Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enmolekylär diffusion och montering på polymerträngda lipidmembran

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

Här presenteras ett protokoll för att utföra och analysera bindning, rörlighet och sammansättning av enskilda molekyler på artificiella trånga lipidmembran med hjälp av enmolekylär total intern reflektionsfluorescens (smTIRF) mikroskopi.

Abstract

Cellmembran är mycket trånga miljöer för biomolekylära reaktioner och signalering. Ändå använder de flesta in vitro-experiment som undersöker proteininteraktion med lipider nakna dubbelskiktsmembran. Sådana system saknar komplexiteten i trängsel av membraninbäddade proteiner och glykaner och utesluter de associerade volymeffekterna som uppstår på cellulära membranytor. Den negativt laddade glasytan på vilken lipid-dubbelskikten bildas förhindrar också fri diffusion av transmembranbiomolekyler. Här presenterar vi ett väl karakteriserat polymer-lipidmembran som en efterlikning för trånga lipidmembran. Detta protokoll använder polyetylenglykol (PEG) -konjugerade lipider som ett generaliserat tillvägagångssätt för att införliva crowders i det stödda lipid-dubbelskiktet (SLB). Först presenteras en rengöringsprocedur av mikroskopiska glidbanor och täckglas för att utföra enmolekylära experiment. Därefter diskuteras metoder för att karakterisera PEG-SLB: erna och utföra enmolekylära experiment av bindning, diffusion och sammansättning av biomolekyler med hjälp av enmolekylspårning och fotoblekning. Slutligen visar detta protokoll hur man övervakar nanoporsammansättningen av bakteriellt porbildande toxin Cytolysin A (ClyA) på trånga lipidmembran med enmolekylär fotoblekningsanalys. MATLAB-koder med exempeldatauppsättningar ingår också för att utföra några av de vanliga analyserna, till exempel partikelspårning, extrahering av diffusivt beteende och räkning av underenheter.

Introduction

Cellmembran är mycket trånga och komplexa system1. Molekylär trängsel kan ha en betydande inverkan på diffusionen av membranbundna enheter som protein och lipider 2,3,4. På liknande sätt påverkas bimolekylära reaktioner på lipidmembran som receptordimerisering eller oligomerisering av membrankomplex av trängsel 5,6,7. Crowders natur, konfiguration och koncentration kan styra membranbindningen, diffusiviteten och protein-proteininteraktionen på flera sätt 8,9. Eftersom det är utmanande att kontrollera membranträngsel på cellmembran och tolka dess påverkan på inbäddade biomolekyler, har forskare försökt etablera alternativa in vitro-system 10.

Ett populärt tillvägagångssätt för konstgjorda trånga membran är dopning av dubbelskiktsmembranen med polymer (såsom polyetylenglykol, PEG) -ympade lipider11,12. Under visualiseringen av protein- och lipiddynamik på stödda lipid-dubbelskikt (SLB) skyddar dessa polymerer dessutom de membraninbäddade komponenterna från det underliggande negativt laddade substratet (såsom glas) genom att effektivt lyfta dubbelskiktet bort från det underliggande stödet. Genom att variera polymerens storlek och koncentration kan man kontrollera omfattningen av molekylär trängsel, liksom dess separation från det underliggande fasta stödet13,14. Detta är helt klart en fördel jämfört med lipid-dubbelskikt som stöds på fasta substrat utan polymerkuddar15,16, där transmembranbiomolekyler kan förlora sin aktivitet17,18,19. Ännu viktigare är att det gör det möjligt för oss att rekapitulera den trånga miljön i cellmembranet in vitro, vilket är avgörande för många membranprocesser.

Ytympade polymerer på membran genomgår också förändringar i deras konfiguration beroende på deras ympningstäthet12. Vid låga koncentrationer förblir de i en entropiskt lindad konfiguration, känd som en svamp, ovanför membranytan. Med ökande koncentration börjar de interagera och tenderar att lossa och sträcka sig, vilket slutligen ger en tät borstliknande bildning på membranet21. Eftersom övergången från svampen till borstregimen är mycket heterogen och manifesterar sig i dåligt karakteriserade förhållanden hos polymeren, är det viktigt att använda väl karakteriserade förhållanden för trängsel på polymerympade membran. Jämfört med en nyligen genomförd studie20 identifierar och rapporterar vi trånga membrankompositioner som upprätthåller diffusiv transport och aktivitet av transmembranbiomolekyler.

I detta protokoll diskuterar vi hur man genererar PEGylerade lipidmembran och ger rekommendationer för PEG-densiteter som efterliknar trängsel i två olika regimer av polymerkonfiguration (nämligen svamp och borste). Protokollet beskriver också enmolekylbindning, partikelspårning och fotoblekning av datainsamling och analys för molekyler inbäddade i dessa trånga membran. Först beskriver vi de grundliga rengöringsstegen, monteringen av bildkammaren och genereringen av PEG-SLB. För det andra tillhandahåller vi detaljer för enmolekylbindnings-, partikelspårnings- och fotoblekningsexperiment. För det tredje diskuterar vi i) extrahering av de relativa bindningsaffiniteterna, ii) karakteriserande molekylär diffusion och iii) räkning av underenheter i en proteinsammansättning från filmer av enstaka molekyler på membranet.

Medan vi karakteriserade detta system med enmolekylavbildning, är protokollet användbart för alla membranbiofysiker som är intresserade av att förstå effekten av trängsel på biomolekylära reaktioner på lipidmembran. Sammantaget presenterar vi en robust pipeline för att göra trånga och stödda lipid-dubbelskikt, tillsammans med olika enmolekylära analyser som utförs på dem och motsvarande analysrutiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rengöring av objektsglas och täckglas för enmolekylära experiment

  1. Innan bildkammaren monteras, rengör och förbered både täckglas och glidbanor. Borra flera par hål på glasskivorna med en borrmaskin med diamantbelagda borrkronor (0,5-1 mm i diameter). Om akrylplåtar används, använd en laserskärare för att göra exakta hål (0,5 mm), som visas i figur 1.
    OBS: Varje par hål kommer att fungera som ett inlopp och utlopp för flödesutbyte för en individuell mikrofluidisk kammare. En representativ CAD-fil för hål i en akrylglas finns i kompletterande kodningsfil 1. Hål borrade på glasskivor blir vanligtvis 1,5x-2x större än borrkronans storlek.
  2. Rengör diabilderna och täckglasen med tvättmedel. Skölj dem noggrant med avjoniserat vatten. Placera diabilderna och täckglasen i en separat glidfärgning (Coplin) burk med vatten och sonicate i ett bad sonicator för 30 min. För alla ultraljudsbehandling steg, använd en 70 W effektinställning.
  3. Ta bort vattnet och fyll Coplin-burken som innehåller glasskivorna och täckglasen med aceton till randen (50-100 ml beroende på burkens volym). När det gäller akrylplåtar, använd samma volym förblandad 50% (v / v) acetonlösning, annars blir glasen frostiga. Skaka Coplin-burken för att säkerställa att alla glidbanor och täckglas är helt nedsänkta i lösningen och sonikera i en badsonicator i 30 minuter.
  4. Ta bort acetonen och kasta den i en avfallsbehållare, häll metanol i Coplin-burkarna (50%, v / v för akrylglas) och sonika i 30 minuter. Både aceton och metanol används för att avlägsna organiska partiklar på objektglasen.
  5. Skölj bilderna och täckglasen med rikliga mängder typ 1-vatten och lägg dem i en Coplin-burk i glas. Häll 1 M KOH-lösning i burken och sonika i 1 h. För akrylglasen, använd 0,5 M KOH.
  6. Kassera KOH i en oorganisk avfallsbehållare. Skölj burken med mycket vatten och placera Coplin-burkarna i en dragskåp för piranhabehandling. Utför inte piranha-behandling för akrylglas; Fortsätt direkt till steg 1.9.
    VARNING: Piranha-behandling bör göras i en dragskåp med ordentliga handskar, skyddsglasögon och ett förkläde för hantering av syror. Piranha-lösningen är ett starkt oxidationsmedel och tar bort eventuella kvarvarande organiska partiklar från objektglasen och täckglasen.
  7. För beredning av piranha-lösningen, häll försiktigt en 2/3 volym svavelsyra (98%, v / v) i en glasbägare och fyll resten med väteperoxid (30%, v / v). Blanda lösningen försiktigt med en glasstäng, häll den i Coplin-burken och lämna Coplin-burken i rökhuven i minst 1 timme.
  8. Dekantera piranha-lösningen från Coplin-burken i en kasseringsbehållare för surt avfall som förvaras inuti dragskåpet. Skölj Coplin-burken med en riklig mängd typ 1-vatten.
  9. Torka rutschkanorna och täckglasen i en mild ström av kvävgas och lägg dem i en ren Coplin-burk. De torkade glasrutschbanorna och täckglasen är nu klara för plasmabehandling. Ta ett par diabilder och täckglas och placera dem i plasmamaskinen.
  10. Skapa ett vakuum i kammaren. Vrid vredet till radiofrekvensen 8-12 MHz för att generera plasma i kammaren. En lila glöd inuti kammaren indikerar bildandet av ett plasma i kammaren.
  11. Utför plasmabehandlingen i 8-10 min. Släpp försiktigt vakuumet efter att du har stängt av plasma och fortsätt till steg 2 för montering av den mikrofluidiska bildkammaren.

2. Montering av mikrofluidikkammaren

OBS: Bildkammaren skapas genom att klämma in dubbelsidig tejp mellan en förrenad täckglas och glid från föregående steg enligt beskrivningen nedan.

  1. Montera objektglasen och täckglaset efter plasmabehandlingen enligt figur 1. Placera glasskivan på ett rent silkespapper. Skär den dubbelhäftande tejpen i ~2-3 mm breda remsor och placera dem på varje sida av ett par hål på glasskivan. Använd en pipettspets för att platta ut tejpen, annars orsakar det läckage från en kanal till en annan.
    OBS: Alternativt kan du klippa tejpen för hela bilden med en laser- eller automatiserad plotterskärare (figur 1).
  2. Placera det plasmabehandlade täckglaset på den tejpade bilden för att stänga kammaren. Använd en pipspets för att försiktigt trycka på täckglaset på de tejpade områdena för att göra kanalen vattentät.
  3. Om du använder glasskivor, försegla kanterna med epoxiharts. Slutligen har varje bildkammare tillverkad av en bild och täckglas en dimension på 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (längd x bredd x djup). Förvara de förberedda mikrofluidiska bildkamrarna i 1-2 veckor under uttorkade förhållanden (helst mellan 10-25 °C).
    OBS: För de laserskurna tejperna som används med akrylglas är det inte nödvändigt att använda epoxi eftersom tejpkanterna bildar en tät läckagesäker tätning.

3. Göra stödda dubbelskikt på glassubstrat genom vesikelfusion

OBS: Trånga stödda lipid-dubbelskikt genereras på väggarna i bildkammaren genom fusion av lipidblåsor framställda med dopade PEG-lipider.

  1. Ta en ren glasflaska, helst förrenad med piranha-lösning. Tillsätt kloroformlösning av 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC) och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polyetylenglykol)-2000] (DOPE-PEG2000) vid önskad molfraktion av PEG2000-lipider så att den slutliga koncentrationen efter tillsats av buffert blir 3 mM lipider i steg 3.4. Förbered andra membrankompositioner av lipider på liknande sätt.
  2. Torka ut kloroformen från injektionsflaskan med en mild ström av kväve med en liten virvel så att de torkade lipiderna är jämnt belagda på injektionsflaskans yta. Sätt injektionsflaskan i en vakuum exsickator i 1 h. Detta tar bort eventuell kvarvarande kloroform i glasflaskan. Tillsätt 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera över natten vid 37 °C.
  3. Förbered små unilamellära vesiklar (SUV) enligt beskrivningen nedan.
    1. Virvla försiktigt i 1-2 minuter efter inkubation över natten tills lösningen blir grumlig och mjölkaktig.
    2. Ta 100 μL av denna lösning i ett litet 500 μL centrifugrör och sonika i ca 1 h i en bad sonicator (inställd på en 70 W effektinställning). Lösningen kommer att bli tydlig; om inte, så sonika i ytterligare 30 min. Detta steg kommer att generera SUV: er med en diameter på 50-100 nm.
      OBS: Om du förbereder dig för första gången, karakterisera SUV: erna med dynamisk ljusspridning22,23 (DLS) eller en motsvarande metod.
  4. Tillsätt kalciumklorid (CaCl2, 3 M lager) till de ultraljudsbelysta vesiklarna så att dess slutliga koncentration är 30 mM i lipidlösningen.
  5. Skär en mikropipettspets för att injicera provlösningen så att den sitter tätt i hålet. Blanda lipidlösningen och injicera genom ett av hålen i bildkammaren i steg 2. Torka av överskottslösningen som kommer ut ur kammaren från utloppet med en ren vävnad för att förhindra förorening av intilliggande kanaler.
  6. Lämna denna enhet i en fuktad kammare i 90 minuter. Förbered en befuktningskammare genom att placera en våt vävnad i slutet av ett 50 ml centrifugrör. Placera bilden i sidled inuti röret med rörlocken stängda. Vesiklarna smälter samman och genererar ett enhetligt dubbelskikt på glasytan.
  7. Tvätta kammaren noggrant med en riklig mängd PBS-buffert (ungefär 5 gånger bildkammarens volym). Förhindra att luftbubblor kommer in i kammaren under tvätt eftersom detta kan generera defekter i membranet.

4. Mikroskopinställning och mätningar av enpartikelavbildning

OBS: Enmolekylära experiment utförs på en objektivbaserad total intern reflektionsfluorescens 24,25,26 (TIRF) mikroskopinställning (figur 2). TIRF-avbildning ger ett bättre signal-brusförhållande för enmolekylavbildning, även om epifluorescensmikroskop också kan användas under vissa förhållanden (särskilt när de fluorescerande biomolekylerna kan avlägsnas från bulklösningen genom tvätt). Prisma-typ TIRF kan användas men objektivtypen är att föredra för att underlätta installationen av mikrofluidik27. För TIRF av måltyp rekommenderas ett mål med hög numerisk bländare (100x förstoring, vanligtvis kommersiellt tillgängligt som TIRF-mål).

  1. Innan du utför något experiment på rörlighet och montering, justera TIRF-mikroskopet för att säkerställa ett optimalt signal-brusförhållande på grund av belysning av det evanescenta fältet. Håll lasereffekten låg under justeringen, mellan 100 μW och 1 mW.
    VARNING: Laserskyddsglasögon ska användas under inriktningen av laserstrålen.
    1. För att justera mikroskopet, förbered ett fluorescerande pärlprov genom att tillsätta dem i mikrofluidikkanalen vid låga koncentrationer (vid ~ 100 pM) så att fluorescerande fläckar från enstaka pärlor inte överlappar varandra i bilderna.
    2. Visualisera först pärlorna i epifluorescensläge. Medan belysningen är i epifluorescensläge, flytta M5-spegelöversättningssteget (spegeln som reflekterar lasern till dikroiken) så att strålen som kommer ut ur målet böjer sig tills den så småningom är i en total intern reflektionskonfiguration.
    3. Kontrollera om TIR-belysning har uppnåtts. När TIR-evanescentfältet belyser pärlprovet, kontrollera att endast pärlorna på ytan är synliga och att fritt flytande pärlor bort från ytan inte observeras.
  2. I början av experimentet, ställ in lasereffekten vid objektivets bakre fokalplan till 5-10 mW för att förhindra fotoförstöring (fotoblekning) av fluoroforerna.
  3. Håll bilden på mikroskopstadiet och fokusera på det nakna membranet (utan fluoroforer) först. Vanligtvis är små spår av föroreningar i lipidmembran tillräckliga för att göra detta. Valfritt: Inkorporera ett litet antal fluorescerande pärlor eller kvantprickar (subpikomolärt intervall) under steg 3.1, så att endast två till fem fluorescerande partiklar finns i synfältet för att underlätta identifiering av rätt fokus.
  4. Injicera provet (membranproteiner etc.) med hjälp av en mikropipett i den PEG-SLB-belagda bildkammaren som tillverkas i steg 3.7.
  5. För att mäta enmolekylbindningskinetik, använd en sprutpump för att strömma de märkta biomolekylerna genom inloppshålen in i mikrofluidikkammaren (figur 3). Använd en flödeshastighet på 50-500 μl/min.
    1. Starta filmförvärvet innan du lägger till lösningen i bildkammaren. Skaffa > 5 000 bilder med en bildhastighet på 25-50 bildrutor/s under kontinuerligt flöde tills det inte finns någon ytterligare ökning av utseendet på nya fläckar på membranytan (Video 1). För analys av bindande kinetik, följ stegen från 6.1.
  6. För spårning av enstaka partiklar, tillsätt de märkta biomolekylerna i låga koncentrationer (jämfört med bindningskonstanten) till kanalen med hjälp av en mikropipett. Optimera koncentrationen till en densitet på <0,1 partiklar/μm 2 så att enskilda partiklar sällan korsar vägar (Video 2). Detta säkerställer hög återgivning av spår som återställs från datauppsättningarna. Inkubera vid behov (vid dålig membranbindning med biomolekyler, ~ 10 min) i en befuktande miljö och tvätta kammaren med bufferten.
    OBS: Tvätt behövs om bindningen är dålig på membranet och de flesta fluorescerande molekylerna finns kvar i lösningen. Annars kan detta störa avbildning och resultera i ett dåligt signal-brusförhållande.
  7. För analys av enpartikelbana, skaffa 200-500 bilder vid 10-100 ramar / s. Håll objektivlinsen fokuserad på tvåskiktsplanet med minimal stegavdrift under förvärvsintervallet.

5. Bildförvärv för att räkna underenheter i en proteinsammansättning

OBS: Bildförvärv för uppskattning av stökiometri kräver kontinuerlig blekning av fluoroforer och detektion av antalet steg tills inga fler fluoroforer avger fluorescens.

  1. För mätning av underenheter, lägg till relevant koncentration av märkta biomolekyler (exempel: se resultat; ClyA tillsattes vid 25 nM koncentration) till den mikrofluidiska bildkammaren och inkuberade (tvätt vid behov). Inkubera objektsglaset i en befuktningskammare vid önskad temperatur under önskad tid (exempel: 37 °C och 60 min för montering av ClyA).
  2. Utför bildförvärv för enmolekylär fotoblekning enligt beskrivningen nedan.
    1. Tvätta bildkammaren med en buffert före avbildning (vid behov). Placera bilden på mikroskopet och justera fokus för att visualisera de märkta molekylerna.
    2. Ställ in lasereffekten på en nivå där blekningen av fluoroforen sker gradvis (~ 1-5 min). Helst, för varje monterad biomolekyl, håll fotoblekningssteghastigheten >10-20 bildramar isär. Skaffa bilderna tills alla molekyler är helt fotoblekta (Video 3).
      OBS: För att bestämma den totala varaktigheten för den fotoblekningsbana som krävs, plotta den genomsnittliga intensiteten för enskilda fläckar med antalet bildramar och bestäm tidskonstanten genom att montera en exponentiell sönderfallsfunktion. Den totala varaktigheten av förvärvet kan ställas in på 5-10 gånger tidskonstanten.
  3. Utför en tidsberoende monteringsmätning genom att starta filmförvärv så snart provet införs i kammaren och förvärva nya fotoblekningsfilmer med fasta tidsintervall efter membranbindning från olika segment av PEG-SLB.

6. Bild- och dataanalys

  1. Utför enpartikelbindning och spårning enligt beskrivningen nedan.
    1. Extrahera enpartikelbanor från filmerna som förvärvats ovan, som visas i figur 4. För att upptäcka enstaka partiklar och spåra dem, använd MATLAB-paketet, u-track28 eller Trackmate29, ett plugin i ImageJ, som också ger en robust enpartikelspårningsalgoritm. Följ stegen för att ställa in u-track-analys som visas i tilläggsfil 1.
      OBS: De kritiska parametrarna för spårning av enstaka partiklar är standardavvikelsen för partikelstorleken (i pixlar) och gapstängningslängden. Använd 1 respektive 0 för dessa parametrar som de strängaste kriterierna för spårning.
    2. För att beräkna bindningshastighetskonstanterna, uppskatta först antalet partiklar som binder till membranytan över tiden. Använd MATLAB-filen binding_SPT (Supplementary Coding File 2) med u-track-utdatamappen för att identifiera och plotta antalet partiklar som visas på membranet som erhållits från steg 6.1. Anpassa den observerade kinetiken till lämpliga kinetiska modeller (exempel: enkel exponentiell anpassning för att bestämma tidskonstanten, vars invers kan tilldelas den skenbara hastighetskonstanten)30 för att extrahera hastighetskonstanterna (se resultat, figur 5).
    3. Den genomsnittliga kvadratförskjutningen (MSD) för de diffusa partiklarna (såsom DNA-spårare i PEG-SLB, figur 6) indikerar diffusionens natur. Använd MATLAB-paketet MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) med u-track-utdatamappen för att hämta MSD-diagrammet som en funktion av fördröjningstiden (figur 6B).
    4. För att identifiera heterogena diffusa arter, beräkna momentana fördelningar i kvadratförskjutning (ISD) enligt figur 6C. ISD2, definierad som (X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2, där fördröjningstid, τ = 2, är att föredra eftersom det minskar bruset. Filtrera bort korta banor med mindre än tre bildrutor för att minska bruset.
    5. Använd ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) i MATLAB med u-track-utdata för att plotta ISD:erna för de spårade partiklarna (figur 6C).
  2. Utför enmolekylär fotoblekningsanalys enligt beskrivningen nedan.
    1. För att uppskatta stökiometrin hos membrankomplexen, utför en fotoblekningsanalys på de tidsberoende intensiteterna hos de fluorescerande komplexen (Video 3). Använd därför en algoritm för driftkorrigering (drift_correct_images, kompletterande kodningsfil 2) baserat på autokorrelationen för filmramar för att extrahera översättningsavdriften. Detta förutsätter att de monterade strukturerna till stor del är orörliga under bildförvärv. Kör MATLAB-paketet Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) för att upptäcka partikelintensitetstidsspår från filmerna.
    2. Använd MATLAB-koden Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) för att utföra stegidentifieringen för intensitetstidsspårningarna. Om partiklarna inte är immobila, använd u-track-paketet för att extrahera platsen för rörliga partiklar. Denna uppsättning xy-koordinater kan mappas till råfilmerna för att extrahera intensitetsvärdena för den rörliga partikeln när den diffunderar i sidled på membranet. Använd MATLAB-paketet utrack_Int (Supplementary Coding File 2) med utdata från u-track-analys för det här alternativet.
    3. Utför en korrigering för ofullständig märkning av biomolekylerna med fluorofortaggar för att uppskatta rätt proteinkomplex stökiometri. Bestäm märkningseffektiviteten med en UV-VIS-spektrofotometer genom att mäta absorptionen av färgämne och protein för att uppskatta koncentrationen. Beräkna märkningseffektiviteten som det molära förhållandet mellan färgämnet och proteinet.
      OBS: Vissa färgämnen absorberas också vid våglängder nära 280 nm, och därför bör detta absorptionsbidrag från färgämnet beaktas under koncentrationsberäkningen.
    4. Utför en binomialkorrigering för att ta hänsyn till fluoroforens ofullständiga märkningseffektivitet på följande sätt genom att använda MATLAB-koden Step_correction (Supplementary Coding File 2) med data som erhållits från stegräkning i steg 6.2.2. Till exempel, för ett porbildande toxin som Cytolysin A, som bildar en dodekaerrisk ringliknande struktur, applicera en binomial korrigering med följande formel:
      nkEquation 1
      där Equation 2 = märkningseffektivitet, n = antal fotoblekningssteg och s = faktiska räkningar. Använd MATLAB-rutinen Stepcount_immobile för att återställa de korrigerade oligomera arterna. Konvertera frekvensen av oligomerer (si) till massfraktioner (figur 7C; Kompletterande kodningsfil 2).
      En uppsättning analyserade filer som du spårar ingår i kompletterande kodningsfil 3. MATLAB-koderna i kompletterande kodningsfil 2 kan köras med dessa datamängder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Övervakning av bindningen av ClyA-protein på PEGylerade membran
Efter steg 4.5 uppskattas bindningskinetiken genom att plotta antalet partiklar som binder till membranytan över tid (Video 1). Eftersom ClyA-protein binder till ett membran med 5 mol% PEG2000-lipider ökar partikeldensiteten och når mättnad (figur 5). En exponentiell sönderfallspassning till de bundna partiklarna (cyancirklar) ger tidskonstanten (τb) för membranbindningen (särskilt de initiala tidpunkterna [röda cirklar] passar inte i detta fall).

Rörlighet av DNA-spårare på trånga membran
Vi använder vanligtvis DNA-spårare (DNA förankrat i membranet med en tokoferol), lipofila spårämnen (t.ex. DiI) eller membranproteiner (t.ex. ClyA) för att karakterisera membranet under PEG-medierad trängsel. Lateral diffusion av märkta spårmolekyler (25–100 pM) kan övervakas genom avbildning av membranet vid partikelbindning. I avsaknad av någon PEG-polymer i membranet uppvisar de flesta spårämnen (särskilt de som sträcker sig utanför dubbelskiktet) begränsad diffusion på SLB (figur 6A). Med små nivåer av PEG2000 i membranet (0,5–2 mol%) lyfter dubbelskiktet bort från den underliggande ytan och spårmolekylerna kan diffundera utan begränsningar. Å andra sidan observeras extrem inneslutning vid en hög koncentration av PEG (20 mol%), där PEG-molekyler befinner sig i en tät borstregim, med en mängd olika beteenden som visas däremellan. Belastningsbesvärsdiagram för dessa tre villkor visas i figur 6B. Baserat på vår karakterisering av POPC/DOPE-PEG2000 dubbelskiktsmembran rekommenderar vi en 1–3 mol% DOPE-PEG2000-fraktion som inducerar trängsel i svampregimen. Över 7,5 mol% PEG2000-lipid observerar vi uppkomsten av borstregimen, och kompositioner tills 25 mol% PEG2000-lipid kan användas för att inducera trängsel och inneslutning. De mellanliggande 4–7% PEG2000-lipidförhållandena som motsvarar övergången mellan de två regimerna är dåligt karakteriserade och bör undvikas.

Montering av ClyA på trånga membran
Intensitetsbanorna för enskilda diffraktionsbegränsade fläckar av ClyA-protein efter inkubation på det trånga membranet (figur 7A,B) visar ett stort antal distinkta fotoblekningssteg, vilket tyder på bildandet av olika monteringsintermediärer31. ClyA, som är ett transmembranprotein, interagerar med den negativt laddade glasytan i frånvaro av PEG och kommer att monteras mycket dåligt. Vid 7,5 mol% PEG2000-lipider mättes de sammansatta komplexen och plottas i figur 7C. Efter korrigering för märkningseffektiviteten (0,9 i detta fall) visar den slutliga fördelningen av oligomerer den dodecameriska ClyA-arten som den dominerande strukturen, i överensstämmelse med strukturdata32.

Figure 1
Figur 1: Schema för rengöringsstegen och mikrofluidisk kammarenhet. (A) Glasskivorna och täckglasen rengörs med sekventiell ultraljudsbehandling i tvättmedel, aceton, metanol, KOH och piranha-lösning, med flera sköljningar av ultrarent vatten av typ 1 mellan varje steg. Objektglasen och täckglasen torkas sedan med kvävgas före plasmabehandling. (B) Den mikrofluidiska bildkammaren monteras sedan med hjälp av en förskuren dubbelhäftande tejp som binder bilden till täckglaset. * Akrylglas behandlas inte med piranha-lösning, och aceton, metanol och KOH används vid en koncentration på 50% (v / v) av den som används för rengöring av täckglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Inställning av TIRF-mikroskop. En typisk TIRF-mikroskopinställning av objektiv typ anpassad på ett inverterat mikroskop visas med väsentlig optik markerad. M1–M5 är speglar för att styra laserstrålen. Linserna L1 och L2 används för att expandera laserstrålen, och L3-linsen fokuserar laserstrålen på objektivlinsens bakre fokalplan. I1 och I2 är irismembranen som används för att rikta in laserstrålen. En slutare används för att styra laserstrålebelysningen, vilket är avgörande för att förhindra onödig fotoblekning av fluorescensmolekylerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Flödesinställning för membranbindande kinetik. För att genomföra bindningsexperimentet används en tunn PTFE-slang (0,022 i ID x 0,042 i OD) för att flöda provet med hjälp av en sprutpump (bilden ska inte skalas). Slangens ände är ansluten till bildkammarens utlopp med hjälp av en mikropipettspets. Kasseringen samlas i en liten mikrotipbehållare ansluten till utloppet, och den införda volymen är alltid större än 10 gånger volymen på bildkammaren. Infälld figur som visar bildkammarens tvärsnitt. (bilden ska inte skalas) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Pipeline för analys från enpartikelbanor och fotoblekningsfilmer. (A) De förvärvade filmerna analyserades med hjälp av u-spår i MATLAB för att erhålla banorna som (x, y) och intensiteterna (i) för varje partikel, ram för ram. Dessa banor användes sedan för att beräkna momentan kvadratförskjutning (ISD), ISD1 och ISD2. ISD:erna kan sedan plottas som histogram för att identifiera rörliga arter. Alternativt informerar medelvärdet för kvadratförskjutningsdiagram (MSD) om rörelsen är gaussisk, begränsad eller superdiffusiv33,34. Hidden Markov Model35 (HMM) analys kan användas för att skilja olika diffusiva tillstånd av en enda partikel. (B) För fotoblekningsanalysen korrigerades filmerna först för avdrift i systemet (vid behov), följt av partikeldetektering eller spårning med u-spår. Förutom att uppskatta intensitetsfördelningen23 (och andra partikelfunktioner) kan intensitetsbanorna analyseras för antalet fotoblekningssteg med hjälp av stegsökningsalgoritmer36,37,38. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Bindning av ClyA till lipidmembran som stöds med 5 mol% DOPE-PEG2000. En typisk bindningskurva erhålls efter att ha räknat antalet partiklar i varje ram som identifieras av u-spår. Avbildning initieras före flödet av det membranbindande ClyA-proteinet. En exponentiell sönderfallsfunktion (svart linje) som passar partikelnummer (cyancirklar) används för att återställa tidskonstanten för bindning av ClyA till membranet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Rörlighet för lipofilt DNA på PEG-lipid dubbelskiktsmembran . (A) Schematisk för den lipofila DNA-spåraren i POPC / DOPE-PEG2000-membranet visas. (B) Genomsnittliga kvadratförskjutningar beräknade från enpartikelspårningen för olika PEG-SLB visas. I 2 mol% DOPE-PEG2000 visar DNA-spårare rent brownskt beteende jämfört med hindrad rörlighet i frånvaro av polymeren (streckad linje ingår som referens). Å andra sidan avviker samma DNA-spårämne från ren brownsk diffusion, vilket indikerar subdiffusiv rörelse med nedsatt rörlighet i närvaro av 20 mol% DOPE-PEG2000. (C) ISD2-fördelning för diffusion av lipofil DNA-spårare i två olika PEG2000-lipidmembran jämförs med nakna SLB. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Fotoblekningsspår och montering av ClyA på lipid-dubbelskiktsmembran . (A,B) Representativa tidsspår visar fotoblekningssteg av ClyA-nanoporkomplex som detekterats i steg 6.2.1. för ett monterat ClyA-komplex med 7 respektive 5 steg. (C) Fotoblekningsstegfördelningen (grå) för ClyA (25 nM) inkuberad på 64,7% POPC: 27,8% Kolesterol: 7,5% DOPE-PEG2000-membran i 60 min vid 37 °C visas. Efter korrigering för ofullständig märkningseffektivitet visas den uppskattade massfraktionen av olika oligomera arter (magenta). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1: Bindning av ClyA på membranet. Övervakning av Cy3-märkt ClyA-proteinbindning till SLB-membranet innehållande 5 mol% DOPE-PEG2000. De bundna partiklarna detekteras (cyancirklar) av u-spår, och spår ritas för fem efterföljande positioner i sin bana. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 2: Diffusion av DNA-spårämne på 2 mol% PEG-membranet. En film för Cy3-märkt DNA förankrat i lipidmembranet via tokoferol i 2 mol% PEG2000-membranet. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 3: Photobleaching film. En film av sammansatta oligomerer av Cy3-märkta ClyA-molekyler på membranet innehållande 7,5 mol% DOPE-PEG2000. Större komplex framgår av de flera gånger högre intensiteterna jämfört med ett enda protein, liksom från de flera fotoblekningsstegen när partikelintensitet observeras över tid under kontinuerlig belysning. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Tilläggsfil 1: Information om hur du använder u-track och olika MATLAB-koder i steg 6. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 1: En representativ CAD-fil (Computer-Aided Design) för att göra hål i akrylglaset och skärtejpen för hela bilden. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfiler 2: Komprimerad mapp som innehåller tillhörande MATLAB-koder som behövs för bild- och dataanalys i steg 6. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfiler 3: Exempeldata för bild- och dataanalys i steg 6. MATLAB-koderna finns också på https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här demonstrerar vi enmolekylära experiment på stödda lipid-dubbelskikt (SLB) som manifesterar en trång miljö för membraninbäddade biomolekyler. Den trånga miljön genererar en utesluten volymeffekt, vilket leder till förbättring av biomolekylära reaktioner 1,2,39,40. För PEG-lipidsystemet, där polymeren primärt upptar volymen utanför dubbelskiktet, är denna effekt särskilt uttalad för molekylära arter med stora ecto-domäner. Därför, jämfört med lipofila färgämnen, kan diffusionen av en stor hydrofil molekyl inbäddad i membranet, såsom receptorer, glykoproteiner och glykolipider minskas avsevärt. Med hjälp av fluorescerande spår-DNA förankrat i membranet via tokoferol (figur 5) kan vi identifiera sådana trängseleffekter.

Separat lyfter närvaron av PEG i bottenbroschyren också SLB och minskar interaktionen mellan biomolekylerna och stödsubstratet14,41. Vanligtvis hindrar den negativt laddade ytan på bildglasytan ofta rörlighet och molekylära reaktioner. Därför är användningen av PEG-lipider för att lyfta membranet bort från glaset fördelaktigt även när det inte är för trängsel. Man måste dock se till att identifiera de koncentrationsregimer som inte uppvisar molekylär trängsel i dessa fall. För proteiner som sträcker sig över större domäner utanför dubbelskiktet kan användningen av en PEG-lipid med högre molekylvikt, såsom PEG5000, vara nödvändig42.

Några viktiga punkter är avgörande för enmolekylavbildning på SLB-system. Noggrann rengöring av objektglas och täckglas är avgörande i enmolekylära experiment (steg 1). Avbildning av en yta med föroreningar kommer att resultera i defekter i lipidmembranet. Detta kan resultera i fläckar av fluorescerande märkta biomolekyler på membranytan. Täckningen och enhetligheten hos SLB som bildas kan verifieras i en separat beredning genom att dopa dubbelskiktet med ett lipidfärgämne (DiI eller Lissamine Rhodamine DOPE) och avbilda det under ett fluorescensmikroskop. FRAP-analys kan också användas för att jämföra det diffusiva beteendet43,44.

För membranbindningsexperiment (steg 4) bör flödesinställningen med slangen grundas med buffert för att förhindra att luftbubblor kommer in i kammaren. Högre flödeshastigheter eller närvaron av luftbubblor kommer att brista membranet, och molekylerna kommer att binda direkt till täckglaset. Bildinhämtningen bör starta innan flödet startar eftersom vissa molekyler diffunderar från slangen och binder till membranet. Att fokusera målet på dubbelskiktet under avbildning kan underlättas genom att dopa dubbelskiktet i låg koncentration med guldnanopartiklar, kvantprickar eller fluorescerande pärlor.

För enpartikelspårningsexperimenten bör antalet partiklar på membranet kontrolleras för att undvika ett scenario där spårningen är utmanande på grund av överdriven överlappning av partikelbanorna. En annan viktig faktor att tänka på under avbildningen är laserkraften. En hög lasereffekt kommer att fotobleka fluoroforerna snabbt, medan låg intensitet och motsvarande långsamma bildförvärvshastigheter kommer att orsaka suddighet. Optimal lasereffekt bör ge en betydande banlängd (minst >5 i genomsnitt) samtidigt som symmetriska och nära diffraktionsbegränsade bilder av partiklar bibehålls. Ett syrerensningssystem kan också användas för att förlänga fotoblekningen av fluoroforer45. En begränsning av fotoblekningsanalysen som presenteras här uppstår 37,46 vid stora molekylära sammansättningar (~ större än 20 underenheter), såsom kärnporkomplexet47. I sådana fall kan en Bayesiansk baserad metod användas för att härleda underenhetspopulationen48,49,50.

Märkningen av biomolekyler med fluoroforer är i de flesta fall inte fullständig51. Detta utgör en utmaning när det gäller att räkna underenheter i ett kluster med omärkta arter. En binomial korrigering för den sub-par märkningseffektiviteten är vanligtvis en rimlig approximation när stökiometrin hos den molekylära arten är fixerad. I många fall kan oligomera arter vara heterogena eller dynamiskt föränderliga, som i en oligomeriseringsprocess, vilket kräver utveckling av nya verktyg för att extrahera de underliggande fördelningarna från fotoblekningsdata.

Sammantaget tillhandahåller detta protokoll en pipeline för att generera PEG-SLB, med rekommendationer för villkoren för att använda, utföra och analysera enmolekylbindning och spåra och utföra fotoblekningsanalys för membranbiomolekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner professor Benjamin Schuler för att ha delat uttrycket plasmid för ClyA-protein. Detta arbete stöddes av Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

Biokemi utgåva 185
Enmolekylär diffusion och montering på polymerträngda lipidmembran
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., … More

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter