Denne protokollen beskriver et sett med metoder for å syntetisere mikrogelbyggesteinene for mikroporøst glødet partikkelstillas, som kan brukes til en rekke regenerative medisinapplikasjoner.
Den mikroporøse glødede partikkelplattformen (MAP) er en underklasse av granulære hydrogeler. Den består av en injiserbar oppslemming av mikrogeler som kan danne et strukturelt stabilt stillas med celleskala porøsitet in situ etter et sekundært lysbasert kjemisk tverrbindingstrinn (dvs. glødning). MAP stillas har vist suksess i en rekke regenerative medisinske applikasjoner, inkludert dermal sårheling, vokalfoldforstørrelse og stamcellelevering. Denne artikkelen beskriver metodene for syntese og karakterisering av poly(etylenglykol) (PEG) mikrogeler som byggesteiner for å danne et MAP-stillas. Disse metodene inkluderer syntese av en tilpasset glødemakromer (MethMAL), bestemmelse av mikrogelforløpergeleringskinetikk, mikrofluidisk enhetsfabrikasjon, mikrofluidisk generering av mikrogeler, mikrogelrensing og grunnleggende stillaskarakterisering, inkludert mikrogeldimensjonering og stillasglødning. Spesielt kan de mikrofluidiske metodene med høy gjennomstrømning som er beskrevet her, produsere store mengder mikrogeler som kan brukes til å generere MAP-stillaser for enhver ønsket applikasjon, spesielt innen regenerativ medisin.
MAP-stillasplattformen er et injiserbart biomateriale som består utelukkende av hydrogelmikropartikler (mikrogeler) som gir mikroporositet i celleskala når de er tverrbundet sammen, noe som muliggjør nedbrytningsuavhengig cellemigrasjon og bulkvevintegrasjon1. På grunn av sin evne til raskt å integrere med vertsvev og iboende lav immunogenitet, har MAP stillasplattformen vist preklinisk anvendelighet for et bredt spekter av regenerative medisinbehandlinger 2,3,4,5,6,7,8,9,10, inkludert akselererende dermal sårheling 1,3 ,11, revaskularisering av hjerneslagshulrom7, levering av mesenkymale stamceller2, og tilførsel av vevsbulking for å behandle glottisk insuffisiens6. MAP har også vist seg å formidle antiinflammatoriske effekter til vertsvev gjennom rekruttering av M2 makrofager3 og kan til og med justeres for å fremme en Th2 “vevsreparasjon” immunrespons8. Disse gunstige egenskapene til MAP-stillasplattformen gjør at den kan utvides til et mangfoldig utvalg av kliniske applikasjoner.
Tidligere publiserte metoder for generering av mikrogeler for MAP-stillasdannelse har inkludert strømningsfokuserende dråpemikrofluidikk 1,4,7,9, elektrosprøyting 5,12 og overheadspinning med batchemulsjon 6,10. Den dråpemikrofluidiske metoden kan produsere partikler med høy monodispersitet, men bruker svært langsomme strømningshastigheter som gir lave utbytter av partikler (μL / h). Alternativt kan elektrosprayings- og batchemulsjonsmetodene produsere et høyt volum partikler, men med høy partikkelpolydispersitet. Denne protokollen bruker en mikrofluidisk metode med høy gjennomstrømning for å produsere mikrogeler med en monodisperse populasjon, basert på arbeid av de Rutte et al13. Denne metoden benytter myke litografiteknikker for å lage en polydimetylsiloksan (PDMS) mikrofluidisk enhet fra en fotomaske, som deretter bindes til et glassglass. Enhetsdesignet er avhengig av trinnemulgering for å generere et høyt volum mikrogelpartikler (ml / t). Monodispersiteten som kan oppnås med denne metoden gir overlegen kontroll av porøsitet sammenlignet med andre teknikker, siden monodisperse mikrogeler kan danne stillaser med mer ensartede porestørrelser2.
Metodene for å syntetisere og karakterisere de enkelte mikrogelene som kan fungere som byggesteiner for MAP-stillaser er skissert i dette manuskriptet, spesielt når det gjelder å lage mikrogeler som består av en PEG-ryggrad med en maleimid (MAL) gruppe, som lett deltar i effektiv Michael-type tillegg med tiolfunksjonaliserte tverrbindinger for mikrogelgelgelering. For å koble mikrogelgelering fra MAP stillasglødning, beskriver dette manuskriptet også hvordan man syntetiserer en publisert14 tilpasset glødemakromer, MethMAL, som er et heterofunksjonelt metakrylamid / maleimid 4-arm PEG-makromer. De metakrylamidfunksjonelle gruppene deltar lett i fotopolymerisering av frie radikaler (for mikrogelglødning), mens de forblir relativt inerte mot forholdene som fremmer Michael-type tillegg for MAL-funksjonelle grupper.
I tillegg skisserer dette manuskriptet protokollene for å lage PDMS mikrofluidiske enheter, bestemme mikrogelgelgeleringskinetikk og karakterisere mikrogelstørrelse. Den siste delen av manuskriptet beskriver MAP stillasglødning, som er når mikrogelene overføres in situ til et bulkstillas gjennom et sekundært, fotoinitiert tverrbindingstrinn som kovalent binder overflatene til mikrogelene sammen. Det er viktig å merke seg at det finnes andre glødemetoder som kan implementeres i MAP stillassystemer som ikke er avhengige av lysbaserte kjemikalier, for eksempel enzymmediert glødning, som tidligere beskrevet1. Samlet sett kan disse metodene brukes direkte eller brukes med forskjellige hydrogelformuleringskjemier (f.eks. Hyaluronsyrebasert) for å generere MAP-stillaser for enhver applikasjon.
Denne protokollen beskriver metoder for å syntetisere og karakterisere mikrogeler, som fungerer som byggesteiner for mikroporøse glødede partikler (MAP) stillaser. Denne protokollen bruker en mikrofluidisk tilnærming med høy gjennomstrømning for å generere store mengder ensartede mikrogeler, som ikke kan oppnås med andre metoder som strømningsfokuserende mikrofluidikk 1,4,7,9 (høy monodisperisty, lavt utbytte), batchemulsjon6,10 og elektrosprøyting 5,12 (lav monodispersitet, høyt utbytte). Med metodene som er beskrevet her, kan monodisperse mikrogeler lages for bruk i MAP-stillaser som kan brukes til en rekke regenerative medisinapplikasjoner (f.eks. Cellelevering, sårheling).
Et kritisk trinn i denne protokollen er opprettelsen av PDMS mikrofluidiske enheter. Hvis enhetene ikke er laget riktig, kan dette ha negative nedstrømseffekter på mikrogeldannelse og monodispersitet. Det er viktig å forhindre innføring av artefakter (dvs. bobler, støv) i PDMS før det herdes, da dette kan tette kanalene og påvirke mikrogeldannelsen betydelig. For å redusere dette så mye som mulig, bør man bruke tape for å fjerne støv, lagre enhetene i en støvfri beholder og jobbe i en støvfri hette, om mulig. Det anbefales også å oppbevare apparatene ved 60 °C for best resultat med overflatebehandlingen.
Når du heller PDMS-enhetene, er det viktig å opprettholde en jevn tykkelse som er omtrent lik eller mindre enn lengden på biopsistansen. Hvis enheten er for tykk, vil biopsistansen ikke kunne trenge helt gjennom. Det er også viktig å ikke rive PDMS-enhetens innløp / utløp mens du slår med biopsistansen og / eller setter inn slangen. En rift i PDMS-apparatet vil føre til lekkasje fra innløpene/utløpet, noe som kan føre til tap av gelforløperløsningen. Hvis det lekker i en PDMS-enhet, er den beste løsningen å erstatte den med en ny enhet så raskt som mulig.
Ved plasmabehandling av enheten har bruk av rent oksygen og plasmabehandling i 30 s gitt de beste resultatene for å feste PDMS til glassglasset. Hvis enheten ikke binder seg riktig (dvs. PDMS kan fortsatt løftes fra glassglasset etter plasmabehandling), bør man dobbeltsjekke at plasmabehandleren fungerer som den skal, og at enheten og lysbildene er rengjort grundig. Det er også viktig å bruke riktig silanoverflatebehandling, og for best resultat bør PDMS-enhetene overflatebehandles direkte før bruk. Andre metoder for overflatebehandling, for eksempel kjemisk dampavsetning, kan også brukes.
Et annet viktig skritt er å bruke PDMS mikrofluidiske enheter riktig for mikrogeldannelse. Det anbefales å bruke et strømningshastighetsforhold på minst 2: 1 (denne protokollen bruker en 6 ml / t oljestrømningshastighet og en 3 ml / h vandig strømningshastighet), men dette kan justeres for å oppnå ønsket mikrogelstørrelse. PH i mikrogelforløperløsningen er også en viktig beregning for å optimalisere for å forhindre tilstopping av enheten. Fosfatbufret saltvann (PBS) akseler tiolatdannelsen i Michael-type addisjonskjemi, og PBS-konsentrasjonene som brukes i denne protokollen gir de beste resultatene for mikrogelgelering i mikrofluidiske enheter. Når sprøytepumpene er startet, kan det være noen bobler i mikrofluidiske kanaler, men dette bør likevektes etter noen minutter. Det anbefales å overvåke mikrogeldannelse med et mikroskop. Hvis strømmen ikke ser lik ut som i denne videoen og/eller det er noen få kanaler som produserer store partikler, skyldes dette sannsynligvis problemer med overflatebehandlingstrinnet. Den beste løsningen er å erstatte enheten med en som er nylig overflatebehandlet.
Hvis mikrogelene ser ut til å samle seg, kan dette skyldes utilstrekkelig konsentrasjon av fluorosurfaktant. Den anbefalte løsningen er å øke vektprosenten av overflateaktivt middel i oljefasen. En begrensning ved bruk av høye konsentrasjoner av overflateaktivt middel er imidlertid at det kan være vanskeligere å fjerne under rensetrinnet. Det anbefales å bruke mikrofluidiske enheter bare en gang, men enhetene kan gjenbrukes hvis de skylles med Novec-olje umiddelbart etter bruk for å fjerne vandig løsning som kan gele i enheten og tette kanalene. Mens en mikrofluidisk enhet kan produsere et høyt gjennomstrømningsvolum av mikrogeler (ml / t), kan denne produksjonshastigheten skaleres ved å bruke flere mikrofluidiske enheter parallelt.
Annealingstrinnet til MAP stillasmontering er avhengig av bruk av en lysaktivert fotoinitiator av radikal polymerisasjon, og fotoinitiatoren kan velges basert på ønsket applikasjon. For eksempel har LAP fotoinitiator raske glødetider (<30 s) ved bruk av langbølget UV-lys, noe som har minimal innvirkning på cellens levedyktighet in vitro14. Imidlertid absorberes denne bølgelengden sterkt av vev16 og har kanskje ikke så høy glødeeffekt in vivo som in vitro.
Eosin Y er en annen fotoinitiator aktivert av synlige bølgelengder (505 nm) og har dypere penetrasjon i vev, noe som forbedrer MAP-stillasets evne til å bli glødet under vev. Imidlertid kan de lange lyseksponeringstidene som trengs for Eosin Y-glødning, forlenge celleeksponeringen for frie radikaler og påvirke cellens levedyktighet in vitro14. Bruk av disse metodene for høy gjennomstrømningsgenerering av svært ensartede mikrogelbyggeklosser vil akselerere MAP stillasfokusert forskning og fremme kunnskap innen injiserbare porøse materialer for regenerativ medisin.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Joe de Rutte og Di Carlo Lab ved University of California, Los Angeles, for deres hjelp med den opprinnelige mikrofluidiske enhetsdesignen som den rapporterte enheten ble utviklet fra, samt deres tidlige veiledning i PDMS-enhetsfabrikasjon og feilsøking. Figurskjemaer ble opprettet med Biorender.com.
2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |