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Biochemistry

पॉलिमर-भीड़ वाले लिपिड झिल्ली पर एकल-अणु प्रसार और असेंबली

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

यहां, एकल-अणु कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (एसएमटीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कृत्रिम भीड़ वाले लिपिड झिल्ली पर एकल अणुओं के बंधन, गतिशीलता और असेंबली का प्रदर्शन और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

सेलुलर झिल्ली बायोमोलेक्यूलर प्रतिक्रियाओं और सिग्नलिंग के लिए अत्यधिक भीड़ वाले वातावरण हैं। फिर भी, लिपिड के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच करने वाले अधिकांश इन विट्रो प्रयोग नग्न बाइलेयर झिल्ली को नियोजित करते हैं। ऐसी प्रणालियों में झिल्ली-एम्बेडेड प्रोटीन और ग्लाइकेन द्वारा भीड़ की जटिलताओं की कमी होती है और सेलुलर झिल्ली सतहों पर आने वाले संबंधित मात्रा प्रभावों को बाहर रखा जाता है। इसके अलावा, नकारात्मक रूप से चार्ज की गई कांच की सतह जिस पर लिपिड बाइलेयर बनते हैं, ट्रांसमेम्ब्रेन बायोमोलेक्यूल्स के मुक्त प्रसार को रोकता है। यहां, हम भीड़ भरे लिपिड झिल्ली के लिए एक मिमिक के रूप में एक अच्छी तरह से विशेषता बहुलक-लिपिड झिल्ली प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) में क्राउडर्स को शामिल करने के लिए एक सामान्यीकृत दृष्टिकोण के रूप में पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) -संयुग्मित लिपिड का उपयोग करता है। सबसे पहले, एकल-अणु प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए सूक्ष्म स्लाइड और कवरलिप की एक सफाई प्रक्रिया प्रस्तुत की जाती है। इसके बाद, पीईजी-एसएलबी को चिह्नित करने और एकल-अणु ट्रैकिंग और फोटोब्लीचिंग का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स के बंधन, प्रसार और असेंबली के एकल-अणु प्रयोगों को करने के तरीकों पर चर्चा की जाती है। अंत में, यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एकल-अणु फोटोब्लीचिंग विश्लेषण के साथ भीड़ वाले लिपिड झिल्ली पर बैक्टीरियल पोर बनाने वाले विष साइटोलिसिन ए (सीएलवाईए) के नैनोपोर असेंबली की निगरानी कैसे करें। उदाहरण डेटासेट के साथ MATLAB कोड भी कुछ सामान्य विश्लेषण करने के लिए शामिल हैं जैसे कण ट्रैकिंग, यांत्रिक व्यवहार निकालना और सबयूनिट गिनती।

Introduction

सेलुलर झिल्ली अत्यधिक भीड़ और जटिल सिस्टम हैं। आणविक भीड़ प्रोटीन और लिपिड 2,3,4 जैसे झिल्ली-बाध्य संस्थाओं के प्रसार पर काफी प्रभाव डाल सकती है। इसी तरह, लिपिड झिल्ली पर द्वि-आणविक प्रतिक्रियाएं जैसे रिसेप्टर डिमराइजेशन या झिल्ली परिसरों के ऑलिगोमेराइजेशनभीड़ 5,6,7 से प्रभावित होती हैं। क्राउडर्स की प्रकृति, विन्यास और एकाग्रता झिल्ली बंधन, प्रसार और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को कई तरीकों से नियंत्रित कर सकती है। चूंकि सेलुलर झिल्ली पर झिल्ली भीड़ को नियंत्रित करना और एम्बेडेड बायोमोलेक्यूल्स पर इसके प्रभाव की व्याख्या करना चुनौतीपूर्ण है, इसलिए शोधकर्ताओं ने वैकल्पिक इन विट्रो सिस्टम10 स्थापित करने की कोशिश की है।

कृत्रिम भीड़ वाले झिल्ली के लिए एक लोकप्रिय दृष्टिकोण बहुलक (जैसे पॉलीथीन ग्लाइकोल, पीईजी) -ग्राफ्टेड लिपिड11,12 के साथ बाइलेयर झिल्ली को डोपिंग कर रहा है। समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) पर प्रोटीन और लिपिड गतिशीलता के विज़ुअलाइज़ेशन के दौरान, ये पॉलिमर अंतर्निहित नकारात्मक चार्ज सब्सट्रेट (जैसे ग्लास) से झिल्ली-एम्बेडेड घटकों को अंतर्निहित समर्थन से प्रभावी ढंग से उठाकर ढालते हैं। बहुलक के आकार और एकाग्रता को बदलकर, कोई आणविक भीड़ की सीमा को नियंत्रित कर सकता है, साथ ही अंतर्निहित ठोस समर्थन13,14 से इसके अलगाव को भी नियंत्रित कर सकता है। यह स्पष्ट रूप से बहुलक कुशन15,16 के बिना ठोस सब्सट्रेट्स पर समर्थित लिपिड बाइलेयर पर एक लाभ है, जहां ट्रांसमेम्ब्रेन बायोमोलेक्यूल्स अपनी गतिविधि17,18,19 खो सकते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह हमें विट्रो में कोशिका झिल्ली के भीड़ भरे वातावरण को पुन: उत्पन्न करने की अनुमति देता है, जो कई झिल्ली प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है।

झिल्ली पर सतह-ग्राफ्टेड पॉलिमर भी उनके ग्राफ्टिंग घनत्व12 के आधार पर उनके विन्यास में परिवर्तन से गुजरते हैं। कम सांद्रता में, वे झिल्ली की सतह के ऊपर एक उष्णकटिबंधीय कुंडलित विन्यास में रहते हैं, जिसे मशरूम के रूप में जाना जाता है। बढ़ती एकाग्रता के साथ, वे बातचीत करना शुरू कर देते हैं और अनकॉइल और विस्तारित होते हैं, अंत में झिल्ली21 पर घने ब्रश जैसा गठन होता है। चूंकि मशरूम से ब्रश शासन में संक्रमण अत्यधिक विषम है और बहुलक की खराब विशेषता वाली स्थितियों में प्रकट होता है, इसलिए बहुलक-ग्राफ्टेड झिल्ली पर भीड़ के लिए अच्छी तरह से विशेषता वाली स्थितियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। हाल के एक अध्ययन20 की तुलना में, हम भीड़-भाड़ वाली झिल्ली रचनाओं की पहचान और रिपोर्ट करते हैं जो ट्रांसमेम्ब्रेन बायोमोलेक्यूल्स के परिवहन और गतिविधि को बनाए रखते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, हम चर्चा करते हैं कि पीईजीलेट लिपिड झिल्ली कैसे उत्पन्न करें और पीईजी घनत्व के लिए सिफारिशें प्रदान करें जो बहुलक विन्यास (अर्थात्, मशरूम और ब्रश) के दो अलग-अलग शासनों में भीड़ की नकल करते हैं। प्रोटोकॉल इन भीड़ भरे झिल्ली में एम्बेडेड अणुओं के लिए एकल-अणु बंधन, कण ट्रैकिंग और फोटोब्लीचिंग डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण का भी वर्णन करता है। सबसे पहले, हम पूरी तरह से सफाई चरणों, इमेजिंग कक्ष की असेंबली और पीईजी-एसएलबी की पीढ़ी का वर्णन करते हैं। दूसरा, हम एकल-अणु बाइंडिंग, कण ट्रैकिंग और फोटोब्लीचिंग प्रयोगों के लिए विवरण प्रदान करते हैं। तीसरा, हम चर्चा करते हैं i) सापेक्ष बाध्यकारी समानताओं को निकालना, ii) आणविक प्रसार की विशेषता, और iii) झिल्ली पर एकल अणुओं की फिल्मों से प्रोटीन असेंबली में सबयूनिट्स की गिनती।

जबकि हमने इस प्रणाली को एकल-अणु इमेजिंग के साथ चित्रित किया है, प्रोटोकॉल लिपिड झिल्ली पर बायोमोलेक्यूलर प्रतिक्रियाओं पर भीड़ के प्रभाव को समझने में रुचि रखने वाले सभी झिल्ली बायोफिज़िसिस्टों के लिए उपयोगी है। कुल मिलाकर, हम भीड़ और समर्थित लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए एक मजबूत पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं, साथ ही उन पर किए गए विभिन्न एकल-अणु परख और संबंधित विश्लेषण दिनचर्या।

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Protocol

1. एकल-अणु प्रयोगों के लिए स्लाइड और कवरस्लिप की सफाई

  1. इमेजिंग कक्ष की असेंबली से पहले, कवरलिप और स्लाइड दोनों को साफ और तैयार करें। हीरे-लेपित ड्रिल बिट्स (व्यास में 0.5-1 मिमी) के साथ ड्रिलिंग मशीन का उपयोग करके ग्लास स्लाइड पर छेद के कई जोड़े ड्रिल करें। यदि ऐक्रेलिक शीट का उपयोग किया जाता है, तो सटीक छेद (0.5 मिमी) बनाने के लिए लेजर कटर का उपयोग करें, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।
    नोट: छेद की प्रत्येक जोड़ी एक व्यक्तिगत माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के लिए प्रवाह विनिमय के लिए एक इनलेट और आउटलेट के रूप में कार्य करेगी। ऐक्रेलिक स्लाइड में छेद के लिए एक प्रतिनिधि सीएडी फ़ाइल पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 में उपलब्ध है। ग्लास स्लाइड पर ड्रिल किए गए छेद आमतौर पर ड्रिल बिट आकार से 1.5x-2x बड़े होते हैं।
  2. डिटर्जेंट से स्लाइड और कवरलिप साफ करें। इन्हें अच्छी तरह से विआयनीकृत पानी से धो लें। स्लाइड और कवरलिप को एक अलग स्लाइड स्टेनिंग (कोप्लिन) जार में पानी के साथ रखें और 30 मिनट के लिए स्नान सोनिकेटर में सोनिकेट करें। सभी सोनिकेशन चरणों के लिए, 70 W पावर सेटिंग का उपयोग करें।
  3. पानी निकालें और ग्लास स्लाइड वाले कोप्लिन जार को भरें और एसीटोन के साथ कवरलिप्स (जार की मात्रा के आधार पर 50-100 एमएल)। ऐक्रेलिक शीट्स के मामले में, प्रीमिक्स्ड 50% (वी / वी) एसीटोन समाधान की समान मात्रा का उपयोग करें अन्यथा स्लाइड ्स ठंढे हो जाएंगे। यह सुनिश्चित करने के लिए कोप्लिन जार को हिलाएं कि सभी स्लाइड और कवरलिप पूरी तरह से घोल में डूबे हुए हैं और 30 मिनट के लिए स्नान सोनिकेटर में सोनिकेट करें।
  4. एसीटोन को निकालें और इसे एक अपशिष्ट कंटेनर में फेंक दें, कोपलिन जार में मेथनॉल डालें (ऐक्रेलिक स्लाइड के लिए 50%, वी / वी), और 30 मिनट के लिए सोनिकेट करें। स्लाइड पर कार्बनिक कणों को हटाने के लिए एसीटोन और मेथनॉल दोनों का उपयोग किया जाता है।
  5. टाइप 1 पानी की प्रचुर मात्रा के साथ स्लाइड और कवरलिप को धोएं और उन्हें ग्लास कोप्लिन जार में रखें। जार में 1 एम कोह घोल डालें और 1 घंटे के लिए सोनिकेट करें। ऐक्रेलिक स्लाइड के लिए, KOH के 0.5 M का उपयोग करें।
  6. एक अकार्बनिक अपशिष्ट कंटेनर में KOH को फेंक दें। जार को बहुत सारे पानी से धो लें और पिरान्हा उपचार के लिए कोपलिन जार को फ्यूम हुड में रखें। ऐक्रेलिक स्लाइड के लिए पिरान्हा उपचार न करें; सीधे चरण 1.9 पर आगे बढ़ें।
    सावधानी: पिरान्हा उपचार उचित दस्ताने, सुरक्षा चश्मे और एसिड को संभालने के लिए एक एप्रन के साथ एक फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए। पिरान्हा समाधान एक मजबूत ऑक्सीकरण एजेंट है, और यह स्लाइड और कवरलिप से किसी भी बचे हुए कार्बनिक कणों को हटा देता है।
  7. पिरान्हा घोल तैयार करने के लिए, धीरे से एक ग्लास बीकर में सल्फ्यूरिक एसिड (98%, वी / वी) की 2/3 मात्रा डालें और बाकी को हाइड्रोजन पेरोक्साइड (30%, वी / वी) से भरें। घोल को ग्लास रॉड के साथ सावधानी से मिलाएं, इसे कोप्लिन जार में डालें, और कोपलिन जार को कम से कम 1 घंटे के लिए फ्यूम हुड में छोड़ दें।
  8. फ्यूम हुड के अंदर रखे एसिड कचरे के लिए एक बेकार कंटेनर में कोप्लिन जार से पिरान्हा घोल को निर्धारित करें। टाइप 1 पानी की प्रचुर मात्रा के साथ कोप्लिन जार को कुल्ला करें।
  9. नाइट्रोजन गैस की एक कोमल धारा में स्लाइड और कवरलिप को सुखाएं और उन्हें एक साफ कोप्लिन जार में रखें। सूखे स्लाइड और कवरलिप अब प्लाज्मा उपचार के लिए तैयार हैं। स्लाइड और कवरलिप की एक जोड़ी लें और उन्हें प्लाज्मा मशीन में रखें।
  10. कक्ष में एक वैक्यूम बनाएं। कक्ष में प्लाज्मा उत्पन्न करने के लिए नॉब को 8-12 मेगाहर्ट्ज की रेडियो आवृत्ति में बदलें। कक्ष के अंदर एक बैंगनी चमक कक्ष में प्लाज्मा के गठन का संकेत देगी।
  11. 8-10 मिनट के लिए प्लाज्मा उपचार करें। प्लाज्मा को बंद करने के बाद वैक्यूम को धीरे से छोड़ दें और माइक्रोफ्लुइडिक इमेजिंग कक्ष को इकट्ठा करने के लिए चरण 2 पर आगे बढ़ें।

2. माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष की असेंबली

नोट: इमेजिंग कक्ष नीचे वर्णित पिछले चरण से पूर्व-साफ कवरस्लिप और स्लाइड के बीच डबल-साइडेड टेप को सैंडविच करके बनाया गया है।

  1. चित्र 1 में दिखाए गए अनुसार प्लाज्मा उपचार के बाद स्लाइड और कवरस्लिप को इकट्ठा करें। ग्लास स्लाइड को एक साफ टिशू पेपर पर रखें। डबल-साइडेड टेप को ~ 2-3 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स में काटें और उन्हें ग्लास स्लाइड पर छेद की एक जोड़ी के प्रत्येक तरफ रखें। टेप को समतल करने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें या यह एक चैनल से दूसरे चैनल में रिसाव का कारण बनेगा।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, लेजर या स्वचालित प्लॉटर कटर (चित्रा 1) का उपयोग करके पूरी स्लाइड के लिए टेप काटें।
  2. कक्ष को बंद करने के लिए टैप की गई स्लाइड पर प्लाज्मा-उपचारित कवरस्लिप रखें। चैनल को वाटरटाइट बनाने के लिए टैप किए गए क्षेत्रों पर कवरस्लिप को धीरे से दबाने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें।
  3. ग्लास स्लाइड का उपयोग करते समय, एपॉक्सी राल का उपयोग करके किनारों को सील करें। अंत में, स्लाइड और कवरस्लिप से बने प्रत्येक इमेजिंग कक्ष में 10 मिमी x 2 मिमी x 0.1 मिमी (लंबाई x चौड़ाई x गहराई) का आयाम होता है। तैयार माइक्रोफ्लुइडिक इमेजिंग कक्षों को 1-2 सप्ताह के लिए निराशाजनक परिस्थितियों में स्टोर करें (अधिमानतः 10-25 डिग्री सेल्सियस के बीच)।
    नोट: ऐक्रेलिक स्लाइड के साथ उपयोग किए जाने वाले लेजर कट टेप के लिए, एपॉक्सी का उपयोग करना आवश्यक नहीं है क्योंकि टेप किनारे एक तंग रिसाव-प्रूफ सील बनाते हैं।

3. पुटिका संलयन द्वारा ग्लास सब्सट्रेट पर समर्थित बाइलेयर बनाना

नोट: मिश्रित पीईजी-लिपिड के साथ तैयार लिपिड पुटिकाओं के संलयन द्वारा इमेजिंग कक्ष की दीवारों पर भीड़ समर्थित लिपिड बाइलेयर उत्पन्न होते हैं।

  1. एक साफ कांच की शीशी लें, अधिमानतः पिरान्हा समाधान का उपयोग करके पूर्व-साफ करें। पीईजी 2000 लिपिड के वांछित मोल अंश पर 1-पामिटोयल-2-ओलियोयल-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (पीओपीसी) और 1,2-डायोलियोल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोथेनॉलमाइन-एन-[एमिनो (पॉलीथीन ग्लाइकोल)-2000] (डोप-पीईजी 2000) का क्लोरोफॉर्म घोल जोड़ें ताकि बफर जोड़ने के बाद अंतिम एकाग्रता चरण 3.4 में 3 एमएम लिपिड हो। लिपिड की अन्य झिल्ली रचनाओं को इसी तरह तैयार करें।
  2. एक छोटे से ज़ुल्फ़ के साथ नाइट्रोजन की कोमल धारा का उपयोग करके शीशी से क्लोरोफॉर्म को सुखाएं ताकि सूखे लिपिड समान रूप से शीशी की सतह पर लेपित हों। शीशी को 1 घंटे के लिए वैक्यूम डिसिकेटर में रखें। यह कांच की शीशी में किसी भी अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म को हटा देगा। फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 1 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  3. नीचे वर्णित छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एसयूवी) को तैयार करें।
    1. रात भर इनक्यूबेशन के बाद 1-2 मिनट के लिए धीरे-धीरे भंवर जब तक कि घोल टर्बिड और दूधिया न हो जाए।
    2. इस घोल का 100 μL एक छोटे से 500 μL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लें और स्नान सोनिकेटर (70 W पावर सेटिंग पर सेट) में लगभग 1 घंटे के लिए सोनिकेट करें। समाधान स्पष्ट हो जाएगा; यदि नहीं, तो अतिरिक्त 30 मिनट के लिए सोनिकेट करें। यह कदम 50-100 एनएम व्यास की एसयूवी उत्पन्न करेगा।
      नोट: यदि पहली बार तैयारी कर रहे हैं, तो गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन22,23 (डीएलएस) या समकक्ष विधि का उपयोग करके एसयूवी को चिह्नित करें।
  4. सोनिकेटेड पुटिकाओं में कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2, 3 M स्टॉक) जोड़ें ताकि लिपिड समाधान में इसकी अंतिम एकाग्रता 30 mM हो।
  5. नमूना समाधान को इंजेक्ट करने के लिए एक माइक्रोपिपेट टिप को काटें ताकि यह छेद में कसकर फिट हो। लिपिड समाधान मिलाएं और चरण 2 में किए गए इमेजिंग कक्ष में छेदों में से एक के माध्यम से इंजेक्ट करें। आसन्न चैनलों के संदूषण को रोकने के लिए एक साफ ऊतक के साथ आउटलेट से कक्ष से बाहर आने वाले अतिरिक्त समाधान को पोंछें।
  6. इस सभा को 90 मिनट के लिए ह्यूमिडिफायर कक्ष में छोड़ दें। 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के अंत में एक गीला ऊतक रखकर एक आर्द्र कक्ष तैयार करें। ट्यूब कैप बंद करके ट्यूब के अंदर स्लाइड साइडवे रखें। पुटिकाएं फ्यूज होंगी और कांच की सतह पर एक समान बाइलेयर उत्पन्न करेंगी।
  7. कक्ष को पीबीएस बफर की प्रचुर मात्रा (इमेजिंग कक्ष की मात्रा का लगभग 5 गुना) के साथ अच्छी तरह से धोएं। धोते समय कक्ष में हवा के बुलबुले के प्रवेश को रोकें क्योंकि इससे झिल्ली में दोष उत्पन्न हो सकते हैं।

4. माइक्रोस्कोप सेटअप और एकल कण इमेजिंग माप

नोट: एकल-अणु प्रयोग एक उद्देश्य-आधारित कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति 24,25,26 (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोप सेटअप (चित्रा 2) पर किए जाते हैं। टीआईआरएफ इमेजिंग एकल-अणु इमेजिंग के लिए एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करता है, हालांकि एपि-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कुछ शर्तों के तहत भी किया जा सकता है (खासकर जब फ्लोरोसेंट बायोमोलेक्यूल्स को धोने से थोक समाधान से हटाया जा सकता है)। प्रिज्म-प्रकार टीआईआरएफ का उपयोग किया जा सकता है लेकिन माइक्रोफ्लुइडिक्स27 स्थापित करने में आसानी के लिए उद्देश्य-प्रकार बेहतर है। उद्देश्य-प्रकार टीआईआरएफ के लिए, एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य (100x आवर्धन, आमतौर पर टीआईआरएफ उद्देश्य के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) की सिफारिश की जाती है।

  1. गतिशीलता और असेंबली पर कोई भी प्रयोग करने से पहले, टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप को संरेखित करें ताकि इवानसेंट क्षेत्र द्वारा रोशनी के कारण इष्टतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात सुनिश्चित किया जा सके। संरेखण के दौरान, लेजर शक्ति को 100 μW और 1 mW के बीच कम रखें।
    चेतावनी: लेजर बीम के संरेखण के दौरान लेजर सुरक्षा चश्मे का उपयोग किया जाना चाहिए।
    1. माइक्रोस्कोप को संरेखित करने के लिए, उन्हें कम सांद्रता (~ 100 पीएम पर) पर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में जोड़कर एक फ्लोरोसेंट बीड नमूना तैयार करें ताकि एकल मोतियों से फ्लोरोसेंट स्पॉट छवियों में ओवरलैप न हों।
    2. सबसे पहले, एपिफ्लोरेसेंस मोड में मोतियों की कल्पना करें। जबकि रोशनी एपिफ्लोरेसेंस मोड में है, एम 5 दर्पण अनुवाद चरण (दर्पण जो लेजर को डिक्रोइक में दर्शाता है) को स्थानांतरित करें ताकि उद्देश्य से निकलने वाली बीम तब तक झुक जाए जब तक कि यह अंततः कुल आंतरिक प्रतिबिंब विन्यास में न हो।
    3. सत्यापित करें कि क्या टीआईआर रोशनी हासिल की गई है। जब टीआईआर इवानसेंट क्षेत्र मोती के नमूने को रोशन कर रहा है, तो जांचें कि सतह पर केवल मोती दिखाई दे रहे हैं और सतह से दूर मुक्त-फ्लोटिंग मोती नहीं देखे जाते हैं।
  2. प्रयोग की शुरुआत में, फ्लोरोफोरेस के फोटो-विनाश (फोटोब्लीचिंग) को रोकने के लिए उद्देश्य बैक फोकल प्लेन पर लेजर शक्ति को 5-10 मेगावाट तक सेट करें।
  3. माइक्रोस्कोप स्टेज पर स्लाइड रखें और पहले नंगे झिल्ली (बिना किसी फ्लोरोफोरे) पर ध्यान केंद्रित करें। आमतौर पर, लिपिड झिल्ली में अशुद्धियों के छोटे निशान ऐसा करने के लिए पर्याप्त होते हैं। वैकल्पिक: चरण 3.1 के दौरान फ्लोरोसेंट मोतियों या क्वांटम डॉट्स (उप पिकोमोलर रेंज) की एक छोटी संख्या को शामिल करें, जैसे कि सही फोकस की पहचान करने की सुविधा के लिए दृश्य के क्षेत्र में केवल दो से पांच फ्लोरोसेंट कण मौजूद हैं।
  4. चरण 3.7 में बनाए गए पीईजी-एसएलबी-लेपित इमेजिंग कक्ष में माइक्रोपिपेट का उपयोग करके नमूना (झिल्ली-प्रोटीन, आदि) इंजेक्ट करें।
  5. एकल-अणु बाइंडिंग कैनेटीक्स को मापने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष में इनलेट छेद के माध्यम से लेबल किए गए बायोमोलेक्यूल्स को प्रवाहित करने के लिए एक सिरिंज पंप का उपयोग करें (चित्रा 3)। 50-500 μL/ min की प्रवाह दर का उपयोग करें।
    1. इमेजिंग कक्ष में समाधान जोड़ने से पहले मूवी अधिग्रहण शुरू करें। निरंतर प्रवाह के तहत 25-50 फ्रेम / सेकंड की फ्रेम दर पर >5,000 फ्रेम प्राप्त करें जब तक कि झिल्ली की सतह पर नए धब्बों की उपस्थिति में कोई और वृद्धि न हो (वीडियो 1)। बाइंडिंग कैनेटीक्स के विश्लेषण के लिए, 6.1 से चरणों का पालन करें।
  6. एकल-कण ट्रैकिंग के लिए, माइक्रोपिपेट का उपयोग करके चैनल में कम सांद्रता (बाध्यकारी स्थिरांक की तुलना में) पर लेबल किए गए बायोमोलेक्यूल्स जोड़ें। एकाग्रता को <0.1 कणों / μm2 के घनत्व के लिए अनुकूलित करें ताकि व्यक्तिगत कण शायद ही कभी पथ पार करें (वीडियो 2)। यह डेटासेट से बरामद पटरियों की उच्च निष्ठा सुनिश्चित करता है। यदि आवश्यक हो तो इनक्यूबेट करें (बायोमोलेक्यूल्स द्वारा खराब झिल्ली बंधन के मामले में, ~ 10 मिनट) आर्द्र वातावरण में और बफर के साथ कक्ष को धोएं।
    नोट: यदि झिल्ली पर बाइंडिंग खराब है और अधिकांश फ्लोरोसेंट अणु समाधान में रहते हैं तो धोने की आवश्यकता होती है। अन्यथा, यह इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है और इसके परिणामस्वरूप खराब सिग्नल-टू-शोर अनुपात हो सकता है।
  7. एकल-कण प्रक्षेपवक्र विश्लेषण के लिए, 10-100 फ्रेम / सेकंड पर 200-500 फ्रेम प्राप्त करें। अधिग्रहण अंतराल के दौरान न्यूनतम चरण बहाव के साथ बाइलेयर विमान पर केंद्रित उद्देश्य लेंस बनाए रखें।

5. प्रोटीन असेंबली में सबयूनिट्स की गिनती के लिए छवि अधिग्रहण

नोट: स्टोइकोमेट्री का आकलन करने के लिए छवि अधिग्रहण के लिए फ्लोरोफोरे के निरंतर विरंजन और चरणों की संख्या का पता लगाने की आवश्यकता होती है जब तक कि कोई और फ्लोरोफोरे प्रतिदीप्ति उत्सर्जित नहीं कर रहा हो।

  1. सबयूनिट्स को मापने के लिए, लेबल किए गए बायोमोलेक्यूल्स की प्रासंगिक एकाग्रता जोड़ें (उदाहरण: परिणाम देखें; माइक्रोफ्लुइडिक इमेजिंग कक्ष और इनक्यूबेट (यदि आवश्यक हो तो धोएं) में सीएलवाईए को 25 एनएम एकाग्रता पर जोड़ा गया था। आवश्यक समय के लिए वांछित तापमान पर एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड को इनक्यूबेट करें (उदाहरण: 37 डिग्री सेल्सियस और क्लाया की असेंबली के लिए 60 मिनट)।
  2. नीचे वर्णित एकल-अणु फोटोब्लीचिंग के लिए छवि अधिग्रहण करें।
    1. इमेजिंग से पहले इमेजिंग कक्ष को एक बफर के साथ धोएं (यदि आवश्यक हो)। माइक्रोस्कोप पर स्लाइड रखें और लेबल किए गए अणुओं की कल्पना करने के लिए फोकस समायोजित करें।
    2. लेजर शक्ति को उस स्तर पर सेट करें जिस पर फ्लोरोफोरे का विरंजन धीरे-धीरे होता है (~ 1-5 मिनट)। आदर्श रूप से, प्रत्येक इकट्ठे बायोमोलेक्यूल के लिए, फोटोब्लीचिंग चरण दर >10-20 इमेजिंग फ्रेम को अलग रखें। छवियों को तब तक प्राप्त करें जब तक कि सभी अणु पूरी तरह से फोटोब्लीच न हो जाएं (वीडियो 3)।
      नोट: आवश्यक फोटोब्लीचिंग प्रक्षेपवक्र की कुल अवधि निर्धारित करने के लिए, इमेजिंग फ्रेम की संख्या के साथ अलग-अलग स्पॉट की औसत तीव्रता को प्लॉट करें और घातीय क्षय फ़ंक्शन फिट करके समय स्थिरांक निर्धारित करें। अधिग्रहण की कुल अवधि को समय स्थिरांक के 5-10 गुना पर सेट किया जा सकता है।
  3. जैसे ही नमूना कक्ष में पेश किया जाता है, फिल्म अधिग्रहण शुरू करके और पीईजी-एसएलबी के विभिन्न खंडों से झिल्ली बंधन के बाद निश्चित समय अंतराल पर नई फोटोब्लीचिंग फिल्में प्राप्त करके समय-निर्भर असेंबली माप करें।

6. छवि और डेटा विश्लेषण

  1. नीचे वर्णित एकल-कण बाइंडिंग और ट्रैकिंग करें।
    1. ऊपर प्राप्त फिल्मों से एकल-कण प्रक्षेपपथ निकालें, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। एकल कणों का पता लगाने और उन्हें ट्रैक करने के लिए, MATLAB पैकेज, u-track28, या Trackmate29, ImageJ में एक प्लगइन का उपयोग करें, जो एक मजबूत एकल-कण ट्रैकिंग एल्गोरिदम भी प्रदान करता है। पूरक फ़ाइल 1 में दिखाए गए अनुसार यू-ट्रैक विश्लेषण सेट करने के लिए चरणों का पालन करें।
      नोट: एकल-कण ट्रैकिंग के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर कण आकार (पिक्सेल में) और अंतराल समापन लंबाई का मानक विचलन हैं। ट्रैकिंग के लिए सबसे कड़े मानदंड के रूप में इन मापदंडों के लिए क्रमशः 1 और 0 का उपयोग करें।
    2. बाध्यकारी दर स्थिरांक की गणना करने के लिए, पहले समय के साथ झिल्ली की सतह से बंधे कणों की संख्या का अनुमान लगाएं। चरण 6.1 से प्राप्त झिल्ली पर दिखाई देने वाले कणों की संख्या को पहचानने और प्लॉट करने के लिए यू-ट्रैक आउटपुट फ़ोल्डर के साथ MATLAB फ़ाइल binding_SPT (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) का उपयोग करें। अवलोकन किए गए कैनेटीक्स को उपयुक्त गतिज मॉडल में फिट करें (उदाहरण: समय स्थिरांक निर्धारित करने के लिए एकल घातीय फिट, जिसके व्युत्क्रम को स्पष्ट दर स्थिरांक को सौंपा जा सकता है)30 दर स्थिरांक निकालने के लिए (परिणाम देखें, चित्रा 5)।
    3. अलग-अलग कणों का माध्य-वर्ग विस्थापन (एमएसडी) (जैसे पीईजी-एसएलबी में डीएनए ट्रेसर, चित्रा 6) प्रसार की प्रकृति को इंगित करता है। अंतराल समय (चित्रा 6 बी) के फ़ंक्शन के रूप में एमएसडी प्लॉट प्राप्त करने के लिए यू-ट्रैक आउटपुट फ़ोल्डर के साथ MATLAB पैकेज MSD_ISD (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) का उपयोग करें।
    4. विषम विभेदक प्रजातियों की पहचान करने के लिए, तात्कालिक वर्ग विस्थापन (आईएसडी) वितरण की गणना करें जैसा कि चित्रा 6 सी में दिखाया गया है। ISD2, जिसे (Xt+3 - Xt)2 + (Yt+−Yt)2 के रूप में परिभाषित किया गया है, जहां अंतराल समय, y = 2, को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि यह शोर को कम करता है। शोर को कम करने के लिए तीन फ्रेम से कम के साथ छोटे प्रक्षेपपथ को फ़िल्टर करें।
    5. ट्रैक किए गए कणों (चित्रा 6 सी) के आईएसडी को प्लॉट करने के लिए यू-ट्रैक आउटपुट के साथ MATLAB में ISD_analyzer (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) का उपयोग करें।
  2. नीचे वर्णित एकल-अणु फोटोब्लीचिंग विश्लेषण करें।
    1. झिल्ली परिसरों के स्टोइकोमेट्री का अनुमान लगाने के लिए, फ्लोरोसेंट कॉम्प्लेक्स (वीडियो 3) की समय-निर्भर तीव्रता पर एक फोटोब्लीचिंग विश्लेषण करें। इसके लिए, अनुवाद बहाव निकालने के लिए मूवी फ्रेम के ऑटोकोरिलेशन के आधार पर एक ड्रिफ्ट करेक्शन एल्गोरिदम (drift_correct_images, पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) लागू करें। यह मानता है कि छवि अधिग्रहण के दौरान इकट्ठी संरचनाएं काफी हद तक स्थिर होती हैं। फिल्मों से कण तीव्रता समय के निशान का पता लगाने के लिए MATLAB पैकेज Extract_traces_1C (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) चलाएँ।
    2. तीव्रता समय के निशान के लिए चरण का पता लगाने के लिए MATLAB कोड Stepcount_immobile (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) का उपयोग करें। यदि कण गतिहीन नहीं हैं, तो चलते कणों के स्थान को निकालने के लिए यू-ट्रैक पैकेज का उपयोग करें। xy-निर्देशांक के इस सेट को चलती कण के तीव्रता मूल्यों को निकालने के लिए कच्ची फिल्मों में मैप किया जा सकता है क्योंकि यह झिल्ली पर पार्श्व रूप से फैलता है। इस विकल्प के लिए यू-ट्रैक विश्लेषण से आउटपुट के साथ MATLAB पैकेज utrack_Int (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) का उपयोग करें।
    3. सही प्रोटीन कॉम्प्लेक्स स्टोइकोमेट्री का अनुमान लगाने के लिए फ्लोरोफोरे टैग के साथ बायोमोलेक्यूल्स के अपूर्ण लेबलिंग के लिए एक सुधार करें। एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए डाई और प्रोटीन के अवशोषण को मापकर यूवी-वीआईएस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ लेबलिंग दक्षता निर्धारित करें। प्रोटीन के लिए डाई के दाढ़ अनुपात के रूप में लेबलिंग दक्षता की गणना करें।
      नोट: कुछ रंजक 280 एनएम के करीब तरंग दैर्ध्य पर भी अवशोषित होते हैं, और इसलिए, डाई द्वारा इस अवशोषण योगदान को एकाग्रता गणना के दौरान जिम्मेदार ठहराया जाना चाहिए।
    4. चरण 6.2.2 में चरण गणना से प्राप्त डेटा के साथ MATLAB कोड Step_correction (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) का उपयोग करके निम्नलिखित तरीके से फ्लोरोफोरे की अपूर्ण लेबलिंग दक्षता के लिए द्विपद सुधार करें। उदाहरण के लिए, साइटोलिसिन ए जैसे छिद्र बनाने वाले विष के लिए, जो एक डोडेकेमेरिक रिंग जैसी संरचना बनाता है, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके द्विपद सुधार लागू करें:
      nkEquation 1
      जहां Equation 2 = लेबलिंग दक्षता, एन = फोटोब्लीचिंग चरणों की संख्या, और एस = वास्तविक गणना। सही ऑलिगोमेरिक प्रजातियों को पुनर्प्राप्त करने के लिए MATLAB रूटीन Stepcount_immobile का उपयोग करें। ऑलिगोमर्स (एस आई) की आवृत्ति को द्रव्यमान अंशों में परिवर्तित करें (चित्रा 7 सी; पूरक कोडिंग फ़ाइल 2)।
      नोट: आप-ट्रैक विश्लेषण की गई फ़ाइलों का एक सेट पूरक कोडिंग फ़ाइल 3 में शामिल हैं। पूरक कोडिंग फ़ाइल 2 में MATLAB कोड इन डेटा सेटों के साथ चलाया जा सकता है।

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Representative Results

PEGylated झिल्ली पर CLYA प्रोटीन के बंधन की निगरानी
चरण 4.5 के बाद, बाइंडिंग कैनेटीक्स का अनुमान समय के साथ झिल्ली की सतह से बंधे कणों की संख्या को प्लॉट करके लगाया जाता है (वीडियो 1)। चूंकि क्लाया प्रोटीन 5 मोल% पीईजी 2000 लिपिड के साथ एक झिल्ली को बांधता है, कण घनत्व बढ़ जाता है और संतृप्ति तक पहुंच जाता है (चित्रा 5)। बंधे कणों (सियान सर्कल) के लिए फिट एक घातीय क्षय झिल्ली बंधन के लिए समय स्थिरांक (बी) देता है (विशेष रूप से, प्रारंभिक समय बिंदु [लाल सर्कल] इस मामले में फिट नहीं होते हैं)।

भीड़-भाड़ वाली झिल्लियों पर डीएनए ट्रेसर की गतिशीलता
हम आमतौर पर पीईजी-मध्यस्थता भीड़ के तहत झिल्ली को चिह्नित करने के लिए डीएनए ट्रेसर (टोकोफेरोल के साथ झिल्ली पर लंगर डाले गए डीएनए), लिपोफिलिक ट्रेसर रंजक (जैसे, डीआईआई), या झिल्ली प्रोटीन (जैसे, क्लाया) का उपयोग करते हैं। लेबल किए गए ट्रेसर अणुओं (25-100 पीएम) के पार्श्व प्रसार की निगरानी कण बंधन पर झिल्ली की इमेजिंग करके की जा सकती है। झिल्ली में किसी भी पीईजी बहुलक की अनुपस्थिति में, अधिकांश ट्रेसर (विशेष रूप से बाईलेयर के बाहर फैले हुए) एसएलबी (चित्रा 6 ए) पर प्रतिबंधित प्रसार प्रदर्शित करते हैं। झिल्ली में पीईजी 2000 के छोटे स्तर (0.5-2 मोल) के साथ, बाइलेयर अंतर्निहित सतह से दूर उठता है, और ट्रेसर अणु बिना किसी बाधा के फैल सकते हैं। दूसरी ओर, पीईजी (20 मोल) की उच्च सांद्रता पर चरम कारावास देखा जाता है, जहां पीईजी अणु घने ब्रश शासन में होते हैं, जिसके बीच में विभिन्न प्रकार के व्यवहार प्रदर्शित होते हैं। इन तीन स्थितियों के लिए एमएसडी प्लॉट चित्रा 6 बी में दिखाए गए हैं। पीओपीसी / डोप-पीईजी 2000 बाइलेयर झिल्ली के हमारे लक्षण वर्णन के आधार पर, हम 1-3 मोल% डोप-पीईजी 2000 अंश की सिफारिश करते हैं जो मशरूम शासन में भीड़ को प्रेरित करता है। 7.5 मोल% पीईजी 2000-लिपिड से ऊपर, हम ब्रश शासन की शुरुआत का निरीक्षण करते हैं, और भीड़ और कारावास को प्रेरित करने के लिए 25 मोल% पीईजी 2000-लिपिड तक की रचनाओं को नियोजित किया जा सकता है। दो शासनों के बीच संक्रमण के अनुरूप हस्तक्षेप करने वाली 4-7% पीईजी 2000-लिपिड स्थितियों को खराब विशेषता है और इससे बचा जाना चाहिए।

भीड़-भाड़ वाली झिल्लियों पर CLYA की सभा
भीड़-भाड़ वाली झिल्ली (चित्रा 7 ए, बी) पर इनक्यूबेशन के बाद क्लाया प्रोटीन के व्यक्तिगत विवर्तन-सीमित धब्बों के तीव्रता प्रक्षेपवक्र बड़ी संख्या में अलग-अलग फोटोब्लीचिंग चरणों को प्रदर्शित करते हैं, जो विभिन्न असेंबली इंटरमीडिएट्स31 के गठन का सुझाव देते हैं। क्लाया, एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन होने के नाते, पीईजी की अनुपस्थिति में नकारात्मक रूप से चार्ज ग्लास सतह के साथ बातचीत करता है और बहुत खराब तरीके से इकट्ठा होगा। 7.5 मोल% पीईजी 2000 लिपिड पर, इकट्ठे परिसरों को मापा गया और चित्रा 7 सी में प्लॉट किया गया है। लेबलिंग दक्षता (इस मामले में 0.9) को सही करने के बाद, ऑलिगोमर्स का अंतिम वितरण डोडेकेमेरिक क्लाया प्रजातियों को प्रमुख संरचना के रूप में प्रदर्शित करता है, जो संरचनात्मक डेटा32 के अनुरूप है।

Figure 1
चित्र 1: सफाई चरणों और माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष असेंबली के लिए योजनाबद्ध। (A) ग्लास स्लाइड और कवरलिप्स को डिटर्जेंट, एसीटोन, मेथनॉल, KOH और पिरान्हा समाधान में अनुक्रमिक सोनिकेशन के साथ साफ किया जाता है, जिसमें प्रत्येक चरण के बीच टाइप 1 अल्ट्राप्योर पानी द्वारा कई कुल्ला होते हैं। प्लाज्मा उपचार से पहले स्लाइड और कवरलिप को नाइट्रोजन गैस के साथ सुखाया जाता है। (बी) माइक्रोफ्लुइडिक इमेजिंग चैंबर को तब एक प्री-कट डबल-साइडेड चिपकने वाला टेप का उपयोग करके इकट्ठा किया जाता है जो स्लाइड को कवरस्लिप से बांधता है। * ऐक्रेलिक स्लाइड्स को पिरान्हा समाधान के साथ इलाज नहीं किया जाता है, और एसीटोन, मेथनॉल और केओएच का उपयोग कवरस्लिप सफाई के लिए उपयोग किए जाने वाले 50% (वी / वी) एकाग्रता पर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप सेटअप। उल्टे माइक्रोस्कोप पर अनुकूलित एक विशिष्ट उद्देश्य-प्रकार टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप सेटअप को आवश्यक प्रकाशिकी पर प्रकाश डाला गया है। एम 1-एम 5 लेजर बीम को चलाने के लिए दर्पण हैं। लेंस एल 1 और एल 2 का उपयोग लेजर बीम का विस्तार करने के लिए किया जाता है, और एल 3 लेंस लेजर बीम को उद्देश्य लेंस के पीछे फोकल प्लेन पर केंद्रित करता है। आई 1 और आई 2 लेजर बीम को संरेखित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आइरिस डायाफ्राम हैं। लेजर बीम रोशनी को नियंत्रित करने के लिए एक शटर का उपयोग किया जाता है, जो प्रतिदीप्ति अणुओं के अनावश्यक फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: झिल्ली बाइंडिंग कैनेटीक्स प्रवाह सेटअप। बाध्यकारी प्रयोग के संचालन के लिए, एक पतली पीटीएफई ट्यूबिंग (आईडी एक्स 0.042 में आईडी एक्स 0.042 ओडी) का उपयोग सिरिंज पंप (छवि स्केल नहीं) की मदद से नमूने को प्रवाहित करने के लिए किया जाता है। ट्यूबिंग का अंत एक माइक्रोपिपेट टिप की मदद से इमेजिंग चैंबर आउटलेट से जुड़ा हुआ है। फेंक को आउटलेट में प्लग किए गए एक छोटे माइक्रोटिप जलाशय में एकत्र किया जाता है, और पेश की गई मात्रा हमेशा इमेजिंग कक्ष की मात्रा से 10 गुना अधिक होती है। इमेजिंग कक्ष के क्रॉस सेक्शन को दर्शाने वाला इनसेट आंकड़ा। (छवि स्केल करने के लिए नहीं) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एकल-कण प्रक्षेपपथ और फोटोब्लीचिंग फिल्मों से विश्लेषण के लिए पाइपलाइन। (A) अधिग्रहित फिल्मों का विश्लेषण MATLAB में u-ट्रैक का उपयोग करके किया गया था ताकि प्रत्येक कण के प्रक्षेपपथ (x, y) और प्रत्येक कण की तीव्रता (i) को फ्रेम-दर-फ्रेम प्राप्त किया जा सके। इन प्रक्षेपपथों का उपयोग तब तात्कालिक वर्ग विस्थापन (आईएसडी), आईएसडी 1 और आईएसडी 2 की गणना करने के लिए किया गया था। आईएसडी को तब मोबाइल प्रजातियों की पहचान करने के लिए हिस्टोग्राम के रूप में प्लॉट किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, माध्य वर्ग विस्थापन (एमएसडी) प्लॉट सूचित करते हैं कि गति गॉसियन, सीमित, या सुपर-लीटर33,34 है या नहीं। हिडन मार्कोव मॉडल35 (एचएमएम) विश्लेषण को एक कण के विभिन्न राज्यों को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। (बी) फोटोब्लीचिंग विश्लेषण के लिए, फिल्मों को पहले सिस्टम में बहाव (यदि आवश्यक हो) के लिए सही किया गया था, इसके बाद यू-ट्रैक का उपयोग करके कण का पता लगाने या ट्रैकिंग की गई थी। तीव्रता वितरण23 (और अन्य कण विशेषताओं) का अनुमान लगाने के अलावा, चरण-खोज एल्गोरिदम36,37,38 का उपयोग करके फोटोब्लीचिंग चरणों की संख्या के लिए तीव्रता प्रक्षेपपथ का विश्लेषण किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: 5 मोल% डोप-पीईजी 2000 के साथ समर्थित लिपिड झिल्ली के लिए सीएलवाईए का बंधन। यू-ट्रैक द्वारा पहचाने गए प्रत्येक फ्रेम में कणों की संख्या की गणना के बाद एक विशिष्ट बाध्यकारी वक्र प्राप्त किया जाता है। इमेजिंग झिल्ली-बाध्यकारी सीएलवाईए प्रोटीन के प्रवाह से पहले शुरू की जाती है। कण संख्याओं (सियान सर्कल) के लिए फिट एक घातीय क्षय फ़ंक्शन (काली रेखा) का उपयोग झिल्ली में सीएलवाईए के बंधन के लिए समय स्थिरांक को पुनर्प्राप्त करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: पीईजी-लिपिड बाइलेयर झिल्ली पर लिपोफिलिक डीएनए की गतिशीलता। (ए) पीओपीसी / डोप-पीईजी 2000 झिल्ली में लिपोफिलिक डीएनए ट्रेसर के लिए योजनाबद्ध दिखाया गया है। (बी) विभिन्न पीईजी-एसएलबी के लिए एकल-कण ट्रैकिंग से गणना की गई औसत वर्ग विस्थापन दिखाए गए हैं। 2 मोल% डोप-पीईजी 2000 में, डीएनए ट्रेसर बहुलक की अनुपस्थिति में बाधित गतिशीलता की तुलना में शुद्ध ब्राउनियन व्यवहार प्रदर्शित करता है (संदर्भ के लिए डैश लाइन शामिल है)। दूसरी ओर, एक ही डीएनए ट्रेसर शुद्ध ब्राउनियन प्रसार से दूर हो जाता है, जो 20 मोल% डोप-पीईजी 2000 की उपस्थिति में कम गतिशीलता के साथ उप-गति का संकेत देता है। (C) दो अलग-अलग PEG2000 लिपिड झिल्ली में लिपोफिलिक डीएनए ट्रेसर के प्रसार के लिए ISD2 वितरण की तुलना नंगे SLB से की जाती है। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: फोटोब्लीचिंग निशान और लिपिड बाइलेयर झिल्ली पर सीएलवाईए की असेंबली। (ए, बी) प्रतिनिधि समय के निशान चरण 6.2.1 में पाए गए सीएलवाईए नैनोपोर कॉम्प्लेक्स के फोटोब्लीचिंग चरण दिखाते हैं। क्रमशः 7 और 5 चरणों के साथ एक इकट्ठे सीएलआईए कॉम्प्लेक्स के लिए। (ग) 647% पीओपीसी पर इनक्यूबेट किए गए क्लाया (25 एनएम) के लिए फोटोब्लीचिंग स्टेप वितरण (ग्रे) 278% कोलेस्ट्रॉल: 75% डोप-पीईजी 2000 झिल्ली को 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर दिखाया गया है। अपूर्ण लेबलिंग दक्षता के लिए सही करने के बाद, विभिन्न ऑलिगोमेरिक प्रजातियों (मैजेंटा) का अनुमानित द्रव्यमान अंश दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: झिल्ली पर सीएलवाईए का बंधन। 5 मोल% डोप-पीईजी 2000 युक्त एसएलबी झिल्ली के लिए Cy3-लेबल CLYA प्रोटीन बाइंडिंग की निगरानी। बाध्य कणों का यू-ट्रैक द्वारा पता लगाया जाता है (सियान सर्कल), और पटरियों को उनके प्रक्षेपवक्र में पांच बाद की स्थितियों के लिए प्लॉट किया जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: 2 मोल% पीईजी झिल्ली पर डीएनए ट्रेसर का प्रसार। Cy3-लेबल डीएनए के लिए एक फिल्म जो 2 mol% PEG2000 झिल्ली में टोकोफेरोल के माध्यम से लिपिड झिल्ली पर लंगर डालती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 3: फोटोब्लीचिंग मूवी। झिल्ली पर Cy3-लेबल CLYA अणुओं के इकट्ठे ऑलिगोमर्स की एक फिल्म जिसमें 7.5 mol% डोप-PEG2000 होता है। बड़े परिसर एक एकल प्रोटीन की तुलना में कई गुना अधिक तीव्रता से स्पष्ट होते हैं, साथ ही साथ कई फोटोब्लीचिंग चरणों से जब निरंतर रोशनी के तहत समय के साथ कण तीव्रता देखी जाती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: चरण 6 में यू-ट्रैक और विभिन्न MATLAB कोड का उपयोग करने के तरीके के बारे में जानकारी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: ऐक्रेलिक स्लाइड में छेद बनाने और पूरी स्लाइड के लिए टेप काटने के लिए एक प्रतिनिधि कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइलें 2: चरण 6 में छवि और डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक संबंधित MATLAB कोड युक्त संपीड़ित फ़ोल्डर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइलें 3: चरण 6 में छवि और डेटा विश्लेषण के लिए नमूना डेटा। MATLAB कोड https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis पर भी उपलब्ध हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) पर एकल-अणु प्रयोगों का प्रदर्शन करते हैं जो झिल्ली-एम्बेडेड बायोमोलेक्यूल्स के लिए भीड़ भरे वातावरण को प्रकट करते हैं। भीड़ भरा वातावरण एक बहिष्कृत मात्रा प्रभाव उत्पन्न करता है, जिससे बायोमोलेक्यूलर प्रतिक्रियाओंमें वृद्धि होती है 1,2,39,40। पीईजी-लिपिड प्रणाली के लिए, जहां बहुलक मुख्य रूप से बाईलेयर के बाहर की मात्रा पर कब्जा कर लेता है, यह प्रभाव विशेष रूप से बड़े एक्टो-डोमेन वाले आणविक प्रजातियों के लिए स्पष्ट है। इसलिए, लिपोफिलिक रंगों की तुलना में, झिल्ली में एम्बेडेड एक बड़े हाइड्रोफिलिक अणु का प्रसार, जैसे रिसेप्टर्स, ग्लाइकोप्रोटीन और ग्लाइकोलिपिड्स को काफी कम किया जा सकता है। टोकोफेरोल (चित्रा 5) के माध्यम से झिल्ली पर लंगर डाले फ्लोरोसेंट ट्रेसर डीएनए का उपयोग करके, हम इस तरह के भीड़ प्रभावों की पहचान कर सकते हैं।

अलग से, नीचे के पत्रक में पीईजी की उपस्थिति भी एसएलबी को उठाती है और समर्थन सब्सट्रेट14,41 के साथ बायोमोलेक्यूल्स की बातचीत को कम करती है। आमतौर पर, इमेजिंग ग्लास सतह की नकारात्मक चार्ज सतह अक्सर गतिशीलता और आणविक प्रतिक्रियाओं में बाधा डालती है। इसलिए, झिल्ली को कांच से दूर उठाने के लिए पीईजी-लिपिड का उपयोग तब भी फायदेमंद है जब भीड़ के उद्देश्य से नहीं। हालांकि, एकाग्रता व्यवस्थाओं की पहचान करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए जो उन मामलों में आणविक भीड़ को प्रकट नहीं करते हैं। बाईलेयर के बाहर बड़े डोमेन का विस्तार करने वाले प्रोटीन के लिए, पीईजी 5000 जैसे उच्च आणविक भार पीईजी-लिपिड का उपयोग आवश्यक हो सकताहै।

एसएलबी सिस्टम पर एकल-अणु इमेजिंग के लिए कुछ प्रमुख बिंदु महत्वपूर्ण हैं। एकल-अणु प्रयोगों (चरण 1) में स्लाइड और कवरलिप की कठोर सफाई महत्वपूर्ण है। अशुद्धियों के साथ एक सतह की इमेजिंग के परिणामस्वरूप लिपिड झिल्ली में दोष होंगे। इसके परिणामस्वरूप झिल्ली की सतह पर फ्लोरोसेंटली लेबल बायोमोलेक्यूल्स के पैच हो सकते हैं। गठित एसएलबी की कवरेज और एकरूपता को लिपिड डाई (डीआईआई या लिस्सामाइन रोडामाइन डोप) के साथ बाइलेयर को डोपिंग करके और इसे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत इमेजिंग करके एक अलग तैयारी में सत्यापित किया जा सकता है। एफआरएपी विश्लेषण का उपयोग43,44 के साथ-साथ व्यवहार को बेंचमार्क करने के लिए किया जा सकता है।

झिल्ली बाध्यकारी प्रयोगों (चरण 4) के लिए, कक्ष में हवा के बुलबुले के प्रवेश को रोकने के लिए ट्यूबिंग के साथ प्रवाह सेटअप को बफर के साथ प्राइम किया जाना चाहिए। उच्च प्रवाह दर या हवा के बुलबुले की उपस्थिति झिल्ली को तोड़ देगी, और अणु सीधे कवरस्लिप से जुड़ जाएंगे। प्रवाह शुरू होने से पहले छवि अधिग्रहण शुरू होना चाहिए क्योंकि कुछ अणु ट्यूबिंग से फैलते हैं और झिल्ली से बंधते हैं। इमेजिंग के दौरान बाइलेयर पर उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित करने से सोने के नैनोकणों, क्वांटम डॉट्स या फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ कम सांद्रता पर बाइलेयर को डोपिंग करके सुविधा प्रदान की जा सकती है।

एकल-कण ट्रैकिंग प्रयोगों के लिए, झिल्ली पर कणों की संख्या को एक ऐसे परिदृश्य से बचने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए जहां कण प्रक्षेपपथ के अत्यधिक ओवरलैप के कारण ट्रैकिंग चुनौतीपूर्ण है। इमेजिंग के दौरान विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक लेजर शक्ति है। एक उच्च लेजर शक्ति फ्लोरोफोरेस को जल्दी से फोटोब्लीच करेगी, जबकि कम तीव्रता और संबंधित धीमी छवि अधिग्रहण दर धुंधली होने का कारण बनेगी। इष्टतम लेजर शक्ति को कणों की विवर्तन-सीमित छवियों के सममित और करीब बनाए रखते हुए एक महत्वपूर्ण प्रक्षेपवक्र लंबाई (औसतन कम से कम >5) प्राप्त करनी चाहिए। फ्लोरोफोरे45 के फोटोब्लीचिंग को लम्बा खींचने के लिए ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग सिस्टम का भी उपयोग किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत फोटोब्लीचिंग विश्लेषण की एक सीमा बड़ी आणविक असेंबली (~ 20 सबयूनिट्स से अधिक) के मामले में37,46 उत्पन्न होती है, जैसे कि परमाणु छिद्र परिसर47। ऐसे मामलों में, सबयूनिट आबादी 48,49,50 का अनुमान लगाने के लिए बायेसियन-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है।

ज्यादातर मामलों में फ्लोरोफोरे के साथ बायोमोलेक्यूल्स की लेबलिंगपूरी नहीं होती है। यह बिना लेबल वाली प्रजातियों वाले क्लस्टर में सबयूनिट्स की गिनती में एक चुनौती है। उप-पार लेबलिंग दक्षता के लिए एक द्विपद सुधार आमतौर पर एक उचित अनुमान होता है जब आणविक प्रजातियों का स्टोइकोमेट्री तय किया जाता है। कई मामलों में, ऑलिगोमेरिक प्रजातियां विषम या गतिशील रूप से बदल सकती हैं, जैसा कि एक ऑलिगोमेराइजेशन प्रक्रिया में होता है, जिसमें फोटोब्लीचिंग डेटा से अंतर्निहित वितरण निकालने के लिए नए उपकरणों के विकास की आवश्यकता होती है।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल पीईजी-एसएलबी उत्पन्न करने के लिए एक पाइपलाइन प्रदान करता है, जिसमें एकल-अणु बाइंडिंग का उपयोग करने, प्रदर्शन करने और विश्लेषण करने और झिल्ली बायोमोलेक्यूल्स के लिए फोटोब्लीचिंग विश्लेषण को ट्रैक करने और करने की शर्तों के लिए सिफारिशें हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

बेंजामिन शूलर को क्लाया प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति प्लास्मिड साझा करने के लिए स्वीकार करते हैं। इस काम को ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम (आरजीपी0047-2020) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

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जैव रसायन अंक 185
पॉलिमर-भीड़ वाले लिपिड झिल्ली पर एकल-अणु प्रसार और असेंबली
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Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., … More

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).

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