Summary
Syngeneic mus ortotopiske allotransplantater af pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) rekapitulerer biologi, fænotyper og terapeutiske reaktioner af sygdomsundertyper. På grund af deres hurtige, reproducerbare tumorprogression anvendes de i vid udstrækning i prækliniske undersøgelser. Her viser vi almindelig praksis for at generere disse modeller og injicere syngeneic murine PDAC-kulturer i bugspytkirtlen.
Abstract
Pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) er en meget kompleks sygdom præget af et heterogent tumormikromiljø, der består af forskellige stroma-, immunceller, kar, nerver og ekstracellulære matrixkomponenter. I årenes løb er forskellige musemodeller af PDAC blevet udviklet for at løse udfordringerne ved dets progression, metastatiske potentiale og fænotypiske heterogenitet. Immunokompetente ortotopiske allotransplantater af PDAC har vist sig lovende på grund af deres hurtige og reproducerbare tumorprogression sammenlignet med genetisk manipulerede musemodeller. Desuden kombineret med deres evne til at efterligne de biologiske egenskaber, der observeres i autokton PDAC, muliggør cellelinjebaserede ortopopiske allograftmusemodeller storskala in vivo-eksperimenter . Disse modeller anvendes således i vid udstrækning i prækliniske studier til hurtige genotype-fænotype- og lægemiddelresponsanalyser. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en reproducerbar og robust tilgang til vellykket injektion af PDAC-cellekulturer med primær mus i bugspytkirtlen hos syngeneiske recipientmus. Ud over de tekniske detaljer gives vigtige oplysninger, der skal overvejes, inden disse eksperimenter udføres.
Introduction
For nylig blev PDAC den tredje førende årsag til kræftrelaterede dødsfald i den vestlige verden1. Det forårsager den højeste dødelighed blandt alle kræftformer og en 10 års samlet overlevelsesrate på ~ 1%, hvilket ikke har ændret sig i årtier2. På grund af manglende fremskridt i PDAC-behandling forventes denne sygdom at blive den næststørste årsag til kræftrelaterede dødsfald inden for det næste årti3.
PDAC-tumorer er komplekse enheder kendetegnet ved et forskelligartet tumormikromiljø (TME) sammensat af en heterogen samling af stroma-, vaskulære, immun- og ekstracellulære matrixkomponenter4. Forskelle i sammensætningen af TME påvirker sygdomsprognosen og respons på behandlingen 4,5,6. Faktisk har mange undersøgelser vist, at den basale lignende, mesenkymale undertype af PDAC er forbundet med en stærkt immunsuppressiv TME og viser nedsat overlevelse og manglende respons på terapier 7,8,9,10,11,12. Derfor er en dybere forståelse af forskellene i TME-sammensætning, og hvordan disse egenskaber påvirker tumorbiologi, fortsat en vigtig faktor for udviklingen af molekylært præcise terapier. For bedre at forstå biologien bag denne komplekse fænotype og identificere terapeutiske strategier, der er i stand til at overvinde den barriere, som TME af PDAC udgør, er in vivo-modeller uundværlige.
Et centralt aspekt for ethvert kræftpræklinisk modelsystem er, at det skal efterligne humane fænotyper og rekapitulere både den genetiske heterogenitet og miljøet, der inkorporerer de mange stromale og immunpopulationer, der udgør TME. Derfor skal der tages hensyn til flere aspekter, når man vælger musemodeller til præklinisk forskning. For at undersøge tumorimmuninteraktionen kan histokompatible kræftcellelinjer injiceres i syngeneiske immunkompetente mus. I de fleste tilfælde injiceres disse subkutant i musens flanke, hvilket muliggør nem tumorovervågning ved palpation eller visuel inspektion. De resulterende modeller efterligner imidlertid ikke væksten af tumorceller i deres oprindelsesorgan. Derfor blev ortopiske transplantationer guldstandarden for allograftmodeller.
Musens ortotopiske allotransplantater har flere fordele: de er omkostningseffektive, kan genereres med en relativt enkel procedure og resulterer i modeller med kendt molekylær makeup samt en reproducerbar og forudsigelig tumorprogression og fænotype. Mens patientafledte xenograftmodeller repræsenterer adfærden hos humane PDAC-celler nøjagtigt, begrænser behovet for implantation i immundefekte mus for at undgå transplantatafstødning analysen af tumorimmun- og tumor-stroma-interaktionerne, hvilket gør det muligt for forskere kun at fange et delvist billede af kompleksiteten af disse tumorer. Syngeneiske ortotopiske allotransplantater af PDAC har også en fordel i denne henseende sammenlignet med genetisk manipulerede musemodeller (GEMM'er). GEMM'er rekapitulerer nøjagtigt human PDAC-tumorigenese og heterogeniteten observeret hos PDAC-patienter. På grund af disse funktioner kan GEMM-tumorer imidlertid vise høj varians i deres genetiske sammensætning, tumorprogression, aggressivitet, histologisk differentiering og TME-sammensætning. Selvom dette kan være en fordel i visse undersøgelser, begrænser det genotype-til-fænotype-undersøgelser og den fokuserede undersøgelse af PDAC-fænotyper13. Derfor udgør ortopiske allotransplantater med mus en god afvejning og model til at udføre tumorværts- og behandlingsundersøgelser in vivo. Dette papir skitserer en protokol for ortopiske transplantationseksperimenter af murine PDAC-celler i musebugspytkirtlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøgene blev godkendt af de institutionelle udvalg for dyrepleje og brug (IACUC'er) under de lokale myndigheder ved det tekniske universitet i München og Regierung von Oberbayern.
1. Oplysninger, der skal overvejes forud for proceduren
- Sørg for, at de lokale myndigheder godkender dyreprotokollen og personalet, inden dyreforsøgene påbegyndes.
- Vælg modtagermus.
- Vælg mus i samme alder til implantation (C57Bl/6J-modtagermus med et aldersinterval mellem 2 måneder og 4 måneder).
- Sørg for, at modtagerdyrenes køn og genetiske baggrund svarer til køn og genetisk baggrund for de dyr, som den cellelinje, der anvendes til implantationen, stammer fra (syngeneiske allotransplantater).
- Forbered musene til implantation.
BEMÆRK: Håndter musene i henhold til de hygiejniske standarder for det lokale dyreanlæg.- På implantationsdagen må du ikke fodre musene 4 timer før proceduren for at undgå komplikationer på grund af administration af anæstetika.
- Væg musene før implantation for at beregne mængden af de nødvendige bedøvelsesmidler.
- Overfør musene til operationsrummet.
- Vælg PDAC-cellelinjerne.
- Sørg for, at den genetiske baggrund og køn hos de mus, hvorfra cellelinjerne stammer, stemmer overens med modtagermusenes baggrund og køn (f.eks. PDAC-cellelinjerne PDAC 1-3, der tidligere er genereret fra PDAC GEMM'er på en C57Bl/6J-baggrund i laboratoriet med følgende genotyper, som beskrevet tidligere14: PDAC 1 og 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53 R172H/R172H).
- Vælg de cellelinjer, der ikke udtrykker proteiner, der er potentielt immunogene.
- Dyrk PDAC-cellelinjerne.
BEMÆRK: Udfør cellekulturarbejdet under en laminær strømningshætte. Desinficer handskerne, arbejdsområdet og materialerne inden arbejde.- Optø cellerne 1 uge før implantation ved at resuspendere pelleten i 5 ml cellekulturmedium. Drej cellerne ned, suspirer supernatanten, genopslæmm pelletten i 5 ml fosfatbufret saltvand (PBS), og drej cellerne ned igen. Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i 5 ml af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 0,1% penicillin-streptomycin (PS). Celleopslæmningen overføres til en kolbe på 25 cm².
- Passage cellelinjerne mindst en gang før implantation.
- Fjern cellemediet, vask 1x med PBS, og tilsæt 0,5 ml trypsin for at løsne cellerne fra kolben. Cellerne inkuberes ved 37 °C, indtil de løsner sig fra kolben (afhængigt af cellelinjen tager dette normalt 5-10 minutter). Når cellerne løsnes, resuspenderes cellerne i 10 ml DMEM med 10% FBS og 0,1% PS og overføres cellesuspensionen til en 75 cm² kolbe.
BEMÆRK: Da FBS inaktiverer trypsin, ville det hindre trypsinisering.
- Fjern cellemediet, vask 1x med PBS, og tilsæt 0,5 ml trypsin for at løsne cellerne fra kolben. Cellerne inkuberes ved 37 °C, indtil de løsner sig fra kolben (afhængigt af cellelinjen tager dette normalt 5-10 minutter). Når cellerne løsnes, resuspenderes cellerne i 10 ml DMEM med 10% FBS og 0,1% PS og overføres cellesuspensionen til en 75 cm² kolbe.
- Sørg for sammenløb på ~ 70% -80% på implantationsdagen.
- Materiale, der er nødvendigt til implantation
- Autoklave alle de kirurgiske instrumenter.
- Hold anæstetika klar baseret på dyreforsøgslicensen.
- Brug meloxicam til analgesi mindst 5 minutter i forvejen som et langvarigt smertestillende middel med antiinflammatoriske egenskaber.
- Til kirurgi skal du bruge en kombination af midazolam, medetomidin og fentanyl (MMF) til analgosedation.
- Brug en kombination af atipamezol, flumazenil og naloxon (AFN) til antagonisering af MMF-analgosedation efter implantation.
- Forbered en steril drapering, en varmemåtte, en barbermaskine, handsker, øjencreme, 0,9% natriumchlorid, jod eller chlorhexidinbaseret kirurgisk skrubbe, 80% ethanol, opløselig sutur, sårklemmer, en 50 μL injektionsvolumensprøjte og tape.
2. Forberedelse af cellelinjerne før implantation
BEMÆRK: Forbered kun tumorcellerne, når musene er klar til implantation. Sørg for en kort tidsramme mellem høst eller indsamling af celler og implantation.
- Alle væsker opvarmes til 37 °C før brug.
- Cellerne (fra 1x T75 (en 75cm2 dyrkningskolbe) som beskrevet i trin 1.5.2.1 klargøres, indtil de løsner sig fra kolben. Resuspender cellerne i 10 ml DMEM med 10% FBS og 0,1% PS og overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør.
- Drej cellerne ned ved 200 × g i 5 minutter i en centrifuge. Supernatanten suges op, og cellepelletsen resuspenderes i en tilstrækkelig mængde DMEM uden tilsætningsstoffer baseret på den krævede slutkoncentration af cellerne til injektion. Brug 10 μL af cellesuspensionen til at tælle cellerne ved hjælp af et Neubauer-kammer og beregne antallet af tilgængelige celler.
- Fortynd cellerne til det endelige antal celler til injektion (f.eks. 2.500 celler i 20 μL) i DMEM uden tilsætningsstoffer. Der overføres 1 ml af suspensionen af fortyndede celler til et 1,5 ml glas. Placer røret på en rotator indtil implantation for at forhindre cellerne i at aggregere.
3. Ortopisk implantation af PDAC-celler
BEMÆRK: I tilfælde af utilstrækkelig kirurgisk erfaring skal du først øve med kadavere og få tilstrækkelig træning, for eksempel inden for en dyretræningsprotokol. Det personale, der udfører operationen og dyreforsøgene, skal opfylde de respektive myndigheders kriterier og de institutionelle retningslinjer.
- Brug meloxicam som et perioperativt smertestillende middel og påfør 5 mg/kg legemsvægt subkutant.
- Intraperitonealt injicere MMF i henhold til kropsvægten af hver mus (midazolam [5,0 mg/kg], medetomidin [0,5 mg/kg] og fentanyl [0,05 mg/kg]).
- Sæt musen tilbage i buret i 10-15 min.
- Påfør øjencreme, når musen sover.
- Kontroller tilstrækkelig analgosedation efter 10 minutter ved at teste pedaludtrækningsrefleksen (klem på fodpuderne på begge bagfødder). I tilfælde af respons påføres 1/3 af den oprindelige dosis analgosedation. Efter 10 minutter gentages proceduren, og fortsæt kun i mangel af pedaludtagningsrefleks.
- Barber musens venstre laterale abdominale flanke. Placer musen liggende på højre side på en steril varmemåtte og tape benene til overfladen. Desinficer maven ved hjælp af en jod- eller chlorhexidinbaseret kirurgisk skrubbe efterfulgt af 80% ethanol i en cirkulær bevægelse og gentag proceduren tre gange. For at opretholde sterilitet i det kirurgiske felt skal du bruge en kirurgisk drapering.
- Brug nye handsker og desinficer dem. Brug kirurgisk saks til at skære huden og subkutant fedtvæv i længderetningen på venstre flanke, hvor milten projiceres. Udfør et snit på ca. 1 cm i længden.
- Brug saks og tang til at adskille huden fra bughinden for at få lettere adgang til bughinden.
- Skift saksen. Åbn peritoneum på miltens placering med et 1 cm langsgående snit.
- Mobiliser milten og den vedhæftede bugspytkirtel ved hjælp af stump, finspidsede tang. Sørg for, at organerne ikke er fastgjort til andet væv, og kontroller for at levere blodkar for at undgå at skade karrene eller det omgivende væv, når du håndterer bugspytkirtlen.
BEMÆRK: Tag ikke milten direkte fat for at forhindre blødning. - Træk forsigtigt bugspytkirtlen ud af snittet for at give lettere adgang til organets hale og observere milten efter bugspytkirtlen. Brug den ikke-dominerende hånd til at gribe fat i bugspytkirtlen med tang og skær forsigtigt ledbåndene, der forhindrer bugspytkirtlen i ekstrakorporalisering. Sørg for, at organet ikke foldes under injektionen, og at organets kapsel holdes under spænding på nåleindtrængningsstedet for at undgå spild.
- Brug den dominerende hånd til at udføre injektionen. Træng forsigtigt ind i organets kapsel med sprøjtens nål efter organets længdeakse. Sigt efter et stykke bugspytkirtelvæv mellem synlige blodkar for at minimere risikoen for punktering eller injektion i et kar. Injicer langsomt et passende antal celler i henhold til forsøgsplanen (her 2.500 celler i 20 μL DMEM) med en 27 G kanyle og en 50 μL sprøjte i haleområdet i bugspytkirtlen.
BEMÆRK: Der dannes en gennemsigtig boble ved vellykket injektion i vævet. - Hold bugspytkirtlen og den indsatte sprøjte stille i ca. 1 minut for at undgå spild af tumorcellerne. Fjern nålen forsigtigt fra injektionsstedet.
BEMÆRK: Skift kanyler mellem mus og brug en ny steril sprøjte til injektion af en ny cellelinje. - Omarranger organerne inde i maven omhyggeligt. Pas på ikke at skade vævet for at undgå spild af cellerne. Hæld 1 ml 0,9% natriumchlorid på organerne for at undgå organadhæsion.
- Sutur forsigtigt bughinden ved hjælp af den enkle afbrudte suturteknik og luk huden ved hjælp af to til tre 9 mm sårklemmer i rustfrit stål.
BEMÆRK: Fjern sårklemmerne 7 dage efter implantation, hvis det kirurgiske snit er helet. - Undgå om nødvendigt dehydrering af dyrene på grund af proceduren og anæstesien ved at injicere 0,5 ml natriumchlorid subkutant.
- Efter implantation antagoniseres analgosedationen af MMF med en subkutan injektion af AFN (atipamezol [2,5 mg / kg], flumazenil [0,5 mg / kg], naloxon [1,2 mg / kg]), i henhold til musens kropsvægt.
- Anbring musen i et opvarmet kammer på 37 °C, indtil den er vågen og helt aktiv. Placer derefter musen tilbage i sit oprindelige bur. Overvåg musens sundhedsstatus ved at kontrollere pels, hudfarve og aktivitet, og gentag dette 3-4 timer efter operationen.
4. Efterbehandling af musene
- Giv musene adgang til vand og mad, når de er tilbage i dyreanlægget.
- Fortsæt subkutan eller oral applikation af meloxicam (5 mg/kg) hver 6-12 timer i 2-3 dage efter operationen.
- Overvåg musenes sundhedstilstand regelmæssigt i henhold til dyreprotokollen og de institutionelle retningslinjer.
- Afhængigt af målet med eksperimentet skal du overvåge tumorvækst hver uge eller oftere ved palpering, ultralydsbilleddannelse, bioluminescens (BLI) eller magnetisk resonansbilleddannelse (MR).
BEMÆRK: Baseret på den valgte metode, væksthastigheden og antallet af implanterede celler kan en tumor detekteres så tidligt som 1 uge efter injektionen.
5. Høstning af tumortransplantater
- Høst tumorerne i slutningen af eksperimentet, eller når musene skal aflives efter kriterierne for de institutionelle dyrepleje- og brugskomitéer eller dyreforsøgslicens.
- Aflive musen ved hjælp af en metode, der er tilladt i henhold til dyreforsøgslicensen.
BEMÆRK: Udfør trin med et minimalt tidstab for at minimere iskæmitiden. Derfor anbefales cervikal dislokation, da det er en hurtig metode, og dødstidspunktet kan bestemmes nøjagtigt i modsætning til terminal blødning eller kemiske metoder. - Placer musen liggende på en steril måtte og tape benene til overfladen. Brug 80% ethanol til at desinficere maven.
- Brug nye handsker og desinficer dem. Brug kirurgisk saks til at skære huden i længderetningen på den centrale del af maven.
- Brug saks og tang til at adskille huden fra bughinden for at få lettere adgang til bughinden.
- Skift saksen. Åbn peritoneum ved den centrale mave med et 5 cm langsgående snit.
- Mobiliser milten og den vedhæftede bugspytkirtel ved hjælp af stump, finspidsede tang. Fjern forsigtigt tumoren fra det omgivende væv ved hjælp af tang og kirurgisk saks.
- Opbevar tumorvævet i et medium, der er egnet til nedstrøms eksperimenter. Vævene behandles straks, eller prøven opbevares om nødvendigt ved 4 °C i højst 6 timer, indtil den viderebehandles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I forbindelse med en storstilet lægemiddelresponsundersøgelse implanterede vi med succes mere end 170 mus (C75Bl6/J-modtagermus, han- og hunmuskøn matchet med PDAC-cellelinjerne injiceret) ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol, eksemplificeret i dens hovedtrin i figur 112. I denne protokol implanterede vi ortopisk tre KrasG12D-drevne PDAC-cellelinjer (PDAC 1 og 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), som tidligere blev genereret i laboratoriet. Engraftment af PDAC-celler kan abdominalt palperes tidligst ca. 7 dage efter operationen, afhængigt af det injicerede cellenummer og aggressiviteten og vækstegenskaberne ved den podede cellelinje. MR (figur 2A), ultralyd og BLI i musens underliv kan bruges til kvantitative målinger af tumorvolumen. Afhængigt af cellelinjernes tumorcelle-iboende egenskaber kan overlevelsen af de resulterende implanterede mus variere (figur 2B). Succesfulde intrapancreas injektioner fører til fuldblæste tumorer i musens bugspytkirtel (figur 2C, D). I modsætning hertil kan mislykkede implantationer resultere i fravær af bugspytkirteltumorer på grund af a) injektion af ikke-levedygtige celler, b) afvisning af de implanterede celler (f.eks. hvis cellerne ikke var syngeneiske for modtagermusen) eller c) et utilstrækkeligt antal celler injiceret. Alternative negative resultater kan føre til fravær af en primær tumor i bugspytkirtlen, men tilstedeværelsen af en tumor i bughinden, svarende til injektionsstedet (fx gennem spild af tumorcellesuspensionen fra injektionsstedet i bugspytkirtlen).
Figur 1: Skematisk gengivelse af protokollens vigtigste trin . (A) PDAC-celler skal passeres mindst én gang før implantation. (B) Celler trypsiniseres for at løsne dem fra kolben, overføres til et 15 ml rør og tælles. C) Den passende cellefortynding anbringes i et rør og bringes til implantationsrummet. (D) Modtagermusen bedøves, barberes og desinficeres i det område, hvor operationen finder sted. (E) Der foretages et snit på 1 cm i musens mave svarende til bugspytkirtlens haleplacering. (F) Det ønskede antal celler injiceres i bugspytkirtlens hale. Forkortelse: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på vellykkede resultater på ortopiske allotransplantater med syngeneic mus. (A) Repræsentativ MR af en mus 2 uger efter ortopisk transplantation af primære PDAC-celler fra mus. Stiplet kontur angiver tumoren. Skalabjælke = 5 mm. (B) Kaplan-Meier-overlevelseskurve for tre forskellige PDAC-cellelinjer med mus (PDAC 1-3) ortopisk transplanteret i bugspytkirtlen hos syngeneiske immunkompetente mus (C57Bl/6J-baggrund). (C) Repræsentativt billede af en tumor isoleret ved endepunktet fra den ortopisk injicerede PDAC1-cellelinje. Både en bugspytkirteltumor som følge af en vellykket intrapancreas injektion af tumorceller og milten er vist på fotografiet. Skalabjælke = 5 mm. (D) Barplot, der viser de gennemsnitlige tumorvægte af ortopisk transplanterede tumorer fra PDAC 1-3. Prikker repræsenterer individuelle mus. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; MR = magnetisk resonansbilleddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ortotopiske transplantater med mus udgør en robust model for prækliniske undersøgelser på grund af deres omkostningseffektivitet, reproducerbarhed og relativt enkle eksperimentelle procedurer13,15. Disse modeller tillader ikke kun undersøgelse af tumor-værtsinteraktioner, men garanterer også bevarelsen af den genetiske heterogenitet af de tumorer, de stammer fra, når primære musecellekulturer anvendes til eksperimentet.
Denne protokol præsenterer en enkel og hurtig procedure til ortopisk implantation af mus PDAC-cellekulturer i bugspytkirtlen. For at opnå reproducerbare resultater skal flere tekniske overvejelser tages i betragtning, herunder kvaliteten af den kirurgiske teknik. Da kirurgisk praksis varierer, anbefales det, at en person udfører alle ortopiske injektioner inden for samme eksperiment.
Injektion af celler i bugspytkirtlen skal udføres med forsigtighed. Spildte celler, piercing bugspytkirtlen, eller skade vævet kan forårsage cellerne til at engraft på andre organ steder uden for bugspytkirtlen. Dette kan komplicere den kliniske evaluering (fx størrelse og lokal infiltration) af den primære tumor, såvel som dens lokale og fjerne metastatiske spredning. Derfor anbefales det at dokumentere og vurdere bobledannelse og eventuelle oplysninger om cellespild for hver implanteret mus. Nedskæringer i hud og bughinden bør foretages i en passende størrelse for at muliggøre optimal adgang til bugspytkirtlen, samtidig med at sårene holdes så små som muligt.
Antallet af implanterede celler kan justeres afhængigt af forsøgsplanen. Mens et større antal implanterede celler fører til fysiologisk hurtigt voksende tumorer og hurtig progression af kliniske symptomer, øger mindre celletal risikoen for, at tumorer ikke vil indpodes. Desuden anbefales små mængder cellesuspensioner, da større volumener (>20 μL) er forbundet med et øget potentiale for dannelse af en cystisk kerne13. Vi fandt ud af, at implantering af 2.500-5.000 celler i et volumen på 20 μL cellekulturmedium er en optimal mængde til prækliniske terapeutiske undersøgelser ved at sikre tumorvækst over flere uger. Til andre applikationer kan der dog implanteres op til 1,6 × 106 celler.
Ud over cellekulturmedium kan Matrigel anvendes som et næringsrigt medium til at resuspendere PDAC-cellerne, hvilket også øger injektionsopløsningens viskositet og derved forhindrer lækage af tumorcellerne13. Injektioner i haleområdet i bugspytkirtlen foretrækkes med denne protokol, da bugspytkirtelhalen er let tilgængelig, og adgangen til bugspytkirtelhovedet er begrænset. Protokoller til vellykket injektion af celler i bugspytkirtelhovedet er beskrevet andetsteds13,15. For at udføre den kirurgiske procedure holdes mus under analgosedation ved anvendelse af en lægemiddelkombination, herunder midazolam, medetomidin og fentanyl samt meloxicam som peri- og postoperativt smertestillende middel. Alternativt kan isofluran i kombination med passende analgetika anvendes som inhalationsanæstesi under konstant flow. Valget af den valgte analgosedationsmetode til dyretilladelsen afhænger af de institutionelle retningslinjer og de respektive lokale myndigheder.
Omhyggeligt valg af cellelinjer og modtagermus er bydende nødvendigt. Det er faktisk vigtigt at sikre, at modtagermusenes genetiske baggrund stemmer overens med den genetiske baggrund for de valgte cellelinjer for at undgå immunogenicitet og transplantatafstødning af PDAC-cellerne. Desuden påvirker immunogene eksogene proteiner, såsom fluorescerende reporteralleler eller Cas9, udtrykt af implanterede tumorceller, værtsens respons og kan føre til en immunogen reaktion. Derfor kan tumorvækst og sammensætningen af TME påvirkes og forårsage bias.
Sammenlignet med GEMM'er viser syngeneiske ortotopiske museallotransplantater en reduceret mængde desmoplasi og i nogle tilfælde en lavere metastatisk spredningshastighed, hvilket delvis begrænser ligheden med humane tumorer. Desuden øger behovet for kirurgisk indgreb procedurens kompleksitet. Mislykkede implantationer, der resulterer i fravær af bugspytkirteltumorer på det ønskede sted på grund af ikke-levedygtig celleinjektion, afvisning af implanterede celler, lavt antal injicerede celler og injektionslækage kan forhindre afslutningen af den eksperimentelle procedure.
På trods af disse begrænsninger har syngeneiske ortotopiske museallograftmodeller af PDAC vist sig effektivt at løse mange af udfordringerne ved at studere PDAC og dens heterogenitet. Med deres meget reproducerbare fænotyper og tumorvækstmønstre samt tumor-TME-interaktioner repræsenterer de en uvurderlig ressource, der hurtigt kan opnås efter en relativt enkel protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke TUM dyrefacilitet og billeddannelse kernefacilitet af Institut for Nuklearmedicin, Klinikum rechts der Isar, for fremragende teknisk support. Denne undersøgelse blev støttet af det tyske kræftkonsortium (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 og S01) til D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 og 2017.091.2) til D.S. og Det Europæiske Forskningsråd (ERC CoG nr. 648521, til D.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D.
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
