Summary
膵管腺癌(PDAC)の同系マウス同所性同種移植片は、疾患サブタイプの生物学、表現型、および治療反応を再現します。迅速で再現性のある腫瘍進行により、前臨床試験で広く使用されています。ここでは、これらのモデルを生成するための一般的な方法を示し、同系マウスPDAC培養物を膵臓に注入します。
Abstract
膵管腺癌(PDAC)は、多様な間質、免疫細胞、血管、神経、および細胞外マトリックス成分で構成される不均一な腫瘍微小環境を特徴とする非常に複雑な疾患です。長年にわたり、PDACの進行、転移の可能性、および表現型の不均一性によってもたらされる課題に対処するために、PDACのさまざまなマウスモデルが開発されてきました。PDACの免疫適格マウス同所性同種移植片は、遺伝子操作されたマウスモデルと比較して、迅速かつ再現性のある腫瘍進行により、良好な可能性を示しています。さらに、自生PDACで観察される生物学的特徴を模倣する能力と組み合わせることで、細胞株ベースの同所性同種移植マウスモデルは、大規模な in vivo 実験を可能にします。したがって、これらのモデルは、迅速な遺伝子型表現型および薬物反応分析のための前臨床試験で広く使用されています。このプロトコルの目的は、初代マウスPDAC細胞培養物を同系レシピエントマウスの膵臓に正常に注入するための再現性のある堅牢なアプローチを提供することです。技術的な詳細に加えて、これらの実験を実行する前に考慮しなければならない重要な情報が与えられます。
Introduction
最近、PDACは西側世界で癌関連の死亡の3番目に多い原因になりました1。それはすべての癌の中で最も高い死亡率と10年全生存率~1%を引き起こしますが、これは何十年も変わっていません2。PDAC治療の進歩がないため、この病気は今後10年までに癌関連の死亡の2番目に多い原因になると予想されています3。
PDAC腫瘍は、間質、血管、免疫、および細胞外マトリックス成分の不均一な集合体で構成される多様な腫瘍微小環境(TME)を特徴とする複雑な実体です4。TMEの組成の違いは、疾患の予後および治療への反応に影響を及ぼす4,5,6。実際、多くの研究は、PDACの基底様間葉系サブタイプが高度に免疫抑制性のTMEと関連しており、生存率の低下と治療法に対する反応の欠如を示していることを示しています7、8、9、10、11、12。したがって、TME組成の違いと、これらの特徴が腫瘍生物学にどのように影響するかについてのより深い理解は、分子的に正確な治療法の開発にとって依然として重要な要素です。この複雑な表現型の背後にある生物学をよりよく理解し、PDACのTMEが構成する障壁を克服できる治療戦略を特定するには、in vivoモデルが不可欠です。
がんの前臨床モデルシステムの重要な側面は、ヒトの表現型を模倣し、遺伝的不均一性と、TMEを構成する多数の間質集団と免疫集団を組み込んだ環境の両方を再現する必要があることです。したがって、前臨床研究用のマウスモデルを選択する際には、いくつかの側面を考慮する必要があります。腫瘍と免疫の相互作用を調べるために、組織適合性の癌細胞株を同系免疫コンピテントマウスに注射することができます。ほとんどの場合、これらはマウスの脇腹に皮下注射され、触診や目視検査による腫瘍モニタリングが容易です。しかしながら、得られたモデルは、それらの起源器官における腫瘍細胞の増殖を模倣しない。したがって、同所移植は同種移植モデルのゴールドスタンダードになりました。
マウス同所性同種移植片にはいくつかの利点があります:費用対効果が高く、比較的簡単な手順で生成でき、既知の分子構成を持つモデル、および再現性と予測可能な腫瘍の進行と表現型をもたらします。実際、患者由来の異種移植片モデルはヒトPDAC細胞の挙動を正確に表していますが、移植片拒絶反応を回避するために免疫不全マウスに移植する必要があるため、腫瘍-免疫および腫瘍-間質相互作用の分析が制限され、研究者はこれらの腫瘍の複雑さの部分的な画像しかキャプチャできません。PDACの同系同所性同種移植片は、遺伝子改変マウスモデル(GEMM)と比較してもこの点で利点を有する。GEMMは、ヒトPDAC腫瘍形成とPDAC患者で観察された不均一性を正確に再現します。ただし、これらの特徴のために、GEMM腫瘍は、遺伝子構成、腫瘍の進行、攻撃性、組織学的分化、およびTME組成に大きなばらつきを示す可能性があります。これは特定の研究では有利になる可能性がありますが、遺伝子型から表現型への研究とPDAC表現型の焦点を絞った調査を制限します13。したがって、マウス同所性同種移植片は、 in vivoで腫瘍宿主および治療研究を行うための良好なトレードオフおよびモデルを構成する。この論文は、マウスPDAC細胞のマウス膵臓への同所移植実験のためのプロトコルを概説します。
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Protocol
動物実験は、ミュンヘン工科大学とオーバーバイエルン工科大学の地方自治体の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1.手続き前に考慮すべき情報
- 動物実験を開始する前に、地方自治体による動物プロトコルと人員の承認を確認してください。
- レシピエントマウスを選択します。
- 移植のために同様の年齢のマウスを選択します(2か月から4か月の年齢範囲のC57Bl / 6Jレシピエントマウス)。
- レシピエント動物の性別および遺伝的背景が、移植に使用された細胞株が由来する動物の性別および遺伝的背景と一致することを確認する(同系同種移植片)。
- 移植のためにマウスを準備します。
注:地元の動物施設の衛生基準に従ってマウスを取り扱ってください。- 移植当日は、麻酔薬の投与による合併症を避けるために、処置の4時間前にマウスに給餌しないでください。
- 移植前にマウスの体重を測定し、必要な麻酔薬の量を計算します。
- マウスを手術室に移します。
- PDAC細胞株を選択します。
- 細胞株の由来であるマウスの遺伝的背景および性別が、レシピエントマウスのバックグラウンドおよび性別と一致することを確認してください(例えば、前述のように、以下の遺伝子型を有する実験室のC57Bl/6Jバックグラウンド上のPDAC GEMMから以前に生成されたPDAC細胞株PDAC1-3:PDAC 1および2: PDAC 1および2: Ptf1aCre/+;LSL-クラスG12D / +;LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+;LSL-クラスG12D / +;LSL-Trp53 R172H/R172H)。
- 免疫原性の可能性のあるタンパク質を発現しない細胞株を選択します。
- PDAC細胞株を培養します。
注:層流フードの下で細胞培養作業を行います。作業前に手袋、作業スペース、および材料を消毒してください。- 移植の1週間前に、ペレットを5 mLの細胞培養培地に再懸濁して細胞を解凍します。細胞をスピンダウンし、上清を吸引し、ペレットを5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、細胞を再びスピンダウンします。上清を除去し、10%ウシ胎児血清(FBS)および0.1%ペニシリン-ストレプトマイシン(PS)を含む5 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を25cm²のフラスコに移します。
- 移植前に細胞株を少なくとも1回継代する。
- 細胞培地を取り出し、PBSで1回洗浄し、0.5 mLのトリプシンを加えて細胞をフラスコから剥離します。細胞がフラスコから剥離するまで37°Cでインキュベートします(細胞株にもよりますが、これには通常5〜10分かかります)。細胞が剥離したら、10%FBSおよび0.1%PSを含む10 mLのDMEMに細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を75cm²のフラスコに移します。
注:FBSはトリプシンを不活性化するため、トリプシン処理を妨げます。
- 細胞培地を取り出し、PBSで1回洗浄し、0.5 mLのトリプシンを加えて細胞をフラスコから剥離します。細胞がフラスコから剥離するまで37°Cでインキュベートします(細胞株にもよりますが、これには通常5〜10分かかります)。細胞が剥離したら、10%FBSおよび0.1%PSを含む10 mLのDMEMに細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を75cm²のフラスコに移します。
- 移植当日に~70%-80%のコンフルエンシーを確保してください。
- 移植に必要な材料
- すべての手術器具をオートクレーブします。
- 動物実験ライセンスに基づいて麻酔薬を準備してください。
- 鎮痛のためにメロキシカムを少なくとも5分前に、抗炎症特性を有する長期持続性鎮痛薬として使用する。
- 手術には、鎮痛のためにミダゾラム、メデトミジン、フェンタニル(MMF)の組み合わせを使用してください。
- 移植後のMMF鎮静に拮抗するために、アチパメゾール、フルマゼニル、およびナロキソン(AFN)の組み合わせを使用してください。
- 滅菌ドレープ、加熱マット、シェーバー、手袋、アイクリーム、0.9%塩化ナトリウム、ヨウ素またはクロルヘキシジンベースの外科用スクラブ、80%エタノール、可溶性縫合糸、創傷クリップ、50μL注射容量シリンジ、およびテープを準備します。
2. 移植前の細胞株の準備
注:マウスが移植の準備ができたときにのみ腫瘍細胞を準備します。細胞の採取または収集と移植の間の短い時間枠を確保してください。
- 使用前にすべての液体を37°Cに温めてください。
- 細胞を準備します(ステップ1.5.2.1に記載されているように、1x T75(75 cm2 培養フラスコ)からフラスコから剥離するまで)。10% FBSおよび0.1% PSを含む10 mLのDMEMに細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。
- 細胞を200 × g で遠心分離機で5分間スピンダウンします。上清を吸引し、注射用細胞の必要な最終濃度に基づいて、添加剤なしで適切な量のDMEMに細胞ペレットを再懸濁します。10 μLの細胞懸濁液を使用して、ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントし、利用可能な細胞数を計算します。
- 細胞を最終的に必要な注入細胞数(例えば、20 μL中2,500細胞)まで無添加のDMEMで希釈します。希釈した細胞懸濁液1 mLを1.5 mLチューブに移します。細胞が凝集するのを防ぐために、移植されるまでチューブをローテーターに置きます。
3. PDAC細胞の同所移植
注:手術経験が不十分な場合は、最初に死体で練習し、たとえば動物のトレーニングプロトコル内で適切なトレーニングを受けてください。手術および動物実験を行う職員は、それぞれの当局の基準および施設のガイドラインを満たす必要があります。
- メロキシカムを周術期鎮痛薬として使用し、5 mg / kg体重を皮下投与します。.
- 各マウスの体重に応じてMMFを腹腔内注射します(ミダゾラム[5.0 mg / kg]、メデトミジン[0.5 mg / kg]、フェンタニル[0.05 mg / kg])。
- マウスをケージに10〜15分間戻します。
- マウスが眠っているときにアイクリームを塗ります。
- ペダル離脱反射(両後ろ足のフットパッドをつまむ)をテストして、10分後に十分な鎮痛を確認します。応答の場合には、鎮痛鎮静の元の用量の1/3を適用する。10分後、手順を繰り返し、ペダル離脱反射がない場合にのみ続行してください。
- マウスの左外側腹部を剃ります。右側に横たわっているマウスを滅菌加熱マットの上に置き、その脚を表面にテープで留めます。ヨウ素またはクロルヘキシジンベースの外科用スクラブを使用して腹部を消毒し、続いて80%エタノールを円を描くようにし、手順を3回繰り返します。手術野の無菌性を維持するために、外科用ドレープを使用してください。
- 新しい手袋を着用して消毒してください。外科用ハサミを使用して、脾臓が突出している左脇腹の皮膚と皮下脂肪組織を縦方向に切断します。長さ約1 cmのカットを行います。
- はさみと鉗子を使用して、腹膜へのアクセスを容易にするために腹膜から皮膚を分離します。
- はさみを交換します。脾臓の位置にある腹膜を1 cmの縦方向の切り込みで開きます。
- 鈍くて先端の細かい鉗子を使用して、脾臓と付着した膵臓を動員します。臓器が他の組織に付着していないことを確認し、膵臓を扱うときに血管や周囲の組織を傷つけないように血管の供給を確認してください。
注意: 出血を防ぐために脾臓を直接つかまないでください。 - 膵臓を切開部から慎重に引き出して、臓器の尾部にアクセスしやすくし、膵臓に続く脾臓を観察します。利き手ではない手を使って鉗子で膵臓をつかみ、膵臓が体外に分裂するのを防ぐ靭帯を慎重に切ります。注射中に臓器が折りたたまれていないこと、およびこぼれないように、臓器のカプセルが針の貫通部位で張力をかけられていることを確認してください。
- 利き手を使って注射を行います。臓器の縦軸に沿って注射器の針で臓器のカプセルを慎重に貫通します。目に見える血管の間の膵臓組織の一部を目指して、血管に穿刺または注入するリスクを最小限に抑えます。実験計画に従って適切な数の細胞(ここでは、20 μLのDMEMに2,500個の細胞)を27 Gのカニューレと50 μLのシリンジで膵臓の尾部にゆっくりと注入します。
注意: 組織への注入が成功すると、透明な泡が形成されます。 - 腫瘍細胞のこぼれを防ぐために、膵臓と挿入した注射器を約1分間静止させてください。注射部位から針を慎重に取り外します。
注:マウス間で針を交換し、新しい細胞株の注射に新しい滅菌注射器を使用します。 - 腹部内の臓器を慎重に再配置します。細胞がこぼれないように、組織を傷つけないように注意してください。臓器の癒着を避けるために、1mLの0.9%塩化ナトリウムを臓器に注ぎます。
- 簡単な中断縫合技術を使用して腹膜を慎重に縫合し、2〜3個の9mmステンレス鋼の創傷クリップを使用して皮膚を閉じます。
注:外科的切開が治癒した場合は、移植の7日後に創傷クリップを取り外します。 - 必要に応じて、0.5mLの塩化ナトリウムを皮下注射することにより、手順と麻酔による動物の脱水を防ぎます。
- 移植後、マウスの体重に応じて、AFN(アチパメゾール[2.5 mg / kg]、フルマゼニル[0.5 mg / kg]、ナロキソン[1.2 mg / kg])の皮下注射でMMFによる鎮痛に拮抗します。.
- マウスが覚醒して完全にアクティブになるまで、37°Cの加熱チャンバーにマウスを置きます。次に、マウスを元のケージに戻します。毛皮、肌の色、活動をチェックしてマウスの健康状態を監視し、手術後3〜4時間これを繰り返します。
4.マウスのアフターケア
- 動物施設に戻ったときに、マウスに水と食物へのアクセスを与えます。
- 手術後2〜3日間、6〜12時間ごとにメロキシカム(5 mg / kg)の皮下または経口投与を継続します。.
- 動物プロトコルと施設のガイドラインに従って、マウスの健康状態を定期的に監視します。
- 実験の目的に応じて、触診、超音波画像、生物発光(BLI)、または磁気共鳴画像法(MRI)によって、毎週またはより頻繁に腫瘍の成長を監視します。
注:選択した方法、増殖速度、および移植された細胞の数に基づいて、腫瘍は注射後1週間という早い時期に検出できます。
5.腫瘍移植片の収穫
- 実験の終了時、または施設の動物管理および使用委員会または動物実験ライセンスの基準に従ってマウスを安楽死させる必要がある場合は、腫瘍を収穫します。
- 動物実験許可証で認められている方法でマウスを安楽死させる。
注:虚血時間を最小限に抑えるために、最小限の時間損失でステップを実行してください。したがって、子宮頸部脱臼は迅速な方法であり、終末出血や化学的方法とは対照的に、死亡時刻を正確に決定できるため、推奨されます。 - マウスを滅菌マットの上に仰臥位で置き、その脚を表面にテープで留めます。腹部を消毒するために80%エタノールを使用してください。
- 新しい手袋を着用して消毒してください。外科用ハサミを使用して、中央腹部の皮膚を縦方向に切断します。
- はさみと鉗子を使用して、腹膜へのアクセスを容易にするために腹膜から皮膚を分離します。
- はさみを交換します。中央腹部の腹膜を5 cmの縦方向の切り傷で開きます。
- 鈍くて先端の細かい鉗子を使用して、脾臓と付着した膵臓を動員します。鉗子と外科用ハサミを使用して、周囲の組織から腫瘍を慎重に剥離します。
- 腫瘍組織を下流の実験に適した培地に保存する。組織をすぐに処理するか、必要に応じて、さらに処理するまでサンプルを4°Cで最大6時間保持します。
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Representative Results
大規模な薬物反応研究の文脈では、図1から図12の主なステップで例示した上記のプロトコルを使用して、170匹以上のマウス(C75Bl6/Jレシピエントマウス、PDAC細胞株に性別が一致した雄および雌マウス)の移植に成功しました。このプロトコルでは、3つのKrasG12D駆動PDAC細胞株(PDAC 1および2:Ptf1aCre/+;LSL-クラスG12D / +;LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+;LSL-クラスG12D / +;LSL-Trp53R172H / R172H)、以前に実験室で生成されました。PDAC細胞の生着は、注入された細胞数と接種された細胞株の攻撃性と成長特性に応じて、術後約7日で最も早く腹部触診することができます。MRI(図2A)、超音波、およびマウス腹部のBLIは、腫瘍体積の定量的測定に使用することができる。細胞株の腫瘍細胞固有の特徴に応じて、得られた移植マウスの生存率は変化し得る(図2B)。膵内注射が成功すると、マウスの膵臓に本格的な腫瘍が生じます(図2C、D)。対照的に、移植に失敗した場合、a)非生存細胞の注入、b)移植された細胞の拒絶(例えば、細胞がレシピエントマウスと同系でない場合)、またはc)注入された細胞の数が不十分であるため、膵臓腫瘍がなくなる可能性があります。代替の否定的な結果は、膵臓に原発腫瘍が存在しないが、注射部位に対応する腹膜に腫瘍が存在することにつながる可能性がある(例えば、膵臓注射部位からの腫瘍細胞懸濁液のこぼれによる)。
図1:プロトコルの主なステップの概略図。 (A)PDAC細胞は、移植前に少なくとも1回は継代する必要があります。(B)細胞をトリプシン処理してフラスコから剥離し、15 mLチューブに移し、カウントします。(C)適切な細胞希釈液をチューブに入れ、移植室に持ち込む。(D)レシピエントマウスは、手術が行われる領域で麻酔され、剃毛され、消毒されます。(E)膵臓の尾の位置に対応するマウスの腹部に1cmの切り込みを入れます。(f)所望の数の細胞を膵臓の尾部に注入する。略語:PDAC =膵管腺癌。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:同系マウス同所性同種移植片で成功した結果の例 。 (a)初代マウスPDAC細胞の同所移植後2週間のマウスの代表的なMRI。破線の輪郭は腫瘍を示します。スケールバー= 5 mm。 (B)同系免疫適格マウスの膵臓に同所的に移植された3つの異なるマウスPDAC細胞株(PDAC 1-3)のKaplan-Meier生存曲線(C57Bl/6Jバックグラウンド)。(C)同所性に注入されたPDAC1細胞株からエンドポイントで単離された腫瘍の代表的な画像。腫瘍細胞の膵内注射に成功した膵臓腫瘍と脾臓の両方が写真に示されています。スケールバー= 5mm。 (D)PDAC1〜3からの同所性腫瘍の平均腫瘍重量を示す棒グラフ。ドットは個々のマウスを表します。略語:PDAC =膵管腺癌;MRI =磁気共鳴画像法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
同系マウス同所性同種移植片は、その費用対効果、再現性、および比較的簡単な実験手順により、前臨床試験の堅牢なモデルを表しています13,15。これらのモデルは、腫瘍と宿主の相互作用の研究を可能にするだけでなく、初代マウス細胞培養を実験に使用した場合、腫瘍に由来する腫瘍の遺伝的不均一性の保存を保証します。
このプロトコルは、マウスPDAC細胞培養物の膵臓への同所性移植のための簡単で迅速な手順を提示します。再現性のある結果を得るには、手術技術の品質など、いくつかの技術的考慮事項に留意する必要があります。外科的慣行は異なるため、1人が同じ実験内ですべての同所性注射を実行することをお勧めします。
膵臓への細胞の注入は慎重に行われるべきです。こぼれた細胞、膵臓を突き刺す、または組織を傷つけると、細胞が膵臓の外側の他の臓器部位に生着する可能性があります。これは、原発腫瘍の臨床的評価(例えば、サイズおよび局所浸潤)、ならびにその局所的および遠隔転移性転移を複雑にする可能性がある。したがって、移植された各マウスの気泡形成と細胞流出に関する情報を文書化して評価することをお勧めします。皮膚と腹膜の切り傷は、傷をできるだけ小さく保ちながら膵臓への最適なアクセスを可能にするために適切なサイズで行う必要があります。
移植細胞の数は、実験計画に応じて調整することができます。移植された細胞の数が多いほど、生理学的に急速に成長する腫瘍と臨床症状の急速な進行につながりますが、細胞数が少ないと、腫瘍が生着しないリスクが高まります。さらに、より大きな容量(>20μL)は嚢胞性コアの形成の可能性の増加と関連しているため、少量の細胞懸濁液が推奨されます13。2,500〜5,000個の細胞を20 μLの細胞培養培地に移植することは、数週間にわたる腫瘍の成長を確実にすることにより、前臨床治療研究に最適な量であることがわかりました。ただし、他のアプリケーションでは、最大1.6×106 個の細胞を移植できます。
細胞培養培地に加えて、マトリゲルは、PDAC細胞を再懸濁するための栄養豊富な培地として使用することができ、これもまた、注射溶液の粘度を増加させ、それによって腫瘍細胞13の漏出を防止する。膵臓の尾部への注射は、膵臓の尾部に容易にアクセスでき、膵臓頭部へのアクセスが制限されるため、このプロトコルで好まれます。膵臓頭部に細胞を首尾よく注入するためのプロトコルは、他の場所に記載されている13、15。外科的処置を行うために、マウスは、ミダゾラム、メデトミジン、およびフェンタニル、ならびに周術期および術後の鎮痛剤としてのメロキシカムを含む薬物の組み合わせを使用して鎮痛下に保たれます。あるいは、適切な鎮痛薬と組み合わせたイソフルランを、一定の流れ下で吸入麻酔として使用することができる。動物ライセンスのために選択する鎮痛方法の選択は、機関のガイドラインとそれぞれの地方自治体によって異なります。
細胞株とレシピエントマウスの慎重な選択が不可欠です。実際、PDAC細胞の免疫原性および移植片拒絶を回避するために、レシピエントマウスの遺伝的背景が選択された細胞株の遺伝的背景と一致することを確認することが重要です。さらに、移植された腫瘍細胞によって発現される蛍光レポーター対立遺伝子やCas9などの免疫原性外因性タンパク質は、宿主の応答に影響を与え、免疫原性反応を引き起こす可能性があります。したがって、腫瘍の成長とTMEの組成が影響を受け、バイアスを引き起こす可能性があります。
GEMMと比較して、同系同所性マウス同種移植片は、デスモプラシアの量が減少し、場合によっては転移播種率が低く、ヒト腫瘍との類似性を部分的に制限します。さらに、外科的介入の必要性は処置の複雑さを増す。生存不能な細胞注入、移植細胞の拒絶、注入された細胞の数の減少、および注入漏れのために所望の場所に膵臓腫瘍が存在しない結果をもたらす移植の失敗は、実験手順の完了を妨げる可能性がある。
これらの制限にもかかわらず、PDACの同系同所性マウス同種移植片モデルは、PDACとその異質性を研究する際の多くの課題に効果的に対処することが示されています。再現性の高い表現型と腫瘍の成長パターン、および腫瘍とTMEの相互作用により、比較的単純なプロトコルに従って迅速に取得できる貴重なリソースです。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
TUM動物施設と核医学部門のイメージングコア施設であるKlinikum rechts der Isarの優れた技術サポートに感謝します。この研究は、ドイツ癌コンソーシアム(DKTK)、ドイツ科学研究センター(DFG SA 1374/4-2、DFG SA 1374/6-1、SFB 1321 Project-ID 329628492 P06、P11およびS01)からD.S.、Wilhelm Sander-Stiftung(2020.174.1および2017.091.2)からD.S.、および欧州研究会議(ERC CoG No. 648521、D.S.)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
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