Summary
Aqui, um protocolo para realizar e analisar a ligação, mobilidade e montagem de moléculas individuais em membranas lipídicas artificiais apinhadas usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total de molécula única (smTIRF) é apresentado.
Abstract
As membranas celulares são ambientes altamente lotados para reações biomoleculares e sinalização. No entanto, a maioria dos experimentos in vitro que investigam a interação de proteínas com lipídios emprega membranas bicamadas nuas. Tais sistemas carecem das complexidades do apinhamento por proteínas e glicanos embutidos na membrana e excluem os efeitos de volume associados encontrados nas superfícies da membrana celular. Além disso, a superfície de vidro carregada negativamente na qual as bicamadas lipídicas são formadas impede a difusão livre de biomoléculas transmembranares. Aqui, apresentamos uma membrana polimérico-lipídica bem caracterizada como uma mímica para membranas lipídicas lotadas. Este protocolo utiliza lipídios conjugados com polietilenoglicol (PEG) como uma abordagem generalizada para incorporar crowders na bicamada lipídica suportada (SLB). Primeiro, um procedimento de limpeza das lâminas microscópicas e coverslips para a realização de experimentos de molécula única é apresentado. Em seguida, são discutidos métodos para caracterizar os PEG-SLBs e realizar experimentos de molécula única de ligação, difusão e montagem de biomoléculas usando rastreamento de molécula única e fotobranqueamento. Finalmente, este protocolo demonstra como monitorar a montagem de nanoporos da toxina formadora de poros bacterianos Citolisina A (ClyA) em membranas lipídicas lotadas com análise de fotobranqueamento de molécula única. Os códigos MATLAB com conjuntos de dados de exemplo também são incluídos para executar algumas das análises comuns, como rastreamento de partículas, extração de comportamento difusivo e contagem de subunidades.
Introduction
As membranas celulares são sistemas altamente lotados e complexos1. O apinhamento molecular pode ter um impacto considerável na difusão de entidades ligadas à membrana, como proteínas e lipídios 2,3,4. Da mesma forma, reações bimoleculares em membranas lipídicas como a dimerização de receptores ou a oligomerização de complexos de membranas são influenciadas pelo apinhamento 5,6,7. A natureza, a configuração e a concentração de crowders podem governar a ligação da membrana, a difusividade e a interação proteína-proteína de várias maneiras 8,9. Como controlar o aglomeramento de membranas nas membranas celulares e interpretar sua influência sobre as biomoléculas embutidas é um desafio, os pesquisadores têm tentado estabelecer sistemas in vitro alternativos10.
Uma abordagem popular para membranas artificiais apinhadas é a dopagem das membranas bicamadas com lipídios enxertados com polímero (como polietilenoglicol, PEG)11,12. Durante a visualização da dinâmica de proteínas e lipídios em bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), esses polímeros adicionalmente protegem os componentes embutidos na membrana do substrato subjacente carregado negativamente (como o vidro), levantando efetivamente a bicamada para longe do suporte subjacente. Variando o tamanho e a concentração do polímero, pode-se controlar a extensão do apinhamento molecular, bem como sua separação do suporte sólido subjacente13,14. Esta é claramente uma vantagem sobre as bicamadas lipídicas suportadas em substratos sólidos sem almofadas poliméricas15,16, onde as biomoléculas transmembranares podem perder sua atividade17,18,19. Mais importante, nos permite recapitular o ambiente lotado da membrana celular in vitro, o que é crítico para muitos processos de membrana.
Polímeros enxertados superficialmente em membranas também sofrem alterações em sua configuração dependendo de sua densidade de enxerto12. Em baixas concentrações, eles permanecem em uma configuração entropicalmente enrolada, conhecida como cogumelo, acima da superfície da membrana. Com o aumento da concentração, eles começam a interagir e tendem a se desenrolar e se estender, finalmente produzindo uma densa formação em forma de escova na membrana21. Uma vez que a transição do cogumelo para o regime de escova é altamente heterogênea e se manifesta em condições mal caracterizadas do polímero, é importante usar condições bem caracterizadas para apinhamento em membranas enxertadas com polímero. Em comparação com um estudo recente20, identificamos e relatamos composições de membranas lotadas que mantêm o transporte difusivo e a atividade das biomoléculas transmembranares.
Neste protocolo, discutimos como gerar membranas lipídicas PEGiladas e fornecemos recomendações para densidades de PEG que imitam o apinhamento em dois regimes diferentes de configuração polimérica (a saber, cogumelo e escova). O protocolo também descreve a ligação de molécula única, o rastreamento de partículas e a aquisição e análise de dados de fotobranqueamento para moléculas embutidas nessas membranas lotadas. Primeiro, descrevemos as etapas de limpeza completas, a montagem da câmara de imagem e a geração de PEG-SLBs. Em segundo lugar, fornecemos detalhes para os experimentos de ligação de molécula única, rastreamento de partículas e fotobranqueamento. Em terceiro lugar, discutimos i) extrair as afinidades relativas de ligação, ii) caracterizar a difusão molecular e iii) contar subunidades em um conjunto de proteínas a partir de filmes de moléculas individuais na membrana.
Embora tenhamos caracterizado esse sistema com imagens de molécula única, o protocolo é útil para todos os biofísicos de membrana interessados em entender o efeito do aglomeração em reações biomoleculares em membranas lipídicas. No geral, apresentamos um pipeline robusto para a fabricação de bicamadas lipídicas lotadas e suportadas, juntamente com vários ensaios de molécula única realizados sobre eles e as rotinas de análise correspondentes.
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Protocol
1. Limpeza da lâmina e da tampa para experimentos de molécula única
- Antes da montagem da câmara de imagem, limpe e prepare as folhas de cobertura e as corrediças. Faça vários pares de furos nas lâminas de vidro usando uma máquina de perfuração com brocas revestidas de diamante (0,5-1 mm de diâmetro). Se forem usadas chapas de acrílico, use um cortador a laser para fazer furos precisos (0,5 mm), como mostra a Figura 1.
NOTA: Cada par de orifícios atuará como uma entrada e saída para troca de fluxo para uma câmara microfluídica individual. Um arquivo CAD representativo para orifícios em um slide de acrílico está disponível no Arquivo de Codificação Suplementar 1. Os furos perfurados em lâminas de vidro geralmente acabam sendo 1,5x-2x maiores do que o tamanho da broca. - Limpe as corrediças e as tampas com detergente. Lave-os bem com água deionizada. Coloque as lâminas e as tampas em um frasco separado de coloração deslizante (Coplin) com água e sonicate em um sonicator de banho por 30 min. Para todas as etapas de sonicação, use uma configuração de energia de 70 W.
- Retire a água e encha o frasco de Coplin contendo as lâminas de vidro e as folhas de cobertura com acetona até a borda (50-100 mL, dependendo do volume do frasco). No caso de folhas de acrílico, use o mesmo volume de solução de acetona pré-misturada a 50% (v/v) ou então as lâminas ficarão geladas. Agite o frasco Coplin para garantir que todas as corrediças e tampas estejam completamente imersas na solução e sonicate em um sonicator de banho por 30 min.
- Remova a acetona e descarte-a em um recipiente de resíduos, despeje metanol nos frascos Coplin (50%, v / v para lâminas de acrílico) e sonicate por 30 min. Tanto a acetona quanto o metanol são usados para remover partículas orgânicas nas lâminas.
- Lave as lâminas e as tampas com grandes quantidades de água tipo 1 e coloque-as em um frasco de vidro Coplin. Despeje a solução de 1 M KOH no frasco e sonicate por 1 h. Para as lâminas de acrílico, use 0,5 M de KOH.
- Descarte o KOH em um recipiente de resíduos inorgânicos. Lave o frasco com bastante água e coloque os frascos Coplin em um exaustor para tratamento de piranhas. Não realize tratamento com piranha para lâminas acrílicas; prossiga directamente para o passo 1.9.
CUIDADO: O tratamento com piranha deve ser feito em um exaustor com luvas adequadas, óculos de segurança e um avental para o manuseio de ácidos. A solução de piranha é um forte agente oxidante e remove quaisquer partículas orgânicas remanescentes das lâminas e deslizamentos de cobertura. - Para preparar a solução de piranha, despeje suavemente um volume de ácido sulfúrico de 2/3 (98%, v/v) num copo de vidro e encha o resto com peróxido de hidrogénio (30%, v/v). Misture a solução cuidadosamente com uma haste de vidro, despeje-a no frasco Coplin e deixe o frasco Coplin no exaustor por pelo menos 1 h.
- Decantar a solução de piranha do frasco Coplin em um recipiente de descarte de resíduos ácidos mantidos dentro do exaustor. Lave o frasco Coplin com uma grande quantidade de água tipo 1.
- Seque as lâminas e as tampas em um fluxo suave de gás nitrogênio e coloque-as em um frasco Coplin limpo. As lâminas secas e as tampas estão agora prontas para o tratamento com plasma. Pegue um par de corrediças e folhas de cobertura e coloque-as na máquina de plasma.
- Crie um vácuo na câmara. Gire o botão para a frequência de rádio de 8-12 MHz para gerar plasma na câmara. Um brilho roxo dentro da câmara indicará a formação de um plasma na câmara.
- Realize o tratamento com plasma por 8-10 min. Solte suavemente o vácuo depois de desligar o plasma e prossiga para a etapa 2 para montar a câmara de imagem microfluídica.
2. Montagem da câmara microfluídica
NOTA: A câmara de imagem é criada pela colocação de fita dupla face entre uma folha de cobertura pré-limpa e o slide da etapa anterior, conforme descrito abaixo.
- Montar as lâminas e a tampa após o tratamento com plasma, conforme mostrado na Figura 1. Coloque a lâmina de vidro em um papel de seda limpo. Corte a fita dupla face em tiras de ~2-3 mm de largura e coloque-as de cada lado de um par de orifícios na lâmina de vidro. Use uma ponta de pipeta para achatar a fita ou isso causará vazamento de um canal para o outro.
NOTA: Como alternativa, corte a fita para o slide inteiro usando um cortador de plotter a laser ou automatizado (Figura 1). - Coloque a tampa tratada com plasma na corrediça colada para fechar a câmara. Use uma ponta de pipeta para pressionar suavemente a tampa nas regiões coladas para tornar o canal estanque.
- Se estiver usando lâminas de vidro, sele as bordas usando resina epóxi. Finalmente, cada câmara de imagem feita de uma lâmina e deslizamento de cobertura tem uma dimensão de 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (comprimento x largura x profundidade). Armazenar as câmaras de imagem microfluídicas preparadas por 1-2 semanas em condições desidratadas (de preferência entre 10-25 °C).
NOTA: Para as fitas de corte a laser usadas com lâminas de acrílico, não é necessário usar epóxi, pois as bordas da fita formam uma vedação à prova de vazamento apertada.
3. Fazendo bicamadas suportadas em substrato de vidro por fusão de vesículas
NOTA: Bicamadas lipídicas suportadas amontoadas são geradas nas paredes da câmara de imagem pela fusão de vesículas lipídicas preparadas com lipídios PEG dopados.
- Tome um frasco para injetáveis de vidro limpo, de preferência pré-limpo com solução de piranha. Adicionar solução de clorofórmio de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1,2-dioleoil-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[amino(polietilenoglicol)-2000] (DOPE-PEG2000) na fracção molar desejada dos lípidos PEG2000, de modo a que a concentração final após a adição do tampão seja de 3 mM de lípidos no passo 3.4. Prepare outras composições de membrana de lipídios de forma semelhante.
- Secar o clorofórmio do frasco para injetáveis utilizando um fluxo suave de azoto com um pequeno redemoinho para que os lípidos secos sejam uniformemente revestidos na superfície do frasco para injetáveis. Coloque o frasco para injetáveis num exsicador a vácuo durante 1 h. Isto irá remover qualquer clorofórmio residual no frasco para injetáveis de vidro. Adicionar 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubar durante a noite a 37 °C.
- Prepare pequenas vesículas unilamelares (SUVs) conforme descrito abaixo.
- Vórtice suavemente por 1-2 min após a incubação durante a noite até que a solução fique turva e leitosa.
- Tome 100 μL desta solução em um pequeno tubo de centrífuga de 500 μL e sonicate por cerca de 1 h em um sonicator de banho (definido em uma configuração de potência de 70 W). A solução tornar-se-á clara; se não, então sonicate por mais 30 min. Esta etapa irá gerar SUVs de 50-100 nm de diâmetro.
NOTA: Se estiver a preparar-se pela primeira vez, caracterize os SUV utilizando o dispersão dinâmica da luz 22,23 (DLS) ou um método equivalente.
- Adicionar cloreto de cálcio (CaCl2, 3 M stock) às vesículas sonicadas de modo a que a sua concentração final seja de 30 mM na solução lipídica.
- Corte uma ponta de micropipeta para injetar a solução de amostra de modo que ela se encaixe firmemente no orifício. Misture a solução lipídica e injete através de um dos orifícios na câmara de imagem feitos na etapa 2. Limpe o excesso de solução que sai da câmara da saída com um tecido limpo para evitar a contaminação dos canais adjacentes.
- Deixe esta montagem em uma câmara umidificada por 90 min. Prepare uma câmara de umidificação colocando um tecido molhado no final de um tubo de centrífuga de 50 mL. Coloque o deslizamento lateralmente dentro do tubo com as tampas do tubo fechadas. As vesículas se fundirão e gerarão uma bicamada uniforme na superfície do vidro.
- Lave bem a câmara com uma grande quantidade de tampão PBS (aproximadamente 5 vezes o volume da câmara de imagem). Evite a entrada de bolhas de ar na câmara durante a lavagem, pois isso pode gerar defeitos na membrana.
4. Configuração do microscópio e medições de imagem de partícula única
NOTA: Experimentos de molécula única são realizados em uma configuração de microscópio de fluorescência de reflexão interna total baseada em objetivos 24,25,26 (TIRF) (Figura 2). A imagem TIRF fornece uma melhor relação sinal-ruído para imagens de molécula única, embora os microscópios de epifluorescência também possam ser usados sob certas condições (especialmente quando as biomoléculas fluorescentes podem ser removidas da solução a granel por lavagem). O TIRF do tipo prisma pode ser usado, mas o tipo objetivo é preferível para a facilidade de configuração da microfluídica27. Para o TIRF do tipo objetivo, recomenda-se uma objetiva de abertura numérica alta (ampliação de 100x, geralmente disponível comercialmente como objetiva TIRF).
- Antes de realizar qualquer experimento sobre mobilidade e montagem, alinhe o microscópio TIRF para garantir uma ótima relação sinal-ruído devido à iluminação pelo campo evanescente. Durante o alinhamento, mantenha a potência do laser baixa, entre 100 μW e 1 mW.
CUIDADO: Óculos de segurança a laser devem ser usados durante o alinhamento do feixe de laser.- Para alinhar o microscópio, prepare uma amostra de grânulos fluorescentes adicionando-os ao canal microfluídico em baixas concentrações (a ~100 pM) de modo que os pontos fluorescentes de contas individuais não se sobreponham nas imagens.
- Primeiro, visualize as contas no modo de epifluorescência. Enquanto a iluminação estiver no modo de epifluorescência, mova o estágio de tradução do espelho M5 (o espelho que reflete o laser para o dicroico) de tal forma que o feixe que sai do objetivo se dobre até que eventualmente esteja em uma configuração de reflexão interna total.
- Verifique se a iluminação TIR foi alcançada. Quando o campo evanescente TIR estiver iluminando a amostra de contas, verifique se apenas as contas na superfície são visíveis e se as contas flutuantes afastadas da superfície não são observadas.
- No início do experimento, defina a potência do laser no plano focal traseiro objetivo para 5-10 mW para evitar a fotodestruição (fotobranqueamento) dos fluoróforos.
- Mantenha a lâmina no estágio do microscópio e concentre-se na membrana nua (sem fluoróforos) primeiro. Normalmente, pequenos vestígios de impurezas nas membranas lipídicas são suficientes para fazer isso. Opcional: Incorpore um pequeno número de esferas fluorescentes ou pontos quânticos (faixa subpicomolar) durante a etapa 3.1, de modo que apenas duas a cinco partículas fluorescentes estejam presentes no campo de visão para facilitar a identificação do foco correto.
- Injectar a amostra (proteínas de membrana, etc.) utilizando uma micropipeta na câmara de imagem revestida com PEG-SLB efectuada no passo 3.7.
- Para medir a cinética de ligação de molécula única, use uma bomba de seringa para fluir as biomoléculas marcadas através dos orifícios de entrada para a câmara microfluídica (Figura 3). Use uma taxa de fluxo de 50-500 μL/min.
- Inicie a aquisição de filmes antes de adicionar a solução à câmara de imagem. Adquira >5.000 quadros a uma taxa de quadros de 25-50 quadros / s sob fluxo contínuo até que não haja aumento adicional na aparência de novos pontos na superfície da membrana (Vídeo 1). Para a análise da cinética de ligação, siga os passos do ponto 6.1.
- Para o rastreamento de partícula única, adicione as biomoléculas marcadas em baixas concentrações (em comparação com a constante de ligação) ao canal usando uma micropipeta. Otimizar a concentração para uma densidade de <0,1 partículas/μm 2 para que partículas individuais raramente se cruzem (Vídeo 2). Isso garante a alta fidelidade das faixas recuperadas dos conjuntos de dados. Incubar, se necessário (em caso de má ligação da membrana por biomoléculas, ~ 10 min) em um ambiente de umidificação e lavar a câmara com o tampão.
NOTA: A lavagem é necessária no caso de a ligação ser pobre na membrana e a maioria das moléculas fluorescentes permanecer na solução. Caso contrário, isso pode interferir com a imagem e resultar em uma baixa relação sinal-ruído. - Para análise de trajetória de partícula única, adquira 200-500 quadros a 10-100 quadros/s. Mantenha a lente objetiva focada no plano da bicamada com desvio mínimo do estágio durante o intervalo de aquisição.
5. Aquisição de imagem para contagem de subunidades em um conjunto de proteínas
NOTA: A aquisição de imagens para estimar a estequiometria requer o branqueamento contínuo dos fluoróforos e a detecção do número de etapas até que não haja mais fluoróforos emitindo fluorescência.
- Para as subunidades de medição, adicionar a concentração relevante de biomoléculas marcadas (exemplo: ver resultados; ClyA foi adicionado na concentração de 25 nM) à câmara de imagem microfluídica e incubado (lavagem, se necessário). Incubar a lâmina numa câmara de umidificação à temperatura desejada durante o tempo necessário (exemplo: 37 °C e 60 min para a montagem de ClyA).
- Realizar a aquisição de imagem para fotobranqueamento de molécula única, conforme descrito abaixo.
- Lave a câmara de imagem com um tampão antes da imagem (se necessário). Coloque a lâmina no microscópio e ajuste o foco para visualizar as moléculas marcadas.
- Defina a potência do laser para um nível em que o branqueamento do fluoróforo ocorra gradualmente (~ 1-5 min). Idealmente, para cada biomolécula montada, mantenha a taxa de passo de fotobranqueamento >10-20 quadros de imagem separados. Adquira as imagens até que todas as moléculas estejam completamente fotobranqueadas (Vídeo 3).
NOTA: Para determinar a duração total da trajetória de fotobranqueamento necessária, plote a intensidade média de pontos individuais com o número de quadros de imagem e determine a constante de tempo ajustando uma função de decaimento exponencial. A duração total da aquisição pode ser definida como 5-10 vezes a constante de tempo.
- Execute uma medição de montagem dependente do tempo, iniciando a aquisição do filme assim que a amostra for introduzida na câmara e adquirindo novos filmes de fotobranqueamento em intervalos de tempo fixos após a ligação da membrana de diferentes segmentos do PEG-SLB.
6. Análise de imagens e dados
- Execute a ligação e o rastreamento de partículas únicas, conforme descrito abaixo.
- Extraia trajetórias de partícula única dos filmes adquiridos acima, como mostra a Figura 4. Para detectar partículas individuais e rastreá-las, use o pacote MATLAB, u-track28, ou o Trackmate29, um plugin no ImageJ, que também fornece um algoritmo robusto de rastreamento de partícula única. Siga as etapas para configurar a análise u-track, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1.
NOTA: Os parâmetros críticos para o rastreamento de partícula única são o desvio padrão do tamanho da partícula (em pixels) e o comprimento de fechamento da lacuna. Use 1 e 0, respectivamente, para esses parâmetros como os critérios mais rigorosos para rastreamento. - Para calcular as constantes da taxa de ligação, primeiro estime o número de partículas que se ligam à superfície da membrana ao longo do tempo. Use o arquivo MATLAB binding_SPT (Arquivo de Codificação Suplementar 2) com a pasta de saída u-track para identificar e plotar o número de partículas que aparecem na membrana obtida da etapa 6.1. Ajustar a cinética observada a modelos cinéticos apropriados (exemplo: ajuste exponencial único para determinar a constante de tempo, cujo inverso pode ser atribuído à constante de taxa aparente)30 para extrair as constantes de taxa (ver resultados, Figura 5).
- O deslocamento quadrado médio (MSD) das partículas difusoras (como o marcador de DNA em PEG-SLBs, Figura 6) indica a natureza da difusão. Use o pacote MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) com a pasta de saída u-track para obter o gráfico MSD em função do tempo de atraso (Figura 6B).
- Para identificar espécies heterogêneas difusoras, calcule as distribuições instantâneas de deslocamento ao quadrado (ISD), conforme mostrado na Figura 6C. ISD2, definido como (X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2, onde o tempo de atraso, τ = 2, é preferido, pois reduz o ruído. Filtre trajetórias curtas com menos de três quadros para reduzir o ruído.
- Use ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) no MATLAB com a saída u-track para plotar os ISDs das partículas rastreadas (Figura 6C).
- Extraia trajetórias de partícula única dos filmes adquiridos acima, como mostra a Figura 4. Para detectar partículas individuais e rastreá-las, use o pacote MATLAB, u-track28, ou o Trackmate29, um plugin no ImageJ, que também fornece um algoritmo robusto de rastreamento de partícula única. Siga as etapas para configurar a análise u-track, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1.
- Realize a análise de fotobranqueamento de molécula única, conforme descrito abaixo.
- Para estimar a estequiometria dos complexos de membrana, realizar uma análise de fotobranqueamento nas intensidades dependentes do tempo dos complexos fluorescentes (Vídeo 3). Para isso, aplique um algoritmo de correção de deriva (drift_correct_images, Arquivo de Codificação Suplementar 2) com base na autocorrelação de quadros de filme para extrair a deriva de tradução. Isso pressupõe que as estruturas montadas são em grande parte imóveis durante a aquisição de imagens. Execute o pacote MATLAB Extract_traces_1C (Arquivo de Codificação Suplementar 2) para detectar traços de tempo de intensidade de partículas dos filmes.
- Use o código MATLAB Stepcount_immobile (Arquivo de Codificação Suplementar 2) para executar a detecção de etapa para os rastreamentos de tempo de intensidade. Caso as partículas não estejam imóveis, use o pacote u-track para extrair a localização das partículas em movimento. Este conjunto de coordenadas xy pode ser mapeado para os filmes brutos para extrair os valores de intensidade da partícula em movimento à medida que se difunde lateralmente na membrana. Use o pacote MATLAB utrack_Int (Arquivo de Codificação Suplementar 2) com a saída da análise u-track para esta opção.
- Realizar uma correção para marcação incompleta das biomoléculas com etiquetas de fluoróforo para estimar a estequiometria correta do complexo proteico. Determine a eficiência de marcação com um espectrofotômetro UV-VIS, medindo a absorção de corante e proteína para estimar a concentração. Calcule a eficiência de marcação como a razão molar do corante para a proteína.
NOTA: Alguns corantes também absorvem em comprimentos de onda próximos de 280 nm e, portanto, essa contribuição de absorção pelo corante deve ser contabilizada durante o cálculo da concentração. - Execute uma correção binomial para explicar a eficiência de rotulagem incompleta do fluoróforo da seguinte maneira, usando o código MATLAB Step_correction (Arquivo de Codificação Suplementar 2) com os dados obtidos da contagem de etapas na etapa 6.2.2. Por exemplo, para uma toxina formadora de poros como a citolisina A, que forma uma estrutura semelhante a um anel dodecamérico, aplique uma correção binomial usando a seguinte fórmula:
nk
onde
= eficiência de rotulagem, n = número de etapas de fotobranqueamento e s = contagens reais. Use a rotina MATLAB Stepcount_immobile para recuperar as espécies oligoméricas corrigidas. Converter a frequência de oligômeros (si) em frações mássicas (Figura 7C; Arquivo de codificação suplementar 2).
Observação : um conjunto de arquivos analisados que você rastreia estão incluídos no arquivo de codificação suplementar 3. Os códigos MATLAB no Arquivo de Codificação Suplementar 2 podem ser executados com esses conjuntos de dados.
= eficiência de rotulagem, n = número de etapas de fotobranqueamento e s = contagens reais. Use a rotina MATLAB Stepcount_immobile para recuperar as espécies oligoméricas corrigidas. Converter a frequência de oligômeros (si) em frações mássicas (Figura 7C; Arquivo de codificação suplementar 2).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monitorização da ligação da proteína ClyA nas membranas PEGiladas
Após a etapa 4.5, a cinética de ligação é estimada plotando o número de partículas que se ligam à superfície da membrana ao longo do tempo (Vídeo 1). À medida que a proteína ClyA se liga a uma membrana com 5 mol% de lipídios PEG2000, a densidade de partículas aumenta e atinge a saturação (Figura 5). Um ajuste de decaimento exponencial às partículas ligadas (círculos cianos) dá a constante de tempo (τb) para a ligação da membrana (notavelmente, os pontos de tempo iniciais [círculos vermelhos] não são adequados neste caso).
Mobilidade do traçador de DNA em membranas lotadas
Comumente usamos traçadores de DNA (DNA ancorado à membrana com um tocoferol), corantes traçadores lipofílicos (por exemplo, DiI) ou proteínas de membrana (por exemplo, ClyA) para caracterizar a membrana sob aglomeração mediada por PEG. A difusão lateral de moléculas traçadoras marcadas (25–100 pM) pode ser monitorada por imagem da membrana após a ligação das partículas. Na ausência de qualquer polímero de PEG na membrana, a maioria dos traçadores (especialmente aqueles que se estendem para fora da bicamada) exibe difusão restrita em SLBs (Figura 6A). Com pequenos níveis de PEG2000 na membrana (0,5-2 mol), a bicamada se afasta da superfície subjacente e as moléculas traçadoras podem se difundir sem restrições. Por outro lado, o confinamento extremo é observado em uma alta concentração de PEG (20 mol%), onde as moléculas de PEG estão em um regime de escova densa, com uma variedade de comportamentos exibidos no meio. Os gráficos de DME para essas três condições são mostrados na Figura 6B. Com base em nossa caracterização de membranas bicamadas POPC/DOPE-PEG2000, recomendamos uma fração DOPE-PEG2000 de 1–3 mol% que induz o apinhamento no regime de cogumelos. Acima de 7,5 mol% de PEG2000-lipídio, observamos o início do regime de escova, e composições até 25 mol% de PEG2000-lipídio podem ser empregadas para induzir aglomeração e confinamento. As condições intervenientes de 4-7% de lipídios PEG2000 correspondentes à transição entre os dois regimes são mal caracterizadas e devem ser evitadas.
Montagem de ClyA em membranas lotadas
As trajetórias de intensidade de pontos individuais limitados por difração da proteína ClyA após incubação na membrana lotada (Figura 7A,B) apresentam um grande número de etapas distintas de fotobranqueamento, sugerindo a formação de vários intermediários de montagem31. A ClyA, sendo uma proteína transmembrana, interage com a superfície de vidro carregada negativamente na ausência de PEG e se montará muito mal. A 7,5 mol% de lipídios PEG2000, os complexos montados foram medidos e plotados na Figura 7C. Após a correção para a eficiência de marcação (0,9 neste caso), a distribuição final dos oligômeros apresenta a espécie dodecamérica ClyA como estrutura dominante, consistente com os dados estruturais32.
Figura 1: Esquema para as etapas de limpeza e montagem da câmara microfluídica. (A) As lâminas de vidro e as tampas são limpas com sonicação sequencial em detergente, acetona, metanol, KOH e solução de piranha, com enxágue múltiplo por água ultrapura tipo 1 entre cada etapa. As lâminas e as coberturas são então secas com gás nitrogênio antes do tratamento com plasma. (B) A câmara de imagem microfluídica é então montada usando uma fita adesiva de dupla face pré-cortada que liga a lâmina à tampa. *As lâminas acrílicas não são tratadas com solução de piranha, e a acetona, o metanol e o KOH são usados a uma concentração de 50% (v/v) da usada para limpeza da lâmina de cobertura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração do microscópio TIRF. Uma configuração típica de microscópio TIRF do tipo objetivo adaptada em um microscópio invertido é mostrada com óptica essencial destacada. M1-M5 são espelhos para orientar o feixe de laser. As lentes L1 e L2 são usadas para expandir o feixe de laser, e a lente L3 foca o feixe de laser no plano focal traseiro da lente objetiva. I1 e I2 são os diafragmas da íris usados para alinhar o feixe de laser. Um obturador é usado para controlar a iluminação do feixe de laser, crítico para evitar o fotobranqueamento desnecessário das moléculas de fluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Configuração do fluxo cinético de ligação à membrana. Para a realização do experimento de ligação, um tubo fino de PTFE (0,022 em ID x 0,042 em OD) é usado para fluir a amostra com a ajuda de uma bomba de seringa (imagem não em escala). A extremidade da tubulação é conectada à saída da câmara de imagem com a ajuda de uma ponta de micropipeta. O descarte é coletado em um pequeno reservatório de microponta conectado à tomada, e o volume introduzido é sempre maior que 10 vezes o volume da câmara de imagem. Figura inserida mostrando a seção transversal da câmara de imagem. (imagem não em escala) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Pipeline para análise de trajetórias de partículas únicas e filmes de fotobranqueamento. (A) Os filmes adquiridos foram analisados utilizando u-track no MATLAB para obtenção das trajetórias como (x, y) e as intensidades (i) de cada partícula, quadro a quadro. Essas trajetórias foram então utilizadas para calcular o deslocamento quadrado instantâneo (ISD), ISD1 e ISD2. Os ISDs podem então ser plotados como histogramas para identificar espécies móveis. Alternativamente, os gráficos de deslocamento quadrado médio (DME) informam se o movimento é gaussiano, confinado ou superdifusivo33,34. A análise oculta do Modelo de Markov35 (HMM) pode ser empregada para distinguir diferentes estados difusivos de uma única partícula. (B) Para a análise de fotobranqueamento, os filmes foram primeiro corrigidos para deriva no sistema (se necessário), seguidos pela detecção ou rastreamento de partículas usando u-track. Além de estimar a distribuição de intensidade23 (e outras características de partículas), as trajetórias de intensidade podem ser analisadas para o número de etapas de fotobranqueamento usando algoritmos de busca de passos36,37,38. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ligação de ClyA a membranas lipídicas suportadas com 5 mol% DOPE-PEG2000. Uma curva de ligação típica é obtida após a contagem do número de partículas em cada quadro identificado pelo u-track. A imagem é iniciada antes do fluxo da proteína ClyA de ligação à membrana. Uma função de decaimento exponencial (linha preta) ajustada aos números de partículas (círculos cianos) é usada para recuperar a constante de tempo para a ligação de ClyA à membrana. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Mobilidade do DNA lipofílico nas membranas da bicamada lipídica PEG. (A) O esquema para o traçador de DNA lipofílico na membrana POPC/DOPE-PEG2000 é mostrado. (B) São mostrados os deslocamentos médios ao quadrado calculados a partir do rastreamento de partícula única para diferentes PEG-SLBs. Em 2 mol% DOPE-PEG2000, o traçador de DNA exibe comportamento browniano puro em comparação com a mobilidade dificultada na ausência do polímero (a linha tracejada é incluída para referência). Por outro lado, o mesmo traçador de DNA se desvia da difusão browniana pura, indicando movimento subdifusivo com mobilidade reduzida na presença de 20 mol% DOPE-PEG2000. (C) A distribuição ISD2 para a difusão do traçador de DNA lipofílico em duas membranas lipídicas diferentes do PEG2000 é comparada aos SLBs nus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Traços de fotobranqueamento e a montagem de ClyA em membranas de bicamada lipídica. (A,B) Traços de tempo representativos mostram etapas de fotobranqueamento do complexo nanoporo de ClyA detectadas na etapa 6.2.1. para um complexo ClyA montado com 7 e 5 passos, respectivamente. (C) A distribuição da etapa de fotobranqueamento (cinza) para ClyA (25 nM) incubada em 64,7% POPC: 27,8% Colesterol: 7,5% membrana DOPE-PEG2000 por 60 min a 37 °C é mostrada. Após a correção da eficiência de marcação incompleta, a fração de massa estimada de várias espécies oligoméricas (magenta) é mostrada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Ligação de ClyA na membrana. Monitoramento da ligação da proteína ClyA marcada com Cy3 à membrana SLB contendo 5 mol% de DOPE-PEG2000. As partículas ligadas são detectadas (círculos cianos) por u-track, e as trilhas são plotadas para cinco posições subsequentes em sua trajetória. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Difusão do traçador de DNA na membrana PEG a 2 mol%. Um filme para DNA marcado com Cy3 ancorado à membrana lipídica via tocoferol na membrana de 2 mol% PEG2000. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 3: Filme de fotobranqueamento. Um filme de oligômeros montados de moléculas de ClyA marcadas com Cy3 na membrana contendo 7,5 mol% DOPE-PEG2000. Complexos maiores são evidentes a partir das várias intensidades mais altas em comparação com uma única proteína, bem como das múltiplas etapas de fotobranqueamento quando a intensidade das partículas é observada ao longo do tempo sob iluminação contínua. Clique aqui para baixar este vídeo.
Arquivo Suplementar 1: Informações sobre como usar o u-track e diferentes códigos MATLAB na etapa 6. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 1: Um arquivo CAD (computer-aided design) representativo para fazer furos no slide de acrílico e fita de corte para todo o slide. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivos de codificação suplementares 2: Pasta compactada contendo códigos MATLAB associados necessários para análise de imagem e dados na etapa 6. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivos de codificação suplementares 3: dados de exemplo para análise de imagem e dados na etapa 6. Os códigos MATLAB também estão disponíveis em https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, demonstramos experimentos de molécula única em bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) que manifestam um ambiente lotado para biomoléculas embutidas em membrana. O ambiente lotado gera um efeito de volume excluído, levando ao aumento das reações biomoleculares 1,2,39,40. Para o sistema lipídico PEG, onde o polímero ocupa principalmente o volume fora da bicamada, esse efeito é especialmente pronunciado para espécies moleculares com grandes domínios ectogênicos. Portanto, em comparação com os corantes lipofílicos, a difusão de uma grande molécula hidrofílica embutida na membrana, como receptores, glicoproteínas e glicolipídios, pode ser significativamente reduzida. Usando DNA traçador fluorescente ancorado à membrana via tocoferol (Figura 5), podemos identificar tais efeitos de apinhamento.
Separadamente, a presença de PEG no folheto inferior também eleva o SLB e reduz a interação das biomoléculas com o substrato de suporte14,41. Normalmente, a superfície carregada negativamente da superfície do vidro de imagem frequentemente dificulta a mobilidade e as reações moleculares. Portanto, o uso de lipídios PEG para levantar a membrana para longe do vidro é vantajoso mesmo quando não para fins de apinhamento. No entanto, deve-se tomar cuidado para identificar os regimes de concentração que não manifestam aglomeração molecular nesses casos. Para proteínas que se estendem por domínios maiores fora da bicamada, pode ser necessário o uso de um lipídio PEG de maior peso molecular, como o PEG500042.
Alguns pontos-chave são críticos para a imagem de molécula única em sistemas SLB. A limpeza rigorosa das lâminas e coberturas é fundamental em experimentos de molécula única (etapa 1). A imagem de uma superfície com impurezas resultará em defeitos na membrana lipídica. Isso pode resultar em manchas de biomoléculas marcadas fluorescentemente na superfície da membrana. A cobertura e uniformidade do SLB formado pode ser verificada em uma preparação separada dopando a bicamada com um corante lipídico (DiI ou Lissamine Rhodamine DOPE) e imageando-o sob um microscópio de fluorescência. A análise FRAP também pode ser utilizada para aferir o comportamento difusivo43,44.
Para experimentos de ligação à membrana (etapa 4), a configuração do fluxo com a tubulação deve ser preparada com tampão para evitar a entrada de bolhas de ar na câmara. Taxas de fluxo mais altas ou a presença de bolhas de ar romperão a membrana, e as moléculas se ligarão diretamente ao deslizamento da cobertura. A aquisição de imagens deve começar antes do início do fluxo, pois algumas moléculas se difundem da tubulação e se ligam à membrana. Focar o objetivo na bicamada durante a imagem pode ser facilitado pela dopagem da bicamada em baixa concentração com nanopartículas de ouro, pontos quânticos ou contas fluorescentes.
Para os experimentos de rastreamento de partícula única, o número de partículas na membrana deve ser controlado para evitar um cenário em que o rastreamento seja desafiador devido à sobreposição excessiva das trajetórias das partículas. Outro fator importante a ser considerado durante a imagem é a potência do laser. Uma alta potência do laser irá fotobranquear os fluoróforos rapidamente, enquanto a baixa intensidade e as taxas de aquisição de imagem lentas correspondentes causarão desfoque. A potência ideal do laser deve produzir um comprimento de trajetória significativo (pelo menos >5 em média), mantendo imagens simétricas e próximas à difração limitada de partículas. Um sistema de eliminação de oxigênio também pode ser usado para prolongar o fotobranqueamento de fluoróforos45. Uma limitação da análise de fotobranqueamento aqui apresentada surge 37,46 no caso de grandes montagens moleculares (~ maiores que 20 subunidades), como o complexo de poros nucleares47. Nesses casos, uma abordagem bayesiana pode ser utilizada para inferir a população da subunidade48,49,50.
A marcação de biomoléculas com fluoróforos na maioria dos casos não está completa51. Isso representa um desafio na contagem de subunidades em um aglomerado com espécies não rotuladas. Uma correção binomial para a eficiência de marcação abaixo da média é geralmente uma aproximação razoável quando a estequiometria da espécie molecular é fixa. Em muitos casos, as espécies oligoméricas podem ser heterogêneas ou mudar dinamicamente, como em um processo de oligomerização, exigindo o desenvolvimento de novas ferramentas para extrair as distribuições subjacentes dos dados de fotobranqueamento.
No geral, este protocolo fornece um pipeline para a geração de PEG-SLBs, com recomendações para as condições de usar, executar e analisar a ligação de molécula única e rastrear e realizar análises de fotobranqueamento para biomoléculas de membrana.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o Prof. Benjamin Schuler por compartilhar a expressão plasmídeo para a proteína ClyA. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Ciência de Fronteira Humana (RGP0047-2020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 ml Syringes | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin | Plastic syringe |
| Acetone | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
| Acrylic Sheet | 2 mm thick | ||
| Acrylic Sheet | BigiMall | 2 mm, Clear | |
| Bath Sonicator | Branson | CPX-1800 | |
| Calcium Chloride | |||
| Chloroform | Sigma | 528730 | HPLC grade |
| Cholesterol | Avanti | 700100 | |
| Coplin Jar | Duran Wheaton Kimble | S6016 | 8 Slide Jar with Glass Cover |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | 24 mm X 50 mm |
| Cy3-DNA Strand | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 |
|
| Cyanine Dye (Cy3) | Cytiva Life Sciences | PA23001 | |
| DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) |
| DNA Connector Strand 1 | Sigma Aldrich | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T |
|
| DNA Connector Strand 2 | Sigma Aldrich | CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT |
|
| DNA Tocopherol Strand | Biomers | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
| DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| Double Sided Tape | 3M | LF93010LE | |
| Drill Bits (Diamond Coated) | 0.5 - 1 mm | ||
| Drilling Machine | Dremel | 220 | Workstation |
| EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
| Fluorescence Beads | Invitrogen | F10720 | |
| Glass Slides | Blue Star | Micro Slides, PIC-1 | |
| Glass Vials | Sigma | 854190 | |
| Hydrogen Peroxide | Lobachemie | 00182 | 30% Solution, AR Grade |
| Labolene | Thermo-Fischer Scientific | Detergent | |
| Laser 532 nm | Coherent | Sapphire | |
| Laser Cutter | Universal Laser Systems | ILS12.75 | |
| Lissamine Rhodamine DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) |
| Methanol | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | 1X | ||
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma Inc | PDC-002 | |
| POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
| Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE1010 | High Pressure Syringe Pump |
| PTFE Caps | Sigma | 27141 | |
| PTFE Tubing | Cole-Parmer | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD |
| Sulphuric Acid | SD Fine Chemicals | 98%, AR Grade | |
| TIRF Objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | |
| Vacuum Desiccator | Tarsons | ||
| Vortex Mixer | Tarsons |
References
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