Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Mikroinjektion von CRISPR-Cas9 und Spender-DNA durch Zygoten, um effizient Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Mäuse zu produzieren.
Abstract
Die CRISPR-Cas-Technologie hat die schnelle und mühelose Erzeugung genetisch veränderter Mäuse ermöglicht. Insbesondere Mäuse und punktmutierte Mäuse werden leicht durch Elektroporation von CRISPR-Faktoren (und einzelsträngigen Oligo-DNA-Donoren) in die Zygote hergestellt. Im Gegensatz dazu werden Genkassetten (>1 kb) knock-in- und floxed Mäuse hauptsächlich durch Mikroinjektion von CRISPR-Faktoren und doppelsträngigen DNA-Donoren in Zygoten erzeugt. Genom-Editing-Technologien haben auch die Flexibilität der Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen erhöht. Es ist nun möglich, die beabsichtigten Mutationen in die Zielgenomregionen einer Reihe von nützlichen Inzucht-Mausstämmen einzuschleusen. Unser Team hat über 200 Genkassetten-Knock-in-Mauslinien und über 110 gefloxte Mauslinien durch Zygoten-Mikroinjektion von CRISPR-Cas9 auf Anfrage aus mehreren Ländern, darunter Japan, hergestellt. Einige dieser Genom-Editierungen verwendeten BALB/c-, C3H/HeJ- und C57BL/6N-Inzuchtstämme, die meisten verwendeten jedoch C57BL/6J. Im Gegensatz zur Elektroporationsmethode ist die Genom-Editierung durch Mikroinjektion von Zygoten in verschiedenen Inzuchtstämmen von Mäusen nicht so einfach. Genkassetten-Knock-in- und Flox-Mäuse auf genetischem Hintergrund mit einfacher Inzucht sind jedoch ebenso wichtig wie genetisch humanisierte, fluoreszierende Reporter- und bedingte Knockout-Mausmodelle. Daher wird in diesem Artikel das Protokoll für die Zygoten-Mikroinjektion von CRISPR-Faktoren und doppelsträngigen DNA-Donoren in C57BL/6J-Mäusen zur Erzeugung von Genkassetten-Knock-in- und Flox-Mäusen vorgestellt. Dieser Artikel konzentriert sich ausschließlich auf die Kerninjektion und nicht auf die zytoplasmatische Injektion. Neben der Mikroinjektion von Zygoten skizzieren wir den Zeitplan für den Produktionsprozess und periphere Techniken wie die Induktion der Superovulation und den Embryotransfer.
Introduction
Knock-in-Mäuse, bei denen die beabsichtigten exogenen Gene an den Zielorten eingeführt werden, werden in vielen In-vivo-Studien häufig als genhumanisierte Mäuse, fluoreszierende Reportermäuse und Cre-Treibermäuse verwendet 1,2. Wenn Knock-in-Mutationen durch Genom-Editierung in Mauszygoten induziert werden, wird einzelsträngige DNA (einzelsträngige Oligo-DNA-Donoren, ssODN) oder doppelsträngige DNA (dsDNA) als Spender-DNA verwendet 2,3. ssODN wird hauptsächlich verwendet, um relativ kurze Genfragmente von weniger als 200 bp4 einzuschlagen. Es ist möglich, Fragmente, die länger als 1 kb DNA sind, mit langen ssODNs (lsODN)5,6 einzuknocken, ihre Herstellung ist jedoch zeitaufwändig. Bei Verwendung von dsDNA-Spendern können Genkassetten (>1 kb) Knock-in-Mäuse ohne aufwändige Spender-DNA-Präparation erzeugt werden7.
Der Hauptvorteil der Verwendung von ssODNs besteht darin, dass Elektroporation8 Knock-in-Mäuse erzeugen kann. dsDNA-Donoren müssen jedoch durch Zygotenmikroinjektion direkt in den Zellkern eingeführt werden. Gleichzeitiges Knock-In an zwei Stellen ist erforderlich, um floxierte Mäuse zu erzeugen, bei denen jede loxP-Sequenz stromaufwärts und stromabwärts des Zielgens eingeschleust wird. Es gibt zwei Möglichkeiten, gefloxte Mäuse durch Genom-Editierung in Mauszygoten zu erzeugen - mit zwei unabhängigen ssODNs, die jeweils eine einzelne loxP-Stelle tragen, oder mit einer einzelnen dsDNA (oder lsDNA) mit einer gefloxten Sequenz; Ersteres ist sehr ineffizient 9,10,11. Die Genom-Editierung mit dsDNA-Spendern ist der einfachste Ansatz, um Mäuse mit Genkassetten, Knock-in und Floxed zu erzeugen, wenn die Umgebung für die Mikroinjektion von Zygoten förderlich ist.
Zunächst werden Mischungen aus Cas9-mRNA und sgRNA oder DNA-Vektoren, die für sgRNA und Cas9 kodieren, für die Genom-Editierung in Mauszygoten verwendet12,13. Da hochwertige und stabile Cas9-Proteine nun kostengünstig verfügbar sind, ist die Einführung von crRNA-tracrRNA-Cas9-Ribonukleoprotein (RNP) in Mauszygoten14 populär geworden. In jüngster Zeit wurden Knock-in-Mäuse mit hoher Effizienz erzeugt, indem die crRNA-tracrRNA-Cas9-RNP und die Spender-DNA in beide Vorkerne von Mauszygoten in einer Zellzyklusphase eingeführt wurden, in der ein Knock-in am wahrscheinlichsten ist15. Daher beschreibt das vorliegende Protokoll Techniken zur Herstellung verschiedener Arten von Knock-in-Mäusen durch diese Methode.
Es gibt viele nützliche Inzuchtstämme von Labormäusen16. Genetische Modifikationen innerhalb des Inzuchthintergrunds können den Einfluss des genetischen Hintergrunds auf den Phänotyp außer Acht lassen. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Induktion von Genkassetten-Knock-in- und Floxed-Mutationen in der Zygote der am häufigsten verwendeten Inzucht-Mauslinie, der C57BL/6J17. Darüber hinaus werden auch der Zeitplan für die Erzeugung genetisch veränderter Mäuse und die verwendeten peripheren Techniken diskutiert, einschließlich der Induktion der Superovulation und des Embryotransfers.
Protocol
Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des Institutionellen Komitees für Tierversuche der Universität Tsukuba gemäß den Vorschriften für Tierversuche der Universität Tsukuba und den grundlegenden Richtlinien für die ordnungsgemäße Durchführung von Tierversuchen und damit verbundenen Aktivitäten in akademischen Forschungseinrichtungen unter der Zuständigkeit des Bildungsministeriums humangerecht durchgeführt. Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie Japans. Als Zygotenspender wurden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 10-25 Wochen verwendet. Als Empfängermäuse wurden ICR-Mäuse (älter als 10 Wochen) verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Bestätigung der crRNA-Spaltaktivität in einem zellfreien System
- Lösen Sie 2 nmol crRNA (trocken) und 20 nmol tracrRNA (trocken) in 25 μl bzw. 250 μl RNase-freiem Wasser auf (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: CRISPR-Zielsequenzen, für die eine hohe Spaltaktivität und so wenig Off-Targets wie möglich vorhergesagt wurden, werden mit CRISPOR ausgewählt (siehe Materialtabelle). Im Falle eines Knock-ins der Genkassette wird die Sequenz über die Insertionsstelle abgezielt. Die zu floxenden Exons wurden mit dem KOnezumi ausgewählt (siehe Materialtabelle). - Amplifizieren Sie das DNA-Fragment (ca. 0,5-1 kb), das die Zielstelle enthält, durch genomische PCR9. Reinigen Sie dieses PCR-Amplikon mit dem gängigen PCR-Produktextraktionskit (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie 10 μl CRISPR-Gemisch vor (100 ng/μl crRNA, 150 ng/μl tracrRNA und 1 ng/μl Cas9 im Cas9-Nuklease-Reaktionspuffer, siehe Materialtabelle). Um den CRISPR-Cas9-Komplex zu konstruieren, legen Sie die CRISPR-Mischung für 30 Minuten in einen Hitzeblock bei 37 °C.
- Das Gesamtvolumen (10 μl) der CRISPR-Mischung wird zu dem in Schritt 1.2 beschriebenen PCR-Produkt (10 μl, 20 ng/μl) gegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert. Fügen Sie 1 μl RNase (500 ng/μl) hinzu, um die crRNA und tracrRNA bei 37 °C für 30 min abzubauen, da RNAs während der Elektrophorese fehlen müssen. Führen Sie eine Elektrophorese der oben genannten Proben mit einem Beladungsfarbstoff durch, der Natriumdodecylsulfat (2 % w/v) enthält.
HINWEIS: In seltenen Fällen werden crRNAs ohne Spaltaktivität beobachtet. In solchen Fällen empfiehlt es sich, das Genom-Editing-Design neu zu gestalten.
2. Vorbereitung der Mischung aus crRNA, tracrRNA, Cas9-Protein und Spender-DNA für die Mikroinjektion von Zygoten
- Bereiten Sie eine CRISPR-Lösung vor (50 ng/μl crRNA, 200 ng/μl tracrRNA und 200 ng/μl Cas9 in RNase-freiem Wasser). Bereiten Sie eine Spender-DNA-Lösung vor (20 ng/μl selbstkonstruierter Plasmid-DNA-Vektor).
- Filtern Sie die Spender-DNA-Lösung durch einen sterilen Spritzenvorsatzfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm. Mischen Sie gleiche Mengen der CRISPR-Lösung und der gefilterten Spender-DNA-Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration jeweils 25 ng/μl crRNA, 100 ng/μl tracrRNA, 100 ng/μl Cas9 und 10 ng/μl Spender-DNA beträgt. Dieses Gemisch wird im Folgenden als RNPD bezeichnet.
HINWEIS: Beim Schneiden von zwei Stellen, wie z. B. bei der Produktion von gefloxten Mäusen, muss die Konzentration jeder crRNA 25 ng/μl betragen. Die Spender-DNA ist eine zirkuläre Plasmid-DNA und kann mit einem handelsüblichen Mini-Prep-Spin-Säulen-Kit aufgereinigt werden (siehe Materialtabelle). Die vorbereitete Lösung muss so schnell wie möglich auf Eis gelegt und für die Mikroinjektion verwendet werden.
- Filtern Sie die Spender-DNA-Lösung durch einen sterilen Spritzenvorsatzfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm. Mischen Sie gleiche Mengen der CRISPR-Lösung und der gefilterten Spender-DNA-Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration jeweils 25 ng/μl crRNA, 100 ng/μl tracrRNA, 100 ng/μl Cas9 und 10 ng/μl Spender-DNA beträgt. Dieses Gemisch wird im Folgenden als RNPD bezeichnet.
3. Gewinnung von Mäusezygoten durch natürliche Paarung
- Injizieren Sie 3 Tage vor der Mikroinjektion 5 I.E. Serumgonadotropin (PMSG, siehe Materialtabelle) subkutan in weibliche C57BL/6J-Mäuse (10-25 Wochen alt). Etwa 46-48 h später 5 I.E. humanes Choriongonadotropin (hCG, siehe Materialtabelle) intraperitoneal verabreichen. Bringen Sie die PMSG- und hCG-behandelten weiblichen Mäuse zusammen mit männlichen C57BL/6J-Mäusen zusammen und überprüfen Sie die Vaginalpfropfen am nächsten Morgen.
HINWEIS: Ungefähr 15-25 Zygoten können von einer weiblichen C57BL/6J-Maus erhalten werden. Die Zeitachse ist in Abbildung 1 dargestellt. - Bereiten Sie zwei 35-mm-Petrischalen für die Zygotenkultur vor, wie in Abbildung 2 gezeigt. Legen Sie sie bis zur Verwendung in den Inkubator (37 °C, 5%CO 2). Diese können über Nacht gelagert werden.
- Euthanasieren Sie die weiblichen Mäuse mit bestätigten Vaginalpfropfen durch Zervixluxation und schneiden Sie mit einer kleinen Schere durch die Bauchhaut und die Muskelschicht von der Mittellinie des Unterbauchs bis unter die Rippen.
HINWEIS: Befolgen Sie die Empfehlungen der örtlichen Tierethikkommission für Euthanasie. - Sammeln Sie die Eileiter und legen Sie sie in einen 20-μl-Tropfen M2-Medium mit 0,75 mg/ml Hyaluronidase (siehe Materialtabelle) auf den Deckel der Petrischale. Nehmen Sie einen Eileiter mit einer feinen Pinzette auf und durchbluten Sie etwa 50 μl M2-Medium mit Hyaluronidase durch die Fimbrien.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sind die Zygoten lose von zahlreichen Cumuluszellen umgeben. - Nach 30 s werden morphologisch normale Zygoten mit einer kleinen Menge Medium unter Verwendung einer Glaskapillare aufgenommen und gewaschen, indem sie in frische M16-Mediumtröpfchen überführt werden. Übertragen Sie die gewaschenen Zygoten in eine Petrischale (Abbildung 2), um sie zu bündeln.
HINWEIS: Die Zeitachse ist in Abbildung 1 dargestellt. Morphologisch normale Zygoten haben einen männlichen und einen weiblichen Vorkern und zwei Polkörper, die die Kugelform nicht stark beeinträchtigt haben15. Die Morphologie der Zygote variiert erheblich zwischen den Stämmen und Arten. - Wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.4, bis alle Zygoten gefunden sind. Etwa 100 Zygoten können in einem M16-Tropfen in der Kulturschale gepoolt werden. Lagern Sie die Schale bis zur Mikroinjektion im Inkubator (37 °C, 5 %CO 2).
4. Vorbereitung der Mikroinjektionsnadel
- Ziehen Sie einige Glaspipetten mit dem programmierbaren Pipettenzieher heraus (siehe Materialtabelle).
Anmerkungen: Mikroinjektionsnadeln müssen eine dünne Spitze und eine lange Verjüngung haben. Wenn der Abzieher über ein Programm zur Herstellung von Nadeln für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion verfügt, kann das gleiche Programm zur Herstellung von Nadeln für die Mikroinjektion verwendet werden. - Brechen Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel, indem Sie auf die Glaskugel schlagen, die an der Spitze der Mikroschmiede befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Spitzengröße der Mikroinjektionsnadel einen Durchmesser von etwa 1 μm hat. Überprüfen Sie die Spitzengröße unter dem Mikroskop bei 1000-facher Vergrößerung.
- Biegen Sie die Mikroinjektionsnadel mit einer Mikroschmiede etwa 2-3 mm von der Spitze entfernt.
Anmerkungen: Der Winkel der Biegung hängt von der Einstellung des Mikromanipulators ab. Eine zu starke Biegung verringert die Wirksamkeit des Piezopulses.
5. Mikroinjektion von Zygoten
- Injizieren Sie 1-1,5 cm der Betriebsflüssigkeit (Trägheitskörper, der für den Piezoeffekt benötigt wird, um alternativ zu Quecksilber Löcher zu bohren, siehe Materialtabelle) in die Mitte der Mikroinjektionsnadel und befestigen Sie sie mit dem Piezoaktor am manuellen Mikroinjektorhalter.
- Befestigen Sie außerdem die Haltenadel an der gegenüberliegenden manuellen Mikroinjektorhalterung. Bewegen Sie die Operationsflüssigkeit mit allmählichem Druck zur Spitze der Mikroinjektionsnadel. Befestigen Sie beide manuellen Mikroinjektorhalter am Mikromanipulator.
HINWEIS: Die Operationsflüssigkeit, die aus der Spitze der Mikroinjektionsnadel austritt, kann unter dem Mikroskop bei 50-facher Vergrößerung beobachtet werden. Nach der Einstellung der abgegebenen Flüssigkeitsmenge kann das Spritzen der Flüssigkeit beobachtet werden, wenn die Piezoimpulse angelegt werden, was bestätigt, dass die Piezoimpulse wirksam sind. Wenn dies nicht bestätigt werden kann, bereiten Sie die Mikroinjektionsnadel erneut vor.
- Befestigen Sie außerdem die Haltenadel an der gegenüberliegenden manuellen Mikroinjektorhalterung. Bewegen Sie die Operationsflüssigkeit mit allmählichem Druck zur Spitze der Mikroinjektionsnadel. Befestigen Sie beide manuellen Mikroinjektorhalter am Mikromanipulator.
- Bereiten Sie eine Injektionskammer mit drei Tröpfchen vor: (1) 10 μl M2-Medium; (2) 5 μl 12%iges Polyvinylpyrrolidon (PVP) in M2-Medium; und (3) eine 5-μl-Mischung aus crRNA, tracrRNA, Cas9-Protein und der Donor DNA (RNPD)-Lösung. Bedecken Sie die Tröpfchen wie in Schritt 3.2 mit Mineralöl und stellen Sie die Injektionskammer auf den inversen Mikroskoptisch.
- Senken Sie die Mikroinjektionspipette unter dem inversen Mikroskop bei einer 50-fachen Vergrößerung in den PVP-Tropfen von 12 %. Saugen Sie 12 % PVP ab und geben Sie es ab, um das Innere der Mikroinjektionsnadelspitze zu reinigen und auf das RNPD-Tröpfchen zu übertragen.
- Setzen Sie den manuellen Mikroinjektor unter Unterdruck und saugen Sie die RNPD-Lösung in die Mikroinjektionsnadel. Warten Sie einige Minuten, bis ein ausreichendes Volumen angesaugt ist. Füllen Sie unter einem 50-fach vergrößerten Mikroskop das gesamte Innere der Mikroinjektionsnadel mit Flüssigkeit.
- Stoppen Sie die Aufnahme und lassen Sie die RNPD-Lösung allmählich ausstoßen, indem Sie den manuellen Mikroinjektor auf Überdruck einstellen. Führen Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel in das Öl.
Anmerkungen: Drehen Sie den Knopf des manuellen Mikroinjektors zum Einatmen gegen den Uhrzeigersinn. Um das Einatmen zu stoppen, drehen Sie den Knopf im Uhrzeigersinn und erhöhen Sie allmählich den Druck, während Sie unter dem Mikroskop beobachten. Die RNPD-Lösung wird nach und nach entleert. Die Bewegung des Flüssigkeitsspiegels in der Mikroinjektionsnadel ermöglicht die Bestätigung des Abflusses.
- Stoppen Sie die Aufnahme und lassen Sie die RNPD-Lösung allmählich ausstoßen, indem Sie den manuellen Mikroinjektor auf Überdruck einstellen. Führen Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel in das Öl.
- Geben Sie 50 Zygoten in das M2-Tröpfchen und senken Sie die Haltepipette vorsichtig in dasselbe Tröpfchen. Übertragen Sie die Mikroinjektionsnadel in den M2-Tropfen mit den Zygoten. Wechseln Sie zu einem 20-fachen Objektiv und konzentrieren Sie sich auf die Spitze der Mikroinjektionspipette.
Anmerkungen: Geben Sie so viele Zygoten hinzu, wie in 10 Minuten injiziert werden können. - Halte eine Zygote und konzentriere dich auf den Vorkern, indem du den Mikromanipulator bewegst. Führen Sie die Mikroinjektionsnadel in die Zygote ein und bringen Sie die Spitze in die Nähe des Vorkerns. Sobald die Spitze die Vorkernmembran erreicht hat, wenden Sie den Piezoimpuls (Intensität: 6-10, Geschwindigkeit: 1) zum Einstechen an.
- Wenn die Mikroinjektionsnadel den Vorkern durchsticht, injizieren Sie die RNPD-Lösung und beobachten Sie die Schwellung des Vorkerns. Sobald der Vorkern vollständig aufgeblasen ist, ziehen Sie die Nadel schnell heraus. Führen Sie das gleiche Verfahren sowohl am weiblichen als auch am männlichen Vorkern durch.
HINWEIS: Das Aufblasen des Vorkerns durch Injektion ist unter dem Mikroskop deutlich zu erkennen. Das Ausmaß dieser Inflation ist schwer zu beschreiben, kann aber durch Verweis auf frühere Berichte bestätigt werden15.
- Wenn die Mikroinjektionsnadel den Vorkern durchsticht, injizieren Sie die RNPD-Lösung und beobachten Sie die Schwellung des Vorkerns. Sobald der Vorkern vollständig aufgeblasen ist, ziehen Sie die Nadel schnell heraus. Führen Sie das gleiche Verfahren sowohl am weiblichen als auch am männlichen Vorkern durch.
- Bewegen Sie die injizierte Zygote an eine andere Stelle innerhalb des M2-Tröpfchens, um die Zygoten vor und nach der Injektion zu identifizieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.5-5.6, bis alle Zygoten im M2-Tröpfchen injiziert wurden. Nach der Injektion die Zygoten in eine frische M16-Schale geben.
- Wählen Sie die überlebenden Zygoten 10 Minuten nach der Injektion aus. Entfernen Sie die lysierten Zygoten, die durch die Injektion beschädigt wurden, und verteilen Sie die überlebenden Zygoten auf jedes Tröpfchen in der M16-Schale. Jedes Tröpfchen muss 20-24 Zygoten für ein pseudoträchtiges Weibchen enthalten. Dies verkürzt die Zeit, in der die M16-Schale während des Embryotransfers der Umgebung außerhalb des Inkubators ausgesetzt ist.
HINWEIS: Unter optimalen Injektionsbedingungen beträgt die Überlebensrate 90%-95%. Dies hängt von der Größe der Nadelspitze, der Stärke des Piezopulses und dem Ausflussdruck der RNPD-Lösung ab.
6. Embryotransfer in den Eileiter
- Um pseudoträchtige Mäuse zu erhalten, paaren Sie jede weibliche ICR-Maus in der Proöstrusphase mit einer vasoligierten männlichen ICR-Maus. Überprüfen Sie die Stecker am nächsten Tag.
HINWEIS: Ungefähr 15 pseudoträchtige Mäuse werden aus 20 Paarungspaaren gewonnen. - Drei Arten von Mischanästhetika (0,2 mg/kg Medetomidin, 4,0 mg/kg Midazolam und 2,5 mg/kg Butorphanol, siehe Materialtabelle) werden den pseudoträchtigen weiblichen Mäusen subkutan verabreicht. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch eine Abnahme der Atemfrequenz und das Verschwinden der Reflexe zum Einklemmen des Schwanzes und des Rückzugspedals der Hintergliedmaßen. Tragen Sie Augensalbe auf, um die Augen gemäß den Empfehlungen der örtlichen Tierethikkommission zu befeuchten.
- Nach der Rasur der Rückenregion der Maus in Bauchlage und der dreimaligen Desinfektion des Operationsbereichs, abwechselnd mit einem Peeling auf Jod- oder Chlorhexidinbasis und Alkohol, wird die Rückenhaut mit einer kleinen Präparierschere ca. 1 cm entlang der Wirbelsäule eingeschnitten.
- Verschieben Sie die dorsale Schnittwunde ventral auf eine Seite, schneiden Sie die Muskelschicht ein, durch die der Eierstock zu sehen ist, fassen Sie das Fett über dem Eierstock mit einer Pinzette und ziehen Sie Eierstock, Eileiter und Gebärmutter heraus.
- Fixieren Sie das Fett mit einer Serrefine-Klemme (siehe Materialtabelle). Legen Sie das Fortpflanzungsgewebe auf sterile Gaze, um direkten Kontakt mit dem Fell zu vermeiden.
- Geben Sie in der folgenden Reihenfolge eine kleine Menge Nährmedium (M2 oder M16), einige Luftblasen als Markierung und die Zygoten zum Transfer in eine Pipette.
HINWEIS: Übertragen Sie ca. 10-12 Zygoten pro Eileiter. - Machen Sie mit einer Mikroschere (siehe Materialtabelle) einen Schnitt zwischen der Ampulle und den Fimbrien des Eileiters (gerade lang genug, damit die Glaspipette eindringen kann), führen Sie die Zygoten in den Einschnitt ein und bestätigen Sie gleichzeitig, dass die Luftblase eingeführt wurde.
- Führen Sie die Implantation in den anderen Eileiter auf ähnliche Weise durch (Schritt 6.6).
- Vernähen Sie die Außenhaut mit Autoclips (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Nähen Sie die eingeschnittene Muskelschicht nur, wenn die Schnittwunde unvermeidlich groß ist. Die ideale Größe der eingeschnittenen Muskelschicht sollte weniger als 2-3 mm betragen. Wenn der Schnitt größer als 5 mm ist, sollte die Muskelschicht mit einer sterilisierten Nahtnadel und einem sterilisierten Faden vernäht werden (siehe Materialtabelle).
7. Genesung von Tieren
- Den Mäusen wird Atipamezolhydrochlorid (0,3 mg/kg) subkutan verabreicht.
HINWEIS: Befolgen Sie die Empfehlungen der örtlichen Tierethikkommission für die postoperative Analgesie. - Setzen Sie die Mäuse dann in Käfige und halten Sie sie auf einer heißen Platte bei 37 °C warm.
- Nachdem die Mäuse geweckt wurden, halten Sie sie etwa 2 Stunden warm. Nachdem bestätigt wurde, dass kein abnormales Verhalten der Mäuse vorliegt, stellen Sie die Käfige wieder in das Zuchtregal.
Representative Results
Die Produktionsergebnisse von Genkassetten-Knock-in- und Flox-Mäusen, die dieses Protokoll verwenden, sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt. Die Zielgene wurden nicht genannt, da jede genomeditierte Mauslinie derzeit in einem unabhängigen, unveröffentlichten Projekt verwendet wird. Stattdessen wurden die Chromosomenregionen beschrieben.
Die Genotypisierungsanalysen wurden mit einer zuvor beschriebenen Methodedurchgeführt 18. Bei dieser Genotypisierungsmethode werden Mäuse, bei denen die Spender-DNA an unbeabsichtigten Chromosomenstellen eingefügt wird, nicht als positive Individuen gezählt, selbst wenn die gewünschte Genom-Editierung induziert wird. Daher wurde die Produktionseffizienz der Gründermäuse gezeigt, die für tatsächliche Zwecke wirklich nützlich sind, und nicht die Effizienz der Genom-Editierung selbst.
Die mediane Produktionseffizienz von 13 unabhängigen Genkassetten-Knock-in-Mäusen betrug 20,8 %, mit einem Maximum von 39,5 % und einem Minimum von 7,9 % (Tabelle 1). Diese Effizienz wurde als hinreichend praktikabel erachtet. Alle letalen embryonalen Gene wurden während des Genkassetten-Knock-ins nicht angegriffen. Die mediane Geburtenrate unter dieser nicht-letalen Gen-Targeting-Bedingung betrug 34,0 % (maximal 43,3 % und minimal 15,9 %). Da dies vergleichbar ist mit der Geburtenrate beim Embryotransfer ohne genetische Manipulation, hielten wir es für unwahrscheinlich, dass die Toxizität der eingeführten Genom-Editing-Elemente und die physische Schädigung durch die Mikroinjektion der Zygoten die Embryonalentwicklung beeinflussen.
Die mediane Produktionseffizienz der 10 unabhängigen Flox-Mäuse betrug 7,7 %, mit einem Maximum von 20,7 % und einem Minimum von 2,1 % (Tabelle 2). Obwohl die Funktionen mehrerer Zielgene unbekannt waren, lag die mediane Geburtenrate bei 30,2 %, mit einem Maximum von 43,8 % und einem Minimum von 17,3 %. Diese Rate war vergleichbar mit der von Genkassetten-Knock-in-Mäusen, was darauf hindeutet, dass die Mikroinjektion einen vernachlässigbaren Effekt auf die Embryonalentwicklung von gefloxten Mäusen hat.
Abbildung 1: Zeitlicher Ablauf der Mikroinjektion der Zygoten. Weiße und dunkle Farbe zeigen den Hell- bzw. Dunkelzyklus an. Die Mäuse wurden unter einem 14-stündigen Hell-/10-Stunden-Dunkelzyklus gehalten. PMSG: Gonadotropin im Serum der trächtigen Stute; hCG: humanes Choriongonadotropin Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Zubereitung von Kulturschalen . (A) Kulturschale für die Zygoten vor der Injektion. Geben Sie zwei Tropfen M16-Medium (jeweils 20-25 μl) in eine 35-mm-Kunststoff-Petrischale. (B) Kulturschale für die Zygoten nach der Injektion. Geben Sie 10 Tropfen (10-20 μl für jeden Tropfen) M16 in eine 35-mm-Kunststoff-Petrischale. Die Tropfen werden mit Mineralöl (3 ml) bedeckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Gezielte Chromosomenregion | Mehrere | Länge des Einschlags (kb) | Homologie-Armlänge (kb) | ||||||
| Embryonen | Neugeborenen | Untersucht (Entwöhnungen) | Knock-In ohne rTG | rTGc | |||||
| eingespritzt | überführt | 5' Arm | 3' Arm | ||||||
| 2qE2 | 349 | 331 | 114 (34,4%)a | 114 | 9 (7,9%)b | 5 (4,4%)d | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 2qE2 | 231 | 215 | 78 (36,3%)a | 74 | 15 (20,3%)b | 23 (31,1%)d | 2.2 | 1.0 | 1.1 |
| 5qG2 | 288 | 262 | 90 (34,4%)a | 81 | 19 (23,5%)b | 18 (22,2%)d | 1.6 | 2.0 | 2.0 |
| 6qB1 | 278 | 259 | 58 (22,4%)a | 46 | 11 (23,9%)b | 11 (23,9%)d | 4.2 | 1.2 | 1.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 295 | 277 | 97 (35.0%)a | 23 | 2 (8,7%)b | 4 (17,4%)d | 6.5 | 1.1 | 3.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 246 | 219 | 87 (39,7%)a | 83 | 22 (26,5%)b | 18 (21,7%)d | 5.8 | 1.1 | 3.0 |
| 7qF5 | 279 | 268 | 116 (43,3%)a | 114 | 45 (39,5%)b | 44 (38,6%)d | 1.4 | 3.1 | 1.0 |
| 11qB4 | 405 | 353 | 56 (15.9%)a | 47 | 8 (17,0%)b | 12 (25,5%)d | 1.7 | 1.0 | 0.8 |
| 11qD | 310 | 294 | 100 (34,4%)a | 98 | 15 (15,3%)b | 76 (77,6%)d | 1.0 | 1.8 | 2.4 |
| 12qE | 368 | 320 | 86 (26.9%)a | 84 | 12 (14,3%)b | 19 (22,6%)d | 3.4 | 1.1 | 1.3 |
| 12qF1 | 315 | 265 | 76 (28,7%)a | 72 | 17 (23,6%)b | 28 (38,9%)d | 1.0 | 1.1 | 1.1 |
| 14qE5 | 256 | 215 | 48 (22,3%)a | 48 | 11 (22,9%)b | 21 (43,8%)d | 3.1 | 1.0 | 0.9 |
| 14qE5 | 287 | 285 | 85 (29,8%)a | 72 | 15 (20,8%)b | 19 (26,4%)d | 2.6 | 1.0 | 0.9 |
Tabelle 1: Herstellung von Knock-in-Mäusen durch Mikroinjektion. Die Tabelle zeigt die Geburtenrate und die Effizienz der Produktion von Mäusen, die das beabsichtigte Knock-in-Allel ohne (W/O) zufällige Integration (rTG) der Spender-DNA tragen. In allen Projekten konnten Mäuse mit dem beabsichtigten Knock-in-Allel gewonnen werden. a: Anzahl der Neugeborenen/Anzahl der übertragenen Embryonen; b: Anzahl der Knock-in-Allele, die Mäuse trugen/Anzahl der untersuchten Mäuse; c: Es ist nicht sicher, ob es ein beabsichtigtes Allel gibt; d: Anzahl der rTG-Allel-getragenen Mäuse/Anzahl der untersuchten Mäuse; rTG: zufällige Integration des Donorvektors. W/O: ohne.
| Gezielte Chromosomenregion | Mehrere | Länge der Floxed (KB) | Homologie-Armlänge (kb) | |||||
| Embryonen | Neugeborenen | Untersucht (Entwöhnungen) | gefloxt ohne rTG | |||||
| eingespritzt | überführt | 5' Arm | 3' Arm | |||||
| 3qC | 325 | 313 | 93 (29,7%)a | 87 | 9 (10,3%)b | 1.3 | 1.2 | 1.1 |
| 4qB1 | 210 | 200 | 36 (18,0%)a | 29 | 6 (20,7%)b | 1.6 | 1.2 | 0.9 |
| 4qC4 | 272 | 256 | 112 (43.8%)a | 100 | 5 (5,0%)b | 2.4 | 1.0 | 1.4 |
| 5qF | 143 | 137 | 40 (29,2%)a | 40 | 6 (15,0%)b | 1.8 | 1.0 | 1.1 |
| 5qF | 255 | 227 | 80 (35,2%)a | 76 | 2 (2,6%)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 9qE3.1 | 289 | 261 | 80 (30,7%)a | 77 | 9 (11,7%)b | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 10qB3 | 284 | 269 | 88 (32.7%)a | 78 | 3 (3,8%)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 10qC1 | 243 | 231 | 40 (17,3%)a | 38 | 4 (10,5%)b | 2.1 | 1.0 | 1.3 |
| 14qE5 | 390 | 372 | 139 (37,4%)a | 135 | 5 (3,7%)b | 1.1 | 0.8 | 0.9 |
| 17qA3.3 | 383 | 374 | 99 (26,5%)a | 95 | 2 (2,1%)b | 2.1 | 0.6 | 0.8 |
Tabelle 2: Produktion von Flox-Mäusen durch Mikroinjektion. Die Tabelle zeigt die Geburtenrate und die Effizienz der Produktion von Mäusen, die das beabsichtigte flox-Allel ohne (W/O) zufällige Integration (rTG) der Spender-DNA tragen. In allen Projekten konnten Mäuse mit dem vorgesehenen flox-Allel gewonnen werden. a: Anzahl der Neugeborenen/Anzahl der übertragenen Embryonen; B: Anzahl der Mäuse, die mit dem Flox-Allel getragen wurden/Anzahl der untersuchten Mäuse. rTG: zufällige Integration eines Donorvektors; W/O: ohne.
Discussion
In der vorliegenden Studie wurden frische (nicht gefroren-aufgetaute) C57BL/6J-Mauszygoten, die aus natürlicher Paarung gewonnen wurden, für die Genom-Editing-Mausproduktion verwendet. Durch die Injektion von crRNA-tracrRNA-Cas9 und Spender-DNA (RNPD) in beide Vorkerne dieser Zygoten in einer Zellzyklusphase, in der ein Knock-in am wahrscheinlichsten ist, wurden Genkassetten-Knock-in- und Floxed-Mäuse mit einer hohen Geburtenrate und ausreichender Genom-Editing-Effizienz erzeugt. Die aktuelle Studie stärkt die Erweiterbarkeit der SPRINT-CRISPR-Methode15, wo sie auch im genetischen Hintergrund von C57BL/6J eine ausreichende Knock-in-Effizienz gewährleistet und auf die Produktion von gefloxten Mäusen angewendet werden kann.
Die Elektroporation ist aufgrund der geringen Kosten der experimentellen Geräte und der Leichtigkeit des Erlernens der Technik eine stark verallgemeinerte Methode zur Herstellung genomeditierter Mäuse8. Darüber hinaus benötigt die i-GONAD-Methode19, bei der die Genom-Editierung mit im Eileiter vorhandenen Präimplantationsembryonen durchgeführt wird, keine Empfängermaus. Im Vergleich zu diesen Methoden ist die hier vorgestellte Methode kostspielig und zeitaufwändig bei der Vorbereitung und Wartung einer experimentellen Umgebung sowohl in Bezug auf Hardware als auch auf Software. Sobald die Versuchsanlagen jedoch eingerichtet sind, können komplexe Genkassetten-Knock-in- und Flox-Mäuse nur mit kommerziell erhältlichen CRISPR-Elementen (crRNA, tracrRNA und Cas9-Protein) und einer einfachen, kleinen Menge eines zirkulären Plasmidvektors hergestellt werden, der als Spender-DNA verwendet werden kann. Dies bedeutet, dass viele komplexe genomeditierte Mauslinien hergestellt werden können, ohne dass zeitaufwändige (oder relativ teure) lsODN 5,6- oder Adeno-assoziierte Virusvektoren20 hergestellt werden müssen.
Im Gegensatz zur ursprünglichen SPRINT-CRISPR-Methode15 wurden frische (gefroren-aufgetaute) Zygoten verwendet. Bei der Gewinnung frischer Zygoten durch natürliche Paarung können die technischen Fehler, die bei der In-vitro-Fertilisation oder beim Einfrieren und Auftauen auftreten können, ignoriert werden. Außerdem kann der Prozess der Embryonenmanipulation nach dem aktuellen Ansatz in etwa einem halben Tag abgeschlossen werden (Abbildung 1). Auf der anderen Seite beinhalten einige Einschränkungen des vorliegenden Verfahrens die Notwendigkeit vieler männlicher Mäuse, die lose Kontrolle des Befruchtungszeitpunkts und die begrenzte Fähigkeit, die Anzahl der Zygoten für die Mikroinjektion vollständig vorherzusagen. Im Vergleich zur ursprünglichen SPRINT-CRISPR-Methode kann diese Methode eine höhere Geburtenrate aufweisen (Tabelle 1). Trotzdem kann nicht der Schluss gezogen werden, dass die gegenwärtige Methode in Bezug auf die Geburtenrate besser ist, da sich die Versuchsleiter, die Zielgene, die genetischen Hintergründe und der Zeitpunkt der Embryonenbestätigung unterscheiden.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, hatte eine große Anzahl von Mäusen in den meisten Genkassetten-Knock-in-Projekten zufällige Integrationsallele. Die zufällige Integration muss eliminiert werden, da sie zu einer unbeabsichtigten Störung endogener Gene und einer ektopischen Expression von Transgenen führen kann. Die Herausforderung für die Zukunft besteht darin, experimentelle Bedingungen zu finden, die die Anzahl der zufälligen Integrationsereignisse reduzieren und gleichzeitig eine ausreichende Knock-in-Effizienz aufrechterhalten.
Fast die gesamte Genom-Editierung von Mauszygoten unter Verwendung von Genom-Editing-Effektoren, die zu DNA-Doppelstrangbrüchen führen, induziert wahrscheinlich unbeabsichtigte Mutationen an den Zielstellen 9,21. Die Ergebnisse dieser unbeabsichtigten On-Target-Mutationen werden hier nicht beschrieben, da wir uns nicht in einer Situation befinden, in der die nächste Generation von Mäusen so gesteuert werden kann, dass sie eindeutige Beweise dafür vorlegen können. Der beste Weg, um die Besorgnis einer Verwechslung auszuschließen, die durch unbeabsichtigte On-Target-Mutagenese verursacht wird, besteht darin, die nächste Generation von Mäusen zu erhalten, indem Gründer mit Wildtyp-Mäusen gepaart werden, anstatt Gründer zu kreuzen. Prinzipiell handelt es sich bei den aus dieser Kreuzung resultierenden N1-Mäusen auf einer Seite des Allels um Wildtyp-Mäuse (WT), d.h. wenn das beabsichtigte knock-in-Allel (KI) nachgewiesen wird, sind sie WT/KI-heterozygot. Daher ist die On-Target-Mutagenese bei der Labormaus, die einen relativ schnellen Lebenszyklus hat und ein produktives Tier ist, kein kritisches Problem. Weitere Verbesserungen sind jedoch erforderlich, wenn diese Technologie auf relativ große Säugetiere angewendet wird.
Es wurde bestätigt, dass diese Technologie Genkassetten-Knock-in-Mäuse in anderen Inzuchtstämmen als C57BL/6J erzeugen kann, aber eine ausreichende Anzahl von Projekten ist nicht gesichert und die Daten sind sehr variabel. Aus diesem Grund sind diese Informationen in der vorliegenden Studie nicht enthalten. Es wird angenommen, dass weitere Studien zu diesem Thema notwendig sein werden, um die Genetik der Maus und die Erforschung von Krankheitsmodellen voranzutreiben.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von Scientific Research (B) (19H03142: an SM), Scientific Research (A) (20H00444: an FS), Scientific Research (A) (21H04838: an SM) und Scientific Research on Innovative Areas "Platform of Advanced Animal Model Support" (16H06276: an ST) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Erstellung von Manuskripten. Wir danken Ryoichi Mori für seine hilfreiche Diskussion über das Design der Genom-Editierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | - | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | - | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | - | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | - | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | - | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | - | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | - | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | - | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | - |
References
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