Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Måling av kompressibiliteten til celle og kjerne basert på akustofluidisk mikrodevice

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/64225
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sino-French Institute of Nuclear Engineering and Technology, Sun Yat-sen University

Summary

Her presenteres en protokoll for å bygge et raskt og ikke-destruktivt system for måling av celle- eller kjernekompressibilitet basert på akustofluidisk mikrodevice. Endringer i mekaniske egenskaper av tumorceller etter epitel-mesenkymal overgang eller ioniserende stråling ble undersøkt, og demonstrerte anvendelsesutsiktene for denne metoden i vitenskapelig forskning og klinisk praksis.

Abstract

Cellemekanikk spiller en viktig rolle i tumormetastase, ondartet transformasjon av celler og radiosensitivitet. Under disse prosessene er det ofte utfordrende å studere de mekaniske egenskapene til cellene. Konvensjonelle målemetoder basert på kontakt som kompresjon eller strekking er tilbøyelige til å forårsake celleskade, noe som påvirker målenøyaktigheten og påfølgende cellekultur. Målinger i adherent tilstand kan også påvirke nøyaktigheten, spesielt etter bestråling siden ioniserende stråling vil flate celler og forbedre vedheft. Her er det utviklet et cellemekanisk målesystem basert på akustofluidisk metode. Cellekomprimerbarheten kan oppnås ved å registrere cellebevegelsesbanen under virkningen av den akustiske kraften, som kan realisere rask og ikke-destruktiv måling i suspendert tilstand. Dette papiret rapporterer i detalj protokollene for chipdesign, prøvepreparering, baneopptak, parameterutvinning og analyse. Kompressibiliteten til forskjellige typer tumorceller ble målt basert på denne metoden. Måling av kompressibiliteten til kjernen ble også oppnådd ved å justere resonansfrekvensen til den piezoelektriske keramikken og bredden på mikrokanalen. Kombinert med molekylær nivåverifisering av immunfluorescenseksperimenter ble cellekompressibiliteten før og etter legemiddelindusert epitel til mesenkymal overgang (EMT) sammenlignet. Videre ble endringen av cellekomprimerbarhet etter røntgenbestråling med forskjellige doser avslørt. Den cellemekaniske målemetoden som foreslås i dette papiret er universell og fleksibel og har brede applikasjonsutsikter i vitenskapelig forskning og klinisk praksis.

Introduction

Cellemekaniske egenskaper spiller en viktig rolle i tumormetastase, ondartet transformasjon av celler og radiosensitivitet 1,2. For å få en grundig forståelse av rollen til cellemekaniske egenskaper i prosessen ovenfor, er nøyaktig måling av cellulær mekanikk kritisk, og målingen skal ikke forårsake skade på cellene for etterfølgende kultur og analyse. Måleprosessen bør være så rask som mulig, ellers kan cellens levedyktighet påvirkes hvis celler fjernes fra dyrkingsmiljøet i lang tid.

Eksisterende målemetoder for cellemekanikk står overfor noen begrensninger. Noen metoder, som magnetisk vridningscytometri, magnetisk pinsett og partikkelsporingsmikroreologi, forårsaker celleskader på grunn av innføring av partikler i celler 3,4,5. Metoder som måles ved kontakt med celler, som atomkraftmikroskop (AFM), mikropipetteaspirasjon, mikroinnsnevring og parallellplateteknikk, er også utsatt for celleskader og gjennomstrømningen er vanskelig å øke 6,7,8. I tillegg vil ioniserende stråling flate ut celler og øke deres vedheft9; Det er derfor nødvendig å måle helcellemekanikk i suspensjon.

Som svar på de ovennevnte utfordringene er det utviklet et cellemekanisk målesystem basert på akustofluidisk metode 10,11,12,13,14. Kanalbredden er tilpasset den akustiske halvbølgelengden, og skaper dermed en stående bølgenode ved mikrokanalens midtlinje. Under virkningen av akustisk strålingskraft kan cellene eller standardperlene bevege seg til den akustiske trykknoden. Siden de fysiske egenskapene til standardkulene (størrelse, tetthet og komprimerbarhet) er kjent, kan den akustiske energitettheten bestemmes. Deretter kan cellekompressibiliteten oppnås ved å registrere bevegelsesbanene til celler i det akustiske feltet. Ikke-destruktiv måling av høy gjennomstrømning av celler i suspensjonstilstand kan oppnås. Dette papiret vil introdusere utformingen av den mikrofluidiske brikken, etableringen av systemet og måletrinnene. Måling av ulike typer tumorceller er utført for å verifisere nøyaktigheten av metoden. Anvendelsesområdet for denne metoden hadde blitt utvidet til subcellulære strukturer (som kjerne) ved å justere resonansfrekvensen til den piezoelektriske keramikken og bredden på mikrokanalen. I tillegg ble endringene i cellekomprimerbarhet etter medikamentindusert EMT eller røntgenbestråling med ulike doser undersøkt. Resultatene viser den brede anvendeligheten av denne metoden som et kraftig verktøy for å studere sammenhengen mellom biokjemiske endringer og cellulære mekaniske egenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling og montering av akustofluidisk mikrodevice

  1. Fabrikasjon av mikrofluidisk chip.
    1. Design en enkeltkanalsbrikke med bare ett innløp og utløp som vist i figur 1. For måling av celler, hold det rektangulære tverrsnittet av mikrokanalen på 740 μm bredt og 100 μm dypt. For å måle cellekjernen, endre bredden og dybden på mikrokanalen til henholdsvis 250 μm og 100 μm.
    2. Forbered mikrokanalen på silisiumskive via reaktiv ionetsing. Forsegl toppen av mikrokanalen med et stykke gjennomsiktig varmebestandig glass ved anodisk binding15. Vask sjetongene med en ultralydrenser i 10 min. Tørk dem i en tørkeovn ved 50 °C for senere bruk.
  2. Fremstille polydimetylsiloksan (PDMS) blokker.
    1. Tilsett 30 ml prepolymer til en 100 mm (i diameter) glassfat. Tilsett 3 ml herdemiddel til prepolymeren med en sprøyte.
      MERK: Volumforholdet mellom herdemiddelet og forpolymeren er 1:10.
    2. Bland PDMS prepolymer og herdemiddel kraftig med en glassstang i ca. 10 minutter. Se etter små og jevnt separerte luftbobler i løsningen, noe som indikerer at PDMS prepolymer og herdemiddel er godt blandet.
    3. Plasser glassfatet i en vakuumtørker og evakuer i 15-25 s. Gjenta denne prosessen til det ikke er luftbobler i blandingen.
    4. Plasser glassfatet i en tørkeovn satt til 50 °C i 1 time for å la blandingen herde. Etter inkubasjonen, bruk en skalpell for å kutte PDMS i blokker av passende størrelse ca 1,2 cm lang og 1 cm bred.
      MERK: Lengden på PDMS-blokken er i samsvar med bredden på brikken, og bredden er valgt for å sikre at det er nok plass i midten for den piezoelektriske keramikken når to PDMS-blokker festes på brikken.
  3. Bind PDMS-blokken til brikken.
    1. Hull hull i PDMS-blokken for innløps- og utløpsporter med en 1 mm diameter hul nål. Sett PDMS-blokkene og brikken (med baksiden opp) i en plasmarenser i 1 min.
    2. Juster hullene på PDMS-blokkene med chipinnløpet og utløpet. Trykk forsiktig PDMS-blokkene til brikken i 15 s. Dette bør føre til at det oppstår binding mellom PDMS-blokkene og overflaten av brikken.
  4. Koble kateteret med polytetrafluoretylen (PTFE) til brikken (figur 2B).
    1. Klipp to stykker PTFE-kateter med en indre diameter på 0,8 mm og en lengde på 10 cm. Bøy en nål i rustfritt stål med en indre diameter på 0,7 mm og en lengde på 1,5 cm x 90 ° til en L-form. Koble den til den ene enden av kateteret. Forbered to slike katetre med nåler.
    2. Sett nålene i rustfritt stål inn i hullene i PDMS-blokkene. For innløpet, koble en 19 G dispenserkanyle til den andre enden av kateteret som en kontakt for en sprøyte.
    3. Etter å ha fullført trinnene ovenfor, injiser avionisert vann for å teste tettheten til den totale kanalen. Ugjennomtrengelig for vann betyr en god tetning.
  5. Piezoelektrisk keramisk montering (figur 2C)
    1. Bruk en diamanttrådkutter til å kutte piezoelektriske keramiske ark med en diameter på 2 cm i fire strimler med en bredde på 5 mm.
    2. Forsikre deg om at resonansfrekvensen til den piezoelektriske keramikken samsvarer med bredden på sponmikrokanalen. For den 740 μm og 250 μm brede mikrokanalen, bruk piezoelektrisk keramikk med resonansfrekvenser på henholdsvis 1 MHz og 3 MHz.
    3. Sveis ledninger på begge sider av den piezoelektriske keramikken i den ene enden.
    4. Lim den piezoelektriske keramikken til midten av baksiden av brikken med cyanoakrylatlim.
    5. For å spre limet jevnt, legg en dråpe lim på den piezoelektriske keramikken, glatt limet med en tannpirker og fjern overflødig lim. Trykk deretter raskt på den på brikken og fortsett å trykke i ca 1 min. Sørg for at den piezoelektriske keramikken og brikken er godt bundet og jevnt kontaktet.
  6. Monter mikroenheten (figur 2D).
    1. Klipp et stykke PDMS (ca. 1,5 cm langt og 1 cm bredt) som base av mikroenheten. Bruk dobbeltsidig tape, fest den ene siden av basen til PDMS-blokkene for innløp og utløp, og den andre siden til en gjennomsiktig glassglid. Fest hele mikroenheten til mikroskopstadiet for å holde brikken i ett fokalplan.

2. Prøvepreparering

  1. Fremstilling av polystyren standard partikkelløsninger.
    1. Tilsett 0,05 ml polystyrenpartikkel (6 μm i diameter) oppløsning (2,1 x 108 partikkel/ml) til 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og bland godt.
      MERK: For å redusere målefeilen forårsaket av endringen av den akustiske energitettheten, ble polystyrenpartikkeloppløsningen blandet med prøveløsningen i hvert eksperiment som kalibrering.
  2. Fremstilling av cellesuspensjoner.
    1. Vask de tilhørende cellene (f.eks. MCF7, MDA-MB-231, HCT116) ved 90 % samløp (~5 x 105 celler) med PBS. Tilsett 500 μL 0,25% trypsin (1x) i 1-2 min ved romtemperatur (25 °C). Fjern trypsinet, tilsett 1 ml komplett medium og form en cellesuspensjon ved pipettering.
    2. Sentrifuge cellesuspensjonen ved 100 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender i 0,5-1 ml PBS for å oppnå en cellesuspensjon. Cellene ble talt med et hemocytometer og konsentrasjonen var ca. 3-5 x 105 celler/ml.
  3. Fremstilling av cellekjernesuspensjon
    1. Utfør trinn 2.2. Fjern deretter supernatanten og tilsett 200 μL cytoplasmatisk proteinekstraksjonsreagens A (supplert med 1% PMSF) per 20 μL cellepellet (ca. 5 millioner celler) og bland godt.
    2. Vortex ovennevnte blanding ved 220 x g i 5 s, og legg deretter på isbad i 10 minutter. Etter inkubering, tilsett 10 μL cytoplasmatisk proteinekstraksjonsreagens B til løsningen.
    3. Vortex ved 220 x g for 5 s. Plasser på isbad i 1 min og virvel igjen ved 220 x g i 5 s. Deretter sentrifugerer du til slutt ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
      MERK: Volumforholdet mellom cytoplasmatiske proteinekstraksjonsreagenser A og B er 20: 1.
    4. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml PBS. Sentrifuger deretter ved 1000 x g ved 4 °C i 4 minutter. Fjern supernatanten og resuspender i 100 μL PBS som cellekjernesuspensjon.
    5. Tilsett trypanblått i ovennevnte cellekjernesuspensjon og flekk ved romtemperatur (25 °C) i 4 minutter. Volumforholdet mellom trypanblå oppløsning og kjernesuspensjon er 1:1. Tell antall kjerner under det omvendte mikroskopet med et 10x mål.
      MERK: For å tydelig identifisere cellekjernene under mikroskopet, er det nødvendig med trypanblå farging. Trypanblå oppløsning må være i et 37 °C vannbad i 10 minutter før bruk for effektiv farging.
    6. Fortynn ovennevnte cellekjernesuspensjon med PBS-buffer til en konsentrasjon på 2-3 x 105 kjerne / ml. Filtrer cellekjernesuspensjonen gjennom en 70 μm sil.

3. Måling av komprimerbarheten av celle og kjerne

  1. Definere målesystemet (figur 3)
    1. Slå på lyskilden til mikroskopet og åpne kameraprogramvaren. Bruk 4x-målet for å finne midtposisjonen til mikrokanalen, dvs. posisjonen til den piezoelektriske keramikken.
    2. Koble ledningene og sveis dem til de positive og negative terminalene til signalgeneratorutgangen på henholdsvis den piezoelektriske keramikken.
    3. Plasser sprøyten på mikroinjeksjonspumpen og koble den til innløpskateteret. Plasser en liten beholder på enden av utløpskateteret for å holde væsken som strømmer ut av mikrokanalen.
  2. Bestem måleparametere
    1. Aspirer polystyrenpartikkeloppløsningen med sprøyten og injiser den i chipmikrokanalen. Unngå luftbobler i chipmikrokanalen for å sikre nøyaktig måling. Sørg for at partiklene fordeles jevnt i chipmikrokanalen.
      MERK: Måling kan utføres uten strømnings- eller sprøytepumpe. Om nødvendig bør strømningshastigheten til mikroinjeksjonspumpen settes til en riktig verdi. Her er strømningshastigheten 0-20 μL / t.
    2. Sett utgangen fra signalgeneratoren til et sinussignal med en frekvens på 1 MHz (3 MHz for cellekjernemåling) og topp-til-topp-spenning (Vpp) på 10 V.
    3. Finjuster frekvensen av signalet til det blir observert at partiklene beveger seg mot mikrokanalens midtlinje og forblir i fremoverbevegelse langs midtlinjen etter å ha nådd midtlinjen (figur 4).
      MERK: Hastigheten til partiklene som beveger seg mot midtlinjen bestemmes av spenningsamplituden, som kan justeres mellom 5 Vpp og 20 Vpp.
  3. Mål celler og kjerner
    1. Bland 1 ml celle- eller kjernesuspensjon med standard partikkeloppløsning i forholdet 1: 1 og injiser den i mikrokanalen med en sprøyte.
    2. Start opptak med CCD-kamera når cellene eller kjernene kommer inn i synsfeltet. Slå deretter på signalgeneratoren. Stopp registreringen når cellene eller kjernene når midtlinjen.
    3. Skyll mikrokanalen med avionisert vann, 75% alkohol og avionisert vann i rekkefølge for senere bruk.

4. Databehandling

  1. Kartpartikkel- eller cellebaner.
    1. Importer den innspilte videoen til ImageJ-programvare: Fil > Åpne> Velg mappe. Klikk på ellipseformen i verktøylinjen i ImageJ-programvaren for å velge en celle av interesse og dens tilstøtende partikkel (figur 5).
    2. Som vist i figur 5, forhåndsinnstilte måleparametere i ImageJ-programvare som Analyser→ Angi måling →område, Centroid, Display Label.
    3. Ta rammen der målcellen eller partikkelen gjennomgår langsgående forskyvning som startrammen; Ta opp pikselposisjonen og størrelsen på cellen eller partikkelen i hver ramme til den når midtlinjen til mikrokanalen. Eksporter dataene som en regnearkfil og gjenta trinnet til baner for alle celler av interesse er oppnådd.
  2. Koordinere transformasjon og korreksjon.
    1. Ta opp pikselkoordinatene til de fire hjørnene av mikrokanalen i dette synsfeltet som (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Her x3 = x4.
    2. For hvert målepunkt (xi, yi) beregner du den nye koordinaten (xi', yi') etter rotasjonskorreksjon ved hjelp av følgende formler:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
    3. Konverter pikselkoordinater til koordinater i reell størrelse. De faktiske koordinatene kan oppnås ved å multiplisere pikselkoordinater med forholdet. Forholdet var den faktiske bredden på mikrokanalen delt på pikselbredden (H) til mikrokanalen.
    4. Transformer og korriger pikselkoordinatene til cellene og partiklene oppnådd i trinn 4.1 til de endelige bevegelsesbanedataene. Alle koordinater minus koordinatene til nedre venstre hjørne, dvs. (0, y2). Bildefrekvensen til videoen er 40 bilder per sekund, så multipliser antall bilder som tilsvarer hver koordinat med 0,025 s for å oppnå tidspunktet for partikkelbevegelse, og derved oppnå endringen av posisjonen i y-retningen med tiden.
  3. Beregn den akustiske energitettheten (figur 6A, B).
    1. Bevegelsen av cellen eller partikkelen i Y-retningen drives av den akustiske kraften F ac og hydrodynamisk kraft FD. Beregn bevegelsesbanen ved hjelp av følgende formler:
      Equation 4(1)
      Equation 5(2)
      Equation 6(3)
      hvor r og D er radiusen og diameteren til cellen eller partikkelen, ρ og β er tettheten og kompressibiliteten, ν er hastighetsvektoren. Abonnementene c og f angir henholdsvis celle og væske. d er avstanden fra nærmeste akustiske trykknode, μ er væskens dynamiske viskositet, k er bølgetallet og E er den akustiske energitettheten.
      MERK: Tettheten av MCF7, HCT116, A549 og cellekjerner var 1068 kg / m 3, 1077 kg / m 3, 1073 kg / m 3 og 1155 kg / m 3, henholdsvis 12,16,17.
    2. I henhold til formlene beskrevet i trinn 4.3.1, bruk MATLAB-programvaren for å oppnå den numeriske løsningen for standard partikkelbane under det akustiske feltet med endelig differansemetode.
    3. Innenfor det forhåndsinnstilte akustiske feltområdet endrer du den akustiske energitettheten og tilpasser den numeriske løsningen (oppnådd i trinn 4.3.2) og den målte bevegelsesbanen (oppnådd i trinn 4.2) for standardpartikkelen. Velg det beste tilpasningsresultatet i henhold til den gjennomsnittlige kvadratfeilen for tilpasning. Den akustiske energidensiteten oppnådd her brukes som en parameter for etterfølgende beregning av cellekomprimerbarhet.
  4. Beregn cellekomprimerbarheten (figur 6C, D).
    1. Sett den akustiske energitettheten til verdien oppnådd i trinn 4.3.3.
    2. I henhold til formlene beskrevet i trinn 4.3.1, bruk MATLAB-programvaren for å oppnå den numeriske løsningen for cellebanen under den akustiske feltet med endelig forskjellsmetode.
    3. I likhet med trinn 4.3.3, innenfor det forhåndsinnstilte kompressibilitetsområdet, endrer du komprimerbarheten og passer til den numeriske løsningen (oppnådd i trinn 4.4.2) og den målte bevegelsesbanen for cellen (oppnådd i trinn 4.2). Bruk komprimerbarhetskoeffisienten som tilsvarer det beste tilpasningsresultatet som den målte cellekomprimerbarheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her presenterte arbeidet en protokoll for konstruksjon av et raskt og ikke-destruktivt cellekomprimerbart målesystem basert på akustofluidisk mikrodevice og demonstrerte fordelene ved måling av celle og kjerne under forskjellige situasjoner. Figur 1 viser skjemaet til den mikrofluidiske kanalen. Komponentene og monteringen av den akustofluidiske mikroenheten er vist i figur 2. Figur 3 viser oppsettet av målesystemet. Under virkningen av den akustiske feltkraften vil celler og partikler bevege seg mot mikrokanalens midtlinje, som vist i figur 4A. Måling av størrelse og posisjon av celler eller partikler er vist i figur 5. Beregningen av energitetthet og cellekomprimerbarhet ved tilpasning er vist i figur 6. For å utvide anvendelsesområdet for denne enheten til cellulære organeller, spesielt kjernen, ble høy renhet og intakte kjerner isolert fra celler (figur 7A). Ved å justere resonansfrekvensen til den piezoelektriske keramikken og bredden på mikrokanalen tilsvarende, ble bevegelsesbanen til kjernen oppnådd (figur 4B) og måling av kjernekompressibilitet ble oppnådd (figur 7B).

Basert på dette systemet ble kompressibiliteten til ulike typer kreftceller målt og sammenlignet (figur 8A). I tillegg ble endringene i cellekomprimerbarhet etter medikamentindusert EMT eller røntgenbestråling med ulike doser undersøkt (figur 8B,C). For EMT-induksjon ble vekstfaktor som transformerende vekstfaktor beta (TGFβ), epidermal vekstfaktor (EGF) og grunnleggende fibroblastvekstfaktor (bFGF) brukt. Ved bestråling var dosehastigheten 153 mU/min, og dosene som ble brukt var 1, 2, 4 og 8 Gy. Disse resultatene viser den brede anvendeligheten av denne metoden som et kraftig verktøy for å studere sammenhengen mellom biokjemiske endringer og cellulære mekaniske egenskaper. Viktigst, denne metoden var en ikke-ødeleggelsesmåling. De målte cellene ble samlet og sådd i en cellekulturskål, og det ble funnet at det ikke var noen signifikant forskjell i celleproliferasjon og levedyktighet sammenlignet med den ubehandlede gruppen etter 48 timers kultur, som vist i figur 9, noe som indikerer at målingen ikke har noen effekt på celleproliferasjon og overlevelse.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk diagram over chipmikrokanalen. Dette bildet viser strukturen og dimensjonene til chipmikrokanalen med et enkelt innløp og utløp. Enheten er mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Monteringsfoto for akustofluidisk mikrodevice . (A) Bilder foran og bak av brikken. (B) Dette bildet viser PTFE-kateteret med påsatt 19 G dispenserkanyle og kanyle i rustfritt stål. (C) Dette bildet viser piezoelektrisk keramikk med ledninger sveiset. (D) Dette bildet viser monteringen av den akustofluidiske mikroenheten med base for festing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Oppsett av målesystemet for cellekompressibilitet. Dette bildet viser oppsettet av målesystemet som består av signalgenerator, sprøytepumpe, akustofluidisk mikrodevice, mikroskop og CCD-kamera. Dette tallet er endret fra10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Bevegelsen av celler og kjerner. Denne figuren viser bevegelsen av celler (A) og cellekjerner (B) til midtlinjen av mikrokanalen under virkningen av den akustiske feltkraften. Skala bar = 250 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Måling av størrelsen og posisjonen til en celle eller partikkel ved hjelp av ImageJ-programvare. Denne figuren viser knappeklikket for å hente parametere som område og sentroid i ImageJ-programvaren. Pikselkoordinatene til de fire hjørnene i mikrokanalen ble registrert som (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Pikselbredden ble representert som H. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Beregning av energitetthet og cellekomprimerbarhet ved tilpasning. (A) Gjennomsnittlige kvadrerte feilverdier (LS) ved forskjellige energitettheter. Den akustiske energitettheten ble oppnådd fra det beste passende resultatet. Enheten for energitetthet er J / m3. (B) Denne figuren viser tilpasningen av den numeriske løsningen og den målte bevegelsesbanen for partikkelen. (C) Gjennomsnittlige kvadrerte feilverdier (LS) ved forskjellig cellekomprimerbarhet. Cellekompressibiliteten ble oppnådd fra det beste passende resultatet. (D) Denne figuren viser tilpasningen av den numeriske løsningen og den målte bevegelsesbanen for cellen. Enheten for cellekomprimerbarhet er 10-10 Pa-1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Kjerneutvinning og komprimerbarhetsmåling. (A) Dette bildet viser cellekjernene ekstrahert fra A549-celler sett med et 40x mål. Skalalinje = 20 μm. (B) Dette bildet viser den målte kompressibilitetssammenligningen av A549-celler (N = 38) og deres kjerner (N = 45). Enheten for cellekomprimerbarhet er 10-10 Pa-1. Lengden på boksen representerer standardavviket. Student t-test og khikvadratanalyse ble brukt for å vurdere signifikans. **P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Kompressibiliteten av ulike typer kreftceller og celler etter medikamentindusert EMT eller røntgenbestråling. (A) Cellekomprimerbarheten av ulike typer kreftceller. HCT116 (N = 36), A549 (N = 68) og MDA-MB-231 (N = 32) var cellelinjene i henholdsvis kolorektal karsinom, lungeadenokarsinom og brystadenokarsinom. (B) Cellekomprimerbarheten til MCF7 og A549 før og etter induksjon av EMT. (C) Cellekomprimerbarhet målt ved 3 timer etter bestråling med forskjellige doser. Enheten for cellekomprimerbarhet er 10-10 Pa-1. Sluttstolpene i boxplot representerer henholdsvis 10 % og 90 %. Lengden på boksen representerer standardavviket. Den midterste horisontale linjen representerer medianverdien. ns betyr ingen statistisk signifikans. Student t-test og khikvadratanalyse ble brukt for å vurdere signifikans. *P < 0,05, **P < 0,01. En del av dette tallet er endret fra18,19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: Celleproliferasjon og levedyktighet etter komprimerbarhetsmåling. Denne figuren viser A549-celleproliferasjon (A) og levedyktighet (B) etter komprimerbarhetsmåling. Kontrollgrupper er ubehandlede celler. Testgrupper er cellene som dyrkes i 48 timer etter komprimerbarhetsmåling. Hvert eksperiment har minst tre replikasjoner. For cellens levedyktighet ble minst 300 celler talt. Student t-test og khikvadratanalyse ble brukt for å vurdere signifikans. ns indikerer ikke statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vanlige målemetoder for cellemekanikk er AFM, mikropipetteaspirasjon, mikrofluidikkmetoder, parallellplateteknikk, optisk pinsett, optisk båre og akustiske metoder20. Mikrofluidikkmetoder kan fungere med tre tilnærminger: mikroinnsnevring, ekstensjonsstrømning og skjærstrøm. Blant dem er optisk båre, optisk pinsett, akustiske metoder, ekstensjonsstrøm og skjærstrømningstilnærminger ikke-kontaktmålinger. I motsetning til kontaktmålinger kan ikke-kontaktmålinger effektivt unngå celleskadeproblemet forårsaket av kontakt eller lokal deformasjon. Optisk pinsett er svært følsom for målemiljøet21. Forstyrrelser i optiske forhold kan forårsake betydelige forskjeller i måleresultater, og høy lasereffekt under måling kan også forårsake celleskader. Dessuten har optisk båre og optisk pinsett generelt lav gjennomstrømning20,22. Mikrofluidikkmetoder som ekstensjonsstrøm og skjærstrøm kan ikke måle mikromekanikk av tumorceller direkte23. Sammenlignet med andre metoder har akustiske metoder fordelene med ikke-destruktiv, høy gjennomstrømning og bred anvendelighet ved måling av cellemekanikk.

Målemetoden basert på akustofluidisk mikrodevice designet i denne artikkelen bruker ikke-kontakt akustisk strålingskraft, og den største fordelen er at den ikke skader celler, noe som ble bekreftet av de eksperimentelle resultatene vist her (figur 9). En annen fordel med denne metoden er den høye gjennomstrømningen, som kan justeres ved å endre cellekonsentrasjonen. For tiden kan en målehastighet på ca. 50-70 celler / min oppnås under forutsetning av å sikre nøyaktigheten av etterfølgende dataanalyse. Fordi cellene måles i suspensjon, kan måling av ikke-adherente celler også oppnås, noe som utvider anvendelsesområdet. Videre ble måling av cellekomprimerbarhet etter bestråling oppnådd i denne artikkelen, og sammenhengen mellom cellekomprimerbarhet og bestrålingsdose ble avdekket (figur 8). I tillegg kan måling av celler eller kjerne med forskjellig stivhet også tilpasses ved å justere resonansfrekvensen til den piezoelektriske keramikken og bredden på mikrokanalen. Som vist i figur 7 ble det oppnådd måling av kompressibiliteten til kjernen.

Her ble bare bevegelsen av celler langs lengden og bredden av den mikrofluidiske kanalen vurdert. Cellene ble ansett å være i suspensjon fordi tettheten av cellene er nær væskens. Hvis det var celleoppgjør eller friksjon med bunnen, ville den bli funnet i den påfølgende banetilpasningsprosessen. Slike data vil bli eliminert. For å validere den foreslåtte metoden ble to typer polystyrenperler med forskjellig diameter (6 μm og 10 μm) testet. Perlene med 6 μm diameter ble brukt som kontroll. Komprimerbarheten av perler med 10 μm diameter ble oppnådd som 2,37 ± 0,11 x 10-10 Pa-1, i samsvar med verdien (2,1-2,4 x 10-10 Pa-1) rapportert i en annen undersøkelse 15,24.

Basert på denne metoden ble kompressibiliteten til celler og kjerner målt. Siden kjernen spiller en viktig rolle i mekanosensing og mekanotransduksjon, kan måling av kjernens mekaniske egenskaper bidra til å bedre forstå hvordan de reagerer på ekstern stimulans som ioniserende strålingsindusert DNA-skade (figur 8). Videre viste eksperimenter at cellekomprimerbarhet kan tjene som en ny indikator for overvåking av EMT-prosessen (figur 8), som viser applikasjonsutsiktene i kreftdiagnose. Siden den akustiske strålingskraften er relatert til cellestørrelse, celletetthet og komprimerbarhet, kan denne metoden også brukes til celleisolasjon som separasjon av sirkulerende tumorceller (CTC) eller deres klynger fra blodprøven. CTC og deres klynger spiller en viktig rolle i tidlig påvisning av metastatiske svulster og overvåking av strålebehandlingseffekt25,26. Derfor har denne metoden gode kliniske anvendelsesutsikter i tidlig screening av kreft og effektevaluering.

Det er verdt å merke seg at nøkkelfaktoren som påvirker målingen av denne metoden er matchingen av resonansfrekvensen med mikrokanalens bredde, noe som resulterer i utseendet til en stående bølgenode ved mikrokanalens midtlinje. Samtidig bør det tas hensyn til liming av piezoelektrisk keramikk. I tillegg, for å nøyaktig identifisere og spore banen til celler eller partikler og unngå problemet med celleaggregering på grunn av vedheft, bør gjennomstrømningen ikke være for høy. Hvordan endringer i andre parametere (som cellestørrelse, celletetthet, etc.) påvirker måling av kompressibilitet har blitt studert i tidligere arbeid18. Videre, når du måler cellekjerner, på grunn av deres mykhet, er det nødvendig med en stor akustisk strålingsdrivkraft for å få dem til å bevege seg jevnt til mikrokanalens midtlinje, og krever dermed et raskt kamera for å fange banene nøyaktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant nummer 12075330 og U1932165) og Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen, Kina (Grant nummer 2020A1515010270).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin(1x) GIBCO 15050-065
502 glue Evo-bond cyanoacrylate glue
A549 ATCC CCL-185 lung adenocarcinoma
Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit Beyotime P0027 Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  corning 10-013-CVRC
Fetal Bovine Srum(FBS) AUSGENEX FBS500-S
HCT116 ATCC CCL247 colorectal carcinoma
Heat-resistant glass Pyrex
Leibovitz’s L-15 medium  GIBCO 11415-064
MCF-7 ATCC HTB-22  breast Adenocarcinoma
MDA-MB-231 ATCC HTB-26  breast Adenocarcinoma
Minimum Essential Medium (MEM) corning 10-010-CV
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15140-122
Phosphate buffer corning 21-040-cvc
PMSF Beyotime ST506 100mM
Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere  polysciences 15714 The diameter of microshpere is 6.00µm
propidium iodide(PI) Sigma-Aldrich P4170
SYLGARD 184Silicone ELASTOMER Dow-Corning 1673921 Contains prepolymers and curing agents
Trypan Blue Beyotime C0011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  2. Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
  3. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
  4. Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
  5. Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
  6. Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
  7. Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
  8. Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
  9. Jung, J. -W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
  10. Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
  11. Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
  12. Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
  13. Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
  14. Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
  15. Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
  16. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  17. Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
  18. Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
  19. Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
  20. Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
  21. Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
  22. Wei, M. -T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
  23. Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
  24. Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
  25. Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
  26. Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).

Tags

Kreftforskning utgave 185
Måling av kompressibiliteten til celle og kjerne basert på akustofluidisk mikrodevice
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu,… More

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu, Y. Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice. J. Vis. Exp. (185), e64225, doi:10.3791/64225 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter