且一个马来酰亚胺臂在6.71 ppm（1）处产生峰。溶剂氯仿在7.26 ppm处产生峰，该样品中的残留水在2.2 ppm处产生峰（在光谱上标记）。在MethMAL光谱中，马来酰亚胺峰的积分面积为0.27，甲基丙烯酰胺峰面积之和为0.73（0.37 + 0.36）。甲基丙烯酰胺修饰百分比为73%（0.73/（0.27 + 0.73））。这个数字来自Pfaff等人14。版权所有 （2021） 美国化学学会。 请点击此处查看此图的大图。
2. 微凝胶前驱体凝胶动力学
注意：可以通过调节用于溶解凝胶前体组分的缓冲液的pH值来修改凝胶化时间。对于PEG-马来酰亚胺水凝胶，酸性更强的pH值通常对应于较慢的凝胶化时间，因为在较低的pH值为15时硫代酸盐浓度降低。
- 预定所需浓度的聚合物、交联剂和其它凝胶前体组分（即肽、 糖胺聚糖）。将聚乙二醇-MAL、RGD 和甲基吡咯烷酮（聚乙二醇主链）溶解在 10 倍 PBS （pH 1.5） 中，将 MMP-2 交联剂溶解在 1 倍 PBS （pH 7.4） 中。
注意：在该协议中，凝胶前体溶液是已公布的配方3，由45.88mg / mL 4臂PEG-MAL（10 kDa），0.82mg / mL RGD，8.06mg / mL甲基MAL和4.62mg / mL MMP-2交联剂（酶可降解交联剂）组成。 - 准备一个粘度计，或等效的仪器，使用0.4 mm的间隙大小，1.0 Hz的剪切应变，1.0 Hz的频率和10，800 s的持续时间来监测存储和损失模量。
- 连接 35 mm 板式转子 （P35/Ti） 几何形状。在几何形状周围使用加湿室或潮湿的海绵，以保持加湿环境。
- 将PEG骨架和MMP交联剂以1：1的体积比混合。
- 将400μL凝胶前体溶液移液到粘度计台的中心。
- 将几何形状缓慢降低到载物台上，直到达到预定的0.4 mm间隙尺寸，并立即开始在室温下监测储存（G'）和损失（G''）模量长达6小时。
注意：当储存模量大于损失模量时，凝胶化被认为是开始的，当储存模量平台化时，凝胶化被认为是完整的。代表性的凝胶动力学曲线如图 2所示。
图2：由粘度计测定的MAP凝胶前体溶液（pH 4.5）凝胶动力学的代表性曲线。 凝胶化始于储存（G'）模量的快速增加，当G'曲线平台化时凝胶化完成。G'' 表示损耗模量。这个数字来自普鲁特等人。版权所有 （2021） 威利-VCH GmBH . 请点击此处查看此图的大图。
3. 微流体器件制造
注意：该协议描述了微流体分步乳化装置设计的器件制造，该装置设计改编自de Rutte等人13，如图 3A所示。但是，该协议可用于蚀刻到SU-8晶圆中的任何器件设计。建议外包SU-8硅晶圆主制造，除非有适当的洁净室设施可用于制造。
- 从 SU-8 晶圆光掩模创建第一个聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 微流体器件。
- 通过将碱和固化剂以10：1 w/ w的比例混合来制备〜200g PDMS（参见 材料表）。
- 将SU-8晶圆放入培养皿中（将晶圆的边缘粘在培养皿上），微流体设计朝上。
- 将PDMS倒入培养皿中，在晶片上形成1-1.5厘米厚的层。将培养皿置于真空下以除去任何气泡。
- 让PDMS固化直至固化（室温下24小时或在60°C下约2小时）。
- PDMS固化后，小心地使用剃须刀片或手术刀在PDMS上切割一个矩形，使得晶圆上的设计周围有0.5-1厘米的余量。
注：不要使用过大的压力，并且要非常温和，以避免损坏（例如，开裂，刮擦）晶圆。 - 将刮刀楔入其中一个切口中，然后沿着切口滑动，以将PDMS与晶圆分开。
注：当 PDMS 与晶圆分离时，PDMS 下将开始形成气泡（参见 图 3B）。 - 使用刮刀轻轻地将矩形的 PDMS 从培养皿中取出。
注意：晶圆上方PDMS中产生的间隙将是微流体器件的模具。
- 从 SU-8 晶圆光掩模创建后续的 PDMS 微流体器件。
- 通过将基体和固化剂以10：1的比例混合，每个模具制备约15-20克PDMS。
- 将 PDMS 倒入模具的矩形间隙中，在晶圆上方形成一层 5 mm 的 PDMS。将模具置于真空下以除去任何气泡。
- 让PDMS固化直至完全固化（室温下24小时或在60°C下2小时）。
- PDMS固化后，使用剃须刀片或手术刀在矩形边缘周围切割PDMS。
注意：不要使用太大的压力，并且要非常温和，以避免损坏（即开裂）晶圆。 - 将刮刀楔入其中一个切口中，然后沿着切口滑动，以将PDMS与晶圆分开。
注意：当 PDMS 与晶圆分离时，PDMS 下将开始形成气泡。 - 使用 1.5 mm 活检打孔，在两个入口和出口处的 PDMS 矩形上创建孔（参见 图 3B）。
- 如果单个晶圆上有多个器件，请使用刮刀或剃须刀片在每个器件之间轻轻地对PDMS进行评分，然后沿着评分线轻轻折叠PDMS，以使PDMS自行非常干净地分离。
- 将 PDMS 设备存放在无尘容器中。
- 将 PDMS 微流体器件粘接到载玻片上。
- 为每个 PDMS 微流体装置准备一个载玻片。使用胶带、过滤空气或异丙醇 （IPA） 清洗剂清除载玻片上的所有灰尘。在继续下一步之前，请确保载玻片完全干燥。
- 将载玻片和PDMS设备（设计面朝上，彼此相邻）放在一个小塑料托盘上（96孔板盖对此效果很好），然后将其放入等离子清洗机中。关闭门和气流阀，打开真空泵。让它运行至少30秒，然后将其关闭。
- 将氧气罐气体管连接到气流阀。让等离子体室充满氧气30秒，然后关闭氧气，关闭气流阀。
- 打开真空泵，将射频 （RF） 电平设置为 高电平。等到腔室变成紫粉红色（参见 图3B）。等待 30 秒通过。
- 当计时器关闭时，关闭等离子体和真空。然后，慢慢打开气流阀以释放真空。从等离子清洗机上取出托盘。
- 轻轻地将 PDMS 设备翻转到载玻片上以粘合它们。当粘合发生时，观察PDMS透明度的细微差异。
注：为获得最佳效果，请将粘合设备储存在60°C，直到使用前立即使用。
- 对 PDMS 微流体器件进行表面处理
- 通过在诺维克油（1：50）中稀释PFOCTS（三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷）来制备表面处理。对于 3-4 个设备，使用 1 mL。将体积转移到1 mL注射器并连接25G针头。
注意：本实验方案中使用的针是斜面的，因此在处理尖锐物品时要小心。如果需要，也可以使用钝针。 - 为每个将要处理的装置切割一块10-12厘米的Tygon管。
- 切一块长约7厘米的PEEK管。如图 4A所示，将几毫米的PEEK管插入Tygon管的末端，以帮助防止针刺穿Tygon管入口。
- 将设备从加热室中取出，并将Tygon管的非PEEK端插入水入口孔中。
- 将表面处理注射器的针头插入PEEK管中，并覆盖油室出口孔（参见 图3B）。
- 将处理液缓慢注入设备，并确保其充满设备，无气泡。首先等待水室填充，然后是较小的通道，然后是油室。从设备中取出泰贡管。设备充满后，让它在室温下静置10分钟。
- 仅用油（无硅烷）填充 5 mL 注射器，然后连接 25 G 针头。
- 通过入口和出口将表面处理从设备中吸出。将Tygon管插入水入口，将装有油的注射器插入PEEK管中，然后用油冲洗每个装置。将油从设备中吸出。
- 重复油冲洗2次以上。取下泰贡管。
注：设备已准备就绪，可供使用。
- 通过在诺维克油（1：50）中稀释PFOCTS（三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷）来制备表面处理。对于 3-4 个设备，使用 1 mL。将体积转移到1 mL注射器并连接25G针头。
图 3：微流体 PDMS 器件 （A） 微流体器件设计的计算机辅助设计 （AutoCAD） 绘图。微凝胶液滴的形成发生在油道两侧的通道中，如放大的露头所示。（二）PDMS器件制造概述。简称：PDMS = 聚二甲基硅氧烷。 请点击此处查看此图的大图。
4. 微凝胶的微流体生成
- 预定所需浓度的聚合物、交联剂和其它凝胶前体组分（即肽、 糖胺聚糖）。将 PEG-MAL、RGD 和甲基吡喃（PEG 主链）溶解在 10x PBS （pH 1.5） 中，将 MMP-2 交联剂与 5 μM 生物素-马来酰亚胺溶解在 1x PBS （pH 7.4） 中。
注意：在该协议中，凝胶前体溶液是已发表的配方3 ，由45.88毫克/毫升4臂PEG-MAL（10 kDa），0.82毫克/毫升RGD，8.06毫克/毫升甲基MAL和4.62毫克/毫升MMP-2交联剂（酶降解交联剂）组成。下面概述的方法将产生~3 mL微凝胶。 - 通过将储备的5%含氟表面活性剂稀释至Novec油中的至少1%，制备6 mL表面活性剂溶液。将此溶液添加到10 mL注射器中。
注意：氟化表面活性剂与水不混溶，这使得它在纯化步骤中的PBS洗涤过程中在凝胶过渡到水相期间很容易被除去。 - 切割三块 Tygon 管子，这些管子的长度适合注射器泵的高度。
- 切开两块PEEK管，长度约为1英寸。如图 4A所示，将几毫米的PEEK管插入两块Tygon管的末端，以帮助防止针刺穿Tygon管入口。
- 将Tygon管的非PEEK端插入微流体装置的入口中。将剩余的Tygon管（末端没有PEEK管）插入微流体装置出口，如图 4C所示。
- 将至少3 mL油加入5 mL塑料注射器中，并将其连接到25 G针头上。小心地将针插入其中一个Tygon入口上的PEEK管中。用油轻轻冲洗管道和设备。将油从出口收集在锥形管中。在另一个Tygon入口处重复油冲洗。
- 将注射泵设置为所需的流速。
注意：此实验方案使用 3 mL/h 作为水流速，使用 6 mL/h 作为油流速。可能需要使用两个单独的注射泵。 - 通过25 G针头（参见 图4A）将含有表面活性剂的注射器连接到进油口，并轻轻分配足够的油以启动微流体装置的管道和油道。
- 设置设备和进油口后，将0.5 mL油加入新的5 mL注射器中，该注射器将包含凝胶前体。这种少量油的目的是帮助在运行结束时通过微喷发装置冲洗前驱体溶液。
- 在锥形管中，将 1.5 mL PEG 骨架溶液和 1.5 mL 交联剂溶液混合。涡旋30秒，并将组合的凝胶前体溶液快速转移到5 mL注射器中。
- 通过25G针将注射器与凝胶前体溶液连接到水入口。轻轻分配足够的溶液以启动管道和水通道。
- 将注射器夹在相应的注射器泵上并按 压运行 （参见 图4B）。确保有液体流过水道和油道。
注意：建议使用显微镜来可视化PDMS设备内的微凝胶形成。 - 从通道中寻找大小均匀的颗粒（参见 图4D）。将微凝胶从出口收集在锥形管中。
（A） 将 PEEK 管路（顶部）和 Tygon 管连接到注射器上的 25 G 针头的方法（底部）的描述。（B） 使用注射器泵、管道、设备和显微镜进行微流体设置。（C） 微流体装置设置的图像，有两个入口（水和油）和一个出口。（D）微流体装置的示意图和从分步乳化装置中的通道中预期的微凝胶形成的代表性明场图像。请点击此处查看此图的大图。
5. 微凝胶的纯化和灭菌
- 一旦凝胶化完成（确定为凝胶动力学表征中的储存模量平台的时间），使用移液管小心地从管底部除去油相（参见 图5）。将其存放在适当的废物容器中，用于氟化废物。
注意：通过在收集管中添加有机可溶性碱（例如三乙胺）可以加速凝胶化时间，但重要的是要注意，添加强碱可能会水解任何未反应的马来酰亚胺。如果需要在凝胶化后通过过量的马来酰亚胺功能化微凝胶，请跳过三乙胺的添加。 - 以1：1的比例向微凝胶收集管中加入更多的油。通过轻轻倒置收集管进行混合。不要涡旋。
- 让收集管沉降约5分钟，以使相分离。寻找底部的油相和顶部的水相（微凝胶）（参见 图5）。
- 重复油洗至少2次以上。
- 以1：1的比例与凝胶添加更多的油，并以4：1 PBS与凝胶的比例加入1x PBS。倒置混合几次。为了分离各层，将管子以~2，000× g 离心~30秒。在管子底部寻找油相，中间寻找凝胶，在顶部寻找PBS（参见 图5）。
- 用移液器除去油相，然后丢弃在废物容器中。
注意：请勿删除 PBS。如果原始收集管为 15 mL，请使用较大的锥形管继续洗涤。 - 重复涂油，PBS再清洗2次。如图 5所示，寻找凝胶通过最终洗涤从不透明过渡到透明，表明表面活性剂被除去并且凝胶处于PBS相。
- 除去所有油。不要从锥形管中取出PBS。
- 在化学通风橱中，使用玻璃移液器向管中加入与PBS体积相等的己烷。涡旋锥形管30秒或直到充分混合。以4，696× g 离心5分钟。
- 分离后，在顶层寻找己烷，在中间寻找PBS，在底部寻找凝胶（参见 图5）。去除己烷层并将其丢弃在容器中作为有机废物。吸出公共广播公司。
- 重复己烷和PBS洗涤至少2倍以上或直到凝胶看起来几乎是半透明的（参见 图5）。用PBS 1x清洗凝胶，以除去任何剩余的己烷。以4，696× g 离心5分钟。吸出 PBS 层。注意不要打扰凝胶沉淀。
- 为了封盖或淬灭微凝胶中任何未反应的马来酰亚胺，在1x PBS中制备100mM的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，并将该溶液加入凝胶中。置于37°C的管旋转器上过夜，然后用PBS洗涤多次以除去未反应的N-乙酰-L-半胱氨酸。
- 对于长期储存（长达1年），将微凝胶重悬于70%IPA中并储存在4°C，以帮助防止微凝胶上细菌的生长。
- 要对微凝胶进行灭菌，请在生物安全罩中以4：1 v / v的比例向凝胶中加入70%的IPA。涡旋管30秒，然后在4，696×g 下离心5分钟。从生物安全罩中的凝胶沉淀中吸出IPA上清液。再进行 2 次 IPA 洗涤，然后用无菌 1x PBS 进行 3 次洗涤。
注意：在将凝胶与细胞或动物一起使用之前，应去除所有IPA。
图5：微凝胶纯化程序概述。 缩写：PBS =磷酸盐缓冲盐水;IPA = 异丙醇。 请点击此处查看此图的大图。
6. 微凝胶大小表征
注意：建议让微凝胶颗粒在37°C的1x PBS中平衡过夜，在施胶前膨胀到其最终直径。
- 图像凝胶颗粒。
- 将MAP凝胶以4，696× g 离心5分钟，然后吸出上清液。
- 使用容积式移液管，从凝胶沉淀中取出5μL微凝胶，并在微量离心管中稀释1mL PBS（1：200稀释）。根据需要调整此稀释度。
注意：在凝胶前体溶液的配制过程中，可以加入5μM生物素 - 马来酰亚胺，并用作用荧光团标记微凝胶的替代品。在这种情况下，链霉亲和素 - 荧光团可以以1：300稀释度（从1mg / mL储备液）加入。在成像前与链霉亲和素孵育至少15分钟。 - 使用容积式移液管，将100μL稀释的微凝胶转移到透明的96孔板的孔中。
- 使用宽视场或共聚焦显微镜用10倍物镜观察微凝胶。获取微凝胶的图像进行分析。
- 参见 图6 ，了解微凝胶的代表性共聚焦图像。
- 使用图像J调整粒子大小
- 在ImageJ中从显微镜中打开图像文件。
- 选择 分析|根据 显微镜物镜设置比例并设置图像比例。
- 选择 图像|类型 |8 位。
- 选择 图像|调整|阈值 ，然后从下拉框中选择“Otsu” 自动阈值选项。
- 点击 分析|设置测量值 并选择 Feret 的直径 和 阈值限制。
- 点击 分析|分析颗粒 并输入微凝胶预期的区域 大小范围 （以像素^2为单位）（以排除小碎片进行分析）。将 循环度 更改为 0.75-1.00 ，然后选择 显示|大纲。选中 “显示结果” 和 “在边上排除”。
注意：圆形过滤器排除了图像边界上的微凝胶，这些微凝胶可能会产生不准确的直径测量。 - 运行 “分析粒子” 模块。
- 等待输出（即每个粒子的 Feret 直径），然后将这些结果导出到电子表格。
- 在该协议中，计算多分散指数（PDI）以确定微凝胶尺寸的异质性。分析至少100微凝胶以定义种群：PDI范围1.00-1.05定义了单分散种群，PDI大于1.05定义了多分散种群。使用等式 （2）、等式 （3） 和等式 （4） 计算 PDI，如下所述。
（二）
（三）
（四）
（二）
（三）
（四）
图6：微凝胶的代表性图像 （A）微凝胶群A的荧光共聚焦图像，（B）阈值微凝胶的图像，以及（C）ImageJ分析后的颗粒轮廓。（D）微凝胶群B的荧光共聚焦图像和（E）微凝胶的透射光图像（微凝胶几乎是半透明的）。（F）描述本协议中概述的ImageJ分析的代表性结果。两种微凝胶群体都具有相对单分散的PDI。两组微凝胶均以3 mL/ h的水流速和6 mL / h的油流速合成。然而，微凝胶尺寸的差异是由于微流体装置步长的差异。例如，用通道步长为11 μm的微流体装置合成微凝胶族群A，在步长为40 μm的装置中合成微凝胶族群B。比例尺 = 100 μm。缩写：PDI = 多分散性指数。 请点击此处查看此图的大图。
7. 微孔退火颗粒（MAP）脚手架退火
- 在1x PBS（pH 7.4）中产生2mM苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰次膦酸锂（LAP）的储备溶液。
- 将 LAP 储备溶液稀释至 0.2 mM，体积为 1x PBS，相当于凝胶体积。如果使用 LAP 光引发剂进行细胞研究或动物研究，请务必在使用前对溶液进行灭菌。
- 将MAP凝胶以4，696× g 旋转5分钟，然后吸出上清液。
- 使用容积式移液管，将所需体积的凝胶转移到微量离心管中。
- 以1：1的体积比向凝胶中加入0.2 mM LAP（最终LAP浓度为0.1mM）。
- 涡旋混合物并在黑暗中孵育至少15分钟。
- 将混合物以18，000× g 离心5分钟以沉淀凝胶。
- 小心地从凝胶沉淀中除去上清液。
- 使用置换式移液管将MAP凝胶转移到目标位置。
- 将聚焦光（365 nm，8.66mW / cm2）施加到样品上113秒以退火支架。
注意：113 s 的退火时间已像之前发表的一样进行了优化，适用于 0.1 mM14 的 LAP 浓度，但可能需要针对不同的光引发剂浓度进行额外的优化。
图 7：MAP 脚手架退火 。 （A） MAP 脚手架退火示意图。当暴露于光引发剂和光下时，甲基丙烯酰胺大分子体上的甲基丙烯酰胺官能团经历点击光聚合反应，其将微凝胶的表面粘合在一起。（B）描绘MAP微凝胶（绿色）的双光子显微镜图像的3D渲染（Imaris），该图像以3D圆盘形状退火在一起，孔隙中含有葡聚糖（红色）。（C）双光子显微镜图像的3D渲染（Imaris）的描绘，显示注入荧光70 kDa葡聚糖（红色）的MAP支架的孔隙率。比例尺 = （B） 100 微米，（C） 70 微米。缩写：MAP=微孔退火颗粒;甲基丙氨酰亚胺 = 定制退火大分子。 请点击此处查看此图的大图。
Representative Results
该协议的目的是概述合成用于MAP支架的微凝胶构建块所需的所有步骤。MethMAL退火大分子聚合物具有高选择性和效率，并且与多个聚合物主链14相容。重要的是，至少67%-75%的20 kDa PEG-马来酰亚胺用甲基丙烯酰胺官能团修饰，以确保高退火效率。通过分析 1个H-NMR光谱峰可以最容易地确定修饰百分比，如图 1所示。由粘度计测定的凝胶动力学是每种凝胶配方需要考虑的重要指标。该方案使用凝胶前体溶液，该溶液由具有MAL基团的PEG骨架组成，其有效地与硫醇官能化交联剂反应以进行微凝胶化。然而，许多水凝胶化学反应可用于通过本文所述的高通量微流体方法制备微凝胶。凝胶化开始的时间将提供对微流体微凝胶生成的持续时间的深入了解。建议选择凝胶前体pH值，该pH值可以在30分钟（图2）至2小时之间引发凝胶化。
如果凝胶化时间过快，凝胶前体溶液将开始在微流体装置内聚合并堵塞通道。此外，重要的是要注意，硫醇化配体浓度的变化（例如RGD ）可能会对凝胶化过程中的网络形成产生影响，并且可能需要通过调整制剂来解释。微流体器件制造步骤可能很繁琐，但成功粘合器件的代表性结果如图 3所示。该协议使用高通量，并行化，步进乳化微流体装置，该器件改编自de Rutte等人的设计13，硅晶圆制造外包给一家微流体技术公司。但是，该协议中概述的步骤可用于在SU-8硅晶圆光掩模上蚀刻的任何器件设计。重要的是要注意，在器件制造过程中必须优化光掩模上通道的步长，因为它会影响微凝胶颗粒的大小。
微凝胶微流控生成的流速应根据凝胶时间、所需粒径和微流体装置设计等因素针对每种凝胶配方进行优化。如果使用高通量设备，水相的流速可高达5 mL/h.图4B显示了该协议中使用的高通量设备的设置。如果设备运行正常，微凝胶的形成应类似于图4D所示。在纯化之前，微凝胶将是不透明的。完成各种油、PBS和己烷洗涤后，凝胶应如图5中的代表性图像所示。如果将荧光团掺入微凝胶中，纯化产物可能具有轻微的彩色色调，但仍应接近半透明。纯化和溶胀后，微凝胶的尺寸应非常均匀，PDI在1.00和1.05之间，如图6所示。各种光引发剂可用于MAP支架的光性照明。如果使用本文中描述的LAP的替代品，则必须确定如前面描述的退火动力学14。此外，只要光源与光引发剂相对应，就可以将各种光源用于光质照明。必须确保校准和聚焦光源。退火时间和光强度可能需要根据凝胶配方和光引发剂浓度进行优化。该方案中概述的退火方法可用于体外和体内研究。退火后，微凝胶将形成一个多孔支架，可以用双光子显微镜观察（图7B-C）。
Discussion
该协议描述了合成和表征微凝胶的方法，微凝胶是微孔退火颗粒（MAP）支架的构建块。该协议使用高通量微流体方法来产生大量均匀的微凝胶，这是其他方法无法实现的，例如流动聚焦微流体1，4，7，9 （高单分散性，低产量），间歇乳液6，10和电喷雾5，12 （单分散性低，产量高）。利用本文描述的方法，单分散微凝胶可以制成用于MAP支架，可用于各种再生医学应用（例如，细胞递送，伤口愈合）。
该协议的一个关键步骤是创建PDMS微流体装置。如果设备制造不正确，这可能会对微凝胶形成和单分散性产生负面影响。重要的是要防止在PDMS固化之前将伪影（即气泡，灰尘）引入PDMS，因为这可能会堵塞通道并显着影响微凝胶的形成。为了尽可能地减轻这种情况，应该使用胶带去除任何灰尘，将设备存放在无尘容器中，并在无尘罩中工作（如果可能）。还建议将设备储存在60°C，以获得最佳表面处理效果。
浇注 PDMS 设备时，保持均匀的厚度大约等于或小于活检冲头的长度非常重要。如果设备太厚，活检冲头将无法穿透。在使用活检冲头和/或插入管子进行冲孔时，不要撕裂 PDMS 设备的入口/出口也至关重要。PDMS装置中的撕裂将导致入口/出口泄漏，从而导致凝胶前体溶液的损失。如果 PDMS 设备中存在泄漏，最好的解决方案是尽快用新设备替换它。
在等离子体处理设备时，使用纯氧和等离子体处理30秒已经产生了将PDMS粘附到载玻片上的最佳效果。如果设备未正确粘合（即，等离子体处理后仍可将 PDMS 从载玻片上抬起），则应仔细检查等离子体处理仪是否正常运行，以及设备和载玻片是否已彻底清洁。使用正确的硅烷表面处理也很重要，为了获得最佳效果，PDMS设备应在使用前直接进行表面处理。也可以使用其他表面处理方法，例如化学气相沉积。
另一个关键步骤是正确使用PDMS微流体装置进行微凝胶形成。建议使用至少2：1的流速比（该方案使用6 mL / h油流速和3 mL / h水流速），但可以调整以达到所需的微凝胶大小。微凝胶前体溶液的pH值也是优化以防止设备堵塞的重要指标。磷酸盐缓冲盐水（PBS）加速了迈克尔型加成化学中的硫代酸盐形成，并且该方案中使用的PBS浓度为微流体装置中的微凝胶化产生了最佳结果。一旦注射泵启动，微流体通道中可能会有一些气泡，但这应该在几分钟后平衡。建议用显微镜监测微凝胶的形成。如果流动看起来与此视频中的不相似和/或有几个通道产生大颗粒，则可能是由于表面处理步骤的问题。最好的解决方案是用经过新鲜表面处理的设备替换设备。
如果微凝胶似乎正在聚结，这可能是由于氟表面活性剂浓度不足。推荐的解决方案是增加油相中表面活性剂的重量百分比。然而，使用高浓度表面活性剂的一个限制是，在纯化步骤中可能更难去除。建议仅使用微流体装置一次，但如果在使用后立即用Novec油冲洗，可以重复使用这些装置，以除去任何可能凝胶在装置中并堵塞通道的水溶液。虽然一个微流体装置可以产生高通量的微凝胶（mL / h），但可以通过并行使用多个微流体装置来扩展该生产率。
MAP支架组装的退火步骤依赖于使用自由基聚合的光活化光引发剂，并且可以根据所需的应用选择光引发剂。例如，LAP光引发剂在使用长波紫外线时具有快速退火时间（<30秒），对 体外14中的细胞活力影响最小。然而，该波长被组织16 高度吸收， 并且在体内 可能不具有与 体外那样高的退火效率。
曙红Y是另一种由可见光波长（505nm）激活的光引发剂，具有更深的渗透到组织中，这增强了MAP支架在组织下方退火的能力。然而，曙红Y退火所需的长光暴露时间可能会延长细胞暴露于自由基并影响细胞 体外活力14。使用这些方法高通量生成高度均匀的微凝胶构建块将加速以MAP支架为重点的研究，并推进再生医学可注射多孔材料领域的知识。
Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
作者要感谢Joe de Rutte和加州大学洛杉矶分校的迪卡洛实验室，感谢他们对原始微流体设备设计的帮助，这些设备是开发所报道的设备，以及他们在PDMS设备制造和故障排除方面的早期指导。图示意图是用 Biorender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
| 35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
| 4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
| 4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
| Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
| Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
| Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
| DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
| Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
| FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
| HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
| ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
| KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
| LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
| Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
| Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
| MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
| Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
| Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
| Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
| Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
| PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
| Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
| Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
| Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
| Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
| Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
| Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
| Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |
References
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