Summary
微型猪（迷你猪）是研究人工耳蜗的理想大型动物模型。小型猪的人工耳蜗植入手术可用于提供新型电极阵列和手术方法在类似于人类的生命系统中的安全性和潜在性能的初步证据。
Abstract
人工耳蜗（CI）是治疗重度至重度感音神经性听力损失患者的最有效方法。尽管CI在世界范围内使用，但没有标准模型用于研究患者或具有CI的动物模型的电生理学和组织病理学，或用于评估电极阵列的新模型。具有与人类相似的耳蜗特征的大型动物模型可以为先进和改良的阵列在用于人类之前提供研究和评估平台。
为此，我们用巴马迷你猪建立了标准的CI方法，其内耳解剖结构与人类高度相似。设计用于人类使用的阵列通过圆窗膜植入迷你猪耳蜗，随后采用类似于人类CI受体的手术方法。阵列插入后进行诱发复合动作电位（ECAP）测量，以评估听觉神经的功能。本研究描述了动物的准备、手术步骤、阵列插入和术中电生理测量。
结果表明，用于人类的相同CI可以通过标准化的手术方法轻松植入迷你猪中，并产生与人类CI受体相似的电生理结果。迷你猪可能是一种有价值的动物模型，在将其应用于人类之前，为新型电极阵列和手术方法的安全性和潜在性能提供初步证据。
Introduction
根据世界卫生组织 （WHO） 的数据，全球有超过 10 亿人面临听力损失的风险，据估计，到 2050 年，四分之一的人将遭受听力损失1。在过去的20年中，CI一直是永久性严重和严重感音神经性听力损失（SNHL）患者的最有效干预措施。CI将声音的物理信号转换为生物电信号，从而绕过毛细胞刺激螺旋神经节神经元（SGN）。随着时间的推移，CI的适应症已经扩大，现在包括残余听力，单侧听力损失以及非常年老或年轻人的人2，3，4。同时，开发了完全可植入的CI和先进的阵列5。然而，没有经济上可行的大型动物模型来研究CI的内耳电生理学和组织病理学。缺乏大型动物模型限制了寻求改善CI和深入了解CI对内耳电生理影响的研究。
几种啮齿动物模型已应用于CI研究，如小鼠6，沙鼠7，大鼠8和豚鼠9;然而，形态和电生理反应的特征与人类不同。传统上用于CI研究的动物模型（如猫，豚鼠和其他动物）的耳蜗结构与人类耳蜗结构有很大不同10。尽管已经在猫11 和兔12上进行阵列插入，但由于它们的耳蜗较小，这是通过不是为人类设计的阵列完成的。还探索了几种大型动物模型的CI。羔羊非常适合作为无创伤性人工耳蜗植入的训练模型，但耳蜗的较小尺寸使得无法进行全阵列插入13。灵长类动物可能是最适合CI研究的动物，因为它们在解剖学上与人类相似14，15;但猴子性成熟延迟（4-5年），妊娠期长达165天左右，每只雌性通常每年只产一个后代16。这些原因以及昂贵的成本阻碍了灵长类动物在CI研究中的广泛应用。
相比之下，猪在5-8个月时达到性成熟，妊娠期为~114天，使猪更容易作为大型动物模型进行CI研究16。巴马迷你猪（mini-pigs）起源于1985年中国的一种小型猪种，其遗传背景众所周知。它们的特点是固有的小尺寸、早的性成熟、快速繁殖和易于管理17。迷你猪是耳科和听力学的理想模型，因为它在形态学和电生理学上与人类相似18。巴马迷你猪的鼓膜长度为38.58毫米，接近人类10的36毫米长度。迷你猪耳蜗有3.5圈，与人类10的2.5-3圈相似。除了形态，巴马迷你猪的电生理学也与人类高度相似18。因此，在本研究中，我们通过圆窗膜将设计用于人类的阵列插入迷你猪耳蜗中，并遵循与人类CI受体类似的手术方法。应用术中ECAP测量来评估手术。我们在此描述的过程既可用于与CI相关的临床前转化研究，也可用于住院医师培训的平台。
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Protocol
所有程序和动物手术均按照解放军总医院伦理委员会的指导方针进行，并获得了批准。
1.麻醉和手术准备
- 肌肉注射猪（雄性，2个月大，5公斤）用替他明和唑拉西泮，剂量为10-15mg / kg，并用5.5法式气管插管插管插管。通过呼吸机辅助呼吸和异氟烷吸入来维持麻醉。使用连接到猪舌头的心电监护仪的脉搏血氧饱和度（>90%）、呼吸（15-20/分钟）和心率（60-120次/分钟）监测血氧饱和度（15-20次/分钟）。
- 将迷你猪放在恒温调节的加热垫上（当右侧要植入时）左侧位置以防止体温过低。使用各种刺激确认猪已充分麻醉。确保无所有反应（例如，脚趾捏反射）。将人工泪膏涂抹在迷你猪的眼睛上，以防止角膜干燥。使用医用贴片保持眼睛闭合。
- 剃除耳垂周围的手术区域，保持直径10厘米（图1），并用三支碘和酒精的棉签从中心向外以圆周运动进行消毒。用无菌手术窗帘覆盖手术区域。
- 用无菌塑料套管盖住显微镜，并取下覆盖目镜和物镜的部件。
2. 外科手术
- 将耳蜗的表面投影部位定位在耳垂水平的耳后沟后面 1 cm 处。使用#15手术刀以投影部位为中心，做一个长约5厘米的耳后切口。用微型剪刀分割皮下组织，腮腺和胸锁乳突肌，以暴露乳突骨的表面（图2A）。必要时使用双极烧灼术以尽量减少出血。
- 皮质乳突切除术
- 在乳突骨上耳蜗的表面投影处钻乳突（图2B）到外耳道（EAC），外耳道致密且呈淡蓝色（图2C）。注意不要损坏面神经背侧到EAC的苍白或红色垂直段，以避免出血（图2C）。
注意：如果面神经受损，双相烧灼是止血的不错选择。
- 在乳突骨上耳蜗的表面投影处钻乳突（图2B）到外耳道（EAC），外耳道致密且呈淡蓝色（图2C）。注意不要损坏面神经背侧到EAC的苍白或红色垂直段，以避免出血（图2C）。
- 通过钻后骨EAC周围的骨来暴露鼓室（图2D）。用皮下注射针将EAC的皮肤和面神经分开，以避免损伤面神经。小心地将EAC的皮肤推开，露出鼓室（包括听小链）和圆窗壁龛（图3A）。
- 露出圆窗膜。用小金刚石毛刺去除圆窗壁龛，并保持连续的吸灌以暴露耳蜗和圆窗膜的基底转弯（图3B）。
- 修复接收器包。分离颅顶肌，形成一个刚好足够大的口袋供接收器使用。将内部接收器包放入肌肉口袋中，并用固定缝合线固定。
- 用锋利的显微手术刀打开圆窗膜，并使用微镊子缓慢、稳定、连续地插入阵列，以相对于耳蜗的模式插入阵列，将其连接到固定在肌肉口袋中的接收器（图 3C）。用可吸收缝合线2-0缝合手术切口。
- ECAP 测量
注意：该设置由一台带有MAESTRO软件的PC组成，通过刺激装置（MAX编程接口）和CI线圈连接到患者的人工耳蜗（CI）。- 通过皮肤将 CI 线圈磁性连接到 CI 接收器。在ECAP测量之前，使用MAESTRO软件自动执行的CI遥测功能确认CI的完整性并检查所有通道的电极阻抗（图4A，B）。
- 如前所述进行 ECAP 测量19.选择ECAP模块，选择所有12个电极进行刺激，然后等待电极的ECAP测试完成。请参阅 材料表 ，了解用于测量 ECAP 响应的软件和刺激设备。使用相位持续时间为 30 μs 的双相刺激刺激所有 12 个电极进行 ECAP 测量，采用交替极性范式，平均超过 25 次迭代，刺激速率为 45.1 脉冲/秒。
3. 术后护理
- 继续监测迷你猪，以避免因无意识运动而造成伤害，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。将迷你猪放在恒温调节的加热垫上，以防止体温过低。
- 将迷你猪单独放回其家笼中。
- 注射抗生素以预防术后感染 7 天。
- 检查迷你猪是否有前庭损伤的症状，如眼球震颤、盘旋或翻身。
4. 术后CT扫描
- 向迷你猪肌内注射3%戊巴比妥钠1ml/kg和0.1ml/kg萝卜硫素以诱导麻醉。使用37°C的加热板保持温暖。3或5分钟后，可以进行CT扫描。
- 为了确认电极阵列的正确位置，在手术后1周用替他明和唑拉西泮麻醉迷你猪。使用3D切片器图像计算平台执行CT扫描和3D重建20 （参见 材料表）。导入CT的DICOM数据并进行 体积渲染 模块，实现CI的3D图像。
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Representative Results
CI的完整性（图4A）和阻抗（图4B）由MAESTRO软件确认。ECAP结果表明，所有12个电极都表现出良好的神经反应（图4C），这意味着电极阵列很好地连接到耳蜗轴并刺激听觉神经。 图5 显示了术后3D重建的右耳蜗电极线圈。阵列未折叠或脱臼。电极阵列盘绕在耳蜗的基底转弯处（图5A），电极呈现为绿色（图5B）。3D重建表明电极阵列螺旋盘绕在耳蜗中（图5C）。
图1：耳蜗的手术位置和表面投影。 麻醉猪处于左侧位置。白色虚线圆圈表示耳蜗的表面投影：耳垂水平的耳后沟后面 1 厘米。比例尺 = 2 厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图2：皮质乳突切除术 。 （A）做耳后切口，将皮下组织、腮腺和胸锁乳突肌分开，露出乳突骨表面。（B）在乳突骨上耳蜗的表面投影处钻乳突。（C）暴露EAC和面神经的垂直段。（D）钻孔后EAC周围的骨头以露出EAC的皮肤。比例尺 = （A） 1 厘米，（B，C） 0.5 厘米，（D） 0.1 厘米。缩写：EAC = 外耳道。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：暴露鼓室。 （A） 向前推 EAC 的皮肤并暴露鼓室。中耳、矽音、镫骨以及圆形窗龛的地标必须清晰可见。（B）拆下圆窗壁龛，露出圆窗膜。（C）通过圆窗膜插入术中电极。比例尺 = （A） 0.5 厘米、（B） 0.2 厘米、（C） 0.1 厘米。缩写：EAC = 外耳道。请点击此处查看此图的大图。
图 4：12 个电极的 CI 和 ECAP 结果的遥测 。 （A） CI 的完整性测试。（B） 电极阻抗测试。（C） 所有 12 个电极的 ECAP 结果。缩写：CI = 人工耳蜗;ECAP = 诱发的复合动作电位。 请点击此处查看此图的大图。
图5：电极的术后CT 3D重建（协奏曲F28的电极）。 （A）电极阵列盘绕在耳蜗的基底转中。（B） 电极呈现为绿色。（C）三维重建表明电极阵列在耳蜗中螺旋盘绕。比例尺 = 10 mm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
世界上约有15%的人口患有一定程度的听力损失，超过5%的人口患有致残性听力损失21。对于患有严重和重度感音神经性听力损失的成人和儿童患者，CI 提供是最有效的治疗方法。作为第一个成功的植入式颅神经刺激器，在过去的20年中，CI为成千上万的听力损失者提供了重返声音世界并（重新）融入主流社会的机会。尽管CI现在与它们原来的外观和功能大不相同，但CI研究仍然缺乏类似于人类的大型动物模型。一个经济且易于访问的大型动物模型将提供重要的电生理和组织病理学信息，这些信息不容易或合乎道德地直接从人类获得。
目前正在研究几种取决于CI的生物电处理方法。Guo等人22发现，通过CI的电声刺激可以促进神经干细胞增殖并分化为神经元。此外，生长激素23、神经胶质细胞系衍生神经营养因子 （GDNF）24 和脑源性神经营养因子 （BDNF）25 等多种因子已被证明可促进神经突延伸或提高 SGN 的存活率。这些结果可能会给SGN变性患者带来希望，他们可能无法从CI使用中受益。
然而，上述可能改善CI性能的有希望的研究是在 体外 或小动物模型上进行的。在对活人进行实验之前，必须在大型动物模型上进行实验。因此，本文描述的方案演示了如何在巴马迷你猪中进行人工耳蜗植入。使用这种动物模型的最大优点是，可以在动物身上研究与人类相同的设备，即设备或剂量不需要放大或缩小。
与豚鼠或小鼠的人工耳蜗植入不同，豚鼠在自主呼吸动物中进行全身麻醉就足够了，巴马迷你猪的人工耳蜗植入在手术时间和方案方面与人类相似。肌内注射替他明和唑拉西泮，剂量为10-15mg/kg。麻醉成功诱导后，气管插管和异芴呼吸机辅助呼吸对于确保术中麻醉深度至关重要。
成功公开圆形窗口有两个关键步骤。首先是手术过程中动物的位置。在动物的脖子下方以横向位置放置一个垫子有助于清楚地暴露乳突骨。第二种是确定耳蜗在乳突表面的投影区域，乳突位于耳垂水平的耳后沟后面1厘米处（图1）。在该部位钻乳突可以方便地进入EAC和面神经。
两个重要的解剖标志，EAC和面神经的垂直段，有助于识别中耳。面神经呈红色或苍白，而EAC的皮肤呈蓝色（图2D）。应切除后骨 EAC，并小心地将 EAC 的皮肤向前推，以露出鼓室。圆窗壁龛遮蔽圆窗膜（图3A）。用钻头去除壁龛暴露膜（图3B）。面神经可能会阻塞圆窗膜，在这种情况下，必须切断面神经以暴露膜。切断面神经会导致大量出血并遮挡手术视野。应使用双极凝血来止血。与人类的人工耳蜗植入手术不同，植入物固定在颅骨上的骨沟中，我们将植入物固定在肌肉口袋中，因为迷你猪的头骨比人类的头骨薄。将接收器固定在头骨顶部应避免因两侧碰撞而损坏，因为猪经常用头部两侧摩擦笼子。
本文描述的程序可以应用于新型阵列的研究以及生物疗法和基因疗法与CI相结合。由于本研究中使用的猪听力正常，因此很难观察到术后对声音的反应（例如，食物的哨声）。作为未来研究的主题，我们的目标是建立一系列方法来观察猪对CI传输的声音的反应。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金（第81970890号）和重庆市科研机构绩效激励项目（第19540号）资助。我们感谢MED-EL公司的Anandhan Dhanasingh和Zhi Shu的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm diamond burr | |||
| 1 mm diamond burr | |||
| 5 mm diamond burr | |||
| 2-0 suture silk | |||
| 3D Slicer image computing platform | 3D reconstruction of CT image | ||
| Alcohol | |||
| Bipolar cautery | |||
| Bipolar electrocoagulation | Stop bleeding | ||
| CI designed for human use (CONCERTO FLEX28) | MED-EL | Concerto F28 | |
| Dressing forceps | |||
| ECG monitor | |||
| Iodine tincture | |||
| Isoflurane | 3.6 mL/h | ||
| Laryngoscope | |||
| MAESTRO Software | MED-EL | Measure ECAP responses | |
| Micro forceps | |||
| Micro spatula | |||
| Mosquito forceps | |||
| Needle holder | |||
| Needle probe | |||
| Negative pressure suction device | |||
| Otological surgical instruments | |||
| Respiratory Anesthesia Machine | |||
| Scalpel with blade No. 15 | |||
| Scissors | |||
| Shaver | |||
| Stimulation device (MAX Programming Interface) | MED-EL | Measure ECAP responses | |
| Surgery microscope | Leica | ||
| Surgical drill | |||
| Surgical Power Device | |||
| Tiletamine and zolazepan | 10-15 mg/kg | ||
| Tissue forceps | |||
| Trachea cannula |
References
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