该协议描述了一组用于合成用于微孔退火颗粒支架的微凝胶构建块的方法,其可用于各种再生医学应用。
微孔退火颗粒(MAP)脚手架平台是颗粒水凝胶的一个亚类。它由可注射的微凝胶浆料组成,可以在二次光基化学交联步骤(即退火)之后形成结构稳定的支架, 原位 具有细胞规模的孔隙率。MAP支架在各种再生医学应用中取得了成功,包括真皮伤口愈合,声带增大和干细胞递送。本文介绍了聚乙二醇(PEG)微凝胶作为形成MAP支架的构建块的合成和表征方法。这些方法包括合成定制退火大分子体(MethMAL),测定微凝胶前体凝胶动力学,微流体装置制造,微流体生成微凝胶,微凝胶纯化和基本支架表征,包括微凝胶施胶和支架退火。具体而言,本文描述的高通量微流体方法可以产生大量的微凝胶,这些微凝胶可用于产生MAP支架用于任何所需的应用,特别是在再生医学领域。
MAP支架平台是一种可注射的生物材料,完全由水凝胶微粒(微凝胶)组成,当交联在一起时提供细胞规模的微孔隙率,这允许降解无关的细胞迁移和本体组织整合1。由于其能够快速与宿主组织整合并且固有的低免疫原性,MAP支架平台已被证明适用于各种再生医学疗法2,3,4,5,6,7,8,9,10,包括加速真皮伤口愈合1,3,11,脑卒中腔7血运重建,递送间充质干细胞2,并提供组织膨胀治疗声门功能不全6。MAP还被证明可以通过招募M2巨噬细胞3向宿主组织传递抗炎作用,甚至可以调节以促进Th2“组织修复”免疫反应8。MAP支架平台的这些有利特性使其能够扩展到各种临床应用。
以前发表的用于生成用于MAP支架形成的微凝胶的方法包括流动聚焦液滴 – 微流体1,4,7,9,电喷雾5,12和用批量乳液6,10的架空纺丝。液滴微流体法可以产生具有高单分散性的颗粒,但使用非常慢的流速,产生低产量的颗粒(μL / h)。或者,电喷雾和间歇乳液方法可以产生高体积的颗粒,但具有高颗粒多分散性。该协议使用高通量微流体方法生产具有单分散群体的微凝胶,基于de Rutte等人的工作13。该方法利用软光刻技术从光掩模制造聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流体器件,然后将其粘合到载玻片上。设备设计依靠分步乳化来产生大量微凝胶颗粒(mL / h)。与其他技术相比,使用该方法可以实现的单分散性提供了更好的孔隙率控制,因为单分散微凝胶可以形成孔径更均匀的支架2。
本手稿概述了合成和表征可用作MAP支架构建块的单个微凝胶的方法,特别是关于创建由PEG骨架和马来酰亚胺(MAL)基团组成的微凝胶,其易于参与用于微凝胶凝胶化的硫醇官能化交联剂的高效迈克尔型添加。为了将微凝胶凝胶与MAP支架退火分离,该手稿还描述了如何合成已发表的14 种定制退火大分子MethMAL,这是一种异官能甲基丙烯酰胺/马来酰亚胺4-arm PEG大分子体。甲基丙烯酰胺官能团容易参与自由基光聚合(用于微凝胶退火),同时对促进MAL官能团的迈克尔型添加的条件保持相对惰性。
此外,该手稿还概述了用于创建PDMS微流体装置,确定微凝胶动力学和表征微凝胶尺寸的方案。手稿的最后一部分详细介绍了MAP支架退火,即当微凝胶通过二次光启动交联步骤 原位 过渡到散装支架时,该步骤将微凝胶的表面共价粘合在一起。重要的是要注意,在MAP支架系统中可以实现其他退火方法,这些方法不依赖于光基化学,例如酶介导的退火,如前所述1。总体而言,这些方法可以直接使用或与不同的水凝胶制剂化学成分(例如,透明质酸基)一起使用,以产生用于任何应用的MAP支架。
该协议描述了合成和表征微凝胶的方法,微凝胶是微孔退火颗粒(MAP)支架的构建块。该协议使用高通量微流体方法来产生大量均匀的微凝胶,这是其他方法无法实现的,例如流动聚焦微流体1,4,7,9 (高单分散性,低产量),间歇乳液6,10和电喷雾5,12 (单分散性低,产量高)。利用本文描述的方法,单分散微凝胶可以制成用于MAP支架,可用于各种再生医学应用(例如,细胞递送,伤口愈合)。
该协议的一个关键步骤是创建PDMS微流体装置。如果设备制造不正确,这可能会对微凝胶形成和单分散性产生负面影响。重要的是要防止在PDMS固化之前将伪影(即气泡,灰尘)引入PDMS,因为这可能会堵塞通道并显着影响微凝胶的形成。为了尽可能地减轻这种情况,应该使用胶带去除任何灰尘,将设备存放在无尘容器中,并在无尘罩中工作(如果可能)。还建议将设备储存在60°C,以获得最佳表面处理效果。
浇注 PDMS 设备时,保持均匀的厚度大约等于或小于活检冲头的长度非常重要。如果设备太厚,活检冲头将无法穿透。在使用活检冲头和/或插入管子进行冲孔时,不要撕裂 PDMS 设备的入口/出口也至关重要。PDMS装置中的撕裂将导致入口/出口泄漏,从而导致凝胶前体溶液的损失。如果 PDMS 设备中存在泄漏,最好的解决方案是尽快用新设备替换它。
在等离子体处理设备时,使用纯氧和等离子体处理30秒已经产生了将PDMS粘附到载玻片上的最佳效果。如果设备未正确粘合(即,等离子体处理后仍可将 PDMS 从载玻片上抬起),则应仔细检查等离子体处理仪是否正常运行,以及设备和载玻片是否已彻底清洁。使用正确的硅烷表面处理也很重要,为了获得最佳效果,PDMS设备应在使用前直接进行表面处理。也可以使用其他表面处理方法,例如化学气相沉积。
另一个关键步骤是正确使用PDMS微流体装置进行微凝胶形成。建议使用至少2:1的流速比(该方案使用6 mL / h油流速和3 mL / h水流速),但可以调整以达到所需的微凝胶大小。微凝胶前体溶液的pH值也是优化以防止设备堵塞的重要指标。磷酸盐缓冲盐水(PBS)加速了迈克尔型加成化学中的硫代酸盐形成,并且该方案中使用的PBS浓度为微流体装置中的微凝胶化产生了最佳结果。一旦注射泵启动,微流体通道中可能会有一些气泡,但这应该在几分钟后平衡。建议用显微镜监测微凝胶的形成。如果流动看起来与此视频中的不相似和/或有几个通道产生大颗粒,则可能是由于表面处理步骤的问题。最好的解决方案是用经过新鲜表面处理的设备替换设备。
如果微凝胶似乎正在聚结,这可能是由于氟表面活性剂浓度不足。推荐的解决方案是增加油相中表面活性剂的重量百分比。然而,使用高浓度表面活性剂的一个限制是,在纯化步骤中可能更难去除。建议仅使用微流体装置一次,但如果在使用后立即用Novec油冲洗,可以重复使用这些装置,以除去任何可能凝胶在装置中并堵塞通道的水溶液。虽然一个微流体装置可以产生高通量的微凝胶(mL / h),但可以通过并行使用多个微流体装置来扩展该生产率。
MAP支架组装的退火步骤依赖于使用自由基聚合的光活化光引发剂,并且可以根据所需的应用选择光引发剂。例如,LAP光引发剂在使用长波紫外线时具有快速退火时间(<30秒),对 体外14中的细胞活力影响最小。然而,该波长被组织16 高度吸收, 并且在体内 可能不具有与 体外那样高的退火效率。
曙红Y是另一种由可见光波长(505nm)激活的光引发剂,具有更深的渗透到组织中,这增强了MAP支架在组织下方退火的能力。然而,曙红Y退火所需的长光暴露时间可能会延长细胞暴露于自由基并影响细胞 体外活力14。使用这些方法高通量生成高度均匀的微凝胶构建块将加速以MAP支架为重点的研究,并推进再生医学可注射多孔材料领域的知识。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢Joe de Rutte和加州大学洛杉矶分校的迪卡洛实验室,感谢他们对原始微流体设备设计的帮助,这些设备是开发所报道的设备,以及他们在PDMS设备制造和故障排除方面的早期指导。图示意图是用 Biorender.com 创建的。
2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |