Summary
Здесь описан подробный протокол генерации высокообогащенных культур астроцитов, полученных из разных областей центральной нервной системы постнатальных мышей и их прямого преобразования в функциональные нейроны путем принудительной экспрессии факторов транскрипции.
Abstract
Прямое нейрональное перепрограммирование — это мощный подход к генерации функциональных нейронов из различных популяций стартовых клеток без прохождения через мультипотентные промежуточные продукты. Данная методика не только имеет большие перспективы в области моделирования заболеваний, так как позволяет преобразовывать, например, фибробласты пациентов, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, в нейроны, но и представляет собой перспективную альтернативу клеточной заместительной терапии. В этом контексте крупным научным прорывом стала демонстрация того, что дифференцированные неневральные клетки в центральной нервной системе, такие как астроциты, могут быть преобразованы в функциональные нейроны in vitro. С тех пор прямое перепрограммирование астроцитов в нейроны in vitro дало существенное представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе принудительного преобразования идентичности, и препятствиях, которые препятствуют эффективному перепрограммированию. Однако результаты экспериментов in vitro, проведенных в разных лабораториях, трудно сравнивать из-за различий в методах, используемых для выделения, культивирования и перепрограммирования астроцитов. Здесь мы описываем подробный протокол надежного выделения и культивирования астроцитов с высокой чистотой из разных областей центральной нервной системы мышей в постнатальном возрасте с помощью магнитной сортировки клеток. Кроме того, мы предоставляем протоколы для перепрограммирования культивируемых астроцитов в нейроны посредством вирусной трансдукции или трансфекции ДНК. Этот оптимизированный и стандартизированный протокол может быть использован для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе поддержания идентичности клеток, установления новой нейронной идентичности, а также генерации конкретных подтипов нейронов и их функциональных свойств.
Introduction
Центральная нервная система млекопитающих (ЦНС) очень сложна, состоит из сотен различных типов клеток, включая огромное количество различных нейронных подтипов 1,2,3,4,5,6. В отличие от других органов или тканей 7,8,9, ЦНС млекопитающих обладает очень ограниченной регенеративной способностью; потеря нейронов после черепно-мозговой травмы или нейродегенерации необратима и часто приводит к двигательному и когнитивному дефициту10. Стремясь спасти функции мозга, различные стратегии по замене потерянных нейронов находятся под интенсивным исследованием11. Среди них прямое перепрограммирование соматических клеток в функциональные нейроны становится перспективным терапевтическим подходом12. Прямое перепрограммирование, или трансдифференцировка, представляет собой процесс преобразования одного дифференцированного типа клеток в новую идентичность без прохождения через промежуточное пролиферативное или плюрипотентное состояние 13,14,15,16. Впервые идентифицированный MyoD1 как фактора, достаточного для преобразования фибробластов в мышечные клетки17,18, этот метод был успешно применен для перепрограммирования нескольких типов клеток в функциональные нейроны 19,20,21.
Астроциты, наиболее распространенная макроглия в ЦНС22,23, являются особенно перспективным типом клеток для прямого нейронного перепрограммирования по нескольким причинам. Во-первых, они широко и равномерно распределены по всей ЦНС, обеспечивая обильный локо-источник для новых нейронов. Во-вторых, астроциты и нейроны тесно связаны между собой в развитии, так как у них общий предок во время эмбрионального развития, радиальные глиальные клетки24. Общее эмбриональное происхождение двух типов клеток, по-видимому, облегчает преобразование нейронов по сравнению с перепрограммированием клеток из разных зародышевых слоев19,21. Кроме того, информация о паттернах, унаследованная астроцитами через их радиальное происхождение глии, также поддерживается во взрослых астроцитах 25,26,27 и, по-видимому, способствует генерации регионально подходящих нейронных подтипов 28,29,30. Следовательно, исследование и понимание преобразования астроцитов в нейроны является важной частью достижения полного потенциала этой техники для клеточных стратегий замещения.
Превращение культивируемых in vitro астроцитов в нейроны привело к нескольким прорывам в области прямого нейронного перепрограммирования, в том числе: i) идентификация факторов транскрипции, достаточных для генерации нейронов из астроцитов 15,19,31, ii) разгадка молекулярных механизмов, вызванных различными факторами перепрограммирования в одном и том же клеточном контексте 32 и iii) подчеркивая влияние развития астроцитов на индуцирование различных нейронных подтипов 28,29,33. Кроме того, прямое преобразование астроцитов in vitro раскрыло несколько основных препятствий, которые ограничивают прямое нейрональное перепрограммирование34,35, таких как увеличение производства активных форм кислорода (АФК)34 и различия между митохондриальным протеомом астроцитов и нейронами35. Следовательно, эти наблюдения решительно поддерживают использование первичных культур астроцитов в качестве модели для прямого нейронного перепрограммирования для исследования нескольких фундаментальных вопросов в биологии12, связанных с поддержанием идентичности клеток, препятствиями, препятствующими изменениям судьбы клеток, а также ролью метаболизма в перепрограммировании.
Здесь мы представляем подробный протокол выделения астроцитов у мышей в постнатальном (P) возрасте с очень высокой чистотой, что продемонстрировано выделением астроцитов из мышиного спинного мозга29. Мы также предоставляем протоколы для перепрограммирования астроцитов в нейроны посредством вирусной трансдукции или трансфекции плазмид ДНК. Перепрограммированные клетки могут быть проанализированы через 7 дней после трансдукции (7 DPT) для оценки различных аспектов, таких как эффективность перепрограммирования и морфология нейронов, или могут поддерживаться в культуре в течение нескольких недель, чтобы оценить их созревание с течением времени. Важно отметить, что этот протокол не специфичен для астроцитов спинного мозга и может быть легко применен для выделения астроцитов из различных других областей мозга, включая серое вещество коры, средний мозг и мозжечок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующая процедура соответствует руководящим принципам по уходу за животными Helmholtz Zentrum Munich в соответствии с директивой 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях. Пожалуйста, убедитесь, что вы соблюдаете рекомендации по уходу за животными в учреждении, где проводится вскрытие.
1. Подготовка материалов для вскрытия, диссоциации и культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все реагенты для культивирования в шкафу биологической безопасности и работайте с использованием только автоклавного или стерильного оборудования. Реагенты для рассечения и диссоциации могут быть приготовлены вне шкафа биологической безопасности.
- Готовят колбы для культивирования, покрывая колбу для культивирования T25 поли-D-лизином (запас 1 мг/мл; рабочий раствор 20 мкг/мл) вH2Oв течение не менее 2 ч. После этого смойте 3 раза H2O и высушите на воздухе.
- Приготовьте буфер рассечения, добавив 5 мл буферного раствора 1 M HEPES к 500 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS).
- Подготовьте одну С-трубку (см. Таблицу материалов) на шесть спинных мозгов, добавив 1950 мкл буфера X из набора диссоциации нервной ткани (см. Таблицу материалов). Хранить на льду во время рассечения. Готовят мастер-микс ферментативного пищеварения, добавляя 20 мкл буфера Y и 10 мкл буфера А на С-трубку (часть набора диссоциации нервной ткани; см. Таблицу материалов). Хорошо перемешать и хранить при 4 °C до необходимости.
- Приготовьте 1x фосфатного буферного физиологического раствора (1x PBS) с кальцием и магнием и поместите на лед. Готовят основную питательную среду, добавляя 5 мл пенициллин-стрептомицина (конечная концентрация, 100 Ед/мл), 5 мл 45% D-глюкозы и 5 мл добавки глутамина (конечная концентрация 2 мМ; см. Таблицу материалов) к 485 мл DMEM/F12. Базовая среда стабильна при 4 °C в течение 4 недель.
- Готовят культуральную среду астроцитов путем добавления 1 мл добавки B27 и 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 44 мл основной питательной среды. Добавляйте среду с эпидермальным фактором роста (EGF) и основным фактором роста фибробластов (bFGF) (по 10 нг/мл). Добавьте EGF и bFGF непосредственно перед использованием в соответствующее количество среды.
- Для рассечения ткани спинного мозга используйте пару больших щипцов с изогнутым кончиком, пару маленьких щипцов с изогнутым кончиком, одну пару маленьких щипцов, пару маленьких ножниц и небольшой шпатель.
2. Выделение астроцитов
- Изолируют астроциты из спинного мозга постнатальных мышей для выполнения их прямого перепрограммирования в функциональные нейроны (рисунок 1А). Для этого протокола соберите ткань спинного мозга у мышей на 2-3 день после рождения. Соберите шесть-восемь спинных мозгов для выделения астроцитов. Используйте этот же протокол для выделения астроцитов из других областей нервной системы, таких как кора, средний мозг и мозжечок. Для этих областей получают клетки через пять-семь дней после рождения.
ПРИМЕЧАНИЕ: При цели выделения астроцитов из областей, не упомянутых в настоящем протоколе, следует экспериментально определить возраст и исходный материал.
3. Рассечение тканей спинного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение ткани может быть выполнено вне шкафа биологической безопасности.
- Жертвоприношение мышей при Р2-Р3 путем обезглавливания без обезболивания животного. Поместите туловище в 35-миллиметровую чашку Петри и держите на льду.
- Откройте кожу ножницами, удалите позвонок мелкими ножницами, извлеките спинной мозг и поместите его в буфер рассечения на льду. Под стереотаксическим рассеченным микроскопом с 2-кратным увеличением удалите мозговые оболочки из изолированных спинных мозгов с помощью щипцов и перенесите рассеченную и очищенную ткань спинного мозга в С-трубку.
4. Магнитно-активированная сортировка ячеек (MACS)
- Добавьте 50 мкл фермента Р из набора диссоциации нервной ткани (см. Таблицу материалов) и 30 мкл предварительно приготовленной ферментной смеси в каждую С-трубку. Переверните С-трубки и поместите их на нагретый диссоциатор (см. Таблицу материалов), убедившись, что вся ткань собрана в крышке трубки.
- Запустите программу диссоциации 37_NTDK_1 со временем выполнения около 22 минут. Незадолго до окончания программы поместите сетчатый фильтр 70 мкм (см. Таблицу материалов) на количество трубок объемом 15 мл, равное количеству используемых С-трубок, и предварительно смочите ситечко 2 мл ледяного PBS. Храните 1x PBS на льду в течение всей процедуры MACS.
- После завершения программы удалите С-трубки и ненадолго центрифугируйте их, чтобы собрать ткань в нижней части трубок. Перенесите диссоциированную ткань из С-трубок в 15 мл пробирок, приготовленных путем пропускания ее через ситечко. Оставьте ситечко на пробирках по 15 мл.
- Промойте С-трубку 10 мл 1x PBS, чтобы собрать оставшуюся ткань и собрать ее в ту же 15 мл трубку, пройдя через ситечко еще раз. Центрифугируют пробирки объемом 15 мл, содержащие диссоциированную ткань при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага охладите центрифугу до 4 °C. - Удалить супернатант, не нарушая клеточную гранулу, перед повторным использованием клеток в 80 мкл 1x PBS; добавить 10 мкл блокирующего реагента из мышиного анти-ACSA-2 MicroBead kit (см. Таблицу материалов). Аккуратно перемешать путем пипетки.
- Инкубировать при 4 °C в течение 10 мин в темноте (холодильник). Добавьте 10 мкл антиастроцитарных микрошариков, связанных с антигеном 2-й поверхностью клеток (см. Таблицу материалов) и аккуратно перемешайте путем пипетирования. Инкубировать в течение 15 мин при 4 °C в темноте.
- Промыть ячейки, добавив 3 мл 1x PBS и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C. Во время центрифугирования соберите магнитный сепаратор (см. Таблицу материалов), поместив соответствующее количество магнитных сортировочных колонн (см. Таблицу материалов) на сепаратор с трубкой сбора 15 мл внизу. Промойте колонны 500 мкл 1x PBS.
- Удалите супернатант и повторно суспендируйте ячейки в 500 мкл 1x PBS перед переносом суспензий клеток в магнитные колонны. Дайте стекать под действием силы тяжести. Промойте 15 мл пробирки с 500 мкл 1x PBS и нанесите на колонку. Мыть колонны с 500 мкл 1x PBS для дополнительных двух стирок.
- Элюируют клетки, удаляя колонку из сепаратора, добавляя 800 мкл культуральной среды астроцитов и выталкивая клетки из колонны включенным плунжером.
- Пластинчатые клетки в предварительно приготовленные колбы для культивирования добавляют 4,2 мл культуральной среды астроцитов, дополненной EGF и bFGF и культурой при 37 °C и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие колб культуры не является необходимым для астроцитов, выделенных из других областей мозга, но обеспечивает лучший субстрат для астроцитов, выделенных из спинного мозга. - Культивировать клетки в течение примерно 7 дней до слияния (80%-90%). Если клетки не сливаются через 7 дней, подождите до 10 дней, прежде чем обмазывать их. Через 10 дней клетки больше не размножаются, и эффективность перепрограммирования снижается.
5. Посев астроцитов для перепрограммирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены под шкафом биологической безопасности с уровнем безопасности 1 (SL1).
- Подготовьте 24-луночные пластины со стеклянными крышками с поли-D-лизином так же, как ранее готовили колбы для культивирования. Чтобы определить необходимое количество пластин, учтите, что астроциты покрыты плотностью 5-5,5 х 104 клетки на лунку в 24-луночной пластине. Обычно выделение шести спинных мозгов у мышей P2 дает около 1 x 106 клеток.
- Аспиратные среды из колб культуры Т25, содержащих культивируемые астроциты, и промывают однократно 1x PBS. Отделяют астроциты от колбы для культивирования путем добавления 0,5 мл 0,05% трипсина/ЭДТА и инкубируют при 37 °C в течение 5 мин. Осторожно постучите по боковой стороне колбы, чтобы освободить клетки от поверхности колбы культуры, и проверьте отслоение под микроскопом яркого поля с помощью 10-кратного увеличения.
- Прекратить трипсинизацию 2,5 мл культуральной среды астроцитов и собрать клеточную суспензию в пробирках по 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин, аспират супернатант и повторное суспендирование клеток в 1 мл культуральной среды астроцитов. Рассчитайте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированной системы подсчета клеток.
- Исходя из количества клеток, разводят клеточную суспензию свежей астроцитарной средой для получения раствора 1-1,1 х 105 клеток на мл. Дополните среду EGF и bFGF по 10 нг/мл на фактор. Добавляют 500 мкл клеточной суспензии, эквивалентной 5-5,5 х 104 ячейкам, в каждую лунку предварительно подготовленных 24-луночных пластин и культуральных клеток при 37 °C и 5% CO2.
6. Принудительное выражение факторов транскрипции
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к протоколу, важно правильно спроектировать эксперимент. В частности, важно всегда включать отрицательный контроль за перепрограммированием, а именно состояние, при котором не выражен фактор перепрограммирования. Например, при использовании векторов, несущих кДНК для коэффициента перепрограммирования и репортера (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), DsRed), отрицательный контроль представлен тем же вектором, несущим только репортер. При выражении множества факторов, несущих разных репортеров, отрицательный контроль должен быть соответствующим образом скорректирован.
- На следующий день после нанесения покрытия осмотрите 24-луночные пластины, чтобы убедиться, что ячейки прилипли к покровам.
- Исходя из экспериментальной цели и имеющихся ресурсов, принудительная экспрессия факторов перепрограммирования может быть достигнута путем вирусной трансдукции (см. шаг 6.3) или трансфекции ДНК (см. шаг 6.4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ретровируса или лентивируса требует одобрения государственных органов и должно выполняться в рамках кабинета биологической безопасности в лаборатории с уровнем безопасности 2 (SL2). - Перепрограммируйте астроциты путем трансдукции клеток ретровирусом или лентивирусом, несущим генетическую информацию, для экспрессии интересующего фактора (факторов) перепрограммирования, как описано ниже.
- Трансдуцировать клетки с высоким титром вируса 1 х 1010-1 х 1012 частиц / мл путем добавления 1 мкл клеточной суспензии непосредственно в астроцитарную среду. Это обеспечивает высокий уровень заражения. Культивируйте клетки с астроцитарной средой, содержащей вирусные частицы при 37 °C, в течение 24-36 ч, прежде чем переходить к разделу 7 или разделу 8, в зависимости от цели эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные промоторы могут быть использованы для управления экспрессией трансгенов (см. также Репрезентативные результаты). Конститутивные промоторы (например, ЦМВ, ЦАГ) индуцируют экспрессию трансгена раньше, чем индуцируемые промоторы; однако оба типа промоторов были успешно использованы для перепрограммирования клеток в нейроны.
- Трансдуцировать клетки с высоким титром вируса 1 х 1010-1 х 1012 частиц / мл путем добавления 1 мкл клеточной суспензии непосредственно в астроцитарную среду. Это обеспечивает высокий уровень заражения. Культивируйте клетки с астроцитарной средой, содержащей вирусные частицы при 37 °C, в течение 24-36 ч, прежде чем переходить к разделу 7 или разделу 8, в зависимости от цели эксперимента.
- Плазмиды ДНК также могут быть введены в астроциты посредством трансфекции ДНК, как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано под шкафом биологической безопасности, утвержденным для SL1.- Перед трансфекцией получают трансфекционный реагент, плазмидную ДНК нужных конструкций, свежую астроцитарную среду и сывороточно-восстановленную среду (см. Таблицу материалов). Рассчитайте необходимое количество среды, восстановленной в сыворотке крови (см. Таблицу материалов), учитывая, что каждая скважина 24-луночной пластины требует 300 мкл сывороточно-восстановленной среды. Добавьте соответствующее количество среды, восстановленной в сыворотке, в пробирку объемом 50 мл и нагрейте ее до 37 °C.
- Когда сывороточная среда будет теплой, аспирируйте астроцитарную среду из всех лунок и соберите ее в трубку объемом 50 мл. Отфильтруйте собранную астроцитарную среду шприцевым фильтром 0,45 мкМ для удаления отсоединенных клеток.
- Добавьте равный объем свежей астроцитарной среды в фильтрованную среду для получения раствора, достаточного для добавления 1 мл астроцитарной среды на лунку. Поддерживать кондиционированную среду астроцитов в инкубаторе при 37 °C до момента использования (этап 6.4.9).
ПРИМЕЧАНИЕ: Культуральная среда используется повторно, поскольку она содержит несколько секретируемых факторов, которые поддерживают жизнеспособность культуры. - Добавьте 300 мкл предварительно нагретой среды, восстановленной в сыворотке, в каждую лунку и поместите 24-луночную пластину обратно в инкубатор.
- Готовят раствор А, состоящий из ДНК и сывороточно-восстановленной среды. Для каждой лунки используют в общей сложности 0,6 мкг ДНК и добавляют ее к 50 мкл среды, восстановленной в сыворотке крови. Хранить раствор А при комнатной температуре до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, учитывается техническое утроение для каждого условия. Поэтому получают смесь, достаточную для 3,5 реакции (например, 2,1 мкг общей ДНК, разбавленной в 175 мкл сывороточно-восстановленной среды), чтобы обеспечить достаточное количество материала для трансфекции трех лунок 24-луночной пластины. - Готовят раствор В, состоящий из трансфекционного реагента и сывороточно-восстановленной среды. На каждую лунку добавляют 0,75 мкл трансфекционного реагента к 50 мкл сывороточно-восстановленной среды. Поскольку это решение является общим для всех условий трансфекции, приготовьте его оптом, чтобы уменьшить изменчивость между трансфекциями.
- Инкубировать раствор В при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавьте раствор В к раствору А по капле за каплей в соотношении 1:1 и аккуратно перемешайте. Не вихрь. Инкубировать раствор А+В в течение 20-30 мин при комнатной температуре под вытяжкой.
- Повторите этап 6.4.5-6.4.7 для всех условий трансфекции. Через 20-30 мин добавляют раствор А+В к каждой лунке капля за каплей для окончательного объема 100 мкл. Аккуратно встряхните пластину и поместите клетки обратно в инкубатор при 37 °C в течение 4 ч.
- Через 4 ч удаляют трансфекционную среду и добавляют 1 мл предварительно подогретой астроцитарной кондиционированной среды, приготовленной на стадии 6.4.3. Поддерживайте клетки в течение 36-48 ч, прежде чем приступить к разделу 7 или разделу 8, в зависимости от цели эксперимента.
7. Перепрограммирование астроцитов (анализ за 7 дней)
- Подготовьте среду дифференцировки нейронов, добавив 1 мл добавки B27 к 49 мл основной питательной среды (см. шаг 1.4). Через 24-48 ч, в зависимости от того, были ли клетки трансдуцированы или трансфектированы (см. шаги 6.3 и 6.4 соответственно), заменить астроцитарную среду 1 мл нейрональной дифференцировочной среды на лунку и культивировать клетки при 37 °C и 9% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки также могут храниться при 5% CO2 , если инкубатор с 9% CO2 недоступен. Однако нейронное перепрограммирование более эффективно в этих условиях. - Необязательно: Для повышения эффективности перепрограммирования дополните нейрональную дифференцировочную среду Форсколином (конечная концентрация 30 мкМ) и Дорсоморфином (конечная концентрация 1 мкМ) при замене астроцитарной среды на дифференцировальную среду. При выборе лечения клеток Форсколином и Дорсоморфином, предоставьте вторую дозу Дорсоморфина через 2 дня после первоначального лечения. Добавьте эту вторую обработку непосредственно в культуральную среду.
- Прямое перепрограммирование мышиных астроцитов в нейронные клетки обычно происходит в течение 7 дней после изменения среды. Следовательно, через 7 дней после начала нейронального перепрограммирования зафиксируйте или соберите клетки для последующего анализа.
8. Перепрограммирование астроцитов в зрелые нейроны (долгосрочные культуры)
- Подготовьте среду дифференцировки нейронов, добавив 1 мл добавки B27 к 49 мл основной питательной среды (см. шаг 1.4). Через 24-48 ч, в зависимости от того, были ли клетки трансдуцированы или трансфектированы (см. этапы 6.3 и 6.4 соответственно), заменить астроцитарную среду 1 мл нейрональной дифференцировочной среды, дополненной форсколином (конечная концентрация 30 мкМ) и дорсоморфином (конечная концентрация 1 мкМ) на лунку и культивировать клетки при 37 °C и 9% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки также могут храниться при 5% CO2 , если инкубатор с 9% CO2 недоступен. Однако нейронное перепрограммирование более эффективно в этих условиях. - Повторное лечение дорсоморфином через 2 дня после первоначального лечения, добавляя его непосредственно в среду дифференцировки нейронов.
- Через 7 дней с начала нейронального перепрограммирования готовят среду созревания, добавляя 6 мкл N2, 1,2 мкл NT3 (запас 20 мкг/мл), 1,2 мкл BDNF (запас 20 мкг/мл), 1,2 мкл GDNF (запас 20 мкг/мл) и 1,2 мкл цАМФ (запас 100 мММ) до 189,2 мкл среды дифференцировки нейронов. Дополнить нейронную дифференцировочную среду, присутствующую в каждой лунке, 200 мкл среды созревания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда созревания дополняется только для первой обработки. Все последующие процедуры проводятся путем частичной замены среды дифференцировки нейронов, как описано ниже. - Повторяют лечение малыми молекулами, удаляя 200 мкл нейрональной дифференцировочной среды и добавляя 200 мкл свежей среды созревания два раза в неделю в течение 6 недель. Во время созревания используйте клетки для электрофизиологических экспериментов (как правило, на 21-й день или позже) или фиксируйте для последующего анализа (например, иммунофлуоресценции).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первичные культуры астроцитов обычно достигают 80-90% слияния между 7-10 днями после MAC-сортировки и покрытия (рисунок 1B). Как правило, одна колба для культивирования T25 дает около 1-1,5 х 106 клеток, что достаточно для 20-30 покровных пластинок при посеве клеток при плотности 5-5,5 х 104 клеток на лунку. На следующий день после нанесения покрытия клетки обычно покрывают 50%-60% поверхности покрова (рисунок 1C). На этом этапе культуры состоят почти исключительно из астроцитов, в то время как другие типы клеток, такие как нейробласты, практически отсутствуют (рисунок 1D)29.
Факторы перепрограммирования могут быть доставлены к астроцитам либо через ретровирусную или лентивирусную трансдукцию, либо через трансфекцию плазмид ДНК. Обычно вирусная трансдукция заражает больше клеток по сравнению с трансфекцией. Поскольку прямая конверсия нейронов вызывает значительное количество гибели клеток34,35, ретровирусная или лентивирусная трансдукция предпочтительна для максимизации количества клеток для анализа. Для контроля экспрессии факторов перепрограммирования могут быть использованы различные промоторы: конститутивные (например, ЦМВ, CAG)15,32, индуцируемые (например, Tet-чувствительные элементы, Tet-ON)21 или специфические для типа клетки (например, промотор GFAP)36,37. При использовании конститутивных или клеточных специфических промоторов астроциты начинают экспрессировать обнаруживаемые уровни трансгенов, оцениваемые флуоресцентной репортерной экспрессией (например, GFP, DsRed), в течение 24 ч после доставки гена, причем каждая клетка независима от других. И наоборот, индуцируемые промоторы позволяют синхронизировать экспрессию трансгенов через трансдуцированные клетки, поскольку они активируются после добавления небольшой молекулы (например, доксициклина) в культуральную среду. Обнаруживаемые уровни факторов транскрипции обычно достигаются через 18-20 ч после активации промотора. В большинстве случаев пик экспрессии фактора перепрограммирования достигается примерно через 48 ч, при этом лентивирусно-опосредованная экспрессия занимает немного больше времени.
В то время как транскрипционные изменения после экспрессии факторов перепрограммирования могут быть обнаружены уже через 4 ч32, устойчивые изменения происходят через 24 ч и позже29,32. Морфологические изменения следуют за транскрипционными изменениями, и первые признаки конверсии могут наблюдаться примерно через 3 дня после трансдукции / трансфекции (3 DPT). При 7 DPT индуцированные нейрональные клетки четко отличимы от астроцитов: их сома меньше контрольного или неперепрограммированного астроцитов, у них длительные процессы, и они положительны для нейронального маркера βIII-tub и отрицательны для маркера астроцитов GFAP (рисунок 1E). Тем не менее, стоит отметить, что некоторые клетки могут быть либо положительными как для GFAP, так и для βIII-tub, предполагая, что нейронная программа была индуцирована, но идентичность астроцитов не была ингибирована, либо отрицательной для обоих маркеров, что указывает на подавление идентичности астроцитов, но отсутствие индукции нейронного каскада. В любом случае клетки обычно поддерживают морфологию астроцитов.
Для более функционального анализа, такого как электрофизиология или оценка генерируемых нейронных подтипов, культуры обычно поддерживают в течение как минимум 21 DPT и обрабатывают средой созревания. При 21 DPT многие индуцированные нейроны способны возбуждать потенциалы действия и положительны для зрелого нейронального маркера NeuN, а также для пансинаптического белка Synaptophysin29 (рисунок 1F).
Рисунок 1: Обзор культуры астроцитов и перепрограммирования. (A)Временная шкала прямого преобразования астроцитов в нейрон. Каждая черная линия представляет собой важный шаг в протоколе. (B) Репрезентативные изображения культивируемых астроцитов спинного мозга после 7 дней в культуре. Снимки были сделаны с помощью ярко-полевого микроскопа и 10-кратного объектива. Шкала бара представляет собой 100 мкм. (C) Репрезентативные яркие изображения астроцитов спинного мозга через 1 день после повторного покрытия при плотности 5,5 х 104 клеток на лунку в 24-луночной пластине. Снимки были сделаны с помощью яркого микроскопа и 10-кратного объектива. Шкала представляет собой 100 мкм. (D) Иммунофлуоресцентное изображение тройного окрашивания βIII-tub, Sox9, GFAP на астроцитах, зафиксированное через 1 день после покрытия для демонстрации чистоты культуры. Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10 мин и промывали дважды 1x PBS. Клетки блокировали с помощью 3% BSA, 0,5% Triton-X 100 в 1x растворе PBS. Первичные антитела разбавляли в надлежащей концентрации (например, анти-GFAP 1:250; анти-βIII-ванна 1:250; анти-Syp1 1:500) в блокирующем растворе и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Клетки промывали три раза 1x PBS и инкубировали с флуорофор-конъюгированными вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Крышки были промыты три раза с 1x PBS перед монтажом с Aqua Poly/Mount. Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа и 40-кратного объектива. Шкала представляет собой 20 мкм. (E) Иммунофлуоресцентное изображение βIII-ванны, двойного окрашивания DsRed для демонстрации превращения астроцита в нейрон с Ascl1 после 7 DPT. Протокол иммунофлуоресценции и получения изображения был таким, как описано выше. Шкала представляет собой 20 мкм. (F) Иммунофлуоресцентные изображения тройного окрашивания βIII-tub, DsRed, Synaptophysin 1 (Syp1) для демонстрации зрелости нейронов после 21 DPT перепрограммирования с Ascl1. Протокол иммунофлуоресценции и получения изображения был таким, как описано выше. Шкала представляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первичные культуры мышиных астроцитов представляют собой замечательную модельную систему in vitro для изучения прямого перепрограммирования нейронов. Фактически, несмотря на то, что они изолированы на постнатальной стадии, клетки экспрессируют типичные маркеры астроцитов29, сохраняют экспрессию генов паттернов 28,29 и сохраняют способность к пролиферации, аналогично астроцитам in vivo в сопоставимом возрасте38 лет. После MACS-опосредованной изоляции клетки сначала прилипают к колбе, а затем начинают пролиферировать, давая начало высокообогащенным культурам астроцитов29. Важно отметить, что культивируемые астроциты не дедифференцируются в состояние мультипотентных клеток и не увековечиваются. Кроме того, они не спонтанно генерируют нейроны после экспрессии репортерного белка (например, DsRed или GFP), но сохраняют идентичность астроцитов. Кроме того, они не размножаются бесконечно, а скорее замедляют их распространение и переход в более зрелую стадию, что снижает их прямой потенциал перепрограммирования нейронов32,39.
В этом протоколе есть несколько критических шагов: во-первых, важно тщательно изолировать интересующую область и удалить любые загрязняющие ткани. Например, для подготовки астроцитов спинного мозга из позвонков извлекают спинной мозг и аккуратно удаляют ганглии дорсального корешка (ДРГ). Во-вторых, конверсионные клетки подвергаются значительной гибели клеток34, что оказывает негативное влияние на трансдуцированные клетки и общую культуру из-за стимуляции фагоцитоза окружающими астроцитами, а также измененной осмолярности среды. Поэтому важно заменить астроцитарную среду адекватным объемом дифференцировочной среды (обычно 1 мл/лунку 24-луночной пластины). Кроме того, трансфекция плазмидной ДНК является простым и более доступным подходом по сравнению с вирусной трансдукцией, которая требует утвержденной комнаты клеточной культуры уровня безопасности 2. Однако скорость трансфекции и эффективность перепрограммирования ниже по сравнению с вирусно-опосредованной доставкой факторов перепрограммирования. Таким образом, трансфекция может быть использована в качестве быстрого метода для проверки потенциала перепрограммирования новых факторов-кандидатов или для скрининга пулов факторов. Что касается созревания нейронов, перепрограммированные клетки обычно становятся электрофизиологически активными примерно через 3 недели. Хотя обработка клеток небольшими молекулами не требуется, она увеличивает как выживаемость, так и созревание перепрограммированных клеток, что приводит к более высокой плотности индуцированных нейронов и более зрелой морфологии.
Хотя описанный способ выделения и культивирования астроцитов является надежным и надежным, необходимо учитывать несколько аспектов. Во-первых, в то время как обычные методы, основанные на механической диссоциации ткани, дают в целом большее количество клеток в культуре на 40 рассеченныхтканей, подход, отсортированный MAC, требует рассечения ткани от шести до восьми детенышей для выделения достаточного количества клеток для последующих экспериментов. Кроме того, выделение астроцитов основано на экспрессии АТФазы Na+/K+, транспортирующей субъединица белка бета2 (Atp1b2), распознаваемой антителом ACSA-241. В принципе, астроциты, не экспрессирующие Atp1b2, будут потеряны в препарате, что вызовет смещение в препарате. Хотя мы не можем исключать, что это так, наш анализ протекания MACS показал, что немногие клетки в отрицательной фракции были иммунореактивными для маркеров астроглии Sox9, что свидетельствует о высокой эффективности протокола сортировки MAC. Второе предостережение относительно Atp1b2 связано с его выражением. Atp1b2 специфически экспрессируется астроцитами на постнатальной стадии, в то время как во взрослом мозге мыши экспрессируют его другие типы клеток, в частности миелинизирующие олигодендроциты и эпендимальные клетки27. Поэтому для выделения астроцитов из мозга взрослых требуется тщательное рассечение интересующей области и этап удаления миелина.
По сравнению с другими методами выделения астроцитов, подход на основе MACS обеспечивает высокую чистоту культур (>90% клеток Sox9+) и обеспечивает стандартизированную процедуру выделения астроцитов из разных областей ЦНС. Это особенно важно при сравнении культур из разных областей ЦНС, так как чистота культуры, полученная классической механической диссоциацией, может значительно различаться (>80% GFAP+/DAPI из кортикального серого вещества, ~50% GFAP+/DAPI из спинного мозга)15,29. Стандартизированный протокол уменьшает такую изменчивость и обеспечивает общую отправную точку для экспериментов по перепрограммированию in vitro. Это позволяет, например, систематически сравнивать молекулярную идентичность астроцитов из разных областей28,29 и исследовать влияние происхождения развития на эффективность перепрограммирования и подвидовую идентичность индуцированных нейронов.
Таким образом, прямое нейронное перепрограммирование in vitro оптимизированных культур астроцитов является очень мощным подходом к разгадке универсальных, а также специфических для региона молекулярных механизмов преобразования астроцитов в нейроны, предоставляя необходимую информацию для разработки лучших и более эффективных стратегий прямого преобразования in vivo резидентных астроцитов ЦНС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Инес Мюльхан за клонирование конструкций для перепрограммирования, Паулину Хлебик за вирусное производство, а также Магдалену Гётц и Джудит Фишер-Штерняк за комментарии к рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
References
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
