Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

Qui viene presentato un protocollo per eseguire e analizzare il legame, la mobilità e l'assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate artificiali utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale a singola molecola (smTIRF).

Abstract

Le membrane cellulari sono ambienti molto affollati per le reazioni biomolecolari e la segnalazione. Tuttavia, la maggior parte degli esperimenti in vitro che sondano l'interazione proteica con i lipidi impiegano membrane nude a doppio strato. Tali sistemi mancano delle complessità dell'affollamento da parte di proteine e glicani incorporati nella membrana ed escludono gli effetti di volume associati incontrati sulle superfici della membrana cellulare. Inoltre, la superficie di vetro caricata negativamente su cui si formano i doppi strati lipidici impedisce la libera diffusione delle biomolecole transmembrana. Qui, presentiamo una membrana polimero-lipidica ben caratterizzata come imitazione per membrane lipidiche affollate. Questo protocollo utilizza lipidi coniugati con glicole polietilenico (PEG) come approccio generalizzato per incorporare i crowder nel doppio strato lipidico supportato (SLB). In primo luogo, viene presentata una procedura di pulizia dei vetrini microscopici e dei vetrini per l'esecuzione di esperimenti a singola molecola. Successivamente, vengono discussi i metodi per caratterizzare i PEG-SLB ed eseguire esperimenti a singola molecola del legame, della diffusione e dell'assemblaggio di biomolecole utilizzando il tracciamento di singole molecole e il fotosbiancamento. Infine, questo protocollo dimostra come monitorare l'assemblaggio di nanopori della tossina batterica che forma i pori Citolisina A (ClyA) su membrane lipidiche affollate con analisi di fotosbiancamento a singola molecola. Sono inclusi anche codici MATLAB con set di dati di esempio per eseguire alcune delle analisi comuni come il tracciamento delle particelle, l'estrazione del comportamento diffusivo e il conteggio delle subunità.

Introduction

Le membrane cellulari sono sistemi altamente affollati e complessi1. L'affollamento molecolare può avere un impatto considerevole sulla diffusione di entità legate alla membrana come proteine e lipidi 2,3,4. Allo stesso modo, le reazioni bimolecolari sulle membrane lipidiche come la dimerizzazione dei recettori o l'oligomerizzazione dei complessi di membrana sono influenzate dall'affollamento 5,6,7. La natura, la configurazione e la concentrazione dei crowder possono governare il legame di membrana, la diffusività e l'interazione proteina-proteina in diversi modi 8,9. Poiché controllare l'affollamento delle membrane cellulari e interpretare la sua influenza sulle biomolecole incorporate è impegnativo, i ricercatori hanno cercato di stabilire sistemi alternativi in vitro 10.

Un approccio popolare per le membrane artificiali affollate è il drogaggio delle membrane a doppio strato con polimeri (come polietilenglicole, PEG) lipidi innestati11,12. Durante la visualizzazione della dinamica proteica e lipidica su doppi strati lipidici supportati (SLB), questi polimeri schermano ulteriormente i componenti incorporati nella membrana dal substrato sottostante caricato negativamente (come il vetro) sollevando efficacemente il doppio strato lontano dal supporto sottostante. Variando la dimensione e la concentrazione del polimero, è possibile controllare l'estensione dell'affollamento molecolare, nonché la sua separazione dal supporto solido sottostante13,14. Questo è chiaramente un vantaggio rispetto ai doppi strati lipidici supportati su substrati solidi senza cuscini polimerici15,16, dove le biomolecole transmembrana possono perdere la loro attività17,18,19. Ancora più importante, ci permette di ricapitolare l'ambiente affollato della membrana cellulare in vitro, che è fondamentale per molti processi di membrana.

Anche i polimeri innestati superficialmente sulle membrane subiscono cambiamenti nella loro configurazione a seconda della loro densità di innesto12. A basse concentrazioni, rimangono in una configurazione a spirale entropica, nota come fungo, sopra la superficie della membrana. Con l'aumentare della concentrazione, iniziano a interagire e tendono a srotolarsi ed estendersi, producendo infine una densa formazione simile a una spazzola sulla membrana21. Poiché la transizione dal fungo al regime del pennello è altamente eterogenea e si manifesta in condizioni scarsamente caratterizzate del polimero, è importante utilizzare condizioni ben caratterizzate per l'affollamento su membrane innestate in polimero. Rispetto ad un recente studio20, identifichiamo e riportiamo composizioni di membrana affollate che mantengono il trasporto diffusivo e l'attività delle biomolecole transmembrana.

In questo protocollo, discutiamo come generare membrane lipidiche PEGilate e forniamo raccomandazioni per le densità PEG che imitano l'affollamento in due diversi regimi di configurazione polimerica (vale a dire, funghi e spazzole). Il protocollo descrive anche il legame di singole molecole, il tracciamento delle particelle e l'acquisizione e l'analisi dei dati di photobleaching per le molecole incorporate in queste membrane affollate. In primo luogo, descriviamo le fasi di pulizia approfondite, l'assemblaggio della camera di imaging e la generazione di PEG-SLB. In secondo luogo, forniamo dettagli per il legame a singola molecola, il tracciamento delle particelle e gli esperimenti di fotosbiancamento. In terzo luogo, discutiamo i) estraendo le affinità di legame relative, ii) caratterizzando la diffusione molecolare e iii) contando le subunità in un assemblaggio proteico da film di singole molecole sulla membrana.

Mentre abbiamo caratterizzato questo sistema con l'imaging a singola molecola, il protocollo è utile per tutti i biofisici di membrana interessati a comprendere l'effetto dell'affollamento sulle reazioni biomolecolari sulle membrane lipidiche. Nel complesso, presentiamo una solida pipeline per la realizzazione di doppi strati lipidici affollati e supportati, insieme a vari saggi a singola molecola condotti su di essi e le corrispondenti routine di analisi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Pulizia del vetrino e del coprivetrino per esperimenti a singola molecola

  1. Prima dell'assemblaggio della camera di imaging, pulire e preparare sia i vetrini che i vetrini. Praticare più coppie di fori sui vetrini utilizzando una perforatrice con punte diamantate (0,5-1 mm di diametro). Se si utilizzano fogli acrilici, utilizzare un taglio laser per praticare fori precisi (0,5 mm), come mostrato nella Figura 1.
    NOTA: Ogni coppia di fori fungerà da ingresso e uscita per lo scambio di flusso per una singola camera microfluidica. Un file CAD rappresentativo per i fori in un vetrino acrilico è disponibile nel file di codifica supplementare 1. I fori praticati su vetrini di solito finiscono per essere 1,5x-2x più grandi della dimensione della punta del trapano.
  2. Pulire i vetrini e i vetrini con detergente. Risciacquarli accuratamente con acqua deionizzata. Posizionare i vetrini e i vetrini in un barattolo separato per la colorazione dei vetrini (Coplin) con acqua e sonicare in un sonicatore da bagno per 30 minuti. Per tutti i passaggi di sonicazione, utilizzare un'impostazione di potenza di 70 W.
  3. Rimuovere l'acqua e riempire il barattolo Coplin contenente i vetrini e i vetrini con acetone fino all'orlo (50-100 ml a seconda del volume del barattolo). Nel caso di fogli acrilici, utilizzare lo stesso volume di soluzione di acetone premiscelata al 50% (v/v), altrimenti i vetrini diventeranno gelidi. Agitare il barattolo Coplin per assicurarsi che tutti i vetrini e i vetrini siano completamente immersi nella soluzione e sonicare in un sonicatore da bagno per 30 minuti.
  4. Rimuovere l'acetone e gettarlo in un contenitore per rifiuti, versare il metanolo nei barattoli Coplin (50%, v / v per vetrini acrilici) e sonicare per 30 minuti. Sia l'acetone che il metanolo vengono utilizzati per rimuovere le particelle organiche sui vetrini.
  5. Risciacquare i vetrini e i coprivetrini con abbondanti quantità di acqua di tipo 1 e metterli in un barattolo di vetro Coplin. Versare la soluzione 1 M KOH nel barattolo e sonicare per 1 ora. Per i vetrini acrilici, utilizzare 0,5 M di KOH.
  6. Gettare il KOH in un contenitore per rifiuti inorganici. Risciacquare il barattolo con abbondante acqua e posizionare i barattoli Coplin in una cappa aspirante per il trattamento piranha. Non eseguire il trattamento piranha per vetrini acrilici; Procedere direttamente al passaggio 1.9.
    ATTENZIONE: Il trattamento con Piranha deve essere effettuato in una cappa aspirante con guanti adeguati, occhiali di sicurezza e un grembiule per la manipolazione degli acidi. La soluzione di Piranha è un forte agente ossidante e rimuove eventuali particelle organiche residue dai vetrini e dai vetrini.
  7. Per preparare la soluzione di piranha, versare delicatamente un volume di 2/3 di acido solforico (98%, v/v) in un bicchiere di vetro e riempire il resto con perossido di idrogeno (30%, v/v). Mescolare accuratamente la soluzione con una bacchetta di vetro, versarla nel barattolo Coplin e lasciare il barattolo Coplin nella cappa aspirante per almeno 1 ora.
  8. Decantare la soluzione di piranha dal barattolo Coplin in un contenitore di scarto per rifiuti acidi conservati all'interno della cappa aspirante. Risciacquare il barattolo Coplin con una quantità abbondante di acqua di tipo 1.
  9. Asciugare i vetrini e i vetrini in un getto delicato di azoto gassoso e metterli in un barattolo Coplin pulito. I vetrini e i vetrini essiccati sono ora pronti per il trattamento al plasma. Prendi un paio di vetrini e coprivetrini e mettili nella macchina al plasma.
  10. Crea un vuoto nella camera. Ruotare la manopola sulla frequenza radio di 8-12 MHz per generare plasma nella camera. Un bagliore viola all'interno della camera indicherà la formazione di un plasma nella camera.
  11. Eseguire il trattamento al plasma per 8-10 min. Rilasciare delicatamente il vuoto dopo aver spento il plasma e procedere al passaggio 2 per l'assemblaggio della camera di imaging microfluidica.

2. Assemblaggio della camera microfluidica

NOTA: la camera di imaging viene creata inserendo del nastro biadesivo tra un vetrino e una slitta pre-puliti del passaggio precedente, come descritto di seguito.

  1. Montare i vetrini e il coprislip dopo il trattamento al plasma, come mostrato nella Figura 1. Posizionare il vetrino su una carta velina pulita. Tagliare il nastro biadesivo in strisce larghe ~ 2-3 mm e posizionarle su ciascun lato di un paio di fori sul vetrino. Utilizzare una punta del pipet per appiattire il nastro o causerà perdite da un canale all'altro.
    NOTA: In alternativa, tagliare il nastro per l'intera diapositiva utilizzando un laser o una taglierina plotter automatica (Figura 1).
  2. Posizionare il vetrino di copertura trattato al plasma sul vetrino con nastro adesivo per chiudere la camera. Utilizzare una punta del pipet per premere delicatamente il coperchio sulle regioni con nastro adesivo per rendere il canale impermeabile.
  3. Se si utilizzano vetrini, sigillare i bordi con resina epossidica. Infine, ogni camera di imaging costituita da una diapositiva e da una copertina ha una dimensione di 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (lunghezza x larghezza x profondità). Conservare le camere di imaging microfluidico preparate per 1-2 settimane in condizioni essiccate (preferibilmente tra 10-25 °C).
    NOTA: Per i nastri tagliati al laser utilizzati con vetrini acrilici, non è necessario utilizzare resina epossidica poiché i bordi del nastro formano una tenuta ermetica a prova di perdite.

3. Realizzazione di due strati supportati su substrato di vetro mediante fusione di vescicole

NOTA: I doppi strati lipidici supportati affollati sono generati sulle pareti della camera di imaging dalla fusione di vescicole lipidiche preparate con lipidi PEG drogati.

  1. Prenda una fiala di vetro pulita, preferibilmente pre-pulita con la soluzione di piranha. Aggiungere la soluzione di cloroformio di 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[ammino(polietilenglicole)-2000] (DOPE-PEG2000) alla frazione mole desiderata dei lipidi PEG2000 in modo tale che la concentrazione finale dopo l'aggiunta del tampone sia di 3 mM lipidi nella fase 3.4. Preparare altre composizioni di membrana di lipidi in modo simile.
  2. Asciugare il cloroformio dal flaconcino usando un leggero getto di azoto con un piccolo vortice in modo che i lipidi essiccati siano uniformemente rivestiti sulla superficie del flaconcino. Mettere il flaconcino in un essiccatore sottovuoto per 1 ora. Questo rimuoverà qualsiasi residuo di cloroformio nel flaconcino di vetro. Aggiungere 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e incubare per una notte a 37 °C.
  3. Preparare piccole vescicole unilamellari (SUV) come descritto di seguito.
    1. Vortice delicatamente per 1-2 minuti dopo l'incubazione durante la notte fino a quando la soluzione diventa torbida e lattiginosa.
    2. Prelevare 100 μL di questa soluzione in una piccola provetta da centrifuga da 500 μL e sonicare per circa 1 ora in un sonicatore da bagno (impostato su una regolazione di potenza di 70 W). La soluzione diventerà chiara; In caso contrario, sonicare per altri 30 minuti. Questo passaggio genererà SUV di 50-100 nm di diametro.
      NOTA: Se ci si prepara per la prima volta, caratterizzare i SUV utilizzando la diffusione dinamica della luce22,23 (DLS) o un metodo equivalente.
  4. Aggiungere cloruro di calcio (CaCl2, 3 M stock) alle vescicole sonicate in modo tale che la sua concentrazione finale sia di 30 mM nella soluzione lipidica.
  5. Tagliare una punta di micropipetta per iniettare la soluzione campione in modo che si adatti perfettamente al foro. Mescolare la soluzione lipidica e iniettare attraverso uno dei fori nella camera di imaging realizzati al punto 2. Pulire la soluzione in eccesso che esce dalla camera dall'uscita con un fazzoletto pulito per prevenire la contaminazione dei canali adiacenti.
  6. Lasciare questo assemblaggio in una camera umidificata per 90 minuti. Preparare una camera umidificante ponendo un fazzoletto umido all'estremità di una provetta da centrifuga da 50 ml. Posizionare la slitta lateralmente all'interno del tubo con i tappi del tubo chiusi. Le vescicole si fonderanno e genereranno un doppio strato uniforme sulla superficie del vetro.
  7. Lavare accuratamente la camera con una quantità abbondante di tampone PBS (circa 5 volte il volume della camera di imaging). Impedire l'ingresso di bolle d'aria nella camera durante il lavaggio in quanto ciò può generare difetti nella membrana.

4. Configurazione del microscopio e misurazioni di imaging a singola particella

NOTA: Gli esperimenti a singola molecola sono condotti su una configurazione al microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale24,25,26 (TIRF) basata su obiettivi (Figura 2). L'imaging TIRF fornisce un migliore rapporto segnale-rumore per l'imaging a singola molecola, sebbene i microscopi a epifluorescenza possano essere utilizzati anche in determinate condizioni (specialmente quando le biomolecole fluorescenti possono essere rimosse dalla soluzione di massa mediante lavaggio). Il tipo a prisma TIRF può essere utilizzato, ma il tipo obiettivo è preferibile per la facilità di impostazione della microfluidica27. Per il TIRF di tipo obiettivo, si raccomanda un obiettivo ad apertura numerica elevata (ingrandimento 100x, di solito disponibile in commercio come obiettivo TIRF).

  1. Prima di condurre qualsiasi esperimento sulla mobilità e l'assemblaggio, allineare il microscopio TIRF per garantire un rapporto segnale-rumore ottimale grazie all'illuminazione del campo evanescente. Durante l'allineamento, mantenere bassa la potenza del laser, tra 100 μW e 1 mW.
    ATTENZIONE: Gli occhiali di sicurezza laser devono essere utilizzati durante l'allineamento del raggio laser.
    1. Per allineare il microscopio, preparare un campione di perline fluorescenti aggiungendole nel canale microfluidico a basse concentrazioni (a ~ 100 pM) in modo che le macchie fluorescenti delle singole perle non si sovrappongano nelle immagini.
    2. Innanzitutto, visualizza le perle in modalità epifluorescenza. Mentre l'illuminazione è in modalità epifluorescenza, spostare lo stadio di traslazione dello specchio M5 (lo specchio che riflette il laser al dicroico) in modo tale che il raggio che esce dall'obiettivo si pieghi fino a quando alla fine è in una configurazione di riflessione interna totale.
    3. Verificare se l'illuminazione TIR è stata raggiunta. Quando il campo evanescente TIR illumina il campione di perline, controllare che siano visibili solo le perle sulla superficie e che non si osservino sfere fluttuanti dalla superficie.
  2. All'inizio dell'esperimento, impostare la potenza del laser sul piano focale posteriore dell'obiettivo a 5-10 mW per prevenire la fotodistruzione (fotosbiancamento) dei fluorofori.
  3. Tenere il vetrino sul palco del microscopio e concentrarsi prima sulla membrana nuda (senza fluorofori). Di solito, piccole tracce di impurità nelle membrane lipidiche sono sufficienti per farlo. Facoltativo: incorporare un piccolo numero di sfere fluorescenti o punti quantici (gamma sub picomolare) durante il passaggio 3.1, in modo tale che solo da due a cinque particelle fluorescenti siano presenti nel campo visivo per facilitare l'identificazione della messa a fuoco corretta.
  4. Iniettare il campione (proteine di membrana, ecc.) utilizzando una micropipetta nella camera di imaging rivestita con PEG-SLB realizzata al punto 3.7.
  5. Per misurare la cinetica di legame di una singola molecola, utilizzare una pompa a siringa per far fluire le biomolecole marcate attraverso i fori di ingresso nella camera microfluidica (Figura 3). Utilizzare una portata di 50-500 μL/min.
    1. Avviare l'acquisizione del filmato prima di aggiungere la soluzione nella camera di imaging. Acquisire >5.000 fotogrammi a un frame rate di 25-50 fotogrammi/s sotto flusso continuo fino a quando non vi è un ulteriore aumento della comparsa di nuove macchie sulla superficie della membrana (Video 1). Per l'analisi della cinetica di legame, seguire i passaggi di 6.1.
  6. Per il tracciamento di singole particelle, aggiungere le biomolecole marcate a basse concentrazioni (rispetto alla costante di legame) al canale utilizzando una micropipetta. Ottimizzare la concentrazione a una densità di <0,1 particelle/μm 2 in modo che le singole particelle raramente si incrocino (Video 2). Ciò garantisce l'alta fedeltà delle tracce recuperate dai set di dati. Incubare se necessario (in caso di scarso legame della membrana da parte di biomolecole, ~10 min) in un ambiente umidificante e lavare la camera con il tampone.
    NOTA: Il lavaggio è necessario nel caso in cui il legame sia scarso sulla membrana e la maggior parte delle molecole fluorescenti rimangano nella soluzione. In caso contrario, ciò potrebbe interferire con l'imaging e causare uno scarso rapporto segnale-rumore.
  7. Per l'analisi della traiettoria di singole particelle, acquisire 200-500 fotogrammi a 10-100 fotogrammi/s. Mantenere l'obiettivo focalizzato sul piano a doppio strato con una deriva minima dello stadio durante l'intervallo di acquisizione.

5. Acquisizione di immagini per il conteggio di subunità in un assemblaggio proteico

NOTA: L'acquisizione di immagini per la stima della stechiometria richiede lo sbiancamento continuo dei fluorofori e il rilevamento del numero di passaggi fino a quando non emettono più fluorofori fluorescenza.

  1. Per misurare le subunità, aggiungere la concentrazione rilevante di biomolecole marcate (esempio: vedi risultati; ClyA è stato aggiunto a una concentrazione di 25 nM) alla camera di imaging microfluidico e incubato (lavare se necessario). Incubare il vetrino in una camera umidificante alla temperatura desiderata per il tempo richiesto (esempio: 37 °C e 60 minuti per il montaggio di ClyA).
  2. Eseguire l'acquisizione di immagini per il fotosbiancamento a singola molecola come descritto di seguito.
    1. Lavare la camera di imaging con un tampone prima di eseguire l'imaging (se necessario). Posizionare il vetrino sul microscopio e regolare la messa a fuoco per visualizzare le molecole etichettate.
    2. Impostare la potenza del laser a un livello in cui lo sbiancamento del fluoroforo avvenga gradualmente (~1-5 min). Idealmente, per ogni biomolecola assemblata, mantenere la velocità di passo del fotosbiancamento >10-20 fotogrammi di imaging. Acquisire le immagini fino a quando tutte le molecole sono completamente fotosbiancate (Video 3).
      NOTA: per determinare la durata totale della traiettoria di fotosbiancamento richiesta, tracciare l'intensità media dei singoli punti con il numero di fotogrammi di imaging e determinare la costante di tempo adattando una funzione di decadimento esponenziale. La durata totale dell'acquisizione può essere impostata su 5-10 volte la costante di tempo.
  3. Eseguire una misurazione di assemblaggio dipendente dal tempo avviando l'acquisizione del filmato non appena il campione viene introdotto nella camera e acquisendo nuovi filmati fotosbiancanti a intervalli di tempo fissi dopo il legame della membrana da diversi segmenti del PEG-SLB.

6. Analisi di immagini e dati

  1. Eseguire il legame e il tracciamento di singole particelle come descritto di seguito.
    1. Estrarre traiettorie a singola particella dai filmati acquisiti sopra, come mostrato nella Figura 4. Per rilevare singole particelle e tracciarle, utilizzare il pacchetto MATLAB, u-track28 o Trackmate29, un plug-in di ImageJ, che fornisce anche un robusto algoritmo di tracciamento di singole particelle. Seguire i passaggi per impostare l'analisi u-track come mostrato nel file supplementare 1.
      NOTA: I parametri critici per il tracciamento di singole particelle sono la deviazione standard della dimensione delle particelle (in pixel) e la lunghezza di chiusura dello spazio. Utilizzare 1 e 0, rispettivamente, per questi parametri come criteri più rigorosi per il monitoraggio.
    2. Per calcolare le costanti della velocità di legame, stimare prima il numero di particelle che si legano alla superficie della membrana nel tempo. Utilizzare il file MATLAB binding_SPT (Supplementary Coding File 2) con la cartella di output u-track per identificare e tracciare il numero di particelle che appaiono sulla membrana ottenuta dal passaggio 6.1. Adattare la cinetica osservata a modelli cinetici appropriati (esempio: singolo adattamento esponenziale per determinare la costante di tempo, il cui inverso può essere assegnato alla costante di velocità apparente)30 per estrarre le costanti di velocità (vedere risultati, Figura 5).
    3. Lo spostamento quadratico medio (MSD) delle particelle diffuse (come il tracciante del DNA nelle SLB PEG, Figura 6) indica la natura della diffusione. Utilizzare il pacchetto MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) con la cartella di output u-track per ottenere il grafico MSD in funzione del tempo di ritardo (Figura 6B).
    4. Per identificare specie eterogenee a diffusione, calcolare le distribuzioni di spostamento istantaneo al quadrato (ISD) come mostrato nella Figura 6C. ISD2, definito come (X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2, dove il tempo di ritardo, τ = 2, è preferito in quanto riduce il rumore. Filtra le traiettorie brevi con meno di tre fotogrammi per ridurre il rumore.
    5. Usa ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) in MATLAB con l'output u-track per tracciare gli ISD delle particelle tracciate (Figura 6C).
  2. Eseguire l'analisi di fotosbiancamento a singola molecola come descritto di seguito.
    1. Per stimare la stechiometria dei complessi di membrana, eseguire un'analisi di fotosbiancamento sulle intensità dipendenti dal tempo dei complessi fluorescenti (Video 3). Per questo, applicare un algoritmo di correzione della deriva (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) basato sull'autocorrelazione dei fotogrammi del filmato per estrarre la deriva della traslazione. Ciò presuppone che le strutture assemblate siano in gran parte immobili durante l'acquisizione dell'immagine. Esegui il pacchetto MATLAB Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) per rilevare le tracce temporali di intensità delle particelle dai filmati.
    2. Utilizza il codice MATLAB Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) per eseguire il rilevamento dei passi per le tracce temporali di intensità. Nel caso in cui le particelle non siano immobili, utilizzare il pacchetto u-track per estrarre la posizione delle particelle in movimento. Questo insieme di coordinate xy può essere mappato sui filmati grezzi per estrarre i valori di intensità della particella in movimento mentre si diffonde lateralmente sulla membrana. Utilizza il pacchetto MATLAB utrack_Int (Supplementary Coding File 2) con l'output dell'analisi u-track per questa opzione.
    3. Eseguire una correzione per l'etichettatura incompleta delle biomolecole con tag fluorofori per stimare la corretta stechiometria del complesso proteico. Determinare l'efficienza di marcatura con uno spettrofotometro UV-VIS misurando l'assorbimento di colorante e proteine per stimare la concentrazione. Calcola l'efficienza di etichettatura come rapporto molare tra il colorante e la proteina.
      NOTA: Alcuni coloranti assorbono anche a lunghezze d'onda vicine a 280 nm e, quindi, questo contributo di assorbimento da parte del colorante deve essere considerato durante il calcolo della concentrazione.
    4. Eseguire una correzione binomiale per tenere conto dell'efficienza di etichettatura incompleta del fluoroforo nel modo seguente utilizzando il codice MATLAB Step_correction (Supplementary Coding File 2) con i dati ottenuti dal conteggio dei passi nel passaggio 6.2.2. Ad esempio, per una tossina che forma pori come la citolisina A, che forma una struttura ad anello dodecamerica, applicare una correzione binomiale utilizzando la seguente formula:
      nkEquation 1
      dove Equation 2 = efficienza di etichettatura, n = numero di passaggi di fotosbiancamento e s = conteggi effettivi. Usa il Stepcount_immobile di routine MATLAB per recuperare le specie oligomeriche corrette. Convertire la frequenza degli oligomeri (si) in frazioni di massa (Figura 7C; File di codifica supplementare 2).
      NOTA: un insieme di file analizzati è incluso nel file di codifica supplementare 3. I codici MATLAB nel Supplementary Coding File 2 possono essere eseguiti con questi set di dati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Monitoraggio del legame della proteina ClyA sulle membrane PEGilate
Dopo il passo 4.5, la cinetica di legame viene stimata tracciando il numero di particelle che si legano alla superficie della membrana nel tempo (Video 1). Quando la proteina ClyA si lega a una membrana con 5 mol% di lipidi PEG2000, la densità delle particelle aumenta e raggiunge la saturazione (Figura 5). Un decadimento esponenziale adattato alle particelle legate (cerchi ciano) fornisce la costante di tempo (τb) per il legame della membrana (in particolare, i punti temporali iniziali [cerchi rossi] non sono adatti in questo caso).

Mobilità del tracciante del DNA su membrane affollate
Usiamo comunemente traccianti del DNA (DNA ancorato alla membrana con un tocoferolo), coloranti traccianti lipofili (ad esempio, DiI) o proteine di membrana (ad esempio, ClyA) per caratterizzare la membrana sotto affollamento mediato da PEG. La diffusione laterale delle molecole traccianti marcate (25-100 pM) può essere monitorata mediante imaging della membrana al momento del legame delle particelle. In assenza di qualsiasi polimero PEG nella membrana, la maggior parte dei traccianti (specialmente quelli che si estendono al di fuori del doppio strato) mostrano una diffusione limitata sugli SLB (Figura 6A). Con piccoli livelli di PEG2000 nella membrana (0,5-2 mol%), il doppio strato si solleva dalla superficie sottostante e le molecole traccianti possono diffondersi senza vincoli. D'altra parte, si osserva un confinamento estremo ad un'alta concentrazione di PEG (20 mol%), dove le molecole di PEG sono in un regime di spazzola denso, con una varietà di comportamenti mostrati nel mezzo. I grafici MSD per queste tre condizioni sono mostrati nella Figura 6B. Sulla base della nostra caratterizzazione delle membrane a doppio strato POPC/DOPE-PEG2000, raccomandiamo una frazione DOPE-PEG2000 di 1-3 mol% che induca l'affollamento nel regime dei funghi. Al di sopra di 7,5 mol% PEG2000-lipid, osserviamo l'inizio del regime di spazzola, e composizioni fino a 25 mol% PEG2000-lipid possono essere impiegate per indurre affollamento e confinamento. Le condizioni intermedie del 4-7% di lipidi PEG2000 corrispondenti alla transizione tra i due regimi sono scarsamente caratterizzate e dovrebbero essere evitate.

Assemblaggio di ClyA su membrane affollate
Le traiettorie di intensità dei singoli punti limitati dalla diffrazione della proteina ClyA dopo l'incubazione sulla membrana affollata (Figura 7A,B) mostrano un gran numero di fasi distinte di fotosbiancamento, suggerendo la formazione di vari intermedi di assemblaggio31. ClyA, essendo una proteina transmembrana, interagisce con la superficie di vetro caricata negativamente in assenza di PEG e si assemblerà molto male. A 7,5 mol% di lipidi PEG2000, i complessi assemblati sono stati misurati e sono tracciati nella Figura 7C. Dopo aver corretto l'efficienza di etichettatura (0,9 in questo caso), la distribuzione finale degli oligomeri mostra le specie di ClyA dodecameriche come struttura dominante, coerente con i dati strutturali32.

Figure 1
Figura 1: Schema per le fasi di pulizia e l'assemblaggio della camera microfluidica. (A) I vetrini e i vetrini vengono puliti con sonicazione sequenziale in soluzione detergente, acetone, metanolo, KOH e piranha, con risciacquo multiplo con acqua ultrapura di tipo 1 tra ogni passaggio. I vetrini e i vetrini di copertura vengono quindi essiccati con azoto gassoso prima del trattamento al plasma. (B) La camera di imaging microfluidico viene quindi assemblata utilizzando un nastro biadesivo pretagliato che lega il vetrino al vetrino. *I vetrini acrilici non sono trattati con la soluzione di piranha e l'acetone, il metanolo e il KOH vengono utilizzati a una concentrazione del 50% (v/v) di quella utilizzata per la pulizia del vetrino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Configurazione del microscopio TIRF. Viene mostrata una tipica configurazione del microscopio TIRF di tipo obiettivo adattata su un microscopio invertito con l'ottica essenziale evidenziata. M1-M5 sono specchi per guidare il raggio laser. Le lenti L1 e L2 vengono utilizzate per espandere il raggio laser e l'obiettivo L3 focalizza il raggio laser sul piano focale posteriore dell'obiettivo. I1 e I2 sono i diaframmi dell'iride utilizzati per allineare il raggio laser. Un otturatore viene utilizzato per controllare l'illuminazione del raggio laser, fondamentale per prevenire inutili fotosbiancamenti delle molecole di fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Impostazione del flusso cinetico di legame della membrana. Per condurre l'esperimento di legame, viene utilizzato un sottile tubo in PTFE (0,022 in ID x 0,042 in OD) per far fluire il campione con l'aiuto di una pompa a siringa (immagine non in scala). L'estremità del tubo è collegata all'uscita della camera di imaging con l'aiuto di una punta a micropipetta. Lo scarto viene raccolto in un piccolo serbatoio di microtip collegato all'uscita e il volume introdotto è sempre maggiore di 10 volte il volume della camera di imaging. Figura inserita che mostra la sezione trasversale della camera di imaging. (immagine non in scala) Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Pipeline per l'analisi da traiettorie di singole particelle e filmati fotobleaching. (A) I filmati acquisiti sono stati analizzati utilizzando u-track in MATLAB per ottenere le traiettorie come (x, y) e le intensità (i) di ogni particella, fotogramma per fotogramma. Queste traiettorie sono state quindi utilizzate per calcolare lo spostamento quadrato istantaneo (ISD), ISD1 e ISD2. Le ISD possono quindi essere tracciate come istogrammi per identificare le specie mobili. In alternativa, i grafici di spostamento quadratico medio (MSD) informano se il moto è gaussiano, confinato o super-diffusivo33,34. L'analisi HMM (Hidden Markov Model35) può essere impiegata per distinguere diversi stati diffusivi di una singola particella. (B) Per l'analisi del fotosbiancamento, i filmati sono stati prima corretti per la deriva nel sistema (se necessario), seguiti dal rilevamento delle particelle o dal tracciamento utilizzando u-track. Oltre a stimare la distribuzione dell'intensità23 (e altre caratteristiche delle particelle), le traiettorie di intensità possono essere analizzate per il numero di passi di fotosbiancamento utilizzando algoritmi di ricerca dei gradini36,37,38. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Legame di ClyA alle membrane lipidiche supportate con 5 mol% DOPE-PEG2000. Una tipica curva di legame si ottiene dopo aver contato il numero di particelle in ciascun fotogramma identificate da u-track. L'imaging viene avviato prima del flusso della proteina ClyA che lega la membrana. Una funzione di decadimento esponenziale (linea nera) adatta al numero di particelle (cerchi ciano) viene utilizzata per recuperare la costante di tempo per il legame di ClyA alla membrana. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Mobilità del DNA lipofilo su membrane a doppio strato PEG-lipidico . (A) Viene mostrato lo schema per il tracciante di DNA lipofilo nella membrana POPC/DOPE-PEG2000. (B) Vengono mostrati gli spostamenti quadratici medi calcolati dall'inseguimento di singole particelle per diversi PEG-SLB. In 2 mol% DOPE-PEG2000, il tracciante del DNA mostra un comportamento browniano puro rispetto alla mobilità ostacolata in assenza del polimero (la linea tratteggiata è inclusa come riferimento). D'altra parte, lo stesso tracciante del DNA si discosta dalla pura diffusione browniana, indicando un moto sub-diffusivo con mobilità ridotta in presenza di 20 mol% DOPE-PEG2000. (C) La distribuzione ISD2 per la diffusione del tracciante del DNA lipofilo in due diverse membrane lipidiche PEG2000 viene confrontata con le SLB nude. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Tracce di fotosbiancamento e assemblaggio di ClyA su membrane lipidiche a doppio strato . (A,B) Le tracce temporali rappresentative mostrano le fasi di fotosbiancamento del complesso di nanopori ClyA rilevate nella fase 6.2.1. per un complesso ClyA assemblato con 7 e 5 gradini, rispettivamente. (C) Viene mostrata la distribuzione della fase di fotosbiancamento (grigio) per ClyA (25 nM) incubato con 64,7% POPC: 27,8% Colesterolo: 7,5% membrana DOPE-PEG2000 per 60 minuti a 37 °C. Dopo aver corretto l'efficienza di etichettatura incompleta, viene mostrata la frazione di massa stimata di varie specie oligomeriche (magenta). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Video 1: Legame di ClyA sulla membrana. Monitoraggio del legame della proteina ClyA marcata con Cy3 alla membrana SLB contenente 5 mol% DOPE-PEG2000. Le particelle legate vengono rilevate (cerchi ciano) da u-track, e le tracce vengono tracciate per cinque posizioni successive nella loro traiettoria. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Diffusione del tracciante del DNA sulla membrana PEG a 2 mol%. Un filmato per il DNA marcato con Cy3 ancorato alla membrana lipidica tramite tocoferolo nella membrana PEG2000 a 2 mol%. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Photobleaching filmato. Un filmato di oligomeri assemblati di molecole di ClyA marcate con Cy3 sulla membrana contenente 7,5 mol% DOPE-PEG2000. I complessi più grandi sono evidenti dalle intensità diverse volte superiori rispetto a una singola proteina, così come dalle molteplici fasi di fotosbiancamento quando l'intensità delle particelle viene osservata nel tempo sotto illuminazione continua. Clicca qui per scaricare questo video.

File supplementare 1: informazioni su come utilizzare u-track e diversi codici MATLAB nel passaggio 6. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 1: un file rappresentativo di progettazione assistita da computer (CAD) per praticare fori nella diapositiva acrilica e tagliare il nastro per l'intera diapositiva. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementari 2: cartella compressa contenente i codici MATLAB associati necessari per l'analisi di immagini e dati nel passaggio 6. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementari 3: dati di esempio per l'analisi di immagini e dati nel passaggio 6. I codici MATLAB sono disponibili anche su https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. Clicca qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Qui, dimostriamo esperimenti a singola molecola su doppi strati lipidici supportati (SLB) che manifestano un ambiente affollato per le biomolecole incorporate nella membrana. L'ambiente affollato genera un effetto di volume escluso, portando al potenziamento delle reazioni biomolecolari 1,2,39,40. Per il sistema PEG-lipidico, in cui il polimero occupa principalmente il volume al di fuori del doppio strato, questo effetto è particolarmente pronunciato per le specie molecolari con grandi ecto-domini. Pertanto, rispetto ai coloranti lipofili, la diffusione di una grande molecola idrofila incorporata nella membrana, come recettori, glicoproteine e glicolipidi può essere significativamente ridotta. Utilizzando DNA tracciante fluorescente ancorato alla membrana tramite tocoferolo (Figura 5), possiamo identificare tali effetti di affollamento.

Separatamente, la presenza di PEG nel foglietto inferiore solleva anche l'SLB e riduce l'interazione delle biomolecole con il substrato di supporto14,41. Di solito, la superficie caricata negativamente della superficie del vetro di imaging spesso ostacola la mobilità e le reazioni molecolari. Pertanto, l'uso di lipidi PEG per sollevare la membrana lontano dal vetro è vantaggioso anche quando non allo scopo di affollare. Tuttavia, occorre prestare attenzione a identificare i regimi di concentrazione che non manifestano affollamento molecolare in questi casi. Per le proteine che estendono domini più grandi al di fuori del doppio strato, potrebbe essere necessario l'uso di un lipide PEG a peso molecolare più elevato come PEG500042.

Alcuni punti chiave sono fondamentali per l'imaging a singola molecola sui sistemi SLB. Una pulizia rigorosa dei vetrini e dei vetrini di copertura è fondamentale negli esperimenti a singola molecola (fase 1). L'imaging di una superficie con impurità si tradurrà in difetti nella membrana lipidica. Ciò può provocare chiazze di biomolecole marcate con fluorescenza sulla superficie della membrana. La copertura e l'uniformità dell'SLB formato possono essere verificate in una preparazione separata drogando il doppio strato con un colorante lipidico (DiI o Lissamina Rhodamine DOPE) e visualizzandolo al microscopio a fluorescenza. L'analisi FRAP può essere utilizzata per confrontare anche il comportamento diffusivo43,44.

Per gli esperimenti di legame della membrana (fase 4), la configurazione del flusso con il tubo deve essere innescata con tampone per impedire l'ingresso di bolle d'aria nella camera. Portate più elevate o la presenza di bolle d'aria romperanno la membrana e le molecole si legheranno direttamente al coprifoglio. L'acquisizione dell'immagine dovrebbe iniziare prima dell'inizio del flusso, poiché alcune molecole diffondono dal tubo e si legano alla membrana. Focalizzare l'obiettivo sul doppio strato durante l'imaging può essere facilitato drogando il bistrato a bassa concentrazione con nanoparticelle d'oro, punti quantici o perline fluorescenti.

Per gli esperimenti di tracciamento di singole particelle, il numero di particelle sulla membrana dovrebbe essere controllato per evitare uno scenario in cui il tracciamento è difficile a causa dell'eccessiva sovrapposizione delle traiettorie delle particelle. Un altro fattore importante da considerare durante l'imaging è la potenza del laser. Un'elevata potenza laser fotobleggerà rapidamente i fluorofori, mentre la bassa intensità e le corrispondenti basse velocità di acquisizione dell'immagine causeranno sfocature. Una potenza laser ottimale dovrebbe produrre una lunghezza di traiettoria significativa (almeno >5 in media) mantenendo immagini simmetriche e vicine alla diffrazione delle particelle. Un sistema di scavenging dell'ossigeno può anche essere utilizzato per prolungare il fotosbiancamento dei fluorofori45. Una limitazione dell'analisi di fotosbiancamento qui presentata sorge 37,46 nel caso di grandi assemblaggi molecolari (~ maggiori di 20 subunità), come il complesso dei pori nucleari47. In questi casi, un approccio bayesiano può essere utilizzato per dedurre la popolazione di subunità48,49,50.

L'etichettatura delle biomolecole con fluorofori nella maggior parte dei casi non è completa51. Ciò rappresenta una sfida nel conteggio delle subunità in un cluster con specie non etichettate. Una correzione binomiale per l'efficienza di marcatura sub-par è di solito un'approssimazione ragionevole quando la stechiometria delle specie molecolari è fissa. In molti casi, le specie oligomeriche potrebbero essere eterogenee o dinamicamente mutevoli, come in un processo di oligomerizzazione, richiedendo lo sviluppo di nuovi strumenti per estrarre le distribuzioni sottostanti dai dati di fotosbiancamento.

Nel complesso, questo protocollo fornisce una pipeline per la generazione di PEG-SLB, con raccomandazioni per le condizioni da utilizzare, eseguire e analizzare il legame a singola molecola e tracciare ed eseguire analisi di photobleaching per biomolecole di membrana.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono il Prof. Benjamin Schuler per aver condiviso l'espressione plasmide per la proteina ClyA. Questo lavoro è stato supportato dallo Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

Biochimica Numero 185
Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., … More

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter