Denne protokol beskriver et sæt metoder til syntetisering af mikrogelbyggestenene til mikroporøs udglødet partikelstillads, som kan bruges til en række regenerative medicinapplikationer.
Den mikroporøs udglødede partikel (MAP) stilladsplatform er en underklasse af granulære hydrogeler. Den består af en injicerbar opslæmning af mikrogeler, der kan danne et strukturelt stabilt stillads med celleskala porøsitet in situ efter et sekundært lysbaseret kemisk tværbindingstrin (dvs. udglødning). MAP stillads har vist succes i en række regenerative medicin applikationer, herunder dermal sårheling, vokal foldforstørrelse og stamcelle levering. Dette papir beskriver metoderne til syntese og karakterisering af poly (ethylenglycol) (PEG) mikrogeler som byggestenene til dannelse af et MAP-stillads. Disse metoder omfatter syntese af en brugerdefineret udglødningsmakromer (MethMAL), bestemmelse af mikrogelprecursorgeleringskinetik, mikrofluidisk enhedsfabrikation, mikrofluidisk generering af mikrogeler, mikrogelrensning og grundlæggende stilladskarakterisering, herunder mikrogelstørrelse og stilladsglødning. Specifikt kan de mikrofluidiske metoder med høj kapacitet, der er beskrevet heri, producere store mængder mikrogeler, der kan bruges til at generere MAP-stilladser til enhver ønsket anvendelse, især inden for regenerativ medicin.
MAP-stilladsplatformen er et injicerbart biomateriale, der udelukkende består af hydrogelmikropartikler (mikrogeler), der giver celleskala mikroporøsitet, når de er tværbundet sammen, hvilket muliggør nedbrydningsuafhængig cellemigration og bulkvævsintegration1. På grund af sin evne til hurtigt at integrere med værtsvæv og iboende lav immunogenicitet har MAP-stilladsplatformen vist præklinisk anvendelighed til en lang række regenerative medicinbehandlinger 2,3,4,5,6,7,8,9,10, herunder accelererende dermal sårheling 1,3 ,11, revaskularisering af hjerneslag hulrum7, levering af mesenkymale stamceller2 og tilvejebringelse af vævsmasse til behandling af glottisk insufficiens6. MAP har også vist sig at formidle antiinflammatoriske virkninger til værtsvæv gennem rekruttering af M2-makrofager3 og kan endda indstilles til at fremme et Th2 “vævsreparation” immunrespons8. Disse gunstige egenskaber ved MAP-stilladsplatformen gør det muligt at udvide den til en bred vifte af kliniske applikationer.
Tidligere offentliggjorte metoder til generering af mikrogeler til MAP-stilladsdannelse har inkluderet flowfokuserende dråbemikrofluidik 1,4,7,9,elektrospraying 5,12 og overhead spinding med batchemulsion 6,10. Dråbemikrofluidmetoden kan producere partikler med høj monodispersitet, men bruger meget langsomme strømningshastigheder, der producerer lave udbytter af partikler (μL / h). Alternativt kan elektrospray- og batchemulsionsmetoderne producere et stort volumen partikler, men med høj partikelpolydispersitet. Denne protokol bruger en mikrofluidisk metode med høj kapacitet til at producere mikrogeler med en monodisperse population, baseret på arbejde af de Rutte et al13. Denne metode anvender bløde litografiteknikker til at fremstille en polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk enhed fra en fotomaske, som derefter bindes til et glasglas. Enhedens design er afhængig af trinemulgering for at generere et stort volumen mikrogelpartikler (ml / h). Den monodispersitet, der kan opnås med denne metode, giver overlegen kontrol af porøsitet sammenlignet med andre teknikker, da monodisperse mikrogeler kan danne stilladser med mere ensartede porestørrelser2.
Metoderne til syntetisering og karakterisering af de enkelte mikrogeler, der kan fungere som byggesten til MAP-stilladser, er skitseret i dette manuskript, specifikt med hensyn til at skabe mikrogeler, der består af en PEG-rygrad med en maleimid (MAL) gruppe, som let deltager i effektiv Michael-type tilsætning med thiol-funktionaliserede tværbindinger til mikrogelgelering. For at afkoble mikrogelgelgelering fra MAP-stilladsglødning beskriver dette manuskript også, hvordan man syntetiserer en offentliggjort14 brugerdefineret udglødningsmakromer, MethMAL, som er en heterofunktionel methacrylamid / maleimid 4-arm PEG-makromer. Methacrylamidfunktionelle grupper deltager let i fotopolymerisering af frie radikaler (til mikrogelglødning), mens de forbliver relativt inerte over for de betingelser, der fremmer Michael-type tilsætning for MAL funktionelle grupper.
Derudover skitserer dette manuskript protokollerne til oprettelse af PDMS-mikrofluidiske enheder, bestemmelse af mikrogelgelgeleringskinetik og karakterisering af mikrogelstørrelse. Den sidste del af manuskriptet beskriver MAP-stilladsglødning, hvilket er, når mikrogelerne overføres in situ til et bulkstillads gennem et sekundært, fotoinitieret tværbindingstrin, der kovalent binder mikrogelernes overflader sammen. Det er vigtigt at bemærke, at der er andre udglødningsmetoder, der kan implementeres i MAP-stilladssystemer, der ikke er afhængige af lysbaserede kemikalier, såsom enzymmedieret udglødning, som tidligere beskrevet1. Samlet set kan disse metoder anvendes direkte eller anvendes med forskellige hydrogelformuleringskemikalier (f.eks. Hyaluronsyrebaserede) til at generere MAP-stilladser til enhver anvendelse.
Denne protokol beskriver metoder til syntetisering og karakterisering af mikrogeler, der fungerer som byggesten til mikroporøs udglødede partikelstilladser (MAP). Denne protokol bruger en mikrofluidisk tilgang med høj kapacitet til at generere store mængder ensartede mikrogeler, hvilket ikke kan opnås med andre metoder såsom flowfokuserende mikrofluidik 1,4,7,9 (høj monodisperisty, lavt udbytte), batchemulsion 6,10 og elektrosprayning 5,12 (lav monodispersitet, højt udbytte). Med de metoder, der er beskrevet heri, kan monodisperse mikrogeler fremstilles til brug i MAP-stilladser, der kan bruges til en række regenerative medicinapplikationer (f.eks. Cellelevering, sårheling).
Et kritisk trin i denne protokol er oprettelsen af PDMS mikrofluidiske enheder. Hvis enhederne ikke fremstilles korrekt, kan dette have negative nedstrøms virkninger på mikrogeldannelse og monodispersitet. Det er vigtigt at forhindre introduktion af artefakter (dvs. bobler, støv) i PDMS, før det hærder, da dette kan tilstoppe kanalerne og påvirke mikrogeldannelsen betydeligt. For at afbøde dette så meget som muligt skal man bruge tape til at fjerne støv, opbevare enhederne i en støvfri beholder og arbejde i en støvfri hætte, hvis det er muligt. Det anbefales også at opbevare enhederne ved 60 °C for at opnå de bedste resultater med overfladebehandling.
Ved hældning af PDMS-enhederne er det vigtigt at opretholde en ensartet tykkelse, der er omtrent lig med eller mindre end længden af biopsistansen. Hvis enheden er for tyk, vil biopsistansen ikke være i stand til at trænge igennem hele vejen igennem. Det er også afgørende ikke at rive PDMS-enhedens indløb / udløb, mens du stanser med biopsistansen og / eller indsætter slanger. En tåre i PDMS-enheden vil forårsage lækage fra indløbene / udløbet, hvilket kan forårsage tab af gelprecursoropløsningen. Hvis der lækker i en PDMS-enhed, er den bedste løsning at udskifte den med en ny enhed så hurtigt som muligt.
Ved plasmabehandling af enheden har brugen af ren ilt og plasmabehandling i 30 s givet de bedste resultater for at klæbe PDMS til glasglasset. Hvis enheden ikke binder korrekt (dvs. PDMS kan stadig løftes fra glasglasset efter plasmabehandling), skal man dobbelttjekke, at plasmabehandleren fungerer korrekt, og at enheden og diasene er blevet rengjort grundigt. Det er også vigtigt at bruge den korrekte silanoverfladebehandling, og for de bedste resultater skal PDMS-enhederne overfladebehandles direkte før brug. Andre metoder til overfladebehandling, såsom kemisk dampaflejring, kan også anvendes.
Et andet afgørende trin er at bruge PDMS mikrofluidiske enheder korrekt til mikrogeldannelse. Det anbefales at anvende et strømningshastighedsforhold på mindst 2: 1 (denne protokol bruger en 6 ml / h oliestrømningshastighed og en 3 ml / h vandig strømningshastighed), men dette kan indstilles for at opnå den ønskede mikrogelstørrelse. pH-værdien af mikrogelprecursoropløsningen er også en vigtig måling, der skal optimeres for at forhindre tilstopning af enheden. Fosfatbufferet saltvand (PBS) accelererer thiolatdannelse i Michael-type additionskemi, og PBS-koncentrationerne, der anvendes i denne protokol, giver de bedste resultater for mikrogelgelgelering i de mikrofluidiske enheder. Når sprøjtepumperne er startet, kan der være nogle bobler i de mikrofluidiske kanaler, men dette skal afbalanceres efter et par minutter. Det anbefales at overvåge mikrogeldannelse med et mikroskop. Hvis flowet ikke ser ud som i denne video, og/eller der er nogle få kanaler, der producerer store partikler, skyldes det sandsynligvis problemer med overfladebehandlingstrinnet. Den bedste løsning er at udskifte enheden med en, der er nybehandlet.
Hvis mikrogelerne ser ud til at smelte sammen, kan dette skyldes en utilstrækkelig koncentration af FluoroSurfactant. Den anbefalede løsning er at øge vægtprocenten af det overfladeaktive stof i oliefasen. En begrænsning ved at bruge høje koncentrationer af overfladeaktive stoffer er imidlertid, at det kan være vanskeligere at fjerne under rensningstrinnet. Det anbefales kun at bruge mikrofluidiske enheder én gang, men enhederne kan genbruges, hvis de skylles med Novec-olie umiddelbart efter brug for at fjerne enhver vandig opløsning, der kan gelere i enheden og tilstoppe kanalerne. Mens en mikrofluidisk enhed kan producere et volumen af mikrogeler med høj kapacitet (ml / h), kan denne produktionshastighed skaleres ved hjælp af flere mikrofluidiske enheder parallelt.
Udglødningstrinnet i MAP-stilladssamlingen er afhængig af brugen af en lysaktiveret fotoinitiator til radikal polymerisation, og fotoinitiatoren kan vælges ud fra den ønskede applikation. For eksempel har LAP-fotoinitiator hurtige udglødningstider (<30 s), når der anvendes langbølget UV-lys, hvilket har minimal indvirkning på cellelevedygtighed in vitro14. Denne bølgelængde absorberes imidlertid stærkt af væv16 og har muligvis ikke så høj en udglødningseffektivitet in vivo som in vitro.
Eosin Y er en anden fotoinitiator aktiveret af synlige bølgelængder (505 nm) og har dybere indtrængning i væv, hvilket forbedrer MAP-stilladsets evne til at blive udglødet under væv. Imidlertid kan de lange lyseksponeringstider, der er nødvendige for Eosin Y-udglødning, forlænge celleeksponeringen for frie radikaler og påvirke cellelevedygtighed in vitro14. Brug af disse metoder til højkapacitetsgenerering af meget ensartede mikrogelbyggesten vil fremskynde MAP-stilladsfokuseret forskning og fremme viden inden for injicerbare porøse materialer til regenerativ medicin.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Joe de Rutte og Di Carlo Lab ved University of California, Los Angeles, for deres hjælp med det originale mikrofluidiske enhedsdesign, som den rapporterede enhed blev udviklet fra, samt deres tidlige vejledning i PDMS-enhedsfremstilling og fejlfinding. Figurskemaer blev oprettet med Biorender.com.
2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |