Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekyldiffusjon og montering på polymerfylte lipidmembraner

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

Her presenteres en protokoll for å utføre og analysere binding, mobilitet og montering av enkeltmolekyler på kunstige overfylte lipidmembraner ved bruk av enkeltmolekyl total intern refleksjonsfluorescens (smTIRF) mikroskopi.

Abstract

Cellulære membraner er svært overfylte miljøer for biomolekylære reaksjoner og signalering. Likevel bruker de fleste in vitro-eksperimenter som undersøker proteininteraksjon med lipider nakne dobbeltlagsmembraner. Slike systemer mangler kompleksiteten ved trengsel av membraninnstøpte proteiner og glykaner og utelukker de tilknyttede volumeffektene som oppstår på cellulære membranoverflater. Også den negativt ladede glassoverflaten som lipid-dobbeltlagene dannes på, forhindrer fri diffusjon av transmembrane biomolekyler. Her presenterer vi en godt karakterisert polymer-lipidmembran som en etterligning for overfylte lipidmembraner. Denne protokollen benytter polyetylenglykol (PEG)-konjugerte lipider som en generalisert tilnærming for å inkorporere crowders i det støttede lipid dobbeltlaget (SLB). Først presenteres en rengjøringsprosedyre for mikroskopiske lysbilder og deksler for å utføre enkeltmolekyleksperimenter. Deretter diskuteres metoder for å karakterisere PEG-SLBene og utføre enkeltmolekyleksperimenter av binding, diffusjon og montering av biomolekyler ved bruk av enkeltmolekylsporing og fotobleking. Til slutt demonstrerer denne protokollen hvordan man overvåker nanopore-samlingen av bakteriell poredannende toksin Cytolysin A (ClyA) på overfylte lipidmembraner med enkeltmolekylær fotoblekingsanalyse. MATLAB-koder med eksempeldatasett er også inkludert for å utføre noen av de vanlige analysene som partikkelsporing, ekstrahering av diffusiv oppførsel og telling av underenheter.

Introduction

Cellemembraner er svært overfylte og komplekse systemer1. Molekylær trenging kan ha en betydelig innvirkning på diffusjonen av membranbundne enheter som protein og lipider 2,3,4. På samme måte påvirkes bimolekylære reaksjoner på lipidmembraner som reseptordimerisering eller oligomerisering av membrankomplekser av trengsel 5,6,7. Naturen, konfigurasjonen og konsentrasjonen av crowders kan styre membranbindingen, diffusiviteten og protein-proteininteraksjonen på flere måter 8,9. Siden det er utfordrende å kontrollere membranbelastning på cellulære membraner og tolke dens innflytelse på innebygde biomolekyler, har forskere forsøkt å etablere alternative in vitro-systemer 10.

En populær tilnærming for kunstige overfylte membraner er doping av dobbeltlagsmembranene med polymer (som polyetylenglykol, PEG)-podede lipider11,12. Under visualisering av protein og lipiddynamikk på støttede lipid dobbeltlag (SLBer), beskytter disse polymerene i tillegg de membraninnebygde komponentene fra det underliggende negativt ladede substratet (for eksempel glass) ved effektivt å løfte dobbeltlaget bort fra den underliggende støtten. Ved å variere størrelsen og konsentrasjonen av polymeren, kan man kontrollere omfanget av molekylær trengsel, samt dens separasjon fra den underliggende faste støtten13,14. Dette er helt klart en fordel i forhold til lipid-dobbeltlag som støttes på faste underlag uten polymerputer15,16, hvor transmembrane biomolekyler kan miste sin aktivitet17,18,19. Enda viktigere, det tillater oss å rekapitulere det overfylte miljøet i cellemembranen in vitro, noe som er kritisk for mange membranprosesser.

Overflatetransplanterte polymerer på membraner gjennomgår også endringer i konfigurasjonen avhengig av deres podningstetthet12. Ved lave konsentrasjoner forblir de i en entropisk kveilet konfigurasjon, kjent som en sopp, over membranoverflaten. Med økende konsentrasjon begynner de å samhandle og har en tendens til å løsne og utvide seg, noe som til slutt gir en tett børstelignende formasjon på membranen21. Siden overgangen fra sopp til børsteregimet er svært heterogen og manifesterer seg i dårlig karakteriserte forhold av polymeren, er det viktig å bruke godt karakteriserte forhold for trengsel på polymertransplanterte membraner. Sammenlignet med en nylig studie20, identifiserer og rapporterer vi overfylte membransammensetninger som opprettholder diffusiv transport og aktivitet av transmembrane biomolekyler.

I denne protokollen diskuterer vi hvordan man genererer PEGylerte lipidmembraner og gir anbefalinger for PEG-tettheter som etterligner trengsel i to forskjellige regimer av polymerkonfigurasjon (nemlig sopp og børste). Protokollen beskriver også enkeltmolekylbinding, partikkelsporing og fotobleking av datainnsamling og analyse for molekyler innebygd i disse overfylte membranene. Først beskriver vi de grundige rengjøringstrinnene, montering av bildekammeret og generering av PEG-SLB-er. For det andre gir vi detaljer for enkeltmolekylbinding, partikkelsporing og fotoblekingseksperimenter. For det tredje diskuterer vi i) å trekke ut de relative bindingsaffinitetene, ii) karakterisere molekylær diffusjon og iii) telle underenheter i en proteinsamling fra filmer av enkeltmolekyler på membranen.

Mens vi karakteriserte dette systemet med enkeltmolekylavbildning, er protokollen nyttig for alle membranbiofysikere som er interessert i å forstå effekten av trengsel på biomolekylære reaksjoner på lipidmembraner. Samlet sett presenterer vi en robust rørledning for å lage overfylte og støttede lipid-dobbeltlag, sammen med forskjellige enkeltmolekylanalyser utført på dem og tilhørende analyserutiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rengjøring av lysbildet og dekselet for enkeltmolekyleksperimenter

  1. Før montering av bildekammeret, rengjør og klargjør både dekslene og lysbildene. Bor flere par hull på glassglassene ved hjelp av en boremaskin med diamantbelagte borekroner (0,5-1 mm i diameter). Hvis akrylplater brukes, bruk en laserskjærer for å lage presise hull (0,5 mm), som vist i figur 1.
    MERK: Hvert par hull vil fungere som et innløp og utløp for strømningsutveksling for et individuelt mikrofluidisk kammer. En representativ CAD-fil for hull i et akryllysbilde er tilgjengelig i Supplementary Coding File 1. Hull boret på glassglass ender vanligvis opp med å bli 1,5x-2x større enn borekronestørrelsen.
  2. Rengjør lysbildene og dekslene med vaskemiddel. Skyll dem grundig med avionisert vann. Plasser lysbildene og dekslene i en separat lysbildefarging (Coplin) krukke med vann og sonikat i et bad sonicator i 30 min. For alle sonikeringstrinnene, bruk en 70 W strøminnstilling.
  3. Fjern vannet og fyll Coplin-krukken som inneholder glassglassene og dekslene med aceton til randen (50-100 ml avhengig av glassvolumet). Når det gjelder akrylplater, bruk samme volum av ferdigblandet 50% (v / v) acetonløsning, ellers blir lysbildene frostige. Rist Coplin-krukken for å sikre at alle lysbilder og deksler er helt nedsenket i løsningen og sonikerer i en badsonikator i 30 minutter.
  4. Fjern acetonet og kast det i en avfallsbeholder, hell metanol i Coplin-krukkene (50%, v / v for akrylglass) og sonikat i 30 minutter. Både aceton og metanol brukes til å fjerne organiske partikler på lysbildene.
  5. Skyll lysbildene og dekslene med store mengder type 1-vann og legg dem i en Coplin-krukke i glass. Hell 1 M KOH-løsning i krukken og sonikat i 1 time. For akrylglassglassene, bruk 0,5 M KOH.
  6. Kast KOH i en uorganisk avfallsbeholder. Skyll krukken med rikelig med vann og legg Coplin-krukkene i en avtrekkshette for piranha-behandling. Ikke utfør piranha-behandling for akrylglass; Gå direkte videre til trinn 1.9.
    FORSIKTIG: Piranha-behandling bør gjøres i en avtrekkshette med riktige hansker, vernebriller og et forkle for håndtering av syrer. Piranha-løsningen er et sterkt oksidasjonsmiddel, og det fjerner eventuelle rester av organiske partikler fra lysbildene og dekslene.
  7. For å forberede piranha-løsningen, hell forsiktig et 2/3 volum svovelsyre (98%, v / v) i et glassbeger og fyll resten med hydrogenperoksid (30%, v / v). Bland løsningen forsiktig med en glassstang, hell den i Coplin-krukken, og la Coplin-krukken ligge i avtrekkshetten i minst 1 time.
  8. Dekanter piranha-løsningen fra Coplin-krukken i en avfallsbeholder for syreavfall som holdes inne i røykhetten. Skyll Coplin-krukken med en rikelig mengde type 1 vann.
  9. Tørk lysbildene og dekslene i en mild strøm av nitrogengass og legg dem i en ren Coplin-krukke. De tørkede lysbildene og dekslene er nå klare for plasmabehandling. Ta et par lysbilder og deksler og plasser dem i plasmamaskinen.
  10. Lag et vakuum i kammeret. Vri knappen til radiofrekvensen på 8-12 MHz for å generere plasma i kammeret. En lilla glød inne i kammeret vil indikere dannelsen av et plasma i kammeret.
  11. Utfør plasmabehandlingen i 8-10 min. Slipp vakuumet forsiktig etter at du har slått av plasmaet og fortsett til trinn 2 for montering av mikrofluidisk avbildningskammer.

2. Montering av det mikrofluidiske kammeret

MERK: Bildekammeret er opprettet ved å klemme dobbeltsidig tape mellom en forhåndsrenset deksel og skyve fra forrige trinn som beskrevet nedenfor.

  1. Monter lysbildene og dekselet etter plasmabehandlingen som vist i figur 1. Plasser glassglasset på et rent silkepapir. Klipp den dobbeltsidige tapen i ~2-3 mm brede strimler og legg dem på hver side av et par hull på glassglasset. Bruk en pipetspiss for å flate ut båndet, ellers vil det føre til lekkasje fra den ene kanalen til den andre.
    MERK: Alternativt kan du klippe båndet for hele lysbildet ved hjelp av en laser- eller automatisert plotterkutter (figur 1).
  2. Plasser det plasmabehandlede dekselet på det teipede lysbildet for å lukke kammeret. Bruk en pipetspiss til å trykke dekselet forsiktig på de teipede områdene for å gjøre kanalen vanntett.
  3. Hvis du bruker glassglass, må du forsegle kantene med epoksyharpiks. Til slutt har hvert bildekammer laget av et lysbilde og deksel en dimensjon på 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (lengde x bredde x dybde). Oppbevar de tilberedte mikrofluidiske avbildningskamrene i 1-2 uker under uttørkede forhold (helst mellom 10-25 °C).
    MERK: For laserkuttede bånd som brukes med akrylglass, er det ikke nødvendig å bruke epoksy, da tapekantene danner en tett lekkasjesikker tetning.

3. Lage støttede dobbeltlag på glassunderlag ved vesikkelfusjon

MERK: Overfylte støttede lipid-dobbeltlag genereres på veggene i avbildningskammeret ved fusjon av lipidvesikler fremstilt med dopede PEG-lipider.

  1. Ta et rent hetteglass, helst forrenset med piranha-oppløsning. Tilsett kloroformoppløsning av 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polyetylenglykol)-2000] (DOPE-PEG2000) ved ønsket molfraksjon av PEG2000 lipider slik at den endelige konsentrasjonen etter tilsetning av buffer vil være 3 mM lipider i trinn 3.4. Forbered andre membranblandinger av lipider på samme måte.
  2. Tørk ut kloroformen fra hetteglasset med en mild strøm av nitrogen med en liten virvel slik at de tørkede lipidene er jevnt belagt på overflaten av hetteglasset. Sett hetteglasset i en vakuumtørker i 1 time. Dette vil fjerne eventuell gjenværende kloroform i hetteglasset. Tilsett 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og rug over natten ved 37 °C.
  3. Forbered små unilamellære vesikler (SUVer) som beskrevet nedenfor.
    1. Vortex forsiktig i 1-2 minutter etter inkubasjon over natten til løsningen blir uklar og melkeaktig.
    2. Ta 100 μL av denne løsningen i et lite 500 μL sentrifugerør og sonikat i ca. 1 time i en badsonikator (sett ved en 70 W strøminnstilling). Løsningen vil bli klar; hvis ikke, så sonikere i ytterligere 30 min. Dette trinnet vil generere SUVer på 50-100 nm i diameter.
      MERK: Hvis du forbereder deg for første gang, karakteriser SUV-ene ved hjelp av dynamisk lysspredning22,23 (DLS) eller en tilsvarende metode.
  4. Tilsett kalsiumklorid (CaCl2, 3 M lager) til de sonikerte vesiklene slik at den endelige konsentrasjonen er 30 mM i lipidoppløsningen.
  5. Klipp en mikropipettespiss for å injisere prøveløsningen slik at den passer tett i hullet. Bland lipidoppløsningen og injiser gjennom et av hullene i bildekammeret i trinn 2. Tørk overflødig løsning som kommer ut av kammeret fra utløpet med et rent vev for å forhindre forurensning av tilstøtende kanaler.
  6. La denne forsamlingen stå i et fuktet kammer i 90 minutter. Forbered et fuktkammer ved å plassere et vått vev på enden av et 50 ml sentrifugerør. Plasser lysbildet sidelengs inne i røret med rørhetter lukket. Vesiklene vil smelte sammen og generere et jevnt dobbeltlag på glassoverflaten.
  7. Vask kammeret grundig med en rikelig mengde PBS-buffer (omtrent 5 ganger volumet av bildekammeret). Forhindre at luftbobler kommer inn i kammeret mens du vasker, da dette kan generere defekter i membranen.

4. Mikroskopoppsett og enkeltpartikkelavbildningsmålinger

MERK: Enkeltmolekyleksperimenter utføres på en målbasert total intern refleksjonsfluorescens24,25,26 (TIRF) mikroskopoppsett (figur 2). TIRF-avbildning gir et bedre signal-til-støy-forhold for enkeltmolekylavbildning, selv om epifluorescensmikroskoper også kan brukes under visse forhold (spesielt når de fluorescerende biomolekylene kan fjernes fra bulkløsningen ved vask). Prisme-type TIRF kan brukes, men måltypen er å foretrekke for enkel å sette opp mikrofluidikk27. For TIRF av objektiv type anbefales et mål med høy numerisk blenderåpning (100x forstørrelse, vanligvis kommersielt tilgjengelig som et TIRF-objektiv).

  1. Før du utfører et eksperiment på mobilitet og montering, juster TIRF-mikroskopet for å sikre et optimalt signal-til-støy-forhold på grunn av belysning av det unnvikende feltet. Under justering, hold lasereffekten lav, mellom 100 μW og 1 mW.
    FORSIKTIG: Laserbeskyttelsesbriller bør brukes under justering av laserstrålen.
    1. For å justere mikroskopet, lag en fluorescerende perleprøve ved å legge dem inn i den mikrofluidiske kanalen ved lave konsentrasjoner (ved ~ 100 pM) slik at fluorescerende flekker fra enkeltperler ikke overlapper i bildene.
    2. Først visualiserer du perlene i epifluorescensmodus. Mens belysningen er i epifluorescensmodus, flytter du M5-speiloversettelsestrinnet (speilet som reflekterer laseren til dikroisk) slik at strålen som kommer ut av målet bøyer seg til den til slutt er i en total intern refleksjonskonfigurasjon.
    3. Kontroller om TIR-belysning er oppnådd. Når TIR evanescent-feltet lyser opp perleprøven, må du kontrollere at bare perlene på overflaten er synlige og frittflytende perler vekk fra overflaten ikke observeres.
  2. Ved starten av eksperimentet, sett lasereffekten på det objektive bakre fokalplanet til 5-10 mW for å forhindre fotodestruksjon (fotobleking) av fluoroforene.
  3. Hold lysbildet på mikroskopstadiet og fokuser på den nakne membranen (uten fluoroforer) først. Vanligvis er små spor av urenheter i lipidmembraner tilstrekkelig til å gjøre dette. Valgfritt: Inkluder et lite antall fluorescerende perler eller kvanteprikker (subpikomolært område) i trinn 3.1, slik at bare to til fem fluorescerende partikler er tilstede i synsfeltet for å gjøre det lettere å identifisere riktig fokus.
  4. Injiser prøven (membranproteiner, etc.) ved hjelp av en mikropipette i PEG-SLB-belagt avbildningskammer laget i trinn 3.7.
  5. For måling av enkeltmolekylbindende kinetikk, bruk en sprøytepumpe for å strømme de merkede biomolekylene gjennom innløpshullene inn i det mikrofluidiske kammeret (figur 3). Bruk en strømningshastighet på 50-500 μL / min.
    1. Start filminnhentingen før du legger løsningen inn i bildekammeret. Skaff >5000 bilder med en bildefrekvens på 25-50 bilder / s under kontinuerlig strømning til det ikke er ytterligere økning i utseendet på nye flekker på membranoverflaten (Video 1). For analyse av bindingskinetikk, følg trinnene fra 6.1.
  6. For enkeltpartikkelsporing, tilsett de merkede biomolekylene ved lave konsentrasjoner (sammenlignet med bindingskonstanten) til kanalen ved hjelp av en mikropipette. Optimaliser konsentrasjonen til en tetthet på <0,1 partikler/μm 2 slik at enkeltpartikler sjelden krysser baner (Video 2). Dette sikrer høy gjengivelse av spor som gjenopprettes fra datasettene. Inkuber om nødvendig (i tilfelle dårlig membranbinding av biomolekyler, ~ 10 min) i et fuktende miljø og vask kammeret med bufferen.
    MERK: Vasking er nødvendig i tilfelle bindingen er dårlig på membranen og de fleste fluorescerende molekyler forblir i løsningen. Ellers kan dette forstyrre avbildningen og føre til et dårlig signal/støy-forhold.
  7. For enkeltpartikkelbaneanalyse, skaff 200-500 rammer ved 10-100 bilder / s. Oppretthold objektivlinsen fokusert på dobbeltlagsplanet med minimal trinndrift under anskaffelsesintervallet.

5. Bildeoppkjøp for å telle underenheter i en proteinmontering

MERK: Bildeinnsamling for estimering av støkiometri krever kontinuerlig bleking av fluoroforer og oppdager antall trinn til det ikke sendes ut flere fluoroforer fluorescens.

  1. For måling av underenheter, legg til den relevante konsentrasjonen av merkede biomolekyler (eksempel: se resultater; ClyA ble tilsatt ved 25 nM konsentrasjon) til mikrofluidisk avbildningskammer og ruger (vask om nødvendig). Inkuber lysbildet i et fuktkammer ved ønsket temperatur i ønsket tid (eksempel: 37 °C og 60 minutter for montering av ClyA).
  2. Utfør bildeoppkjøp for enkeltmolekylfotobleking som beskrevet nedenfor.
    1. Vask bildekammeret med en buffer før avbildning (om nødvendig). Plasser lysbildet på mikroskopet og juster fokuset for å visualisere de merkede molekylene.
    2. Still lasereffekten til et nivå der blekingen av fluoroforen skjer gradvis (~ 1-5 min). Ideelt sett, for hvert montert biomolekyl, hold fotoblekingstrinnshastigheten >10-20 bilderammer fra hverandre. Skaff bildene til alle molekylene er fullstendig fotobleket (Video 3).
      MERK: For å bestemme den totale varigheten av fotoblekingsbanen som kreves, plott gjennomsnittsintensiteten til individuelle flekker med antall bilderammer og bestem tidskonstanten ved å tilpasse en eksponentiell forfallsfunksjon. Den totale varigheten av oppkjøpet kan settes til 5-10 ganger tidskonstanten.
  3. Utfør en tidsavhengig monteringsmåling ved å starte filminnsamling så snart prøven er introdusert i kammeret og anskaffe nye fotoblekingsfilmer med faste tidsintervaller etter membranbinding fra forskjellige segmenter av PEG-SLB.

6. Bilde- og dataanalyse

  1. Utfør enkeltpartikkelbinding og sporing som beskrevet nedenfor.
    1. Trekk ut enkeltpartikkelbaner fra filmene som er oppnådd ovenfor, som vist i figur 4. For å oppdage enkeltpartikler og spore dem, bruk MATLAB-pakken, u-spor28 eller Trackmate29, et plugin i ImageJ, som også gir en robust enkeltpartikkelsporingsalgoritme. Følg trinnene for å konfigurere u-sporanalyse som vist i tilleggsfil 1.
      MERK: De kritiske parametrene for sporing av enkeltpartikler er standardavviket for partikkelstørrelsen (i piksler) og gaplukkingslengden. Bruk henholdsvis 1 og 0 for disse parameterne som de strengeste kriteriene for sporing.
    2. For å beregne bindingshastighetskonstantene, estimer først antall partikler som binder seg til membranoverflaten over tid. Bruk MATLAB-filen binding_SPT (Supplementary Coding File 2) med utdatamappen u-spor for å identifisere og plotte antall partikler som vises på membranen oppnådd fra trinn 6.1. Tilpass den observerte kinetikken til passende kinetiske modeller (eksempel: enkel eksponentiell tilpasning for å bestemme tidskonstanten, hvis inverse kan tilordnes den tilsynelatende hastighetskonstanten)30 for å trekke ut hastighetskonstantene (se resultater, figur 5).
    3. Den gjennomsnittlige kvadrerte forskyvningen (MSD) av de diffuserende partiklene (slik som DNA-sporstoff i PEG-SLBer, figur 6) indikerer diffusjonens art. Bruk MATLAB-pakken MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) med utdatamappen u-spor for å få MSD-plottet som en funksjon av forsinkelsestid (figur 6B).
    4. For å identifisere heterogene diffuserende arter, beregne momentan kvadratisk forskyvning (ISD) fordelinger som vist i figur 6C. ISD2, definert som (X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2, der forsinkelse, τ = 2, foretrekkes fordi det reduserer støy. Filtrer ut korte baner med mindre enn tre rammer for å redusere støy.
    5. Bruk ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) i MATLAB med u-sporutgangen for å plotte ISD-ene til de sporede partiklene (figur 6C).
  2. Utfør enkeltmolekylfotoblekingsanalyse som beskrevet nedenfor.
    1. For å estimere støkiometrien til membrankompleksene, utfør en fotoblekingsanalyse av de tidsavhengige intensitetene til de fluorescerende kompleksene (Video 3). For dette bruker du en driftkorreksjonsalgoritme (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) basert på autokorrelasjonen av filmrammer for å trekke ut oversettelsesdriften. Dette forutsetter at de monterte konstruksjonene i stor grad er immobile under bildeinnsamling. Kjør MATLAB-pakken Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) for å oppdage partikkelintensitetstidsspor fra filmene.
    2. Bruk MATLAB-koden Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) til å utføre trinnregistreringen for intensitetstidssporingene. Hvis partiklene ikke er immobile, bruk u-sporpakken for å trekke ut plasseringen av bevegelige partikler. Dette settet med xy-koordinater kan kartlegges til råfilmene for å trekke ut intensitetsverdiene til den bevegelige partikkelen når den diffunderer lateralt på membranen. Bruk MATLAB-pakken utrack_Int (Supplementary Coding File 2) med utdataene fra u-sporanalyse for dette alternativet.
    3. Utfør en korreksjon for ufullstendig merking av biomolekylene med fluoroforkoder for å estimere riktig proteinkompleksstøkiometri. Bestem merkingseffektiviteten med et UV-VIS-spektrofotometer ved å måle absorpsjonen av fargestoff og protein for å estimere konsentrasjonen. Beregn merkingseffektiviteten som molforholdet mellom fargestoffet og proteinet.
      MERK: Noen fargestoffer absorberer også ved bølgelengder nær 280 nm, og derfor bør dette absorpsjonsbidraget fra fargestoffet tas hensyn til under konsentrasjonsberegningen.
    4. Utfør en binomisk korreksjon for å ta hensyn til fluoroforens ufullstendige merkingseffektivitet på følgende måte ved å bruke MATLAB-koden Step_correction (Supplementary Coding File 2) med dataene hentet fra trinntelling i trinn 6.2.2. For eksempel, for et poredannende toksin som Cytolysin A, som danner en dodekamerisk ringlignende struktur, bruk en binomisk korreksjon ved å bruke følgende formel:
      nkEquation 1
      hvor Equation 2 = merkingseffektivitet, n = antall fotoblekingstrinn og s = faktiske tellinger. Bruk MATLAB-rutinen Stepcount_immobile for å gjenopprette de korrigerte oligomere artene. Konverter frekvensen av oligomerer (si) til massefraksjoner (figur 7C; Tilleggskodefil 2).
      MERK: Et sett med u-sporede analyserte filer er inkludert i Supplementary Coding File 3. MATLAB-kodene i Supplementary Coding File 2 kan kjøres med disse datasettene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overvåking av bindingen av ClyA-protein på PEGylerte membraner
Etter trinn 4.5 estimeres bindingskinetikken ved å plotte antall partikler som binder seg til membranoverflaten over tid (Video 1). Når ClyA-proteinet binder seg til en membran med 5 mol% PEG2000 lipider, øker partikkeltettheten og når metning (figur 5). En eksponentiell henfallstilpasning til de bundne partiklene (cyansirkler) gir tidskonstanten (τb) for membranbindingen (spesielt de første tidspunktene [røde sirkler] passer ikke i dette tilfellet).

Mobilitet av DNA-sporstoff på overfylte membraner
Vi bruker vanligvis DNA-sporstoffer (DNA forankret til membranen med en tokoferol), lipofile sporstofffarger (f.eks. DiI) eller membranproteiner (f.eks. ClyA) for å karakterisere membranen under PEG-mediert trengsel. Lateral diffusjon av merkede spormolekyler (25–100 pM) kan overvåkes ved å avbilde membranen ved partikkelbinding. I fravær av PEG-polymer i membranen, viser de fleste sporstoffer (spesielt de som strekker seg utenfor dobbeltlaget) begrenset diffusjon på SLB-er (figur 6A). Med små nivåer av PEG2000 i membranen (0,5–2 mol») løfter dobbeltlaget seg bort fra den underliggende overflaten, og spormolekylene kan diffundere uten begrensninger. På den annen side observeres ekstrem inneslutning ved en høy konsentrasjon av PEG (20 mol%), hvor PEG-molekyler er i et tett børsteregime, med en rekke atferd som vises i mellom. MSD-plott for disse tre forholdene er vist i figur 6B. Basert på vår karakterisering av POPC/DOPE-PEG2000 dobbeltlagsmembraner, anbefaler vi en 1–3 mol% DOPE-PEG2000 fraksjon som induserer trengsel i soppregimet. Over 7,5 mol% PEG2000-lipid observerer vi utbruddet av børsteregimet, og sammensetninger til 25 mol% PEG2000-lipid kan brukes til å indusere trengsel og inneslutning. De mellomliggende 4-7% PEG2000-lipidforholdene som tilsvarer overgangen mellom de to regimene er dårlig karakterisert og bør unngås.

Montering av ClyA på overfylte membraner
Intensitetsbanene til individuelle diffraksjonsbegrensede flekker av ClyA-protein etter inkubasjon på den overfylte membranen (figur 7A, B) viser et stort antall forskjellige fotoblekingstrinn, noe som tyder på dannelsen av forskjellige monteringsmellomprodukter31. ClyA, som er et transmembranprotein, interagerer med den negativt ladede glassoverflaten i fravær av PEG og vil montere svært dårlig. Ved 7,5 mol% PEG2000 lipider ble de sammensatte kompleksene målt og plottet i figur 7C. Etter å ha korrigert for merkingseffektiviteten (0,9 i dette tilfellet), viser den endelige fordelingen av oligomerer den dodekameriske ClyA-arten som den dominerende strukturen, i samsvar med strukturelle data32.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for rengjøringstrinn og mikrofluidisk kammermontering. (A) Glassglassene og dekslene rengjøres med sekvensiell sonikering i vaskemiddel, aceton, metanol, KOH og piranha-løsning, med flere skyllinger av type 1 ultrarent vann mellom hvert trinn. Lysbildene og dekslene tørkes deretter med nitrogengass før plasmabehandling. (B) Det mikrofluidiske bildekammeret monteres deretter ved hjelp av et forhåndskuttet dobbeltsidig tape som binder lysbildet til dekselet. *Akrylglass behandles ikke med pirajaoppløsning, og aceton, metanol og KOH brukes i en 50 % (v/v) konsentrasjon av det som brukes til rengjøring av deksel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: TIRF mikroskop oppsett. Et typisk TIRF-mikroskopoppsett av objektiv type tilpasset et omvendt mikroskop er vist med essensiell optikk uthevet. M1-M5 er speil for å styre laserstrålen. Objektivene L1 og L2 brukes til å utvide laserstrålen, og L3-objektivet fokuserer laserstrålen på det bakre fokalplanet på objektivlinsen. I1 og I2 er Iris-membranene som brukes til å justere laserstrålen. En lukker brukes til å kontrollere laserstrålebelysningen, kritisk for å forhindre unødvendig fotobleking av fluorescensmolekylene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Oppsett av membranbindende kinetikkflyt. For å gjennomføre bindingseksperimentet brukes en tynn PTFE-slange (0,022 i ID x 0,042 i OD) til å strømme prøven ved hjelp av en sprøytepumpe (bilde ikke skaleres). Enden av slangen er koblet til avbildningskammerutløpet ved hjelp av en mikropipettespiss. Avfallet samles i et lite mikrotuppreservoar som er koblet til uttaket, og volumet som introduseres er alltid større enn 10 ganger volumet av avbildningskammeret. Innfelt figur som viser tverrsnitt av bildekammeret. (bilde ikke skaleres) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Pipeline for analyse fra enkeltpartikkelbaner og fotoblekingsfilmer. (A) De oppkjøpte filmene ble analysert ved hjelp av u-spor i MATLAB for å oppnå banene som (x, y) og intensitetene (i) til hver partikkel, ramme for ramme. Disse banene ble deretter brukt til å beregne øyeblikkelig kvadratforskyvning (ISD), ISD1 og ISD2. ISD-ene kan deretter plottes som histogrammer for å identifisere mobile arter. Alternativt informerer gjennomsnittlige kvadrerte forskyvningsplott (MSD) om bevegelsen er gaussisk, begrenset eller superdiffusiv33,34. Skjult Markov Model35 (HMM) analyse kan brukes til å skille forskjellige diffusive tilstander av en enkelt partikkel. (B) For fotoblekingsanalysen ble filmene først korrigert for drift i systemet (om nødvendig), etterfulgt av partikkeldeteksjon eller sporing ved hjelp av u-spor. Bortsett fra å estimere intensitetsfordelingen23 (og andre partikkelfunksjoner), kan intensitetsbanene analyseres for antall fotoblekingstrinn ved hjelp av trinnfinnende algoritmer36,37,38. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Binding av ClyA til støttede lipidmembraner med 5 mol% DOPE-PEG2000. En typisk bindingskurve oppnås etter å ha talt antall partikler i hver ramme identifisert av u-spor. Avbildning initieres før strømmen av det membranbindende ClyA-proteinet. En eksponentiell henfallsfunksjon (svart linje) som passer til partikkelnumre (cyan sirkler) brukes til å gjenopprette tidskonstanten for binding av ClyA til membranen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Mobilitet av lipofilt DNA på PEG-lipid dobbeltlagsmembraner . (A) Skjematisk for den lipofile DNA-sporeren i POPC/DOPE-PEG2000-membranen er vist. (B) Gjennomsnittlige kvadrerte forskyvninger beregnet fra enkeltpartikkelsporing for forskjellige PEG-SLBer vises. I 2 mol% DOPE-PEG2000 viser DNA-sporstoff ren brownsk oppførsel sammenlignet med hindret mobilitet i fravær av polymeren (stiplet linje er inkludert for referanse). På den annen side avviker det samme DNA-sporstoffet bort fra ren brownsk diffusjon, noe som indikerer subdiffusiv bevegelse med redusert mobilitet i nærvær av 20 mol% DOPE-PEG2000. (C) ISD2-fordeling for diffusjon av lipofil DNA-tracer i to forskjellige PEG2000 lipidmembraner sammenlignes med bare SLBer .

Figure 7
Figur 7: Fotoblekingsspor og montering av ClyA på lipid dobbeltlagsmembraner . (A,B) Representative tidsspor viser fotoblekingstrinn av ClyA nanoporekompleks oppdaget i trinn 6.2.1. for et montert ClyA-kompleks med henholdsvis 7 og 5 trinn. (C) Fordelingen av fotoblekingstrinnet (grå) for ClyA (25 nM) inkubert på 64,7 % POPC: 27,8 % Kolesterol: 7,5 % DOPE-PEG2000-membran i 60 minutter ved 37 °C er vist. Etter korrigering for ufullstendig merkingseffektivitet vises estimert massefraksjon av forskjellige oligomere arter (magenta). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1: Binding av ClyA på membranen. Overvåking av Cy3-merket ClyA-proteinbinding til SLB-membranen som inneholder 5 mol% DOPE-PEG2000. De bundne partiklene oppdages (cyansirkler) av u-spor, og sporene plottes for fem påfølgende posisjoner i banen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Diffusjon av DNA-tracer på 2 mol% PEG-membranen. En film for Cy3-merket DNA forankret til lipidmembranen via tokoferol i 2 mol% PEG2000-membranen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3: Fotobleking film. En film av monterte oligomerer av Cy3-merkede ClyA-molekyler på membranen som inneholder 7,5 mol% DOPE-PEG2000. Større komplekser er tydelige fra flere ganger høyere intensiteter sammenlignet med et enkelt protein, så vel som fra de flere fotoblekingstrinnene når partikkelintensiteten observeres over tid under kontinuerlig belysning. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsfil 1: Informasjon om hvordan du bruker u-spor og ulike MATLAB-koder i trinn 6. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfil 1: En representativ dataassistert konstruksjonsfil (CAD) for å lage hull i akrylglasset og skjærebånd for hele lysbildet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfiler 2: Komprimert mappe som inneholder tilknyttede MATLAB-koder som trengs for bilde- og dataanalyse i trinn 6. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfiler 3: Eksempeldata for bilde- og dataanalyse i trinn 6. MATLAB-kodene er også tilgjengelige på https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her demonstrerer vi enkeltmolekyleksperimenter på støttede lipid-dobbeltlag (SLB) som manifesterer et overfylt miljø for membraninnstøpte biomolekyler. Det overfylte miljøet genererer en ekskludert volumeffekt, noe som fører til forbedring av biomolekylære reaksjoner 1,2,39,40. For PEG-lipidsystemet, hvor polymeren primært opptar volumet utenfor dobbeltlaget, er denne effekten spesielt uttalt for molekylære arter med store ekto-domener. Derfor, sammenlignet med lipofile fargestoffer, kan diffusjonen av et stort hydrofilt molekyl innebygd i membranen, slik som reseptorer, glykoproteiner og glykolipider, reduseres betydelig. Ved hjelp av fluorescerende tracer-DNA forankret til membranen via tokoferol (figur 5), kan vi identifisere slike trengselseffekter.

Separat løfter tilstedeværelsen av PEG i bunnbrosjyren også SLB og reduserer samspillet mellom biomolekylene og støttesubstratet14,41. Vanligvis hindrer den negativt ladede overflaten av bildeglassoverflaten ofte mobilitet og molekylære reaksjoner. Derfor er bruk av PEG-lipider for å løfte membranen bort fra glasset fordelaktig, selv når det ikke er for trengsel. Imidlertid må det tas hensyn til å identifisere konsentrasjonsregimer som ikke manifesterer molekylær trengsel i disse tilfellene. For proteiner som utvider større domener utenfor dobbeltlaget, kan bruk av en PEG-lipid med høyere molekylvekt som PEG5000 være nødvendig42.

Noen få viktige punkter er kritiske for enkeltmolekylavbildningen på SLB-systemer. Streng rengjøring av lysbilder og deksler er kritisk i enkeltmolekyleksperimenter (trinn 1). Avbildning av en overflate med urenheter vil resultere i defekter i lipidmembranen. Dette kan resultere i flekker av fluorescerende merkede biomolekyler på membranoverflaten. Dekningen og ensartetheten av SLB dannet kan verifiseres i et eget preparat ved å dope dobbeltlaget med et lipidfargestoff (DiI eller Lissamine Rhodamine DOPE) og avbilde det under et fluorescensmikroskop. FRAP-analyse kan brukes til å benchmarke diffusiv oppførsel også43,44.

For membranbindingseksperimenter (trinn 4) skal strømningsoppsettet med slangen primes med buffer for å forhindre at luftbobler kommer inn i kammeret. Høyere strømningshastigheter eller tilstedeværelsen av luftbobler vil briste membranen, og molekylene vil binde seg direkte til dekselet. Bildeinnsamlingen bør starte før strømmen starter, da noen molekyler diffunderer fra slangen og binder seg til membranen. Fokusering av målet på dobbeltlaget under avbildning kan lettes ved å doping dobbeltlaget ved lav konsentrasjon med gull nanopartikler, kvanteprikker eller fluorescerende perler.

For enkeltpartikkelsporingseksperimentene bør antall partikler på membranen kontrolleres for å unngå et scenario der sporingen er utfordrende på grunn av overdreven overlapping av partikkelbanene. En annen viktig faktor å vurdere under avbildningen er laserkraften. En høy lasereffekt vil fotobleke fluoroforene raskt, mens lav intensitet og de tilsvarende langsomme bildeinnsamlingshastighetene vil føre til uskarphet. Optimal lasereffekt bør gi en betydelig banelengde (minst >5 i gjennomsnitt) samtidig som symmetriske og nær diffraksjonsbegrensede bilder av partikler opprettholdes. Et oksygenfjerningssystem kan også brukes til å forlenge fotoblekingen av fluoroforer45. En begrensning av fotoblekingsanalysen som presenteres her, oppstår 37,46 når det gjelder store molekylære enheter (~ større enn 20 underenheter), slik som det kjernefysiske porekomplekset47. I slike tilfeller kan en Bayesian-basert tilnærming brukes til å utlede underenhetspopulasjonen48,49,50.

Merkingen av biomolekyler med fluoroforer er i de fleste tilfeller ikke fullført51. Dette gir en utfordring ved telling av underenheter i en klynge med umerkede arter. En binomisk korreksjon for sub-par merking effektivitet er vanligvis en rimelig tilnærming når støkiometri av molekylære arter er fast. I mange tilfeller kan oligomere arter være heterogene eller dynamisk skiftende, som i en oligomeriseringsprosess, noe som krever utvikling av nye verktøy for å trekke ut de underliggende fordelingene fra fotoblekingsdata.

Samlet sett gir denne protokollen en rørledning for generering av PEG-SLBer, med anbefalinger for forholdene for å bruke, utføre og analysere enkeltmolekylbinding, og spore og utføre fotoblekingsanalyse for membranbiomolekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner prof. Benjamin Schuler for å dele uttrykket plasmid for ClyA-protein. Dette arbeidet ble støttet av Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

Biokjemi utgave 185
Enkeltmolekyldiffusjon og montering på polymerfylte lipidmembraner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., … More

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter