Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

Abstract

ממברנות תאיות הן סביבות צפופות מאוד לתגובות ביומולקולריות ולאיתותים. עם זאת, רוב הניסויים במבחנה החוקרים אינטראקציה של חלבונים עם שומנים משתמשים בממברנות דו-שכבתיות עירומות. מערכות כאלה חסרות את המורכבות של צפיפות על ידי חלבונים וגליקנים המוטמעים בממברנה ואינן כוללות את השפעות הנפח הנלוות על פני השטח של קרום התא. כמו כן, משטח הזכוכית הטעון שלילית שעליו נוצרים דו-שכבתי השומנים מונע דיפוזיה חופשית של ביומולקולות טרנסממברנות. כאן אנו מציגים ממברנה פולימרית-שופתית המאופיינת היטב כחיקוי של ממברנות שומנים צפופות. פרוטוקול זה משתמש בשומנים מצומדים מפוליאתילן גליקול (PEG) כגישה כללית לשילוב קראודרים בשכבת השומנים הנתמכת (SLB). ראשית, מוצג הליך ניקוי של השקופיות והכיסויים המיקרוסקופיים לביצוע ניסויים במולקולה בודדת. לאחר מכן, נדונו שיטות לאפיון PEG-SLBs וביצוע ניסויים של מולקולות בודדות של קשירה, דיפוזיה והרכבה של ביומולקולות באמצעות מעקב אחר מולקולות בודדות ופוטו-הלבנה. לבסוף, פרוטוקול זה מדגים כיצד לנטר את מכלול הננו-נקבוביות של רעלן יוצר נקבוביות חיידקים ציטוליזין A (ClyA) על ממברנות שומנים צפופות באמצעות ניתוח פוטו-לבנה של מולקולה אחת. קודי MATLAB עם מערכי נתונים לדוגמה כלולים גם כדי לבצע חלק מהניתוחים הנפוצים כגון מעקב אחר חלקיקים, חילוץ התנהגות מפוזרת וספירת תת-יחידות.

Introduction

קרומי התאים הם מערכות צפופות ומורכבות מאוד1. לצפיפות מולקולרית יכולה להיות השפעה ניכרת על דיפוזיה של ישויות הקשורות לממברנה כמו חלבונים ושומנים 2,3,4. באופן דומה, תגובות דו-מולקולריות על ממברנות שומניות כמו דימריזציה של קולטנים או אוליגומריזציה של קומפלקסים של ממברנות מושפעות מצפיפותשל 5,6,7. האופי, התצורה והריכוז של ה-crowders יכולים לשלוט בקשירת הממברנה, בדיפוזיביות ובאינטראקציה בין חלבון לחלבון בכמה דרכים 8,9. מאחר שקשה לשלוט בצפיפות הממברנות התאי ולפרש את השפעתן על ביומולקולות משובצות, חוקרים ניסו ליצור מערכות חוץ גופיות חלופיות 10.

גישה פופולרית עבור ממברנות צפופות מלאכותיות היא סימום הממברנות הדו-שכבתיות בפולימר (כגון פוליאתילן גליקול, PEG) - שומנים מושתלים11,12. במהלך הדמיה של דינמיקה של חלבונים ושומנים על דו-שכבתיות שומנים נתמכות (SLBs), פולימרים אלה גם מגנים על הרכיבים המוטבעים בממברנה מפני המצע הטעון שלילית הבסיסי (כגון זכוכית) על ידי הרמה יעילה של הדו-שכבה הרחק מהתמיכה הבסיסית. על ידי שינוי הגודל והריכוז של הפולימר, ניתן לשלוט במידת הצפיפות המולקולרית, כמו גם בהפרדתו מהתמיכה המוצקההבסיסית 13,14. זהו ללא ספק יתרון על פני דו-מולקולות של שומנים הנתמכים על מצעים מוצקים ללא כריות פולימריות15,16, שבהן ביומולקולות טרנס-ממברנה יכולות לאבד את פעילותן17,18,19. חשוב מכך, הוא מאפשר לנו לשחזר את הסביבה הצפופה של קרום התא במבחנה, שהיא קריטית לתהליכי ממברנה רבים.

פולימרים המושתלים על פני השטח על ממברנות עוברים גם שינויים בתצורתם בהתאם לצפיפות ההשתלהשלהם 12. בריכוזים נמוכים, הם נשארים בתצורה מפותלת אנטרופית, המכונה פטריה, מעל פני הממברנה. עם הריכוז הגובר, הם מתחילים לקיים אינטראקציה ונוטים להתפרק ולהתרחב, ולבסוף מניבים היווצרות צפופה דמוית מברשת על הממברנה21. מכיוון שהמעבר מפטרייה למשטר המברשת הוא הטרוגני מאוד ומתבטא בתנאים לא מאופיינים היטב של הפולימר, חשוב להשתמש בתנאים מאופיינים היטב לצפיפות על ממברנות מושתלות בפולימר. בהשוואה למחקרשנערך לאחרונה 20, אנו מזהים ומדווחים על הרכבי ממברנות צפופים השומרים על ההובלה והפעילות הדיפוזית של ביומולקולות טרנסממברניות.

בפרוטוקול זה אנו דנים כיצד ליצור ממברנות שומנים PEGylated ומספקים המלצות לציפותי PEG המחקים צפיפות בשני משטרים שונים של תצורת פולימרים (כלומר, פטריות ומברשת). הפרוטוקול מתאר גם קשירה של מולקולה בודדת, מעקב אחר חלקיקים ואיסוף וניתוח נתוני פוטו-הלבנה עבור מולקולות המוטבעות בממברנות צפופות אלה. ראשית, אנו מתארים את שלבי הניקוי היסודי, את הרכבת תא ההדמיה ואת יצירת PEG-SLBs. שנית, אנו מספקים פרטים לניסויים של קשירת מולקולה בודדת, מעקב אחר חלקיקים ופוטו-הלבנה. שלישית, נדון ב-א) חילוץ זיקות הקשירה היחסיות, ב) אפיון הדיפוזיה המולקולרית, ו-ג) ספירת תת-יחידות במכלול חלבונים מסרטים של מולקולות בודדות על הממברנה.

בעוד שאפיינו את המערכת הזו בהדמיה של מולקולה בודדת, הפרוטוקול שימושי לכל הביופיזיקאים של הממברנות המעוניינים להבין את השפעת הצפיפות על תגובות ביומולקולריות על ממברנות שוממניות. בסך הכל, אנו מציגים צינור חזק לייצור דו-שכבתיות שומנים צפופות ונתמכות, יחד עם בדיקות שונות של מולקולות בודדות הנערכות עליהם ושגרות הניתוח המתאימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ניקוי המגלשה וכיסוי לניסויים במולקולה בודדת

  1. לפני הרכבת תא ההדמיה, נקו והכינו הן את הכיסויים והן את השקופיות. קדחו מספר זוגות חורים על שקופיות הזכוכית באמצעות מכונת קידוח עם מקדחות מצופות יהלום (קוטר 0.5-1 מ"מ). אם משתמשים ביריעות אקריליק, השתמשו בחותך לייזר כדי ליצור חורים מדויקים (0.5 מ"מ), כפי שמוצג באיור 1.
    הערה: כל זוג חורים ישמש ככניסה ושקע להחלפת זרימה עבור תא מיקרופלואידי בודד. קובץ CAD מייצג עבור חורים בשקופית אקרילית זמין בקובץ קידוד משלים 1. חורים שנקדחו במגלשות זכוכית בדרך כלל בסופו של דבר גדולים פי 1.5-2 מגודל המקדחה.
  2. נקו את השקופיות והכיסויים בעזרת חומר ניקוי. שטפו אותם היטב במים שעברו דה-יוניזציה. הניחו את המגלשות והכיסויים בצנצנת נפרדת להכתמת שקופיות (קופלין) עם מים וסוניק בסוניק אמבטיה למשך 30 דקות. עבור כל שלבי הסוניקציה, השתמש בהגדרת הספק של 70 W.
  3. מוציאים את המים וממלאים את צנצנת הקופלין המכילה את מגלשות הזכוכית והכיסויים באצטון עד אפס מקום (50-100 מ"ל, תלוי בנפח הצנצנת). במקרה של יריעות אקריליק, השתמש באותו נפח של תמיסת אצטון מעורבבת מראש של 50% (v/v) אחרת השקופיות יהפכו קפואות. נערו את צנצנת הקופלין כדי להבטיח שכל השקופיות והכיסויים יהיו שקועים לחלוטין בתמיסה ויסולקו בסוניק אמבטיה למשך 30 דקות.
  4. מוציאים את האצטון ומשליכים אותו למיכל פסולת, יוצקים מתנול לצנצנות הקופלין (50%, v/v לשקופיות אקריליות) וסוניקט במשך 30 דקות. גם אצטון וגם מתנול משמשים להסרת חלקיקים אורגניים בשקופיות.
  5. שטפו את המגלשות והכיסויים בכמויות גדולות של מים מסוג 1 והניחו אותם בצנצנת קופלין מזכוכית. יוצקים תמיסת 1 M KOH לתוך הצנצנת וסוניקט במשך שעה אחת. עבור שקופיות אקריליק, השתמש ב- 0.5 M של KOH.
  6. השליכו את ה-KOH במיכל פסולת אנאורגני. שטפו את הצנצנת עם הרבה מים והניחו את צנצנות הקופלין בתוך קולט אדים לטיפול בפיראנה. אין לבצע טיפול פיראנה למגלשות אקריליות; המשך ישירות לשלב 1.9.
    אזהרה: הטיפול בפיראנה צריך להיעשות במכסה אדים עם כפפות מתאימות, משקפי בטיחות וסינר לטיפול בחומצות. תמיסת פיראנה היא חומר מחמצן חזק, והיא מסירה את כל שאריות החלקיקים האורגניים מהשקופיות והכיסויים.
  7. להכנת תמיסת הפיראנה, מוזגים בעדינות נפח של 2/3 של חומצה גופרתית (98%, v/v) לתוך זכוכית וממלאים את השאר במי חמצן (30%, v/v). מערבבים את התמיסה בזהירות עם מוט זכוכית, יוצקים אותה לתוך צנצנת הקופלין, ומשאירים את צנצנת הקופלין במכסה האדים למשך שעה לפחות.
  8. השליכו את תמיסת הפיראנה מצנצנת הקופלין במיכל להשלכה לפסולת חומצית שנשמרה בתוך מכסה האדים. שטפו את צנצנת הקופלין בכמות עצומה של מים מסוג 1.
  9. יבשו את המגלשות והכיסויים בזרם עדין של גז חנקן והניחו אותם בצנצנת קופלין נקייה. המגלשות והכיסויים המיובשים מוכנים כעת לטיפול פלזמה. קח זוג שקופיות וכיסויים והנח אותם במכונת הפלזמה.
  10. צור ואקום בתא. סובב את הידית לתדר הרדיו של 8-12 מגה-הרץ ליצירת פלזמה בתא. זוהר סגול בתוך התא יציין היווצרות פלזמה בחדר.
  11. בצע את הטיפול פלזמה במשך 8-10 דקות. שחררו בעדינות את הוואקום לאחר כיבוי הפלזמה והמשיכו לשלב 2 להרכבת תא ההדמיה המיקרופלואידי.

2. הרכבה של תא microfluidic

הערה: תא ההדמיה נוצר על-ידי כריכה של סרט הדבקה דו-צדדי בין כיסוי שעבר ניקוי מראש לבין החלקה מהשלב הקודם כמתואר להלן.

  1. הרכיבו את השקופיות והכיסויים לאחר טיפול הפלזמה, כפי שמוצג באיור 1. מניחים את שקופית הזכוכית על נייר טישו נקי. חותכים את הסרט הדו-צדדי לרצועות ברוחב ~2-3 מ"מ ומניחים אותן בכל צד של זוג חורים במגלשת הזכוכית. השתמש בקצה פיפט כדי לשטח את הקלטת או שזה יגרום לדליפה מערוץ אחד למשנהו.
    הערה: לחלופין, גזור את הקלטת עבור השקופית כולה באמצעות לייזר או חותך התווין אוטומטי (איור 1).
  2. הניחו את הכיסוי המטופל בפלזמה על המגלשה המודבקת כדי לסגור את התא. השתמש בקצה פיפט כדי ללחוץ בעדינות את הכיסוי על האזורים המודבקים כדי להפוך את התעלה לאטומה למים.
  3. אם אתם משתמשים בזכוכית מחליקה, אטמו את הקצוות באמצעות שרף אפוקסי. לבסוף, לכל תא הדמיה העשוי ממגלשה וכיסוי יש ממד של 10 מ"מ x 2 מ"מ x 0.1 מ"מ (אורך x רוחב x עומק). אחסנו את תאי ההדמיה המיקרופלואידיים המוכנים למשך 1-2 שבועות בתנאי ייבוש (רצוי בין 10-25 מעלות צלזיוס).
    הערה: עבור קלטות חיתוך לייזר המשמשות עם שקופיות אקריליות, אין צורך להשתמש באפוקסי מכיוון שקצוות הקלטת יוצרים אטימה הדוקה חסינת דליפה.

3. ביצוע bilayers נתמך על מצע זכוכית על ידי פיוז'ן שלפוחית

הערה: דו-שכבתי שומנים נתמכים צפופים נוצרים על דפנות תא ההדמיה על ידי איחוי שלפוחיות שומנים שהוכנו עם PEG-ליפידים מסוממים.

  1. קח בקבוקון זכוכית נקי, רצוי לנקות מראש באמצעות תמיסת פיראנה. הוסף תמיסת כלורופורם של 1-פלמיטואיל-2-אולאויל-גליצרו-3-פוספוכולין (POPC) ו-1,2-דיאולאויל-sn-גליצרו-3-פוספוטאנולמין-N-[אמינו(פוליאתילן גליקול)-2000] (DOPE-PEG2000) בחלק השומה הרצוי של ליפידים PEG2000 כך שהריכוז הסופי לאחר הוספת חיץ יהיה 3 mM ליפידים בשלב 3.4. הכן קומפוזיציות קרום אחרות של שומנים באופן דומה.
  2. ייבשו את הכלורופורם מהבקבוקון באמצעות זרם עדין של חנקן עם מערבולת קטנה, כך שהשומנים המיובשים מצופים באופן אחיד על פני השטח של הבקבוקון. שים את הבקבוקון ב ואקום desiccator במשך 1 שעות. פעולה זו תסיר כל כלורופורם שיורי בבקבוקון הזכוכית. יש להוסיף 1 מ"ל של תמיסת מלח נטויה (PBS) ולדגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.
  3. הכינו שלפוחיות חד-שנתיות קטנות (רכבי שטח) כמתואר להלן.
    1. מערבלים בעדינות במשך 1-2 דקות לאחר דגירה במהלך הלילה עד שהתמיסה הופכת עכורה וחלבית.
    2. קח 100 μL של תמיסה זו בצינור צנטריפוגה קטן של 500 μL וסוניקט במשך כשעה אחת בסוניק אמבטיה (מוגדר בהגדרת הספק של 70 W). הפתרון יתבהר; אם לא, אז sonicate במשך 30 דקות נוספות. צעד זה ייצור רכבי שטח בקוטר 50-100 ננומטר.
      הערה: אם מתכוננים בפעם הראשונה, אפיינו את רכבי השטח באמצעות פיזור אור דינמי22,23 (DLS) או שיטה מקבילה.
  4. הוסיפו סידן כלורי (CaCl 2, 3 M) לשלפוחית הסוניקט, כך שהריכוז הסופי שלו הוא 30 mM בתמיסת השומנים.
  5. חותכים קצה micropipette להזרקת תמיסת הדגימה כך שהוא מתאים בחוזקה לתוך החור. מערבבים את תמיסת השומנים ומזריקים דרך אחד החורים בתא ההדמיה שנעשו בשלב 2. נגב את הפתרון העודף שיוצא מהתא מהשקע עם רקמה נקייה כדי למנוע זיהום של ערוצים סמוכים.
  6. השאירו את ההרכבה הזו בתא לח למשך 90 דקות. הכן תא לחות על ידי הצבת רקמה רטובה בקצה צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. הניחו את המגלשה הצידה בתוך הצינור כאשר מכסי הצינורות סגורים. הבועיות יתמזגו וייצרו דו-שכבתי אחיד על משטח הזכוכית.
  7. שטפו היטב את התא עם כמות עצומה של מאגר PBS (בערך פי 5 מנפח תא ההדמיה). מנע את הכניסה של בועות אוויר לתוך החדר בזמן כביסה כמו זה יכול ליצור פגמים בממברנה.

4. הגדרת מיקרוסקופ ומדידות הדמיה של חלקיקים בודדים

הערה: ניסויים במולקולה בודדת מתבצעים על מערך מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימיתמבוססת מטרה של 24,25,26 (TIRF) (איור 2). הדמיית TIRF מספקת יחס אות לרעש טוב יותר עבור הדמיה של מולקולה בודדת, אם כי ניתן להשתמש במיקרוסקופים אפי-פלואורסצנטיים גם בתנאים מסוימים (במיוחד כאשר ניתן להסיר את הביומולקולות הפלואורסצנטיות מהתמיסה בתפזורת על ידי שטיפה). ניתן להשתמש ב- TIRF מסוג פריזמה אך סוג המטרה עדיף על הקלות של הגדרת מיקרופלואידיקה27. עבור TIRF מסוג אובייקטיבי, מומלץ להשתמש ביעד מפתח צמצם מספרי גבוה (הגדלה של 100x, הזמינה בדרך כלל באופן מסחרי כמטרת TIRF).

  1. לפני ביצוע ניסוי כלשהו על ניידות והרכבה, יישר את מיקרוסקופ TIRF כדי להבטיח יחס אות לרעש אופטימלי עקב תאורה על ידי השדה האוונסנטי. במהלך היישור, שמור על עוצמת לייזר נמוכה, בין 100 μW ל- 1 mW.
    התראה: יש להשתמש במשקפי בטיחות לייזר במהלך יישור קרן הלייזר.
    1. כדי ליישר את המיקרוסקופ, הכינו דגימת חרוזים פלואורסצנטיים על ידי הוספתם לתעלה המיקרופלואידית בריכוזים נמוכים (ב~100 pM) כך שכתמי פלואורסצנט מחרוזים בודדים אינם חופפים בתמונות.
    2. ראשית, דמיינו את החרוזים במצב אפיפלואורסצנטי. בעוד שהתאורה נמצאת במצב אפיפלואורסצנטי, הזיזו את שלב תרגום המראה M5 (המראה שמחזירה את הלייזר לדיקרואיקון) כך שהקרן היוצאת מהמטרה מתכופפת עד שבסופו של דבר היא נמצאת בתצורת השתקפות פנימית כוללת.
    3. ודא אם הושגה תאורת TIR. כאשר שדה ה-TIR evanescent מאיר את דגימת החרוזים, בדקו שרק החרוזים על פני השטח נראים לעין ולא נצפו חרוזים שצפים בחופשיות הרחק מהמשטח.
  2. בתחילת הניסוי, הגדר את עוצמת הלייזר במישור המוקד האחורי של המטרה ל-5-10 mW כדי למנוע הרס פוטו (photolabaching) של הפלואורופורים.
  3. שמור את השקופית על שלב המיקרוסקופ והתמקד תחילה בקרום החשוף (ללא כל פלואורופורים). בדרך כלל, עקבות קטנים של זיהומים בקרום השומנים מספיקים כדי לעשות זאת. אופציונלי: שלבו מספר קטן של חרוזים פלואורסצנטיים או נקודות קוונטיות (תת-תחום פיקומולרי) במהלך שלב 3.1, כך שרק שניים עד חמישה חלקיקים פלואורסצנטיים נמצאים בשדה הראייה כדי להקל על זיהוי המיקוד הנכון.
  4. הזרקת הדגימה (חלבוני ממברנה וכו') באמצעות מיקרופיפטה לתוך תא ההדמיה המצופה PEG-SLB שנעשה בשלב 3.7.
  5. למדידת קינטיקה של קשירה של מולקולה בודדת, השתמשו במשאבת מזרק כדי להזרים את הביומולקולות המסומנות דרך חורי הכניסה לתוך התא המיקרופלואידי (איור 3). השתמש בקצב זרימה של 50-500 μL לדקה.
    1. התחל ברכישת סרטים לפני הוספת הפתרון לתא ההדמיה. רכשו >5,000 פריימים בקצב פריימים של 25-50 פריימים לשנייה בזרימה רציפה עד שלא תהיה עלייה נוספת במראה של כתמים חדשים על פני הממברנה (וידאו 1). לניתוח קינטיקה מחייבת, בצע את השלבים מ 6.1.
  6. למעקב אחר חלקיקים בודדים, הוסיפו את הביומולקולות המסומנות בריכוזים נמוכים (בהשוואה לקבוע הקשירה) לתעלה באמצעות מיקרופיפטה. מטב את הריכוז לצפיפות של <0.1 חלקיקים/μm 2 כך שחלקיקים בודדים כמעט ולא חוצים נתיבים (וידאו 2). זה מבטיח את הנאמנות הגבוהה של מסלולים התאושש מערכי הנתונים. לדגור במידת הצורך (במקרה של קשירת ממברנה לקויה על ידי biomolecules, ~ 10 דקות) בסביבה לחות ולשטוף את החדר עם החיץ.
    הערה: יש צורך בשטיפה במקרה שהכריכה לקויה על הממברנה ורוב המולקולות הפלואורסצנטיות נשארות בתמיסה. אחרת, הדבר עלול להפריע להדמיה ולגרום ליחס אות לרעש ירוד.
  7. לניתוח מסלול של חלקיק יחיד, רכשו 200-500 מסגרות ב-10-100 פריימים לשנייה. שמור על העדשה האובייקטיבית הממוקדת במישור הדו-שכבתי עם סחף שלב מינימלי במהלך מרווח הרכישה.

5. רכישת תמונה לספירת תת-יחידות במכלול חלבונים

הערה: רכישת תמונה להערכת סטויכיומטריה דורשת הלבנה מתמשכת של פלואורופורים וזיהוי מספר השלבים עד שלא פולטים יותר פלואורופורים.

  1. למדידת תת-יחידות, הוסף את הריכוז הרלוונטי של ביומולקולות מסומנות (לדוגמה: ראה תוצאות; ClyA נוספה בריכוז של 25 ננומטר) לתא ההדמיה המיקרופלואידי ולדגירה (שטיפה במידת הצורך). דגירה של השקופית בתא אדים בטמפרטורה הרצויה למשך פרק הזמן הנדרש (לדוגמה: 37 מעלות צלזיוס ו-60 דקות להרכבת ClyA).
  2. בצע רכישת תמונה עבור הלבנת תמונות של מולקולה בודדת כמתואר להלן.
    1. שטפו את תא ההדמיה עם חיץ לפני ההדמיה (במידת הצורך). הנח את השקופית על המיקרוסקופ והתאם את המיקוד כדי להמחיש את המולקולות המסומנות.
    2. הגדר את כוח הלייזר לרמה שבה הלבנת הפלואורופור מתרחשת בהדרגה (~ 1-5 דקות). באופן אידיאלי, עבור כל ביומולקולה שהורכבה, יש לשמור על קצב שלב ההלבנה >10-20 מסגרות הדמיה זו מזו. רכשו את התמונות עד שכל המולקולות יתחלפו לחלוטין (וידאו 3).
      הערה: כדי לקבוע את משך הזמן הכולל של מסלול ההלבנה הנדרש, התווה את העוצמה הממוצעת של כתמים בודדים עם מספר מסגרות ההדמיה וקבע את קבוע הזמן על ידי התאמת פונקציית דעיכה מעריכית. ניתן להגדיר את משך הזמן הכולל של הרכישה ל 5-10 פעמים קבוע הזמן.
  3. בצע מדידת הרכבה תלוית זמן על ידי התחלת רכישת סרטים ברגע שהדגימה מוכנסת לתא ורכישת סרטי הלבנת תמונות חדשים במרווחי זמן קבועים לאחר קשירת הממברנה ממקטעים שונים של PEG-SLB.

6. ניתוח תמונות ונתונים

  1. בצע קשירה ומעקב אחר חלקיקים בודדים כמתואר להלן.
    1. חלצו מסלולים של חלקיקים בודדים מהסרטים שנרכשו לעיל, כפי שמוצג באיור 4. לאיתור חלקיקים בודדים ומעקב אחריהם, השתמש בחבילת MATLAB, u-track28, או ב- Trackmate29, תוסף ב- ImageJ, המספק גם אלגוריתם חזק למעקב אחר חלקיקים בודדים. בצע את השלבים להגדרת ניתוח u-track כפי שמוצג בקובץ משלים 1.
      הערה: הפרמטרים הקריטיים למעקב אחר חלקיקים בודדים הם סטיית התקן של גודל החלקיקים (בפיקסלים) ואורך סגירת הפער. השתמש ב- 1 וב- 0, בהתאמה, עבור פרמטרים אלה כקריטריונים המחמירים ביותר למעקב.
    2. כדי לחשב את קבועי קצב הקשירה, העריכו תחילה את מספר החלקיקים הנקשרים לפני השטח של הממברנה לאורך זמן. השתמש בקובץ MATLAB binding_SPT (קובץ קידוד משלים 2) עם תיקיית הפלט u-track כדי לזהות ולהתוות את מספר החלקיקים המופיעים על הממברנה המתקבלת משלב 6.1. התאימו את הקינטיקה הנצפית למודלים קינטיים מתאימים (לדוגמה: התאמה מעריכית יחידה לקביעת קבוע הזמן, שההופכי שלו ניתן להקצות לקבוע קצב נראה)30 כדי לחלץ את קבועי הקצב (ראו תוצאות, איור 5).
    3. התזוזה הממוצעת בריבוע (MSD) של החלקיקים המתפזרים (כגון מעקב דנ"א ב-PEG-SLBs, איור 6) מצביעה על אופי הדיפוזיה. השתמש בחבילת MATLAB MSD_ISD (קובץ קידוד משלים 2) עם תיקיית הפלט u-track כדי לקבל את עלילת MSD כפונקציה של זמן השהיה (איור 6B).
    4. כדי לזהות מינים הטרוגניים מתפזרים, חשבו התפלגויות מיידיות של תזוזה בריבוע (ISD) כפי שמוצג באיור 6C. ISD2, המוגדר כ- (X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Y t)2, כאשר זמן השהיה, τ = 2, מועדף מכיוון שהוא מפחית רעש. סנן מסלולים קצרים עם פחות משלוש מסגרות כדי להפחית את הרעש.
    5. השתמש ISD_analyzer (קובץ קידוד משלים 2) ב- MATLAB עם פלט מסלול u כדי להתוות את ספקי האינטרנט של החלקיקים במעקב (איור 6C).
  2. בצע ניתוח פוטו-הלבנת מולקולה בודדת כמתואר להלן.
    1. כדי להעריך את הסטויכיומטריה של קומפלקסי הממברנה, בצע ניתוח פוטו-הלבנה על העוצמות התלויות בזמן של קומפלקסים פלואורסצנטיים (וידאו 3). לשם כך, החל אלגוריתם תיקון סחף (drift_correct_images, קובץ קידוד משלים 2) המבוסס על ההתאמה האוטומטית של מסגרות סרט כדי לחלץ את סחף התרגום. זאת בהנחה שהמבנים המורכבים הם במידה רבה חסרי תנועה במהלך רכישת תמונה. הפעל את חבילת MATLAB Extract_traces_1C (קובץ קידוד משלים 2) כדי לזהות עקבות זמן של עוצמת חלקיקים מהסרטים.
    2. השתמש בקוד MATLAB Stepcount_immobile (קובץ קידוד משלים 2) כדי לבצע את זיהוי השלבים עבור עקבות זמן העוצמה. במקרה שהחלקיקים אינם חסרי תנועה, השתמש בחבילת u-track כדי לחלץ את מיקומם של חלקיקים נעים. ניתן למפות קבוצה זו של קואורדינטות xy לסרטים הגולמיים כדי לחלץ את ערכי העוצמה של החלקיק הנע כשהוא מתפזר לרוחב על הממברנה. השתמש בחבילת MATLAB utrack_Int (קובץ קידוד משלים 2) עם הפלט מניתוח u-track עבור אפשרות זו.
    3. בצע תיקון לתיוג לא שלם של הביומולקולות עם תגי פלואורופור כדי להעריך את הסטויכיומטריה המורכבת הנכונה של חלבונים. קבע את יעילות הסימון באמצעות ספקטרופוטומטר UV-VIS על ידי מדידת ספיגת הצבע והחלבון כדי להעריך את הריכוז. חשב את יעילות הסימון כיחס הטוחן של הצבע לחלבון.
      הערה: חלק מהצבעים נספגים גם באורכי גל הקרובים ל-280 ננומטר, ולכן יש לקחת בחשבון את תרומת הספיגה הזו של הצבע במהלך חישוב הריכוז.
    4. בצע תיקון בינומי כדי לקחת בחשבון את יעילות התיוג הלא שלמה של הפלואורופור באופן הבא באמצעות קוד MATLAB Step_correction (קובץ קידוד משלים 2) עם הנתונים המתקבלים מספירת השלבים בשלב 6.2.2. לדוגמה, עבור רעלן יוצר נקבוביות כמו ציטוליזין A, היוצר מבנה דמוי טבעת דודקאמרית, החל תיקון בינומי באמצעות הנוסחה הבאה:
      נקEquation 1
      כאשר Equation 2 = יעילות התיוג, n = מספר שלבי ההלבנה בתמונה, ו- s = ספירות בפועל. השתמש בשגרת MATLAB Stepcount_immobile כדי לשחזר את המינים האוליגומריים המתוקנים. המירו את התדירות של אוליגומרים (s i) לשברי מסה (איור 7C; קובץ קידוד משלים 2).
      הערה: קבוצה של קבצים שנותחו על-ידי המעקב כלולים בקובץ קידוד משלים 3. ניתן להפעיל את קודי MATLAB בקובץ קידוד משלים 2 עם ערכות נתונים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניטור הקשירה של חלבון ClyA על ממברנות PEGylated
לאחר שלב 4.5, הקינטיקה המחייבת נאמדת על ידי התוויית מספר החלקיקים הנקשרים לפני השטח של הממברנה לאורך זמן (וידאו 1). כאשר חלבון ClyA נקשר לממברנה עם 5 מול% PEG2000 שומנים, צפיפות החלקיקים גדלה ומגיעה לרוויה (איור 5). דעיכה מעריכית המתאימה לחלקיקים הכבולים (מעגלי ציאן) נותנת את קבוע הזמן (τb) עבור קשירת הממברנה (יש לציין שנקודות הזמן הראשוניות [עיגולים אדומים] אינן מתאימות במקרה זה).

ניידות של מעקב DNA על ממברנות צפופות
בדרך כלל אנו משתמשים במעקב דנ"א (דנ"א המעוגן לממברנה באמצעות טוקופרול), בצבעי מעקב ליפופיליים (לדוגמה, DiI) או בחלבוני ממברנה (לדוגמה, ClyA) כדי לאפיין את הממברנה תחת צפיפות בתיווך PEG. ניתן לעקוב אחר דיפוזיה צידית של מולקולות עוקבות מסומנות (25-100 pM) על ידי הדמיה של הממברנה בעת קשירת החלקיקים. בהיעדר פולימר PEG כלשהו בממברנה, רוב העוקבים (במיוחד אלה המשתרעים מחוץ לדו-שכבתי) מציגים דיפוזיה מוגבלת על SLBs (איור 6A). עם רמות קטנות של PEG2000 בממברנה (0.5-2 מול), הדו-שכבה מתרוממת מהמשטח התחתון, ומולקולות העקיבה יכולות להתפזר ללא אילוצים. מצד שני, כליאה קיצונית נצפית בריכוז גבוה של PEG (20 mol%), כאשר מולקולות PEG נמצאות במשטר מברשת צפוף, עם מגוון התנהגויות המוצגות בין לבין. חלקות MSD עבור שלושת התנאים האלה מוצגות באיור 6B. בהתבסס על האפיון שלנו של ממברנות דו-שכבתיות POPC/DOPE-PEG2000, אנו ממליצים על חלק של 1-3% DOPE-PEG2000 הגורם לצפיפות במשטר הפטריות. מעל 7.5 mol% PEG2000-lipid, אנו רואים את תחילת משטר המברשות, והרכבים עד 25 mol% PEG2000-ליפידים ניתן להשתמש כדי לגרום צפיפות וכליאה. התנאים המתערבים של 4-7% PEG2000-ליפידים המתאימים למעבר בין שני המשטרים אינם מאופיינים היטב ויש להימנע מהם.

הרכבה של ClyA על ממברנות צפופות
מסלולי העוצמה של כתמים בודדים מוגבלי עקיפה של חלבון ClyA לאחר הדגירה על הממברנה הצפופה (איור 7A,B) מציגים מספר רב של שלבי הלבנה שונים, מה שמרמז על היווצרותם של מתווכי הרכבה שונים31. ClyA, להיות חלבון transmembrane, אינטראקציה עם משטח זכוכית טעון שלילית בהיעדר PEG יהיה להרכיב גרוע מאוד. בליפידים של 7.5% PEG2000, הקומפלקסים המורכבים נמדדו והם מתווים באיור 7C. לאחר תיקון יעילות הסימון (0.9 במקרה זה), ההתפלגות הסופית של האוליגומרים מציגה את המין הדודקמרי ClyA כמבנה הדומיננטי, העולה בקנה אחד עם נתונים מבניים32.

Figure 1
איור 1: סכמטי עבור שלבי הניקוי והרכבת התא המיקרופלואידי. (A) מגלשות הזכוכית וכיסויי הכיסוי מנוקים באמצעות סוניקציה רציפה בחומרי ניקוי, אצטון, מתנול, KOH ותמיסת פיראנה, עם שטיפה מרובה במים אולטרה-טהורים מסוג 1 בין כל שלב. לאחר מכן, השקופיות והכיסויים מיובשים בגז חנקן לפני טיפול בפלזמה. (B) לאחר מכן מרכיבים את תא ההדמיה המיקרופלואידי באמצעות סרט דבק דו-צדדי חתוך מראש הקושר את השקופית לכיסוי. *שקופיות אקריליות אינן מטופלות בתמיסת פיראנה, והאצטון, המתנול וה-KOH משמשים בריכוז של 50% (v/v) מזה המשמש לניקוי כיסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הגדרת מיקרוסקופ TIRF. מערך מיקרוסקופ TIRF טיפוסי מסוג אובייקטיבי המותאם למיקרוסקופ הפוך מוצג עם אופטיקה חיונית מודגשת. M1–M5 הן מראות להיגוי קרן הלייזר. עדשות L1 ו-L2 משמשות להרחבת קרן הלייזר, ועדשת L3 ממקדת את קרן הלייזר אל מישור המוקד האחורי של העדשה האובייקטיבית. I1 ו- I2 הן דיאפרגמות הקשתית המשמשות ליישור קרן הלייזר. תריס משמש לשליטה בתאורת קרן הלייזר, קריטי למניעת הלבנה מיותרת של מולקולות הפלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מערך זרימה קינטית של קשירת ממברנה. לביצוע ניסוי הכריכה, צינור PTFE דק (0.022 במזהה x 0.042 ב- OD) משמש להזרמת הדגימה בעזרת משאבת מזרק (תמונה לא בקנה מידה). קצה הצינורות מחובר לשקע תא ההדמיה בעזרת קצה מיקרופיפטה. ההשלכה נאספת במאגר מיקרוטיפ קטן המחובר לשקע, והנפח המוצג תמיד גדול מפי 10 מנפח תא ההדמיה. איור משובץ המציג חתך רוחב של תא ההדמיה. (התמונה לא בקנה מידה) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: צינור לניתוח ממסלולים של חלקיקים בודדים וסרטים של הלבנת תמונות. (A) הסרטים שנרכשו נותחו באמצעות מסלול u ב-MATLAB כדי לקבל את המסלולים כ-(x, y) ואת העוצמות (i) של כל חלקיק, פריים אחר פריים. מסלולים אלה שימשו לאחר מכן לחישוב תזוזה ריבועית מיידית (ISD), ISD1 ו- ISD2. לאחר מכן ניתן לשרטט את ה-ISDs כהיסטוגרמות כדי לזהות מינים ניידים. לחלופין, עלילות תזוזה בריבוע ממוצע (MSD) מודיעות אם התנועה היא גאוסית, מוגבלת אוסופר-מפוזרת 33,34. ניתן להשתמש בניתוח מרקוב נסתר מודל35 (HMM) כדי להבחין בין מצבים דיפוזיים שונים של חלקיק בודד. (B) לצורך ניתוח הלבנת הפוטו, הסרטים תוקנו תחילה להיסחפות במערכת (במידת הצורך), ולאחר מכן לזיהוי חלקיקים או מעקב באמצעות מסלול u. מלבד הערכת התפלגות העוצמה23 (ותכונות חלקיקים אחרות), ניתן לנתח את מסלולי העוצמה עבור מספר שלבי ההלבנה באמצעות אלגוריתמים למציאת שלבים 36,37,38. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: קשירת ClyA לממברנות שומנים נתמכות עם 5 mol% DOPE-PEG2000. עקומת קשירה טיפוסית מתקבלת לאחר ספירת מספר החלקיקים בכל מסגרת שזוהתה על ידי u-track. ההדמיה מתבצעת לפני זרימת חלבון ClyA הקושר את הממברנה. פונקציית דעיכה מעריכית (קו שחור) המתאימה למספרי חלקיקים (מעגלי ציאן) משמשת לשחזור קבוע הזמן לקשירת ClyA לממברנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: ניידות של דנ"א ליפופילי על ממברנות דו-שכבתיות של PEG-שומנים . (A) מוצגת סכמת עבור עוקב הדנ"א הליפופילי בממברנת POPC/DOPE-PEG2000. (B) מוצגות תזוזות ממוצעות בריבוע המחושבות ממעקב אחר חלקיקים בודדים עבור PEG-SLB שונים. ב-2 mol% DOPE-PEG2000, מעקב הדנ"א מציג התנהגות בראונית טהורה בהשוואה לניידות מופרעת בהיעדר הפולימר (קו מקווקו נכלל לצורך התייחסות). מצד שני, אותו מעקב DNA סוטה הרחק מדיפוזיה בראונית טהורה, מה שמצביע על תנועה תת-דיפוזית עם ניידות מופחתת בנוכחות 20% mol% DOPE-PEG2000. (C) התפלגות ISD2 לדיפוזיה של מעקב DNA ליפופילי בשני ממברנות שומנים שונות מסוג PEG2000 מושווית ל-SLBs חשופים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: עקבות פוטו-הלבנה והרכבת ClyA על ממברנות דו-שכבתיות של שומנים . (A,B) עקבות זמן מייצגים מראים שלבי הלבנה של קומפלקס ננו-נקבוביות ClyA שזוהו בשלב 6.2.1. עבור קומפלקס ClyA מורכב עם 7 ו 5 צעדים, בהתאמה. (C) התפלגות שלב הפוטו-הלבנה (אפורה) עבור ClyA (25 ננומטר) מודגרת על 64.7% POPC: 27.8% כולסטרול: 7.5% קרום DOPE-PEG2000 למשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר תיקון ליעילות הסימון הלא שלמה, מוצג חלק המסה המשוער של מינים אוליגומריים שונים (מגנטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרטון 1: קשירת ClyA על הממברנה. ניטור חלבון ClyA עם תווית Cy3 נקשר לקרום SLB המכיל 5 mol% DOPE-PEG2000. החלקיקים הכבולים מזוהים (מעגלי ציאן) על ידי מסלול u, והמסלולים משורטטים לחמישה מיקומים עוקבים במסלולם. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו 2: דיפוזיה של מעקב DNA על קרום 2 mol% PEG. סרט לדנ"א עם תווית Cy3 המעוגן לממברנה השומנית באמצעות טוקופרול בקרום 2 mol% PEG2000. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו 3: צילום סרט. סרט של אוליגומרים מורכבים של מולקולות ClyA המסומנות ב-Cy3 על הממברנה המכילה 7.5% מול% DOPE-PEG2000. קומפלקסים גדולים יותר ניכרים בעוצמות גבוהות פי כמה בהשוואה לחלבון בודד, כמו גם משלבי הפוטו-הלבנה המרובים שבהם עוצמת החלקיקים נצפית לאורך זמן תחת תאורה רציפה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

קובץ משלים 1: מידע על אופן השימוש במסלול u ובקודי MATLAB שונים בשלב 6. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 1: קובץ תכנון מייצג בעזרת מחשב (CAD) ליצירת חורים בשקופית האקרילית וסרט חיתוך עבור השקופית כולה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קבצי קידוד משלימים 2: תיקייה דחוסה המכילה קודי MATLAB משויכים הדרושים לניתוח תמונות ונתונים בשלב 6. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קבצי קידוד משלימים 3: נתונים לדוגמה לניתוח תמונות ונתונים בשלב 6. קודי MATLAB זמינים גם כן ב-https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מדגימים ניסויים של מולקולות בודדות על דו-מולקולות נתמכות של שומנים (SLBs) שמפגינים סביבה צפופה עבור ביומולקולות משובצות ממברנה. הסביבה הצפופה יוצרת אפקט נפח מוחרג, המוביל לשיפור התגובות הביומולקולריות 1,2,39,40. עבור מערכת PEG-lipid, שבה הפולימר תופס בעיקר את הנפח מחוץ לדו-שכבתי, השפעה זו בולטת במיוחד עבור מינים מולקולריים עם תחומי ecto גדולים. לכן, בהשוואה לצבעים ליפופיליים, ניתן להפחית באופן משמעותי את הדיפוזיה של מולקולה הידרופילית גדולה המוטמעת בממברנה, כגון קולטנים, גליקופרוטאינים וגליקוליפידים. באמצעות דנ"א עוקב פלואורסצנטי המעוגן לממברנה באמצעות טוקופרול (איור 5), אנו יכולים לזהות השפעות צפיפות כאלה.

בנפרד, נוכחות PEG בעלון התחתון גם מרימה את ה- SLB ומפחיתה את האינטראקציה של הביומולקולות עם מצע התמיכה14,41. בדרך כלל, המשטח הטעון שלילית של משטח זכוכית ההדמיה מעכב לעתים קרובות ניידות ותגובות מולקולריות. לכן, השימוש ב-PEG-lipids כדי להרים את הממברנה הרחק מהזכוכית הוא יתרון גם כאשר לא לצורך צפיפות. עם זאת, יש להקפיד על זיהוי משטרי הריכוז שאינם מבטאים צפיפות מולקולרית במקרים אלה. עבור חלבונים המרחיבים תחומים גדולים יותר מחוץ לדו-שכבתי, השימוש בליפיד PEG בעל משקל מולקולרי גבוה יותר כגון PEG5000 עשוי להיות נחוץ42.

כמה נקודות מפתח הן קריטיות להדמיה של מולקולה בודדת במערכות SLB. ניקוי קפדני של השקופיות והכיסויים הוא קריטי בניסויים של מולקולה בודדת (שלב 1). הדמיה של משטח עם זיהומים תגרום פגמים בקרום השומנים. זה יכול לגרום לכתמים של ביומולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי על פני הממברנה. ניתן לאמת את הכיסוי והאחידות של SLB שנוצר בתכשיר נפרד על ידי סימום הדו-שכבתי בצבע שומנים (DiI או Lissamine Rhodamine DOPE) והדמיתו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן להשתמש בניתוח FRAP כדי למדוד את ההתנהגות הדיפוזיבית גם43,44.

עבור ניסויי קשירת ממברנה (שלב 4), מערך הזרימה עם הצינורות צריך להיות מוכן עם חיץ כדי למנוע כניסה של בועות אוויר לתוך התא. קצבי זרימה גבוהים יותר או נוכחות של בועות אוויר יקרעו את הממברנה, והמולקולות ייקשרו ישירות לכיסוי. רכישת התמונה צריכה להתחיל לפני תחילת הזרימה, שכן מולקולות מסוימות מתפזרות מהצינורות ונקשרות לממברנה. ניתן להקל על מיקוד המטרה בדו-שכבה במהלך ההדמיה על ידי סימום הדו-שכבתי בריכוז נמוך עם ננו-חלקיקי זהב, נקודות קוונטיות או חרוזים פלואורסצנטיים.

בניסויי המעקב אחר חלקיקים בודדים, יש לשלוט במספר החלקיקים על הממברנה כדי למנוע תרחיש שבו המעקב מאתגר עקב חפיפה מוגזמת של מסלולי החלקיקים. גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון במהלך ההדמיה הוא עוצמת הלייזר. עוצמת לייזר גבוהה תצלם את הפלואורופורים במהירות, בעוד שעוצמה נמוכה וקצבי רכישת התמונה האיטיים המתאימים יגרמו לטשטוש. עוצמת לייזר אופטימלית אמורה להניב אורך מסלול משמעותי (לפחות >5 בממוצע) תוך שמירה על תמונות סימטריות וקרובות לתמונות מוגבלות עקיפה של חלקיקים. מערכת נטרול חמצן יכולה לשמש גם כדי להאריך את photobleaching של fluorophores45. מגבלה של ניתוח הפוטו-הלבנה המוצגת כאן עולה 37,46 במקרה של מכלולים מולקולריים גדולים (~ גדולים מ-20 תת-יחידות), כגון קומפלקס הנקבוביות הגרעיניות47. במקרים כאלה, ניתן להשתמש בגישה מבוססת בייסיאן כדי להסיק את אוכלוסיית תת-היחידות48,49,50.

התיוג של ביומולקולות עם פלואורופורים ברוב המקרים אינו שלם51. זה מציב אתגר בספירת תת-יחידות באשכול עם מינים ללא תווית. תיקון בינומי ליעילות הסימון התת-נקוב הוא בדרך כלל קירוב סביר כאשר הסטויכיומטריה של המין המולקולרי קבועה. במקרים רבים, מינים אוליגומריים יכולים להיות הטרוגניים או משתנים באופן דינמי, כמו בתהליך אוליגומריזציה, הדורש פיתוח כלים חדשים לחילוץ ההתפלגויות הבסיסיות מנתוני הלבנה.

בסך הכל, פרוטוקול זה מספק צינור ליצירת PEG-SLBs, עם המלצות לתנאים לשימוש, ביצוע וניתוח קשירת מולקולה בודדת, ומעקב וביצוע אנליזה פוטו-לבנה עבור ביומולקולות של ממברנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לפרופ' בנימין שולר על שיתוף הביטוי פלסמיד לחלבון ClyA. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע של הגבול האנושי (RGP0047-2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

ביוכימיה גיליון 185
דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., … More

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter