Summary
췌관 선암종(PDAC)의 Syngeneic mouse orthotopic 동종이식편은 질병 아형의 생물학, 표현형 및 치료 반응을 요약합니다. 빠르고 재현 가능한 종양 진행으로 인해 전임상 연구에 널리 사용됩니다. 여기에서는 syngeneic murine PDAC 배양을 췌장에 주입하여 이러한 모델을 생성하는 일반적인 방법을 보여줍니다.
Abstract
췌관 선암종(PDAC)은 다양한 간질, 면역 세포, 혈관, 신경 및 세포외 기질 성분으로 구성된 이질적인 종양 미세환경을 특징으로 하는 매우 복잡한 질병입니다. 수년에 걸쳐 PDAC의 진행, 전이 가능성 및 표현형 이질성으로 인해 발생하는 문제를 해결하기 위해 다양한 마우스 모델이 개발되었습니다. PDAC의 면역 적격 마우스 동종 이식편은 유전자 조작 마우스 모델과 비교하여 빠르고 재현 가능한 종양 진행으로 인해 좋은 가능성을 보여주었습니다. 또한, 자가 PDAC에서 관찰되는 생물학적 특징을 모방하는 능력과 결합된 세포주 기반 동소 동종 이식편 마우스 모델은 대규모 생체 내 실험을 가능하게 합니다. 따라서 이러한 모델은 신속한 유전자형-표현형 및 약물 반응 분석을 위한 전임상 연구에서 널리 사용됩니다. 이 프로토콜의 목적은 1차 마우스 PDAC 세포 배양을 syngeneic 수용자 마우스의 췌장에 성공적으로 주입하기 위한 재현 가능하고 강력한 접근 방식을 제공하는 것입니다. 기술적 세부 사항 외에도 이러한 실험을 수행하기 전에 고려해야 할 중요한 정보가 제공됩니다.
Introduction
최근, PDAC는 서구 세계에서 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인이 되었다1. 모든 암 중에서 가장 높은 사망률을 초래하고 10년 전체 생존율은 ~1%로 수십 년 동안 변하지 않았습니다2. PDAC 치료의 진전이 없기 때문에 이 질병은 향후 10년 동안 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인이 될 것으로 예상됩니다3.
PDAC 종양은 기질, 혈관, 면역 및 세포외 기질 성분의 이질적인 집합체로 구성된 다양한 종양미세환경(TME)을 특징으로 하는 복잡한 개체이다4. TME 구성의 차이는 질병 예후와 치료에 대한 반응에 영향을 미친다 4,5,6. 실제로, 많은 연구에서 PDAC의 기저형, 중간엽 아형은 고도의 면역억제성 TME와 관련이 있으며 생존율 감소 및 요법에 대한 반응 부족을 보여줍니다 7,8,9,10,11,12. 따라서 TME 구성의 차이와 이러한 특징이 종양 생물학에 미치는 영향에 대한 더 깊은 이해는 분자적으로 정밀한 치료법 개발에 중요한 요소로 남아 있습니다. 이 복잡한 표현형의 이면에 있는 생물학을 더 잘 이해하고 PDAC의 TME가 구성하는 장벽을 극복할 수 있는 치료 전략을 식별하려면 생체 내 모델이 필수적입니다.
모든 암 전임상 모델 시스템의 핵심 측면은 TME를 구성하는 수많은 기질 및 면역 집단을 통합하는 유전적 이질성과 환경을 모두 요약하여 인간 표현형을 모방해야 한다는 것입니다. 따라서 전임상 연구를 위한 마우스 모델을 선택할 때 몇 가지 측면을 고려해야 합니다. 종양-면역 상호작용을 조사하기 위해, 조직적합성 암 세포주를 syngeneic immunocompetec 마우스에 주입할 수 있다. 대부분의 경우 마우스의 옆구리에 피하 주사하여 촉진 또는 육안 검사로 종양을 쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 그러나, 생성 된 모델은 기원 기관에서 종양 세포의 성장을 모방하지 않는다. 따라서 동소 이식은 동종 이식편 모델의 황금 표준이 되었습니다.
마우스 동종 동종 이식편은 몇 가지 장점을 가지고 있습니다: 비용 효율적이고, 비교적 간단한 절차로 생성될 수 있으며, 알려진 분자 구성을 갖는 모델뿐만 아니라 재현 가능하고 예측 가능한 종양 진행 및 표현형을 초래합니다. 실제로, 환자 유래 이종이식 모델은 인간 PDAC 세포의 행동을 정확하게 나타내지만, 이식 거부를 피하기 위해 면역결핍 마우스에 이식해야 하는 필요성은 종양-면역 및 종양-기질 상호작용의 분석을 제한하여 연구자들이 이러한 종양의 복잡성에 대한 부분적인 이미지만 캡처할 수 있도록 합니다. PDAC의 Syngeneic orthotopic 동종이식편은 유전자 조작 마우스 모델(GEMM)과 비교하여 이와 관련하여 이점을 가지고 있습니다. GEMM은 PDAC 환자에서 관찰된 인간 PDAC 종양 형성과 이질성을 정확하게 요약합니다. 그러나 이러한 특징으로 인해 GEMM 종양은 유전적 구성, 종양 진행, 공격성, 조직학적 분화 및 TME 구성에서 높은 차이를 보일 수 있습니다. 이는 특정 연구에서는 이점이 될 수 있지만, 유전자형 대 표현형 연구와 PDAC 표현형에 대한 집중 연구를 제한한다13. 따라서, 마우스 동종 동종 이식편은 생체 내에서 종양-숙주 및 치료 연구를 수행하기 위한 좋은 트레이드오프 및 모델을 구성한다. 이 논문은 쥐 PDAC 세포를 마우스 췌장으로 이식하는 동소 실험을 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
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Protocol
동물 실험은 뮌헨 공과 대학과 Regierung von Oberbayern의 지방 당국의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 수속 전에 고려해야 할 사항
- 동물 실험을 시작하기 전에 지역 당국의 동물 프로토콜 및 직원의 승인을 확인하십시오.
- 수신자 마우스를 선택합니다.
- 이식을 위해 비슷한 연령의 마우스를 선택하십시오(2개월에서 4개월 사이의 연령 범위를 가진 C57Bl/6J 수용자 마우스).
- 수용자 동물의 성별 및 유전적 배경이 이식에 사용된 세포주가 유래한 동물의 성별 및 유전적 배경과 일치하는지 확인합니다(동종 동종이식편).
- 이식을 위해 마우스를 준비하십시오.
알림: 지역 동물 시설의 위생 기준에 따라 마우스를 다루십시오.- 이식 당일에는 마취제 투여로 인한 합병증을 피하기 위해 시술 4 시간 전에 마우스를 먹이지 마십시오.
- 필요한 마취제의 양을 계산하기 위해 이식하기 전에 마우스의 무게를 잰다.
- 마우스를 수술실로 옮깁니다.
- PDAC 세포주를 선택합니다.
- 세포주가 유래된 마우스의 유전적 배경 및 성별이 수용자 마우스의 배경 및 성별과 일치하는지 확인하십시오(예: PDAC 세포주 PDAC 1-3은 이전에 설명한 바와 같이 실험실의 C57Bl/6J 배경에서 PDAC GEMM에서 이전에 생성된 PDAC14: PDAC 1 및 2: PTF1A크레/+; LSL-크라스G12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: PTF1aCre/+; LSL-크라스G12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H)입니다.
- 잠재적으로 면역원성인 단백질을 발현하지 않는 세포주를 선택합니다.
- PDAC 세포주를 배양합니다.
참고: 층류 후드 아래에서 세포 배양 작업을 수행합니다. 작업하기 전에 장갑, 작업 공간 및 재료를 소독하십시오.- 펠렛을 5mL의 세포 배양 배지에 재현탁하여 이식 1주일 전에 세포를 해동합니다. 세포를 스핀 다운하고, 상층액을 흡인하고, 펠릿을 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁하고, 세포를 다시 스핀 다운합니다. 상층액을 제거하고 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 0.1% 페니실린-스트렙토마이신(PS)이 포함된 5mL의 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 25cm² 플라스크에 옮깁니다.
- 이식 전에 적어도 한 번 세포주를 계대시킵니다.
- 세포 배지를 제거하고, PBS로 1x 세척하고, 0.5 mL의 트립신을 첨가하여 플라스크로부터 세포를 분리한다. 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 세포를 배양합니다(세포주에 따라 다르지만 일반적으로 5-10분 소요). 세포가 분리되면 10% FBS 및 0.1% PS가 포함된 10mL의 DMEM에 세포를 재현탁하고 세포 현탁액을 75cm² 플라스크로 옮깁니다.
참고: FBS는 트립신을 비활성화하기 때문에 트립신 처리를 방해합니다.
- 세포 배지를 제거하고, PBS로 1x 세척하고, 0.5 mL의 트립신을 첨가하여 플라스크로부터 세포를 분리한다. 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 세포를 배양합니다(세포주에 따라 다르지만 일반적으로 5-10분 소요). 세포가 분리되면 10% FBS 및 0.1% PS가 포함된 10mL의 DMEM에 세포를 재현탁하고 세포 현탁액을 75cm² 플라스크로 옮깁니다.
- 이식 당일 ~70%-80%의 밀도를 보장합니다.
- 이식에 필요한 재료
- 모든 수술 기구를 오토클레이브합니다.
- 동물 실험 허가증에 따라 마취제를 준비하십시오.
- 항염증제를 가진 오래 지속되는 항염증제로 적어도 5 분 전에 진통제를 위해 meloxicam을 사용하십시오.
- 수술의 경우 진통 진정을 위해 미다졸람, 메데토미딘 및 펜타닐(MMF)의 조합을 사용하십시오.
- 이식 후 MMF 진통제를 길항하기 위해 아티파메졸, 플루마제닐 및 날록손(AFN)의 조합을 사용하십시오.
- 멸균 드레이프, 가열 매트, 면도기, 장갑, 아이 크림, 0.9% 염화나트륨, 요오드 또는 클로르헥시딘 기반 수술용 스크럽, 80% 에탄올, 수용성 봉합사, 상처 클립, 50μL 주사기 및 테이프를 준비합니다.
2. 이식 전 세포주 준비
참고: 마우스가 이식할 준비가 되었을 때만 종양 세포를 준비합니다. 세포의 수확 또는 수집과 이식 사이의 짧은 시간 프레임을 보장하십시오.
- 사용하기 전에 모든 액체를 37°C로 데우십시오.
- 세포가 플라스크로부터 분리될 때까지 단계 1.5.2.1에 기재된 바와 같이 1x T75 (75cm2 배양 플라스크)로부터 시작하여 세포를 준비한다. 10% FBS 및 0.1% PS를 사용하여 10mL의 DMEM에 세포를 재현탁하고 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 원심분리기에서 200 × g 의 속도로 5분 동안 세포를 회전시킵니다. 상층액을 흡인하고 주입을 위해 필요한 세포의 최종 농도를 기준으로 첨가제 없이 적절한 부피의 DMEM으로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 10 μL의 세포 현탁액을 사용하여 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 수를 계산하고 사용 가능한 세포 수를 계산합니다.
- 첨가제 없이 DMEM에서 주입에 필요한 최종 세포 수(예: 20μL에서 2,500개 세포)로 세포를 희석합니다. 희석된 세포 현탁액 1mL를 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세포가 응집되는 것을 방지하기 위해 이식할 때까지 회전자에 튜브를 놓습니다.
3. PDAC 세포의 동소 이식
참고: 수술 경험이 충분하지 않은 경우 먼저 시체로 연습하고 예를 들어 동물 훈련 프로토콜 내에서 적절한 훈련을 받으십시오. 수술 및 동물 실험을 수행하는 직원은 해당 기관의 기준과 기관 지침을 충족해야 합니다.
- 멜록시캄을 수술 전후 진통제로 사용하고 5mg/kg 체중을 피하 투여합니다.
- 각 마우스의 체중에 따라 MMF를 복강주사한다(미다졸람[5.0mg/kg], 메데토미딘[0.5mg/kg], 펜타닐[0.05mg/kg]).
- 마우스를 케이지에 10-15분 동안 다시 넣습니다.
- 마우스가 잠 들어있을 때 아이 크림을 바릅니다.
- 페달 인출 반사(양쪽 뒷발의 발 패드를 꼬집음)를 테스트하여 10분 후에 충분한 진통 작용을 확인하십시오. 반응이 있는 경우 원래 진통제 용량의 1/3을 적용하십시오. 10 분 후, 절차를 반복하고 페달 인출 반사가없는 경우에만 진행하십시오.
- 마우스의 왼쪽 측면 복부를 면도하십시오. 멸균 가열 매트 위에 마우스를 오른쪽에 놓고 다리를 표면에 테이프로 붙입니다. 요오드 또는 클로르헥시딘 기반 외과 용 스크럽을 사용하여 복부를 소독 한 다음 80 % 에탄올을 원을 그리며 세 번 반복하십시오. 수술 부위의 무균 상태를 유지하려면 수술 용 드레이프를 사용하십시오.
- 새 장갑을 착용하고 소독하십시오. 수술용 가위를 사용하여 비장이 돌출된 왼쪽 옆구리의 피부와 피하 지방 조직을 세로로 자릅니다. 약 1cm 길이의 절단을 수행하십시오.
- 가위와 집게를 사용하여 복막에서 피부를 분리하여 복막에 쉽게 접근 할 수 있습니다.
- 가위를 바꾸십시오. 1cm 세로 절단으로 비장 위치에서 복막을 엽니 다.
- 뭉툭하고 끝이 가는 집게를 사용하여 비장과 부착된 췌장을 동원합니다. 장기가 다른 조직에 부착되어 있지 않은지 확인하고 췌장을 다룰 때 혈관이나 주변 조직이 손상되지 않도록 혈관 공급을 확인하십시오.
참고: 출혈을 방지하기 위해 비장을 직접 잡지 마십시오. - 절개 부위에서 췌장을 조심스럽게 당겨 장기의 꼬리에 쉽게 접근할 수 있도록 하고 췌장을 따라 비장을 관찰합니다. 비 지배적 인 손을 사용하여 집게로 췌장을 잡고 췌장이 체외로 변하는 것을 막는 인대를 조심스럽게 자릅니다. 주사하는 동안 장기가 접히지 않고 장기의 캡슐이 엎질러지지 않도록 바늘 삽입 부위에 장력을 가하고 있는지 확인하십시오.
- 주로 사용하는 손을 사용하여 주사를 수행하십시오. 장기의 세로축을 따라 주사기의 바늘로 장기의 캡슐을 조심스럽게 관통하십시오. 눈에 보이는 혈관 사이에 췌장 조직 조각을 조준하여 혈관에 구멍을 뚫거나 주사할 위험을 최소화합니다. 실험 계획에 따라 적절한 수의 세포(여기서는 DMEM 20μL에 2,500개 세포)를 27G 캐뉼라와 50μL 주사기로 췌장의 꼬리 부분에 천천히 주입합니다.
참고: 조직에 성공적으로 주입되면 투명한 기포가 형성됩니다. - 종양 세포가 엎질러지지 않도록 췌장과 삽입된 주사기를 약 1분 동안 그대로 두십시오. 주사 부위에서 바늘을 조심스럽게 제거하십시오.
참고: 마우스 사이에 바늘을 교체하고 새 세포주 주입을 위해 새 멸균 주사기를 사용합니다. - 복부 내부의 장기를 조심스럽게 재배치하십시오. 세포가 쏟아지지 않도록 조직을 손상시키지 않도록주의하십시오. 장기 유착을 피하기 위해 1% 염화나트륨 0.9mL를 장기에 붓습니다.
- 간단한 중단 봉합 기술을 사용하여 복막을 조심스럽게 봉합하고 2-3 개의 9mm 스테인리스 스틸 상처 클립을 사용하여 피부를 닫습니다.
참고: 수술 절개 부위가 치유된 경우 이식 후 7일 후에 상처 클립을 제거합니다. - 필요한 경우 0.5mL의 염화나트륨을 피하 주사하여 시술 및 마취로 인한 동물의 탈수를 방지한다.
- 이식 후 마우스의 체중에 따라 AFN(아티파메졸[2.5mg/kg], 플루마제닐[0.5mg/kg], 날록손[1.2mg/kg])을 피하 주사하여 MMF에 의한 진통 완화를 길항합니다.
- 마우스가 깨어나고 완전히 활성화될 때까지 37°C로 가열된 챔버에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 마우스를 원래 케이지에 다시 넣습니다. 털, 피부색 및 활동을 확인하여 마우스의 건강 상태를 모니터링하고 수술 후 3-4 시간 동안 반복합니다.
4. 생쥐 사후 관리
- 동물 시설로 돌아왔을 때 생쥐에게 물과 음식에 접근할 수 있도록 하십시오.
- 수술 후 2-3일 동안 6-12시간마다 멜록시캄(5mg/kg)을 피하 또는 경구 도포를 계속합니다.
- 동물 프로토콜 및 기관 지침에 따라 정기적으로 마우스의 건강 상태를 모니터링합니다.
- 실험의 목표에 따라 매주 또는 촉진, 초음파 영상, 생체발광(BLI) 또는 자기공명영상(MRI)을 통해 종양 성장을 더 자주 모니터링합니다.
참고: 선택한 방법, 성장 속도 및 이식된 세포 수에 따라 주사 후 빠르면 1주일 이내에 종양을 감지할 수 있습니다.
5. 종양 이식편 채취
- 실험이 끝날 때 또는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 또는 동물 실험 허가의 기준에 따라 마우스를 안락사시켜야 할 때 종양을 채취합니다.
- 동물 실험 허가증에서 허용하는 방법을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
알림: 허혈 시간을 최소화하기 위해 최소한의 시간 손실로 단계를 수행하십시오. 따라서 자궁 경부 탈구는 말기 출혈이나 화학적 방법과 달리 빠른 방법이며 사망 시간을 정확하게 결정할 수 있으므로 권장됩니다. - 마우스를 멸균 매트 위에 놓고 다리를 표면에 테이프로 붙입니다. 80 % 에탄올을 사용하여 복부를 소독하십시오.
- 새 장갑을 착용하고 소독하십시오. 수술 용 가위를 사용하여 중앙 복부의 피부를 세로로 자릅니다.
- 가위와 집게를 사용하여 복막에서 피부를 분리하여 복막에 쉽게 접근 할 수 있습니다.
- 가위를 바꾸십시오. 중앙 복부에서 복막을 5cm 세로 절단하여 엽니 다.
- 뭉툭하고 끝이 가는 집게를 사용하여 비장과 부착된 췌장을 동원합니다. 집게와 수술 용 가위를 사용하여 주변 조직에서 종양을 조심스럽게 분리하십시오.
- 종양 조직을 다운스트림 실험에 적합한 배지에 보관합니다. 조직을 즉시 처리하거나 필요한 경우 추가 처리가 이루어질 때까지 샘플을 4°C에서 최대 6시간 동안 유지합니다.
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Representative Results
대규모 약물 반응 연구의 맥락에서, 우리는 그림 1의 주요 단계에 예시된 전술한 프로토콜을 사용하여 170마리 이상의 마우스(C75Bl6/J 수용자 마우스, 주입된 PDAC 세포주에 일치하는 수컷 및 암컷 마우스)를 성공적으로 이식했습니다. 이 프로토콜에서 우리는 3개의 KrasG12D 구동 PDAC 세포주(PDAC 1 및 2: Ptf1aCre/+; LSL-크라스G12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: PTF1aCre/+; LSL-크라스G12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), 이전에 실험실에서 생성되었습니다. PDAC 세포의 생착은 주입된 세포 수와 접종된 세포주의 공격성 및 성장 특성에 따라 수술 후 약 7일 후에 가장 빨리 복부에서 촉진될 수 있습니다. 마우스 복부의 MRI(도 2A), 초음파 및 BLI는 종양 부피의 정량적 측정에 사용될 수 있다. 종양 세포-세포주의 내재적 특징에 따라, 생성된 이식된 마우스의 생존율은 변할 수 있다 (도 2B). 성공적인 췌장 주사는 마우스 췌장에서 본격적인 종양을 유발합니다(그림 2C,D). 대조적으로, 실패한 이식은 a) 생존할 수 없는 세포의 주입, b) 이식된 세포의 거부(예를 들어, 세포가 수용자 마우스와 동족적이지 않은 경우), 또는 c) 주입된 세포의 수가 충분하지 않기 때문에 췌장 종양의 부재를 초래할 수 있습니다. 대안적인 음성 결과는 췌장에 원발성 종양이 없지만 주사 부위에 해당하는 복막에 종양이 존재할 수 있습니다(예: 췌장 주사 부위에서 종양 세포 현탁액의 유출을 통해).
그림 1: 프로토콜의 주요 단계를 개략적으로 표현 한 것입니다. (A) PDAC 세포는 이식 전에 적어도 한 번 계대해야 합니다. (B) 세포를 트립신 처리하여 플라스크에서 분리하고 15mL 튜브로 옮기고 계수합니다. (C) 적절한 세포 희석액을 튜브에 넣고 이식실로 가져옵니다. (D) 수혜자 마우스는 수술이 이루어질 부위에서 마취, 면도 및 소독됩니다. (E) 췌장 꼬리 위치에 해당하는 마우스 복부에 1cm 절단이 이루어집니다. (F) 원하는 수의 세포를 췌장의 꼬리에 주입합니다. 약어: PDAC = 췌관 선암종. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: syngeneic mouse orthotopic allografts에 대한 성공적인 결과의 예 . (A) 1차 마우스 PDAC 세포의 동소 이식 2주 후 마우스의 대표적인 MRI. 점선 윤곽선은 종양을 나타냅니다. 스케일 바 = 5mm. (B) 동계 면역적격 마우스의 췌장에 동소적으로 이식된 3개의 상이한 마우스 PDAC 세포주(PDAC 1-3)의 Kaplan-Meier 생존 곡선(C57Bl/6J 배경). (C) 동소 주사된 PDAC1 세포주로부터 종점에서 분리된 종양의 대표 이미지. 종양 세포와 비장의 성공적인 췌장 내 주사로 인한 췌장 종양이 모두 사진에 나와 있습니다. 스케일 바 = 5mm. (D) PDAC 1-3에서 동소로 이식된 종양의 평균 종양 중량을 나타내는 막대 그림. 점은 개별 마우스를 나타냅니다. 약어: PDAC = 췌관 선암종; MRI = 자기 공명 영상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Syngeneic mouse orthotopic 동종이식편은 비용 효율성, 재현성 및 비교적 간단한 실험 절차로 인해 전임상 연구를 위한 강력한 모델을 나타냅니다13,15. 이러한 모델은 종양-숙주 상호작용에 대한 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 1차 마우스 세포 배양이 실험에 사용될 때 종양이 유래한 종양의 유전적 이질성의 보존을 보장합니다.
이 프로토콜은 마우스 PDAC 세포 배양물을 췌장에 동소 이식하기 위한 간단하고 빠른 절차를 제시합니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 수술 기술의 품질을 포함하여 몇 가지 기술적 고려 사항을 염두에 두어야 합니다. 외과 수술 관행이 다양하기 때문에 한 사람이 동일한 실험 내에서 모든 동소 주사를 수행하는 것이 좋습니다.
췌장에 세포를 주입하는 것은 신중히 수행해야합니다. 엎질러진 세포, 췌장을 뚫거나 조직을 손상시키면 세포가 췌장 외부의 다른 장기 부위에 생착될 수 있습니다. 이것은 원발성 종양의 임상 평가(예: 크기 및 국소 침윤)와 국소 및 원격 전이성 확산을 복잡하게 만들 수 있습니다. 따라서 이식된 각 마우스의 기포 형성 및 세포 유출에 대한 정보를 문서화하고 평가하는 것이 좋습니다. 피부와 복막의 절개는 상처를 가능한 한 작게 유지하면서 췌장에 최적으로 접근할 수 있도록 적절한 크기로 이루어져야 합니다.
이식된 세포의 수는 실험 계획에 따라 조정될 수 있습니다. 이식된 세포의 수가 많을수록 생리학적으로 빠르게 성장하는 종양과 임상 증상의 빠른 진행이 발생하지만, 세포 수가 적을수록 종양이 생착하지 않을 위험이 높아집니다. 또한, 더 큰 부피(>20 μL)가 낭성 코어(13)의 형성 가능성 증가와 연관되기 때문에 소량의 세포 현탁액이 권장된다. 우리는 2,500-5,000개의 세포를 20μL의 세포 배양 배지에 이식하는 것이 여러 주에 걸쳐 종양 성장을 보장함으로써 전임상 치료 연구에 최적의 양임을 발견했습니다. 그러나 다른 응용 분야의 경우 최대 1.6 × 106 세포를 이식 할 수 있습니다.
세포 배양 배지 이외에도, 매트리겔은 PDAC 세포를 재현탁시키는 영양이 풍부한 배지로서 사용될 수 있으며, 이는 또한 주입 용액의 점도를 증가시켜 종양 세포의 누출을 방지한다(13). 췌장의 꼬리 영역에 주사하는 것은 췌장 꼬리에 쉽게 접근할 수 있고 췌장 머리에 대한 접근이 제한되기 때문에 이 프로토콜에서 선호됩니다. 췌장 머리에 세포를 성공적으로 주입하기 위한 프로토콜은 다른 곳에 설명되어 있습니다13,15. 수술 절차를 수행하기 위해 마우스는 미다졸람, 메데토미딘, 펜타닐을 포함한 약물 조합과 수술 전후 진통제인 멜록시캄을 사용하여 진통 상태를 유지합니다. 대안적으로, 적절한 진통제와 함께 이소플루란을 일정한 흐름 하에서 흡입 마취로 사용할 수 있습니다. 동물 면허에 대한 진통 제거 방법의 선택은 기관 지침과 해당 지방 당국에 따라 다릅니다.
세포주와 수용자 마우스를 신중하게 선택하는 것이 필수적입니다. 실제로, 수용자 마우스의 유전적 배경이 PDAC 세포의 면역원성 및 이식편 거부반응을 피하기 위해 선택된 세포주의 유전적 배경과 일치하는지 확인하는 것이 중요하다. 또한, 이식된 종양 세포에 의해 발현되는 형광 리포터 대립유전자 또는 Cas9와 같은 면역원성 외인성 단백질은 숙주의 반응에 영향을 미치고 면역원성 반응을 유발할 수 있습니다. 따라서 종양 성장과 TME의 구성이 영향을 받아 편향을 유발할 수 있습니다.
GEMM과 비교하여, syngeneic orthotopic 마우스 동종 이식편은 감소된 양의 desmoplasia를 보여주고, 일부 경우에는 전이성 파종 속도가 더 낮아 부분적으로 인간 종양과의 유사성을 제한합니다. 또한 외과 적 개입의 필요성으로 인해 절차의 복잡성이 증가합니다. 생존 불가능한 세포 주입, 이식된 세포의 거부, 주입된 세포의 적은 수 및 주입 누출로 인해 원하는 위치에 췌장 종양이 없는 이식 실패는 실험 절차의 완료를 방해할 수 있습니다.
이러한 한계에도 불구하고 PDAC의 동종 동소 마우스 동종이식 모델은 PDAC 및 그 이질성을 연구하는 많은 문제를 효과적으로 해결하는 것으로 나타났습니다. 재현성이 높은 표현형과 종양 성장 패턴, 종양-TME 상호작용을 통해 비교적 간단한 프로토콜에 따라 빠르게 얻을 수 있는 귀중한 자원입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우수한 기술 지원을 해주신 TUM 동물 시설과 핵의학과의 이미징 핵심 시설인 Klinikum rechts der Isar에 감사드립니다. 이 연구는 독일 암 컨소시엄(DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 및 S01)에서 D.S., Wilhelm Sander-Stiftung(2020.174.1 및 2017.091.2)에서 D.S.로, 유럽 연구 위원회(ERC CoG No. 648521, D.S.로).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
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- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
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