Summary
Denne protokol beskriver et sæt metoder til syntetisering af mikrogelbyggestenene til mikroporøs udglødet partikelstillads, som kan bruges til en række regenerative medicinapplikationer.
Abstract
Den mikroporøs udglødede partikel (MAP) stilladsplatform er en underklasse af granulære hydrogeler. Den består af en injicerbar opslæmning af mikrogeler, der kan danne et strukturelt stabilt stillads med celleskala porøsitet in situ efter et sekundært lysbaseret kemisk tværbindingstrin (dvs. udglødning). MAP stillads har vist succes i en række regenerative medicin applikationer, herunder dermal sårheling, vokal foldforstørrelse og stamcelle levering. Dette papir beskriver metoderne til syntese og karakterisering af poly (ethylenglycol) (PEG) mikrogeler som byggestenene til dannelse af et MAP-stillads. Disse metoder omfatter syntese af en brugerdefineret udglødningsmakromer (MethMAL), bestemmelse af mikrogelprecursorgeleringskinetik, mikrofluidisk enhedsfabrikation, mikrofluidisk generering af mikrogeler, mikrogelrensning og grundlæggende stilladskarakterisering, herunder mikrogelstørrelse og stilladsglødning. Specifikt kan de mikrofluidiske metoder med høj kapacitet, der er beskrevet heri, producere store mængder mikrogeler, der kan bruges til at generere MAP-stilladser til enhver ønsket anvendelse, især inden for regenerativ medicin.
Introduction
MAP-stilladsplatformen er et injicerbart biomateriale, der udelukkende består af hydrogelmikropartikler (mikrogeler), der giver celleskala mikroporøsitet, når de er tværbundet sammen, hvilket muliggør nedbrydningsuafhængig cellemigration og bulkvævsintegration1. På grund af sin evne til hurtigt at integrere med værtsvæv og iboende lav immunogenicitet har MAP-stilladsplatformen vist præklinisk anvendelighed til en lang række regenerative medicinbehandlinger 2,3,4,5,6,7,8,9,10, herunder accelererende dermal sårheling 1,3 ,11, revaskularisering af hjerneslag hulrum7, levering af mesenkymale stamceller2 og tilvejebringelse af vævsmasse til behandling af glottisk insufficiens6. MAP har også vist sig at formidle antiinflammatoriske virkninger til værtsvæv gennem rekruttering af M2-makrofager3 og kan endda indstilles til at fremme et Th2 "vævsreparation" immunrespons8. Disse gunstige egenskaber ved MAP-stilladsplatformen gør det muligt at udvide den til en bred vifte af kliniske applikationer.
Tidligere offentliggjorte metoder til generering af mikrogeler til MAP-stilladsdannelse har inkluderet flowfokuserende dråbemikrofluidik 1,4,7,9,elektrospraying 5,12 og overhead spinding med batchemulsion 6,10. Dråbemikrofluidmetoden kan producere partikler med høj monodispersitet, men bruger meget langsomme strømningshastigheder, der producerer lave udbytter af partikler (μL / h). Alternativt kan elektrospray- og batchemulsionsmetoderne producere et stort volumen partikler, men med høj partikelpolydispersitet. Denne protokol bruger en mikrofluidisk metode med høj kapacitet til at producere mikrogeler med en monodisperse population, baseret på arbejde af de Rutte et al13. Denne metode anvender bløde litografiteknikker til at fremstille en polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk enhed fra en fotomaske, som derefter bindes til et glasglas. Enhedens design er afhængig af trinemulgering for at generere et stort volumen mikrogelpartikler (ml / h). Den monodispersitet, der kan opnås med denne metode, giver overlegen kontrol af porøsitet sammenlignet med andre teknikker, da monodisperse mikrogeler kan danne stilladser med mere ensartede porestørrelser2.
Metoderne til syntetisering og karakterisering af de enkelte mikrogeler, der kan fungere som byggesten til MAP-stilladser, er skitseret i dette manuskript, specifikt med hensyn til at skabe mikrogeler, der består af en PEG-rygrad med en maleimid (MAL) gruppe, som let deltager i effektiv Michael-type tilsætning med thiol-funktionaliserede tværbindinger til mikrogelgelering. For at afkoble mikrogelgelgelering fra MAP-stilladsglødning beskriver dette manuskript også, hvordan man syntetiserer en offentliggjort14 brugerdefineret udglødningsmakromer, MethMAL, som er en heterofunktionel methacrylamid / maleimid 4-arm PEG-makromer. Methacrylamidfunktionelle grupper deltager let i fotopolymerisering af frie radikaler (til mikrogelglødning), mens de forbliver relativt inerte over for de betingelser, der fremmer Michael-type tilsætning for MAL funktionelle grupper.
Derudover skitserer dette manuskript protokollerne til oprettelse af PDMS-mikrofluidiske enheder, bestemmelse af mikrogelgelgeleringskinetik og karakterisering af mikrogelstørrelse. Den sidste del af manuskriptet beskriver MAP-stilladsglødning, hvilket er, når mikrogelerne overføres in situ til et bulkstillads gennem et sekundært, fotoinitieret tværbindingstrin, der kovalent binder mikrogelernes overflader sammen. Det er vigtigt at bemærke, at der er andre udglødningsmetoder, der kan implementeres i MAP-stilladssystemer, der ikke er afhængige af lysbaserede kemikalier, såsom enzymmedieret udglødning, som tidligere beskrevet1. Samlet set kan disse metoder anvendes direkte eller anvendes med forskellige hydrogelformuleringskemikalier (f.eks. Hyaluronsyrebaserede) til at generere MAP-stilladser til enhver anvendelse.
Protocol
1. MethMAL udglødning makromer syntese
BEMÆRK: Denne protokol er specifikt til ændring af 1 g PEG-maleimid, men kan skaleres op til at lave større partier.
- Der tilsættes 1 g 4-arm 20 kDa PEG-maleimid til 10 ml 1x phosphatbufferet saltvand (PBS, pH 7.4) i et lille glasbægerglas med rørestang. Opløsningen omrøres ved 300 o /min, indtil PEG'en er helt opløst (~ 30 min).
- Der tilsættes 14,65 mg 2-aminoethanethiol (0,67:1 thiol [SH] til maleimid [MAL] molforhold) til reaktionen under omrøring ved 300 o/min.
BEMÆRK: Thiolgrupperne på 2-aminoethanethiol vil blive tilsat til ca. tre arme af PEG-MAL via Michael-type tilsætning, hvilket efterlader aminendegrupper.- Overhold følgende eksempelberegning for mængden af 2-aminoethanethiol, der skal tilsættes:
BEMÆRK: For at undgå at måle en meget lille mængde opløses 100 mg 2-aminoethanethiol i 1 ml 1x PBS (pH 7,4) og 146,5 μL af denne opløsning tilsættes til reaktionen.
- Overhold følgende eksempelberegning for mængden af 2-aminoethanethiol, der skal tilsættes:
- Vent i 1 time og 10 minutter efter trin 1.2, og bland derefter 160,1 mg 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholiniumchlorid (DMTMM, 12:1 molært forhold til PEG) og 32,77 μL methacrylsyre (8:1 molforhold til PEG) i 5 ml 1x PBS (pH 7,4) i et nyt glasbægerglas og reager i 50 minutter under omrøring ved 300 omdr./min.
BEMÆRK: På dette trin reagerer methacrylsyren med DMTMM for at danne en meget reaktiv ester, der derefter kan kobles til de tilgængelige amingrupper på PEG.- Overhold følgende eksempelberegning til beregning af mængden af DMTMM, der skal tilføjes:
- Overhold følgende eksempelberegning til beregning af mængden af methacrylsyre, der skal tilsættes:
- Overhold følgende eksempelberegning til beregning af mængden af DMTMM, der skal tilføjes:
- Methacrylsyre/DMTMM-opløsningen tilsættes bægerglasset med 20 kDa PEG-MAL/2-aminoethanethiolopløsningen.
- Der tilsættes 53,56 μL triethylamin (1:1 molforhold til methacrylsyre) til bægerglasset, og det tillades at reagere natten over under omrøring ved 300 o/min. Bægerglasset dækkes med folie for at forhindre støv og andre forurenende stoffer i at trænge ind i bægerglasset.
- Overhold følgende eksempelberegning for mængden af triethylamin, der skal tilføjes:
- Overhold følgende eksempelberegning for mængden af triethylamin, der skal tilføjes:
- Overfør reaktionen til slangeskinddialyseslange (molekylvægtafskæring: 3.500 Da).
- Dialyseslangen anbringes i et stort bægerglas med 1 M NaCl i deioniseret (DI) vand (volumen skal dække slangen helt) i 3 dage under omrøring ved 300 o/min. Skift 1 M NaCl-opløsningen 2x dagligt til i alt seks vaske.
- Dialysere i 6 timer i DI-vand. Skift DI-vandet hver time i alt seks vaske.
- Reaktionen overføres til et 50 ml konisk rør og fryses ved -80 °C.
- Lyofiliser røret i mindst 72 timer ved en starttemperatur på -70 °C og en temperaturrampe på 0,01 °C/min. indtil 0 °C.
- Prøven forberedes til 1H-NMR ved at opløse 25 mg MethMAL i 700 μL chloroform-d og overføres til et NMR-rør.
- Anskaf de 1H-NMR spektre.
BEMÆRK: Spektrene i denne protokol blev erhvervet ved hjælp af et 500 MHz spektrometer med følgende parametre: fejebredde = 6.467,3 Hz, tidsforsinkelse = 13,1 s, anskaffelsestid = 5,1 s, pulstid = 5,1 μs og antal scanninger = 8. - Til analyse skal du integrere maleimidtoppen som en reference (~ 6,76 ppm) og derefter integrere de to methacrylamidtoppe (~ 5,35 ppm og 5,6 ppm). Divider forholdet mellem methacrylamid-topområderne med det samlede areal af alle tre toppe for at opnå procentdelen af arme modificeret med methacrylamid.
BEMÆRK: En acceptabel ændring er 67%-75% methacrylamid funktionel gruppesubstitution. Et eksempel på 1H-NMR-spektrum for MethMAL er vist i figur 1.- Brug ligning (1) som graden af substitutionsligning:
(1)
- Brug ligning (1) som graden af substitutionsligning:
(1)
Figur 1: Kemisk struktur og 1H-NMR spektrum af MethMAL. (A) Kemisk struktur: MethMAL-udglødningsmakromeren består af 20 kDa 4-arm poly (ethylenglycol) modificeret med tre methacrylamidarme. (B) Denne struktur genererer toppe ved 5,36 ppm (3) og 5,76 ppm (2), der ikke er til stede i PEG-MAL-spektre, og en maleimidarm, som genererer en top ved 6,71 ppm (1). Opløsningsmidlet, chloroform, genererede en top ved 7,26 ppm, og resterende vand i denne prøve genererede en top ved 2,2 ppm (mærket på spektre). I MethMAL-spektrene havde maleimidtoppen et integreret areal på 0,27, og summen af methacrylamidtoppeområderne var 0,73 (0,37 + 0,36). Modifikationen af methacrylamidprocenten var 73 % (0,73/(0,27 + 0,73)). Dette tal er fra Pfaff et al.14. Ophavsret (2021) American Chemical Society. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Mikrogel forløber gelering kinetik
BEMÆRK: Geleringstiden kan ændres ved at justere pH-værdien af bufferen, der bruges til at opløse gelprecursorkomponenterne. For PEG-maleimidhydrogeler svarer en mere sur pH typisk til langsommere geleringstid, da thiolatkoncentrationen reduceres ved lavere pH15.
- Forudbestemme de ønskede koncentrationer af polymer, tværbinding og andre gelprecursorkomponenter (dvs. peptider, glycosaminoglycaner). PEG-MAL, RGD og MethMAL (PEG-backbone) opløses i 10x PBS (pH 1,5) og MMP-2-tværbindingen i 1x PBS (pH 7,4).
BEMÆRK: I denne protokol er gelprecursoropløsningen en offentliggjort formulering3, som består af 45,88 mg/ ml 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg / ml RGD, 8,06 mg / ml methMAL og 4,62 mg / ml MMP-2 tværbinding (enzymatisk nedbrydelig tværbinding). - Forbered et viskosimeter eller et tilsvarende instrument til overvågning af lagrings- og tabsmoduli ved hjælp af en mellemrumsstørrelse på 0,4 mm, en forskydningsstamme på 1,0, en frekvens på 1,0 Hz og en varighed på 10.800 s.
- Fastgør en 35 mm pladerotor (P35/Ti) geometri. Brug et befugtet kammer eller en fugtig svamp omkring geometrien for at opretholde et befugtet miljø.
- Bland PEG-backbone og MMP-crosslinker i et 1: 1 volumetrisk forhold.
- Pipetter 400 μL af gelprecursoropløsningen på midten af viskosimetertrinnet.
- Sænk langsomt geometrien ned på scenen, indtil den når den forudbestemte mellemrumsstørrelse på 0,4 mm, og begynd straks at overvåge lagrings- (G'') og tab (G'') moduli i op til 6 timer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Gelering anses for at begynde, når lagermodulet bliver større end tabsmodulet, og gelering betragtes som komplet, når opbevaringsmodulet plateauer. En repræsentativ geleringskinetikkurve er vist i figur 2.
Figur 2: Repræsentativ kurve for geleringskinetik af en MAP-gelprecursoropløsning (pH 4.5) bestemt ved hjælp af et viskosimeter. Gelering begynder ved den hurtige stigning i opbevaring (G') modul, og gelering afsluttes, når G 'kurven plateauer. G'' angiver tabsmodulet. Denne figur er fra Pruett et al.3. Copyright (2021) Wiley-VCH GmBH. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Fremstilling af mikrofluidisk enhed
BEMÆRK: Denne protokol beskriver enhedsfabrikation af et mikrofluidisk trinemulgeringsanordningdesign tilpasset fra de Rutte et al.13, som kan ses i figur 3A. Denne protokol kan dog bruges med ethvert enhedsdesign, der er ætset ind i en SU-8 wafer. Det anbefales at outsource SU-8 silicium wafer master fabrikation, medmindre de relevante renrumsfaciliteter er tilgængelige til fremstilling.
- Opret den første polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidiske enhed fra en SU-8 wafer fotomaske.
- Forbered ~ 200 g PDMS ved at blande basen og hærdningsmidlet i et forhold på 10: 1 w / w (se materialetabellen).
- Anbring SU-8-waferen i en kulturskål (tape kanterne af waferen til skålen) med det mikrofluidiske design opad.
- Hæld PDMS i fadet for at skabe et 1-1,5 cm tykt lag over waferen. Placer skålen under vakuum for at fjerne eventuelle bobler.
- Lad PDMS hærde, indtil det er størknet (24 timer ved stuetemperatur eller ~ 2 timer ved 60 °C).
- Når PDMS er hærdet, skal du forsigtigt bruge et barberblad eller en skalpel til at skære et rektangel gennem PDMS, således at der er en margen på 0,5-1 cm omkring designet på waferen.
BEMÆRK: Brug ikke for meget tryk og vær meget skånsom for at undgå at beskadige (f.eks. revne, ridse) waferen. - Kil en spatel ind i et af snittene, og skub det langs snittene for at adskille PDMS fra waferen.
BEMÆRK: Når PDMS adskiller sig fra waferen, begynder en luftboble at danne sig under PDMS (se figur 3B). - Brug spatelen til forsigtigt at løfte rektanglet af PDMS ud af skålen.
BEMÆRK: Det resulterende hul i PDMS over waferen vil være formen til de mikrofluidiske enheder.
- Opret efterfølgende PDMS mikrofluidiske enheder fra SU-8 wafer fotomaske.
- Forbered ~ 15-20 g PDMS pr. Form ved at blande basen og hærdningsmidlet i forholdet 10: 1.
- Hæld PDMS i det rektangulære hul i formen for at skabe et 5 mm lag PDMS over waferen. Sæt formen under vakuum for at fjerne eventuelle bobler.
- Lad PDMS hærde, indtil den er fuldt størknet (24 timer ved stuetemperatur eller 2 timer ved 60 °C).
- Når PDMS er hærdet, skal du bruge et barberblad eller en skalpel til at skære PDMS rundt om rektanglets kanter.
BEMÆRK: Brug ikke for meget tryk og vær meget skånsom for at undgå at beskadige (dvs. revne) waferen. - Kil en spatel ind i et af snittene, og skub det langs snittene for at adskille PDMS fra waferen.
BEMÆRK: Når PDMS adskilles fra waferen, begynder der at dannes en luftboble under PDMS. - Brug en 1,5 mm biopsistans til at skabe huller gennem PDMS-rektanglet ved de to indløb og udløb (se figur 3B).
- Hvis der er flere enheder på en enkelt wafer, skal du bruge en spatel eller barberblad til let at score PDMS mellem hver enhed og derefter forsigtigt fold PDMS langs de scorede linjer, så PDMS adskiller sig meget rent alene.
- Opbevar PDMS-enhederne i en støvfri beholder.
- Bind PDMS mikrofluidiske enheder til glasglas.
- Forbered et glasglas pr. PDMS mikrofluidisk enhed. Brug tape, filtreret luft eller isopropylalkohol (IPA) vaske til at fjerne støv fra diaset. Sørg for, at diasene er helt tørre, før du går videre til næste trin.
- Placer et glasglas og en PDMS-enhed med designsiden opad ved siden af hinanden på en lille plastbakke (et 96-brønd pladelåg fungerer godt til dette) og læg det i en plasmarenser. Luk døren og luftstrømsventilen, og tænd for vakuumpumpen. Lad den køre i mindst 30 s, og sluk den derefter.
- Tilslut ilttankens gasrør til luftstrømsventilen. Lad plasmakammeret fylde med ilt i 30 s, sluk derefter iltet, og luk luftstrømsventilen.
- Tænd for vakuumpumpen, og indstil radiofrekvensniveauet (RF) til højt. Vent, indtil kammeret får en violet-pink farve (se figur 3B). Lad 30 s passere.
- Når timeren slukkes, skal du slukke for plasmaet og vakuumet. Åbn derefter langsomt luftstrømsventilen for at frigøre vakuumet. Fjern bakken fra plasmarenseren.
- Vend forsigtigt PDMS-enheden på glasglasset for at binde dem. Når binding sker, skal du observere den lille forskel i PDMS's gennemsigtighed.
BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater skal du opbevare de bundne enheder ved 60 °C indtil umiddelbart før brug.
- Overfladebehandling af PDMS-mikrofluidiske enheder
- Overfladebehandling forberedes ved fortynding af PFOCTS (trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan) i Novec-olie (1:50). Brug 1 ml til 3-4 enheder. Overfør volumenet til en 1 ml sprøjte og fastgør en 25 G nål.
BEMÆRK: Nålene, der bruges i denne protokol, er skrå, så pas på, når du håndterer skarpe genstande. Stumpe nåle kan også bruges, hvis det ønskes. - Skær et 10-12 cm stykke Tygon-slange pr. Enhed, der skal behandles.
- Skær et stykke PEEK-slange, ~ 7 cm i længden. Indsæt et par millimeter af PEEK-slangen i enden af Tygon-slangen, som vist i figur 4A, for at forhindre nålen i at punktere Tygon-slangeindløbene.
- Tag enheden /enhederne ud af det opvarmede kammer, og indsæt den ikke-PEEK-ende af Tygon-slangen i det vandige indløbshul.
- Sæt nålen på overfladebehandlingssprøjten i PEEK-slangen, og dæk oliekammerets udløbshul (se figur 3B).
- Injicer behandlingen langsomt i enheden og sørg for, at den fylder enheden uden bobler. Vent til de vandige kamre fyldes først, efterfulgt af de mindre kanaler og derefter oliekammeret. Fjern Tygon-slangen fra enheden. Når enheden er fyldt, lad den hvile i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fyld en 5 ml sprøjte kun med olie (ingen silan), og fastgør en 25 G nål.
- Opsuge overfladebehandling ud af enheden gennem indløb og udløb. Indsæt Tygon-slangen i det vandige indløb, indsæt sprøjten med olie i PEEK-slangen, og skyl hver enhed med olie. Opsuge olien ud af enheden.
- Gentag olieskylningen 2x mere. Fjern Tygon-slangen.
BEMÆRK: Enheden er klar til brug.
- Overfladebehandling forberedes ved fortynding af PFOCTS (trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan) i Novec-olie (1:50). Brug 1 ml til 3-4 enheder. Overfør volumenet til en 1 ml sprøjte og fastgør en 25 G nål.
Figur 3: Mikrofluidisk PDMS-enhed. (A) AutoCAD-tegning (Computer assisted design) af mikrofluidisk enhedsdesign. Mikrogel dråbedannelse forekommer i kanalerne på hver side af oliekanalen, som det ses i den forstørrede udskæring. (B) Oversigt over fremstilling af PDMS-enheder. Forkortelse: PDMS = polydimethylsiloxan. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Mikrofluidisk generation af mikrogeler
- Forudbestemme de ønskede koncentrationer af polymer, tværbinding og andre gelprecursorkomponenter (dvs. peptider, glycosaminoglycaner). PEG-MAL, RGD og MethMAL (PEG-backbone) opløses i 10x PBS (pH 1,5) og MMP-2-tværbindingen sammen med 5 μM biotin-maleimid i 1x PBS (pH 7,4).
BEMÆRK: I denne protokol er gelprecursoropløsningen en offentliggjort formulering3 bestående af 45,88 mg/ ml 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg / ml RGD, 8,06 mg / ml methMAL og 4,62 mg / ml MMP-2 tværbinding (enzymatisk nedbrydelig tværbinding). Metoderne beskrevet nedenfor vil give ~ 3 ml mikrogeler. - Der fremstilles 6 ml overfladeaktiv opløsning ved at fortynde lageret 5% FluoroSurfactant til mindst 1% i Novec olie. Tilsæt denne opløsning til en 10 ml sprøjte.
BEMÆRK: Fluoreret overfladeaktivt stof er ublandbart med vand, hvilket gør det let at fjerne det under gelovergangen til den vandige fase under PBS-vaskene i rensningstrinnet. - Skær tre stykker Tygon-slange, der har en passende længde til sprøjtepumpens højde.
- Skær to stykker PEEK-rør, ~ 1 tomme i længden. Indsæt et par millimeter af PEEK-slangen i enden af to stykker Tygon-slange, som vist i figur 4A, for at forhindre nålen i at punktere Tygon-slangeindløbene.
- Indsæt den ikke-PEEK-ende af Tygon-slangen i indløbene på de mikrofluidiske enheder. Indsæt det resterende stykke Tygon-slange (uden PEEK-slange på enden) i den mikrofluidiske enhedsudgang, som vist i figur 4C.
- Tilsæt mindst 3 ml olie til en 5 ml plastsprøjte og fastgør den til en 25 G nål. Sæt forsigtigt nålen i PEEK-slangen på et af Tygon-indløbene. Skyl forsigtigt slangen og enheden med olie. Saml olien fra udløbet i et konisk rør. Gentag olieskylningen på det andet Tygon-indløb.
- Indstil sprøjtepumperne til de ønskede strømningshastigheder.
BEMÆRK: Denne protokol bruger 3 ml / h til den vandige strømningshastighed og 6 ml / h til oliestrømningshastigheden. Det kan være nødvendigt at bruge to separate sprøjtepumper. - Tilslut sprøjten, der indeholder det overfladeaktive stof, til olieindløbet via en 25 G nål (se figur 4A), og udvis forsigtigt nok olie til at prime slangen og oliekanalen på den mikrofluidiske enhed.
- Når enheden og olieindtagene er sat op, tilsættes 0,5 ml olie til en ny 5 ml sprøjte, som indeholder gelprecursoren. Formålet med denne lille mængde olie er at hjælpe med at skylle forløberopløsningen gennem den mikrofuilidiske enhed mod slutningen af kørslen.
- I et konisk rør kombineres 1,5 ml PEG-backbone-opløsningen og 1,5 ml tværbindingsopløsningen. Vortex i 30 s og overfør hurtigt den kombinerede gelprecursoropløsning til 5 ml sprøjten.
- Tilslut sprøjten med gelprecursoropløsningen til det vandige indløb via en 25 G nål. Dispenser forsigtigt nok opløsning til at prime slangen og den vandige kanal.
- Klem sprøjterne fast på de respektive sprøjtepumper, og tryk på kør (se figur 4B). Sørg for, at der strømmer væske gennem både de vandige og oliekanalerne.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge et mikroskop til at visualisere mikrogeldannelse i PDMS-enheden. - Se efter partikler af ensartet størrelse fra kanalerne (se figur 4D). Saml mikrogelerne fra udløbet i et konisk rør.
Figur 4: Mikrofluidisk opsætning. (A) Afbildning af metoden til tilslutning af PEEK-rør (øverst) og Tygon-slange til en 25 G-nål på en sprøjte (nederst). (B) Mikrofluidisk opsætning med sprøjtepumper, slanger, enhed og mikroskop. (C) Billede af opsætning af mikrofluidisk enhed med to indløb (vandig og olie) og en stikkontakt. (D) Skematisk af den mikrofluidiske enhed og repræsentativt lysfeltbillede af forventet mikrogeldannelse fra kanalerne i en trinemulgeringsanordning. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Rensning og sterilisering af mikrogeler
- Når geleringen er afsluttet (bestemt som tid til opbevaringsmodulplateau i geleringskinetikkarakterisering), skal du bruge en pipette til forsigtigt at fjerne oliefasen fra bunden af røret (se figur 5). Opbevar dette i en passende affaldsbeholder til fluoreret affald.
BEMÆRK: Geleringstiden kan fremskyndes ved at tilsætte en organisk opløselig base til opsamlingsrøret (f.eks. Triethylamin), men det er vigtigt at bemærke, at tilsætningen af en stærk base kan hydrolysere eventuelle ureagerede maleimider. Hvis det ønskes at funktionalisere mikrogeler gennem overskydende maleimider efter gelering, skal du springe over tilsætningen af triethylamin. - Tilsæt mere olie i mikrogelopsamlingsrøret i forholdet 1:1. Bland ved forsigtigt at invertere opsamlingsrøret. Må ikke hvirvle.
- Lad opsamlingsrøret sætte sig i ~ 5 minutter for at lade faserne adskilles. Se efter oliefasen i bunden og den vandige fase (mikrogelerne) øverst (se figur 5).
- Gentag olien vasker mindst 2x mere.
- Tilsæt mere olie i forholdet 1:1 med gelen, og der tilsættes 1x PBS i forholdet 4:1 PBS og gel. Inverter for at blande flere gange. For at adskille lagene centrifugeres røret ved ~ 2.000 x g i ~ 30 s. Se efter oliefasen i bunden af røret, gel i midten og PBS øverst (se figur 5).
- Fjern oliefasen med en pipette og kassér i en affaldsbeholder.
BEMÆRK: Fjern ikke PBS'et. Brug et større konisk rør til at fortsætte vasken, hvis det originale opsamlingsrør var 15 ml. - Gentag olie og PBS vasker 2x mere. Gelen skal skifte fra uigennemsigtig til klar ved den sidste vask, som vist i figur 5, hvilket indikerer, at det overfladeaktive stof er fjernet, og gelen er i PBS-fasen.
- Fjern al olie. Fjern ikke PBS fra det koniske rør.
- I en kemisk røghætte skal du bruge en glaspipette til at tilsætte hexaner til røret med samme volumen som PBS. Vortex det koniske rør i 30 s eller indtil blandet grundigt. Centrifuger ved 4.696 x g i 5 min.
- Efter adskillelse skal du kigge efter hexaner i det øverste lag, PBS i midten og gel i bunden (se figur 5). Fjern hexanlaget og kassér det i en beholder til organisk affald. Aspirere PBS.
- Gentag hexan, og PBS vasker mindst 2 gange mere, eller indtil gelen ser næsten gennemskinnelig ud (se figur 5). Gelen vaskes med PBS 1x mere, så eventuelle resterende hexaner fjernes. Centrifuger ved 4.696 x g i 5 min. Aspirere PBS-laget. Pas på ikke at forstyrre gelpellet.
- For at dække eller slukke eventuelle ureagerede maleimider i mikrogelerne fremstilles en 100 mM opløsning af N-acetyl-L-cystein i 1x PBS og tilsættes denne opløsning til gelen. Anbring på en rørrotator ved 37 °C natten over, efterfulgt af mange vaske med PBS for at fjerne ikke-reageret N-acetyl-L-cystein.
- Ved langtidsopbevaring (op til 1 år) skal mikrogelerne genanvendes i 70 % IPA og opbevares ved 4 °C for at forhindre vækst af bakterier på mikrogelerne.
- For at sterilisere mikrogelerne tilsættes 70% IPA til gelen i et forhold på 4:1 v/v i en biosikkerhedshætte. Vortex røret i 30 s, centrifuger derefter ved 4.696 × g i 5 min. Opsuge IPA-supernatanten fra gelpelletten i en biosikkerhedshætte. Udfør 2x flere IPA-vaske efterfulgt af 3x vaske med steril 1x PBS.
BEMÆRK: Al IPA skal fjernes, før gelen anvendes sammen med celler eller dyr.
Figur 5: Oversigt over mikrogelrensningsproceduren. Forkortelser: PBS = fosfatbufferet saltvand; IPA = isopropylalkohol. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Karakterisering af mikrogelstørrelse
BEMÆRK: Det anbefales at lade mikrogelpartikler balancere i 1x PBS natten over ved 37 °C for at svulme op til deres endelige diameter inden dimensionering.
- Billede gel partikler.
- Spin MAP-gelen ned ved 4.696 × g i 5 minutter, og aspirer supernatanten.
- Ved hjælp af en positiv forskydningspipette fjernes 5 μL mikrogel fra gelpillen og fortyndes i 1 ml PBS i et mikrocentrifugerør (1:200 fortynding). Juster denne fortynding efter behov.
BEMÆRK: Under formuleringen af gelprecursoropløsningen kan 5 μM biotin-maleimid tilsættes og anvendes som et alternativ til mærkning af mikrogeler med en fluorofor. I dette tilfælde kan en streptavidin-fluorophore tilsættes ved en fortynding på 1:300 (fra 1 mg/ml lager). Der tillades inkubation med streptavidin i mindst 15 minutter før billeddannelse. - Ved hjælp af en positiv forskydningspipette overføres 100 μL af de fortyndede mikrogeler til brøndene i en klar 96-brøndplade.
- Brug et widefield eller konfokalt mikroskop til at visualisere mikrogelerne med et 10x mål. Indløs billeder af mikrogelerne til analyse.
- Se figur 6 for repræsentative konfokale billeder af mikrogeler.
- Dimensionering af partikler med ImageJ
- Åbn billedfilerne fra mikroskopet i ImageJ.
- Vælg Analysér | Indstil skala og indstil billedskalaen i henhold til mikroskopets mål.
- Vælg | Skriv | 8-bit.
- Vælg | Juster | Tærskel , og vælg derefter indstillingen "Otsu" automatisk tærskel i rullemenuen.
- Klik på Analyser | Indstil målinger, og vælg Ferets diameter og grænse til tærskel.
- Klik på Analyser | Analyser partikler , og indtast det områdestørrelsesområde (i pixel^2), der forventes for mikrogelerne (for at udelukke små snavs fra at blive analyseret). Skift cirkularitet til 0,75-1,00 , og vælg Vis | Oversigter. Kontroller Vis resultater og ekskluder på kanter.
BEMÆRK: Cirkularitetsfigurfilteret udelukker mikrogeler på billedkanten, der kan give en unøjagtig diametermåling. - Kør modulet Analysér partikler .
- Vent på outputtet, som er Ferets diameter for hver partikel, og eksporter disse resultater til et regneark.
- I denne protokol beregnes polydispersitetsindekset (PDI) for at bestemme heterogeniteten i mikrogelstørrelse. Analyser mindst 100 mikrogeler for at definere en population: et PDI-interval på 1,00-1,05 definerer en monodisperse population, og en PDI større end 1,05 definerer en polydisperse population. Brug ligning (2), ligning (3) og ligning (4) til at beregne PDI som beskrevet nedenfor.
(2)
(3)
(4)
(2)
(3)
(4)
Figur 6: Repræsentative billeder af mikrogeler. (A) Fluorescerende konfokalbillede af mikrogelpopulation A, (B) billede af tærskelmikrogeler og (C) partikelkonturer efter ImageJ-analyse. (D) Fluorescerende konfokalt billede af mikrogelpopulation B og (E) transmitteret lysbillede af mikrogeler (mikrogeler er næsten gennemskinnelige). (F) Afbildning af repræsentative resultater fra ImageJ-analysen, der er skitseret i denne protokol. Begge mikrogelpopulationer har relativt monodisperse PDI'er. Begge populationer af mikrogeler blev syntetiseret med en 3 ml / h vandig strømningshastighed og en 6 ml / h oliestrømningshastighed. Forskellen i mikrogelstørrelse skyldes imidlertid forskelle i mikrofluidisk enhedstrinstørrelse. For eksempel blev mikrogelpopulation A syntetiseret med en mikrofluidisk enhed med en kanaltrinstørrelse på 11 μm, og mikrogelpopulation B blev syntetiseret i en enhed med en trinstørrelse på 40 μm. Skalastænger = 100 μm. Forkortelse: PDI = polydispersitetsindeks. Klik her for at se en større version af denne figur.
7. Microporous annealed particle (MAP) stilladsglødning
- Der fremstilles en stamopløsning af 2 mM lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) i 1x PBS (pH 7,4).
- LAP-stamopløsningen fortyndes til 0,2 mM i et volumen på 1x PBS svarende til gelvolumenet. Hvis du bruger LAP-fotoinitiatoren til celleundersøgelser eller dyreforsøg, skal du sørge for at sterilisere opløsningen før brug.
- Spin MAP-gelen ned ved 4.696 × g i 5 minutter, og aspirer supernatanten.
- Brug en positiv forskydningspipette til at overføre det ønskede volumen gel til et mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 0,2 mM LAP til gelen i et 1: 1 volumetrisk forhold (endelig LAP-koncentration er 0,1 mM).
- Vortex blandingen og inkuber i mindst 15 minutter i mørket.
- Blandingen centrifugeres ved 18.000 × g i 5 minutter for at pelletere gelen.
- Fjern forsigtigt supernatanten fra gelpellet.
- Map-gelen overføres til målplaceringen med en positiv forskydningspipette.
- Påfør fokuseret lys (365 nm, 8,66 mW/cm2) på prøven i 113 s for at udgløde stilladset.
BEMÆRK: Udglødningstiden på 113 s er optimeret som tidligere offentliggjort for LAP-koncentration på 0,1 mM14, men yderligere optimering for forskellige fotoinitiatorkoncentrationer kan være nødvendig.
Figur 7: MAP stilladsglødning. (A) Skematisk over MAP stilladsglødning. Når de udsættes for en fotoinitiator og lys, gennemgår methacrylamidfunktionelle grupper på MethMAL-makromeren en klikfotopolymeriseringsreaktion, som binder mikrogelernes overflader sammen. (B) Afbildning af en 3D-gengivelse (Imaris) af et to-fotonmikroskopbillede af MAP-mikrogeler (grøn) udglødet sammen i en 3D-puckform med dextran (rød) i porerne. (C) Afbildning af en 3D-gengivelse (Imaris) af et to-fotonmikroskopbillede, der viser porøsiteten af et MAP-stillads, der er blevet perfunderet med fluorescerende 70 kDa dextran (rød). Skalastænger = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Forkortelser: MAP = mikroporøs udglødet partikel; MethMAL = brugerdefineret udglødning makromer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Formålet med denne protokol er at skitsere alle de trin, der er nødvendige for syntetisering af mikrogelbyggesten, der skal bruges i et MAP-stillads. MethMAL-udglødningsmakromeren er yderst selektiv og effektiv og er kompatibel med flere polymer-backbones14. Det er vigtigt, at mindst 67%-75% af 20 kDa PEG-maleimid modificeres med funktionelle methacrylamidgrupper for at sikre en høj udglødningseffektivitet. Procentvis modifikation kan lettest bestemmes ved at analysere 1H-NMR spektretoppe, som vist i figur 1. Geleringskinetikken, bestemt af et viskosimeter, er en vigtig metrik at overveje for hver gelformulering. Denne protokol bruger en gelprecursoropløsning bestående af en PEG-rygrad med en MAL-gruppe, som effektivt reagerer med thiolfunktionaliserede tværbindinger til mikrogelgelgelering. Imidlertid kan mange hydrogelkemikalier bruges til at fremstille mikrogeler via den mikrofluidiske metode med høj kapacitet, der er beskrevet heri. Tidspunktet for geleringsstart vil give indsigt i varigheden af mikrofluidisk mikrogelgenerering. Det anbefales at vælge en gelprecursor pH, der kan starte gelering mellem 30 min (figur 2) og 2 timer.
Hvis geleringstiden er for hurtig, begynder gelprecursoropløsningen at polymerisere i den mikrofluidiske enhed og tilstoppe kanalerne. Derudover er det vigtigt at bemærke, at ændring af thiolerede ligandkoncentrationer (f.eks . RGD) kan have indflydelse på netværksdannelse under gelering og muligvis skal redegøres for ved at justere formuleringen. De mikrofluidiske enhedsfremstillingstrin kan være kedelige, men repræsentative resultater af en vellykket bundet enhed er vist i figur 3. Denne protokol bruger en mikrofluidisk enhed med høj kapacitet, paralleliseret, trinemulgering, der blev tilpasset fra et design af de Rutte et al.13, og siliciumskivefabrikationen blev outsourcet til et mikrofluidisk teknologifirma. De trin, der er beskrevet i denne protokol, kan dog bruges med ethvert enhedsdesign ætset på en SU-8 siliciumskivefotomaske. Det er vigtigt at bemærke, at trinstørrelsen på kanalerne på fotomasken skal optimeres under enhedsfremstilling, da det vil påvirke størrelsen af mikrogelpartiklerne.
Strømningshastighederne for mikrofluidgenerering af mikrogeler bør optimeres for hver gelformulering baseret på faktorer som geleringstid, ønsket partikelstørrelse og mikrofluidisk enhedsdesign. Hvis du bruger enheden med høj kapacitet, kan strømningshastighederne for den vandige fase gå så højt som 5 ml / t. Figur 4B viser opsætningen for enheder med høj kapacitet, der bruges i denne protokol. Hvis enheden kører korrekt, skal mikrogeldannelsen ligne den, der er vist i figur 4D. Før rensning vil mikrogelerne være uigennemsigtige. Efter at have afsluttet de forskellige olie-, PBS- og hexanvaske, skal gelen se klar ud som det repræsentative billede i figur 5. Hvis der inkorporeres en fluorofor i mikrogelerne, kan det rensede produkt have en let farvet farvetone, men skal stadig være tæt på gennemskinnelig. Efter oprensning og hævelse skal mikrogelerne være meget ensartede i størrelse og have en PDI mellem 1,00 og 1,05, som vist i figur 6. Forskellige fotoinitiatorer kan bruges til fotoannealing MAP stilladser. Hvis man bruger et alternativ til LAP, beskrevet heri, skal man bestemme udglødningskinetikken som tidligere beskrevet14. Derudover kan forskellige lyskilder bruges til fotoannealing, så længe lyskilden svarer til fotoinitiatoren. Man skal sørge for at kalibrere og fokusere lyskilden. Udglødningstiden og lysintensiteten skal muligvis optimeres baseret på gelformulering og fotoinitiatorkoncentration. Udglødningsmetoden, der er skitseret i denne protokol, kan anvendes til in vitro- og in vivo-undersøgelser. Efter udglødning vil mikrogelerne danne et porøst stillads, der kan visualiseres med to-fotonmikroskopi (figur 7B-C).
Discussion
Denne protokol beskriver metoder til syntetisering og karakterisering af mikrogeler, der fungerer som byggesten til mikroporøs udglødede partikelstilladser (MAP). Denne protokol bruger en mikrofluidisk tilgang med høj kapacitet til at generere store mængder ensartede mikrogeler, hvilket ikke kan opnås med andre metoder såsom flowfokuserende mikrofluidik 1,4,7,9 (høj monodisperisty, lavt udbytte), batchemulsion 6,10 og elektrosprayning 5,12 (lav monodispersitet, højt udbytte). Med de metoder, der er beskrevet heri, kan monodisperse mikrogeler fremstilles til brug i MAP-stilladser, der kan bruges til en række regenerative medicinapplikationer (f.eks. Cellelevering, sårheling).
Et kritisk trin i denne protokol er oprettelsen af PDMS mikrofluidiske enheder. Hvis enhederne ikke fremstilles korrekt, kan dette have negative nedstrøms virkninger på mikrogeldannelse og monodispersitet. Det er vigtigt at forhindre introduktion af artefakter (dvs. bobler, støv) i PDMS, før det hærder, da dette kan tilstoppe kanalerne og påvirke mikrogeldannelsen betydeligt. For at afbøde dette så meget som muligt skal man bruge tape til at fjerne støv, opbevare enhederne i en støvfri beholder og arbejde i en støvfri hætte, hvis det er muligt. Det anbefales også at opbevare enhederne ved 60 °C for at opnå de bedste resultater med overfladebehandling.
Ved hældning af PDMS-enhederne er det vigtigt at opretholde en ensartet tykkelse, der er omtrent lig med eller mindre end længden af biopsistansen. Hvis enheden er for tyk, vil biopsistansen ikke være i stand til at trænge igennem hele vejen igennem. Det er også afgørende ikke at rive PDMS-enhedens indløb / udløb, mens du stanser med biopsistansen og / eller indsætter slanger. En tåre i PDMS-enheden vil forårsage lækage fra indløbene / udløbet, hvilket kan forårsage tab af gelprecursoropløsningen. Hvis der lækker i en PDMS-enhed, er den bedste løsning at udskifte den med en ny enhed så hurtigt som muligt.
Ved plasmabehandling af enheden har brugen af ren ilt og plasmabehandling i 30 s givet de bedste resultater for at klæbe PDMS til glasglasset. Hvis enheden ikke binder korrekt (dvs. PDMS kan stadig løftes fra glasglasset efter plasmabehandling), skal man dobbelttjekke, at plasmabehandleren fungerer korrekt, og at enheden og diasene er blevet rengjort grundigt. Det er også vigtigt at bruge den korrekte silanoverfladebehandling, og for de bedste resultater skal PDMS-enhederne overfladebehandles direkte før brug. Andre metoder til overfladebehandling, såsom kemisk dampaflejring, kan også anvendes.
Et andet afgørende trin er at bruge PDMS mikrofluidiske enheder korrekt til mikrogeldannelse. Det anbefales at anvende et strømningshastighedsforhold på mindst 2: 1 (denne protokol bruger en 6 ml / h oliestrømningshastighed og en 3 ml / h vandig strømningshastighed), men dette kan indstilles for at opnå den ønskede mikrogelstørrelse. pH-værdien af mikrogelprecursoropløsningen er også en vigtig måling, der skal optimeres for at forhindre tilstopning af enheden. Fosfatbufferet saltvand (PBS) accelererer thiolatdannelse i Michael-type additionskemi, og PBS-koncentrationerne, der anvendes i denne protokol, giver de bedste resultater for mikrogelgelgelering i de mikrofluidiske enheder. Når sprøjtepumperne er startet, kan der være nogle bobler i de mikrofluidiske kanaler, men dette skal afbalanceres efter et par minutter. Det anbefales at overvåge mikrogeldannelse med et mikroskop. Hvis flowet ikke ser ud som i denne video, og/eller der er nogle få kanaler, der producerer store partikler, skyldes det sandsynligvis problemer med overfladebehandlingstrinnet. Den bedste løsning er at udskifte enheden med en, der er nybehandlet.
Hvis mikrogelerne ser ud til at smelte sammen, kan dette skyldes en utilstrækkelig koncentration af FluoroSurfactant. Den anbefalede løsning er at øge vægtprocenten af det overfladeaktive stof i oliefasen. En begrænsning ved at bruge høje koncentrationer af overfladeaktive stoffer er imidlertid, at det kan være vanskeligere at fjerne under rensningstrinnet. Det anbefales kun at bruge mikrofluidiske enheder én gang, men enhederne kan genbruges, hvis de skylles med Novec-olie umiddelbart efter brug for at fjerne enhver vandig opløsning, der kan gelere i enheden og tilstoppe kanalerne. Mens en mikrofluidisk enhed kan producere et volumen af mikrogeler med høj kapacitet (ml / h), kan denne produktionshastighed skaleres ved hjælp af flere mikrofluidiske enheder parallelt.
Udglødningstrinnet i MAP-stilladssamlingen er afhængig af brugen af en lysaktiveret fotoinitiator til radikal polymerisation, og fotoinitiatoren kan vælges ud fra den ønskede applikation. For eksempel har LAP-fotoinitiator hurtige udglødningstider (<30 s), når der anvendes langbølget UV-lys, hvilket har minimal indvirkning på cellelevedygtighed in vitro14. Denne bølgelængde absorberes imidlertid stærkt af væv16 og har muligvis ikke så høj en udglødningseffektivitet in vivo som in vitro.
Eosin Y er en anden fotoinitiator aktiveret af synlige bølgelængder (505 nm) og har dybere indtrængning i væv, hvilket forbedrer MAP-stilladsets evne til at blive udglødet under væv. Imidlertid kan de lange lyseksponeringstider, der er nødvendige for Eosin Y-udglødning, forlænge celleeksponeringen for frie radikaler og påvirke cellelevedygtighed in vitro14. Brug af disse metoder til højkapacitetsgenerering af meget ensartede mikrogelbyggesten vil fremskynde MAP-stilladsfokuseret forskning og fremme viden inden for injicerbare porøse materialer til regenerativ medicin.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Joe de Rutte og Di Carlo Lab ved University of California, Los Angeles, for deres hjælp med det originale mikrofluidiske enhedsdesign, som den rapporterede enhed blev udviklet fra, samt deres tidlige vejledning i PDMS-enhedsfremstilling og fejlfinding. Figurskemaer blev oprettet med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
| 35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
| 4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
| 4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
| Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
| Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
| Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
| DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
| Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
| FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
| HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
| ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
| KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
| LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
| Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
| Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
| MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
| Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
| Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
| Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
| Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
| PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
| Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
| Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
| Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
| Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
| Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
| Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
| Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1801046 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Pruett, L., et al. Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation. Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advanced Materials. 29 (32), (2017).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Schaeffer, C., et al. Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration. Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Jivan, F., Alge, D. L. Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering. Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148 (2020).
- de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 101, 199-206 (2016).
- Sandell, J. L., Zhu, T. C. A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT. Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).
