Summary
Den foreliggende protokollen beskriver zygote mikroinjeksjon av CRISPR-Cas9 og donor DNA for effektivt å produsere genkassett, knock-in og floxed mus.
Abstract
CRISPR-Cas-teknologien har muliggjort rask og uanstrengt generering av genmodifiserte mus. Spesielt produseres mus og punktmutante mus lett ved elektroporering av CRISPR-faktorer (og enkeltstrengede oligo DNA-donorer) i zygoten. I motsetning til dette genereres genkassett (>1 kb) innslag og floxede mus hovedsakelig ved mikroinjeksjon av CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer til zygoter. Genomredigeringsteknologier har også økt fleksibiliteten til genmodifisert musproduksjon. Det er nå mulig å introdusere de tiltenkte mutasjonene i målgenomiske regioner i en rekke gunstige innavlede musestammer. Vårt team har produsert over 200 genkassett knock-in muselinjer, og over 110 floxed muselinjer ved zygote mikroinjeksjon av CRISPR-Cas9 etter forespørsler fra flere land, inkludert Japan. Noen av disse genomredigeringene brukte BALB/c, C3H/HeJ og C57BL/6N innavlede stammer, men de fleste brukte C57BL/6J. I motsetning til elektroporasjonsmetoden er genomredigering ved zygotemikroinjeksjon i forskjellige innavlede stammer av mus ikke så lett. Imidlertid er genkassett-knock-in og floxed mus på enkelt innavlet genetisk bakgrunn like kritisk som genetisk humanisert, fluorescerende reporter og betingede knockout-musemodeller. Derfor presenterer denne artikkelen protokollen for zygote mikroinjeksjon av CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer i C57BL/6J-mus for generering av genkassett-innslag og floxede mus. Denne artikkelen fokuserer utelukkende på kjernefysisk injeksjon i stedet for cytoplasmatisk injeksjon. I tillegg til zygote mikroinjeksjon, skisserer vi tidslinjen for produksjonsprosessen og perifere teknikker som induksjon av superovulasjon og embryooverføring.
Introduction
Knock-in mus, der de tiltenkte eksogene gener blir introdusert ved målet loci, er mye brukt i mange in vivo studier som gen humaniserte mus, fluorescerende reporter mus og Cre driver mus 1,2. Når knock-in mutasjoner induseres av genomredigering i musezygoter, brukes enkeltstrenget DNA (single-stranded oligo DNA donors, ssODN) eller dobbeltstrenget DNA (dsDNA) som donor DNA 2,3. ssODN brukes hovedsakelig til å banke inn relativt korte genfragmenter på mindre enn 200 bp4. Det er mulig å banke inn fragmenter lengre enn 1 kb DNA ved bruk av lange ssODNs (lsODN)5,6, men deres forberedelse er tidkrevende. Når dsDNA-donorer brukes, kan genkassett (>1 kb) innbankede mus genereres uten arbeidskrevende DNA-forberedelse fra donor7.
Hovedfordelen ved å bruke ssODN-er er at elektroporering8 kan generere innslåingsmus. Imidlertid må dsDNA-donorer innføres direkte i kjernen ved zygote mikroinjeksjon. Samtidig innslag på to steder er nødvendig for å skape floxed mus, hvor hver loxP-sekvens blir slått inn oppstrøms og nedstrøms for målgenet. Det er to måter å generere floxed mus ved genomredigering i muszygoter - ved hjelp av to uavhengige ssODNs, hver bærer et enkelt loxP-nettsted, eller bruker et enkelt dsDNA (eller lsDNA) med en floxed sekvens; Førstnevnte er svært ineffektiv 9,10,11. Genomredigering ved hjelp av dsDNA-donorer er den enkleste tilnærmingen for å produsere genkassett, innbanking og floxed mus hvis miljøet bidrar til zygote mikroinjeksjon.
I utgangspunktet brukes blandinger av Cas9 mRNA og sgRNA eller DNA-vektorer som koder for sgRNA og Cas9 til genomredigering i musezygoter12,13. Siden høykvalitets og stabile Cas9-proteiner nå er tilgjengelige til en lav pris, har introduksjonen av crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) i muszygoter14 blitt populær. Nylig har knock-in mus blitt generert med høy effektivitet ved å introdusere crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP og donor DNA i begge pronuclei av muszygoter i en cellesyklusfase hvor innbanking er mest sannsynlig å forekomme15. Derfor beskriver denne protokollen teknikker for å produsere ulike typer innslagsmus ved denne metoden.
Det er mange nyttige innavlede stammer av laboratoriemus16. Genetisk modifikasjon innenfor den innavlede bakgrunnen kan se bort fra påvirkning av genetisk bakgrunn på fenotypen. Denne artikkelen beskriver en metode for å indusere genkassettinnslag og floxedmutasjoner i zygoten til den mest brukte innavlede muselinjen, C57BL/6J17. Videre diskuteres også tidslinjen for generering av genetisk modifiserte mus og de perifere teknikkene som brukes, inkludert induksjon av superovulasjon og embryooverføring.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført humant med godkjenning fra Institutional Animal Experiment Committee ved University of Tsukuba, i henhold til forskriften for dyreforsøk ved Universitetet i Tsukuba og de grunnleggende retningslinjene for riktig gjennomføring av dyreforsøk og relaterte aktiviteter i akademiske forskningsinstitusjoner under jurisdiksjonen til utdanningsdepartementet, Kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. C57BL/6J-mus av begge kjønn, 10-25 uker gamle, ble brukt som zygotedonor. ICR-mus (eldre enn 10 uker) ble brukt som mottakermus. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell).
1. Bekreftelse av crRNA-spaltningsaktivitet i et cellefritt system
- Løs opp 2 nmol crRNA (tørr) og 20 nmol tracrRNA (tørr) i henholdsvis 25 μL og 250 μL RNase-fritt vann (se materialfortegnelse).
MERK: CRISPR-målsekvenser som ble spådd å ha høy spaltningsaktivitet og så få off-targets som mulig, velges ved hjelp av CRISPOR (se materialfortegnelse). Når det gjelder innbanking av genkassett, målretter du sekvensen over innsettingsstedet. Eksonen(e) som skulle floxes ble valgt ved hjelp av KOnezumi (se materialfortegnelse). - Amplifiser DNA-fragmentet (ca. 0,5-1 kb) som inneholder målstedet ved genomisk PCR9. Rens denne PCR-amplikonen med det vanlige PCR-produktekstraksjonssettet (se Materialfortegnelse).
- Forbered 10 μL CRISPR-blanding (100 ng / μL crRNA, 150 ng / μL tracrRNA og 1 ng / μL Cas9 i Cas9-nukleasereaksjonsbufferen, se materialtabellen). For å konstruere CRISPR-Cas9-komplekset, plasser CRISPR-blandingen i en varmeblokk ved 37 °C i 30 minutter.
- Tilsett totalvolumet (10 μL) av CRISPR-blandingen til PCR-produktet (10 μL, 20 ng / μL) beskrevet i trinn 1,2 og inkuber ved 37 ° C i 1 time. Tilsett 1 μL RNase (500 ng / μL) for å nedbryte crRNA og tracrRNA ved 37 ° C i 30 minutter, da RNA må være fraværende under elektroforese. Utfør elektroforese av de ovennevnte prøvene ved bruk av lastfargestoff som inneholder natriumdodecylsulfat (2% w / v).
MERK: I sjeldne tilfeller observeres crRNA uten spaltningsaktivitet. I slike tilfeller anbefales det å redesigne genomredigeringsdesignet.
2. Fremstilling av blandingen av crRNA, tracrRNA, Cas9 protein og donor DNA for zygote mikroinjeksjon
- Forbered CRISPR-oppløsning (50 ng / μL crRNA, 200 ng / μL tracrRNA og 200 ng / μL Cas9 i RNase-fritt vann). Forbered en donor DNA-løsning (20 ng / μL av selvkonstruert plasmid DNA-vektor).
- Filtrer donor DNA-oppløsningen gjennom et sterilt sprøytefilter med en 0,22 μm porestørrelse. Bland like store mengder CRISPR-løsning og filtrert donor-DNA-løsning. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av hver er 25 ng / μL crRNA, 100 ng / μL tracrRNA, 100 ng / μL Cas9 og 10 ng / μL donor-DNA. Denne blandingen vil heretter bli referert til som RNPD.
MERK: Ved kutting av to steder, for eksempel under produksjon av floxed mus, må konsentrasjonen av hvert crRNA være 25 ng / μL. Donor-DNA er et sirkulært plasmid-DNA og kan renses med et vanlig mini-prep-spinnkolonnesett (se materialtabell). Den klargjorte oppløsningen må legges på is og brukes til mikroinjeksjon så snart som mulig.
- Filtrer donor DNA-oppløsningen gjennom et sterilt sprøytefilter med en 0,22 μm porestørrelse. Bland like store mengder CRISPR-løsning og filtrert donor-DNA-løsning. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av hver er 25 ng / μL crRNA, 100 ng / μL tracrRNA, 100 ng / μL Cas9 og 10 ng / μL donor-DNA. Denne blandingen vil heretter bli referert til som RNPD.
3. Innhenting av muszygoter ved naturlig parring
- Injiser 5 IE drektig hoppes serumgonadotropin (PMSG, se materialfortegnelse) subkutant i C57BL/6J hunnmus (10-25 uker) 3 dager før mikroinjeksjon. Ca. 46-48 timer senere, administrer 5 IE humant choriongonadotropin (hCG, se materialtabell) intraperitonealt. Hus PMSG- og hCG-behandlede hunnmus med hannmus C57BL/6J og sjekk vaginalpluggene neste morgen.
MERK: Omtrent 15-25 zygoter kan fås fra en kvinnelig C57BL/6J-mus. Tidslinjen er vist i figur 1. - Forbered to 35 mm petriskåler for zygotekultur, som vist i figur 2. Legg dem i inkubatoren (37 °C, 5% CO2) til bruk. Disse kan lagres over natten.
- Avlive hunnmusene med bekreftede vaginalplugger ved cervikal luksasjon, og skjær gjennom bukhuden og muskellaget fra midtlinjen i underlivet til under ribbeina ved hjelp av en liten saks.
MERK: Følg anbefalingene fra den lokale dyreetiske komiteen for avlivning. - Samle oviduktene og legg dem i en dråpe M2 medium på 20 μl som inneholder 0,75 mg/ml hyaluronidase (se materialfortegnelse) på lokket på petriskålen. Plukk opp en ovidukt med fin spisstang og perfuser ca. 50 μL M2 medium med hyaluronidase gjennom fimbriae.
MERK: På dette tidspunktet er zygotene løst omgitt av mange cumulusceller. - Etter 30 s, plukk opp morfologisk normale zygoter med en liten mengde medium ved hjelp av en glasskapillær og vask dem ved å overføre dem til friske M16 mediumdråper. Overfør de vasket zygotene til en petriskål (figur 2) for sammenslåing.
MERK: Tidslinjen er vist i figur 1. Morfologisk normale zygoter har en mannlig og kvinnelig pronucleus og to polare legemer som ikke har alvorlig kompromittert den sfæriske formen15. Morfologien til zygoten varierer betydelig mellom stammer og arter. - Gjenta trinn 3.3 og 3.4 til alle zygotene er hentet. Omtrent 100 zygoter kan samles i en M16-dråpe i kulturretten. Oppbevar fatet i inkubatoren (37 °C, 5% CO2) til mikroinjeksjon.
4. Klargjøring av mikroinjeksjonskanylen
- Trekk noen glasspipetter med den programmerbare pipettetrekkeren (se Materialfortegnelse).
MERK: Mikroinjeksjonsnåler må ha en tynn spiss og lang taper. Hvis avtrekkeren har et program for å lage nåler for intracytoplasmatisk spermieinjeksjon, kan det samme programmet brukes til å lage nåler til mikroinjeksjon. - Bryt spissen av mikroinjeksjonsnålen ved å treffe glasskulen som er festet til mikrosmiespissen. Forsikre deg om at størrelsen på spissen på mikroinjeksjonsnålen er ca. 1 μm i diameter. Sjekk spissstørrelsen under et mikroskop ved 1000x forstørrelse.
- Bøy mikroinjeksjonsnålen ca. 2-3 mm fra spissen ved hjelp av en mikrosmie.
NOTAT: Vinkelen på svingen avhenger av oppsettet av mikromanipulatoren. For mye bøyning vil redusere effektiviteten til piezopulsen.
5. Zygote mikroinjeksjon
- Injiser 1-1,5 cm av operasjonsvæsken (treghetslegeme som er nødvendig for at piezoeffekten skal lage hull som et alternativ til kvikksølv, se materialfortegnelse) i midten av mikroinjeksjonsnålen og fest den til den manuelle mikroinjektorholderen med piezoaktuatoren.
- Fest også holdekanylen til den motsatte manuelle mikroinjektorholderen. Beveg operasjonsvæsken til spissen av mikroinjeksjonsnålen med gradvis trykk. Fest begge de manuelle mikroinjektorholderne på mikromanipulatoren.
MERK: Operasjonsvæsken som kommer ut av tuppen av mikroinjeksjonsnålen kan observeres under et mikroskop ved 50x forstørrelse. Etter justering av mengden væske som slippes ut, kan sprut av væske observeres når piezopulser påføres, og bekrefter at piezopulser er effektive. Hvis dette ikke kan bekreftes, klargjøres mikroinjeksjonsnålen på nytt.
- Fest også holdekanylen til den motsatte manuelle mikroinjektorholderen. Beveg operasjonsvæsken til spissen av mikroinjeksjonsnålen med gradvis trykk. Fest begge de manuelle mikroinjektorholderne på mikromanipulatoren.
- Forbered et injeksjonskammer med tre dråper: (1) 10 μL M2 medium; (2) 5 μL 12% polyvinylpyrrolidon (PVP) i M2 medium; og (3) en 5 μL blanding av crRNA, tracrRNA, Cas9 protein og Donor DNA (RNPD) løsning. Dekk dråpene med mineralolje på samme måte som trinn 3.2 og sett injeksjonskammeret på det omvendte mikroskoptrinnet.
- Under det inverterte mikroskopet ved en 50x forstørrelse, senk mikroinjeksjonspipetten ned i 12% PVP-dråpen. Aspirer og dispenser 12% PVP for å rengjøre innsiden av mikroinjeksjonsnålespissen og overføre den til RNPD-dråpen.
- Sett den manuelle mikroinjektoren under undertrykk og sug opp RNPD-oppløsningen i mikroinjeksjonsnålen. Vent noen minutter til et tilstrekkelig volum er aspirert; Under et mikroskop forstørret 50x, fyll hele innsiden av mikroinjeksjonsnålen med væske.
- Stopp inntaket og la RNPD-løsningen bli utvist gradvis ved å sette den manuelle mikroinjektoren til positivt trykk. Beveg spissen av mikroinjeksjonskanylen inn i oljen.
NOTAT: Vri knappen på den manuelle mikroinjektoren mot klokken for innånding. For å stoppe innånding, drei knappen med urviseren og øk trykket gradvis mens du observerer under et mikroskop. RNPD-løsningen vil bli gradvis drenert. Væskenivåbevegelse i mikroinjeksjonsnålen gjør det mulig å bekrefte utstrømningen.
- Stopp inntaket og la RNPD-løsningen bli utvist gradvis ved å sette den manuelle mikroinjektoren til positivt trykk. Beveg spissen av mikroinjeksjonskanylen inn i oljen.
- Sett 50 zygoter i M2-dråpen og senk holdepipetten forsiktig ned i samme dråpe. Overfør mikroinjeksjonsnålen til M2-dråpen som inneholder zygoter. Bytt til et 20x objektiv og fokuser på tuppen av mikroinjeksjonspipetten.
MERK: Sett så mange zygoter som kan injiseres på 10 minutter. - Hold en zygote og fokuser på pronucleus ved å flytte mikromanipulatoren. Sett mikroinjeksjonsnålen inn i zygoten og bring spissen nær pronucleus. Når spissen når pronucleusmembranen, bruk piezopulsen (intensitet: 6-10, hastighet: 1) for å stikke hull.
- Når mikroinjeksjonsnålen punkterer pronucleus, injiser RNPD-løsningen og observer hevelsen av pronucleus. Når pronucleus er fullt oppblåst, trekk raskt ut nålen. Utfør samme prosedyre på både kvinnelige og mannlige pronuclei.
MERK: Oppblåsningen av pronucleus ved injeksjon kan tydelig ses under mikroskopet. Graden av denne inflasjonen er vanskelig å verbalisere, men kan bekreftes ved å referere til tidligere rapporter15.
- Når mikroinjeksjonsnålen punkterer pronucleus, injiser RNPD-løsningen og observer hevelsen av pronucleus. Når pronucleus er fullt oppblåst, trekk raskt ut nålen. Utfør samme prosedyre på både kvinnelige og mannlige pronuclei.
- Flytt den injiserte zygoten til et annet sted i M2-dråpen for å identifisere zygotene før og etter injeksjonen.
- Gjenta trinn 5,5-5,6 til alle zygotene i M2-dråpen er injisert. Etter injeksjonen, overfør zygotene til en frisk M16-tallerken.
- Velg de overlevende zygotene 10 minutter etter injeksjon. Fjern de lyserte zygotene som er skadet av injeksjonen, og fordel overlevde zygoter til hver dråpe i M16-fatet. Hver dråpe må inneholde 20-24 zygoter for en pseudogravid kvinne. Dette reduserer tiden M16-parabolen blir utsatt for miljøet utenfor inkubatoren under embryooverføring.
MERK: Under optimale injeksjonsforhold er overlevelsesraten 90% -95%. Dette avhenger av størrelsen på nålespissen, styrken på piezopulsen og utstrømningstrykket til RNPD-løsningen.
6. Embryooverføring til ovidukten
- For å oppnå pseudogravide mus, parer hver kvinnelig ICR-mus i proøstrusfasen med en vasoligert mannlig ICR-mus. Sjekk pluggene dagen etter.
MERK: Omtrent 15 pseudogravide mus er oppnådd fra 20 parringspar. - Administrer tre typer blandingsanestetika (0,2 mg/kg medetomidin, 4,0 mg/kg midazolam og 2,5 mg/kg butorfanol, se materialfortegnelse) subkutant til pseudodrektige hunnmus. Bekreft passende anestesi ved en reduksjon i respirasjonsfrekvensen og forsvinningen av tilbaketrekningsrefleksene for haleklype og bakbenpedal. Påfør oftalmisk salve for å smøre øynene i henhold til lokale anbefalinger fra dyreetiske komiteer.
- Etter barberhøvelbarbering av musens dorsale region i utsatt stilling og desinfisering av operasjonsområdet tre ganger, vekslende mellom jod- eller klorhexidinbasert skrubb og alkohol, snitt dorsalhuden ca. 1 cm langs ryggraden med liten dissekerende saks.
- Skift det dorsale snittsåret til den ene siden ventralt, snitt muskellaget gjennom hvilket eggstokken kan ses, ta tak i fettet over eggstokken med pinsett, og trekk ut eggstokken, ovidukten og livmoren.
- Fest fettet med en serraffineklemme (se materialfortegnelse). Plasser reproduksjonsvevet på sterilt gasbind for å unngå direkte kontakt med pelsen.
- I følgende rekkefølge, plasser en liten mengde kulturmedium (M2 eller M16), noen luftbobler som en markør og zygotene i en pipette for overføring.
MERK: Overfør ca. 10-12 zygoter per ovidukt. - Gjør et snitt ved hjelp av et mikroskjær (se materialtabell) mellom ampulla og fimbriae av ovidukten (akkurat lang nok til at glasspipetten kan komme inn), introduser zygotene i snittet, og bekreft samtidig at luftboblen er innført.
- Utfør implantasjonen i den andre ovidukten på samme måte (trinn 6.6).
- Sutur den ytre huden med autoclips (se Materialfortegnelse).
MERK: Ikke sutur det snittede muskellaget med mindre snittsåret er uunngåelig stort. Den ideelle størrelsen på det snittede muskellaget bør være mindre enn 2-3 mm. Hvis snittet er større enn 5 mm, skal muskellaget sutureres ved hjelp av en sterilisert suturnål og tråd (se materialfortegnelse).
7. Dyr utvinning
- Administrer atipamezolhydroklorid (0,3 mg/kg) subkutant til mus.
MERK: Følg anbefalingene fra den lokale dyreetiske komiteen for postoperativ analgesi. - Deretter plasserer du musene i bur og holder dem varme på en kokeplate ved 37 °C.
- Etter at musene er vekket, hold dem varme i ca 2 timer. Etter å ha bekreftet ingen unormal oppførsel av musene, returner burene til avlsstativet.
Representative Results
Produksjonsresultatene av genkassettinnslag og floxede mus ved bruk av denne protokollen er vist i tabell 1 og tabell 2. Målgenene ble ikke oppgitt fordi hver genomredigerte muselinje for tiden brukes i et uavhengig, upublisert prosjekt. I stedet ble målkromosomregionene beskrevet.
Genotypingsanalysene ble utført med tidligere rapportert metode18. I denne genotypingsmetoden regnes ikke mus der donor-DNA settes inn i utilsiktede kromosomale steder som positive individer, selv om ønsket genomredigering induseres. Derfor ble produksjonseffektiviteten til grunnleggermusene som virkelig er nyttige for faktiske formål vist, i stedet for effektiviteten til selve genomredigeringen.
Median produksjonseffektivitet for 13 uavhengige genkassett-inn-mus var 20,8 %, med maksimalt 39,5 % og minimum 7,9 % (tabell 1). Denne effektiviteten ble vurdert som tilstrekkelig praktisk. Eventuelle dødelige embryonale gener ble ikke målrettet under genkassetten. Median fødselsrate under denne ikke-dødelige genmålrettingstilstanden var 34,0 % (maksimalt 43,3 % og minimum 15,9 %). Siden dette er sammenlignbart med fødselsraten i embryooverføring uten genetisk manipulasjon, vurderte vi at toksisiteten til de introduserte genomredigeringselementene og den fysiske skaden av zygote mikroinjeksjon var usannsynlig å påvirke embryonal utvikling.
Median produksjonseffektivitet hos de 10 uavhengige floxed musene var 7,7 %, med maksimalt 20,7 % og minimum 2,1 % (tabell 2). Selv om funksjonene til flere målgener var ukjente, var median fødselsrate 30,2%, med maksimalt 43,8% og minimum 17,3%. Denne frekvensen var sammenlignbar med den for genkassett-knock-in mus, noe som tyder på at mikroinjeksjonsoperasjonen har en ubetydelig effekt på den embryonale utviklingen av floxed mus.
Figur 1: Tidslinje for zygote mikroinjeksjon. Hvit og mørk farge viser henholdsvis lys og mørk syklus. Musene ble opprettholdt under en 14 timers lys / 10 h mørk syklus. PMSG: gravid hoppes serum gonadotropin; hCG: humant choriongonadotropin Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tilberedning av kulturretter . (A) Kulturskål for zygotene før injeksjonen. Legg to dråper M16 medium (20-25 μL for hver) i en 35 mm plast petriskål. (B) Dyrkningsfat for zygotene etter injeksjonen. Plasser 10 dråper (10-20 μL for hver dråpe) M16 i en 35 mm plast petriskål. Dråper er dekket med mineralolje (3 ml). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Målrettet kromosomal region | Antall | Innstikkslengde (kb) | Homologisk armlengde (kb) | ||||||
| Embryo | Nyfødte | Undersøkt (avvenning) | Innslag m/o rTG | rTGc | |||||
| Injisert | Overført | 5' arm | 3' arm | ||||||
| 2qE2 | 349 | 331 | 114 (34,4 %)a | 114 | 9 (7,9 %)b | 5 (4,4 %)d | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 2qE2 | 231 | 215 | 78 (36,3 %)a | 74 | 15 (20,3 %)b | 23 (31,1 %)d | 2.2 | 1.0 | 1.1 |
| 5qG2 | 288 | 262 | 90 (34,4 %)a | 81 | 19 (23,5 %)b | 18 (22,2 %)d | 1.6 | 2.0 | 2.0 |
| 6qB1 | 278 | 259 | 58 (22,4 %)a | 46 | 11 (23,9 %)b | 11 (23,9 %)d | 4.2 | 1.2 | 1.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 295 | 277 | 97 (35,0 %)a | 23 | 2 (8,7 %)b | 4 (17,4 %)d | 6.5 | 1.1 | 3.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 246 | 219 | 87 (39,7 %)a | 83 | 22 (26,5 %)b | 18 (21,7 %)d | 5.8 | 1.1 | 3.0 |
| 7qF5 | 279 | 268 | 116 (43,3 %)a | 114 | 45 (39,5 %)b | 44 (38,6 %)d | 1.4 | 3.1 | 1.0 |
| 11qB4 | 405 | 353 | 56 (15,9 %)a | 47 | 8 (17,0 %)b | 12 (25,5 %)d | 1.7 | 1.0 | 0.8 |
| 11qD | 310 | 294 | 100 (34,4 %)a | 98 | 15 (15,3 %)b | 76 (77,6 %)d | 1.0 | 1.8 | 2.4 |
| 12qE | 368 | 320 | 86 (26,9 %)a | 84 | 12 (14,3 %)b | 19 (22,6 %)d | 3.4 | 1.1 | 1.3 |
| 12qF1 | 315 | 265 | 76 (28,7 %)a | 72 | 17 (23,6 %)b | 28 (38,9 %)d | 1.0 | 1.1 | 1.1 |
| 14qE5 | 256 | 215 | 48 (22,3 %)a | 48 | 11 (22,9 %)b | 21 (43,8 %)d | 3.1 | 1.0 | 0.9 |
| 14qE5 | 287 | 285 | 85 (29,8 %)a | 72 | 15 (20,8 %)b | 19 (26,4 %)d | 2.6 | 1.0 | 0.9 |
Tabell 1: Produksjon av innslåtte mus ved mikroinjeksjon. Tabellen viser fødselsraten og effektiviteten av å produsere mus som bærer den tiltenkte knock-in allelen uten (W / O) tilfeldig integrasjon (rTG) av donorens DNA. Det var mulig å få tak i mus med tiltenkt innslagsallel i alle prosjekter. a: Antall nyfødte/antall overførte embryoer; b: Antall innslagsalleler båret mus/antall undersøkte mus; C: Det er ikke sikkert om det finnes et tilsiktet allel; d: Antall rTG-allel båret mus/antall undersøkte mus; rTG: tilfeldig integrasjon av donorvektor. W/O: uten.
| Målrettet kromosomal region | Antall | Floxed lengde (KB) | Homologisk armlengde (kb) | |||||
| Embryo | Nyfødte | Undersøkt (avvenning) | floxed W / O rTG | |||||
| Injisert | Overført | 5' arm | 3' arm | |||||
| 3qC | 325 | 313 | 93 (29,7 %)a | 87 | 9 (10,3 %)b | 1.3 | 1.2 | 1.1 |
| 4qB1 | 210 | 200 | 36 (18,0 %)a | 29 | 6 (20,7 %)b | 1.6 | 1.2 | 0.9 |
| 4qC4 | 272 | 256 | 112 (43,8 %)a | 100 | 5 (5,0 %)b | 2.4 | 1.0 | 1.4 |
| 5qF | 143 | 137 | 40 (29,2 %)a | 40 | 6 (15,0 %)b | 1.8 | 1.0 | 1.1 |
| 5qF | 255 | 227 | 80 (35,2 %)a | 76 | 2 (2,6 %)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 9qE3.1 | 289 | 261 | 80 (30,7 %)a | 77 | 9 (11,7 %)b | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 10qB3 | 284 | 269 | 88 (32,7 %)a | 78 | 3 (3,8 %)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 10qC1 | 243 | 231 | 40 (17,3 %)a | 38 | 4 (10,5 %)b | 2.1 | 1.0 | 1.3 |
| 14qE5 | 390 | 372 | 139 (37,4 %)a | 135 | 5 (3,7 %)b | 1.1 | 0.8 | 0.9 |
| 17qA3.3 | 383 | 374 | 99 (26,5 %)a | 95 | 2 (2,1 %)b | 2.1 | 0.6 | 0.8 |
Tabell 2: Floxed mus produksjon ved mikroinjeksjon. Tabellen viser fødselsraten og effektiviteten av å produsere mus som bærer det tiltenkte floksallelet uten (W/O) tilfeldig integrasjon (rTG) av donorens DNA. Det var mulig å få tak i mus med det tiltenkte floksallelet i alle prosjekter. a: Antall nyfødte/antall overførte embryoer; B: Antall floksallel båret mus/antall undersøkte mus. rTG: tilfeldig integrasjon av eller donorvektor; W/O: uten.
Discussion
I denne studien ble ferske (ikke frosne-tinte) C57BL/6J musezygoter, oppnådd fra naturlig parring, brukt til genomredigering av museproduksjon. Ved å injisere crRNA-tracrRNA-Cas9 og donor-DNA (RNPD) i begge pronuclei av disse zygotene i en cellesyklusfase hvor innbanking er mest sannsynlig, ble genkassett-innslag og floxed mus generert med høy fødselsrate og tilstrekkelig genomredigeringseffektivitet. Den nåværende studien styrker utvidbarheten til SPRINT-CRISPR-metoden15, der den sikrer tilstrekkelig innslagseffektivitet selv i C57BL/6J genetisk bakgrunn, og kan brukes til produksjon av floxed mus.
Elektroporering er en svært generalisert metode for å produsere genomredigerte mus på grunn av de lave kostnadene ved eksperimentelle enheter og det enkle å lære teknikken8. Videre krever i-GONAD-metoden19, der genomredigering gjøres med preimplantasjonsembryoer som eksisterer i ovidukten, ikke en mottakermus. Sammenlignet med disse metodene er den nåværende metoden som presenteres her kostbar og tidkrevende når man forbereder og vedlikeholder et eksperimentelt miljø når det gjelder både maskinvare og programvare. Men når de eksperimentelle fasilitetene er satt opp, kan komplekse genkassetter og floxed mus produseres med bare kommersielt tilgjengelige CRISPR-elementer (crRNA, tracrRNA og Cas9-protein) og en enkel, liten mengde sirkulær plasmidvektor som skal brukes som donor-DNA. Dette betyr at mange komplekse genomredigerte muselinjer kan produseres uten behov for tidkrevende (eller relativt dyre) lsODN 5,6 eller adeno-assosierte virusvektorer20 for å forberede.
I motsetning til den opprinnelige SPRINT-CRISPR-metoden15 ble det brukt friske (frosne-tinte) zygoter. Når du oppnår friske zygoter ved naturlig parring, kan de tekniske feilene ignoreres som kan oppstå under in vitro befruktning eller frysing og tining. Embryomanipulasjonsprosessen kan også fullføres på omtrent en halv dag (figur 1) etter den nåværende tilnærmingen. På den annen side inkluderer noen begrensninger i den nåværende metoden kravet til mange hannmus, løs kontroll av befruktningstidspunktet og den begrensede evnen til å fullstendig forutsi antall zygoter for mikroinjeksjon. Sammenlignet med den opprinnelige SPRINT-CRISPR-metoden kan denne metoden ha høyere fødselsrate (tab 1). Til tross for dette kan det ikke konkluderes med at den nåværende metoden er bedre når det gjelder fødselsrate på grunn av forskjellene i eksperimentlederne, målgener, genetisk bakgrunn og tidspunktet for embryobekreftelse.
Som vist i tabell 1 hadde et stort antall mus i de fleste genkassettprosjektene tilfeldige integrasjonsalleler. Tilfeldig integrasjon må elimineres fordi det kan føre til utilsiktet forstyrrelse av endogene gener og ektopisk ekspresjon av transgener. Utfordringen for fremtiden er å finne eksperimentelle forhold som reduserer antall tilfeldige integrasjonshendelser samtidig som tilstrekkelig innslagseffektivitet opprettholdes.
Nesten all musezygote genomredigering ved hjelp av genomredigeringseffektorer som resulterer i DNA-dobbeltstrengbrudd, vil sannsynligvis indusere utilsiktede mutasjoner på målsteder 9,21. Resultatene av disse utilsiktede mutasjonene på målet er ikke beskrevet her fordi vi ikke er i en situasjon der neste generasjon mus kan styres for å presentere klare bevis på dem. Den beste måten å utelukke bekymringen for forvirring forårsaket av utilsiktet mutagenese på målet, er å skaffe neste generasjon mus ved å parre grunnleggere med villtypemus i stedet for å krysse grunnleggere. I prinsippet er N1-musene som kommer fra dette krysset villtype (WT) på den ene siden av allelet, så hvis det tiltenkte innslagsallelet (KI) oppdages, er de WT/KI heterozygote. Derfor er mutagenese på målet ikke et kritisk problem i laboratoriemusen, som har en relativt rask livssyklus og er et produktivt dyr. Imidlertid vil ytterligere forbedring være nødvendig når denne teknologien brukes på relativt store pattedyr.
Det er bekreftet at denne teknologien kan produsere genkassett-inn-mus i andre innavlede stammer enn C57BL/6J, men et tilstrekkelig antall prosjekter er ikke sikret, og dataene er svært varierende. Denne informasjonen er derfor ikke inkludert i denne studien. Det antas at videre studier om dette emnet vil være nødvendig for å fremme musegenetikk og sykdomsmodellforskning.
Disclosures
Forfatterne har ikke erklært noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av vitenskapelig forskning (B) (19H03142: til SM), vitenskapelig forskning (A) (20H00444: til FS), vitenskapelig forskning (A) (21H04838: til SM), og vitenskapelig forskning på innovative områder "Platform of Advanced Animal Model Support" (16H06276: til ST) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeidelse av manuskript. Vi er takknemlige for Ryoichi Mori for hans nyttige diskusjon om genomredigeringsdesign.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | - | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | - | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | - | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | - | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | - | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | - | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | - | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | - | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | - |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
