Summary
Gli allotrapianti ortotopici singeneici di topo dell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) ricapitolano la biologia, i fenotipi e le risposte terapeutiche dei sottotipi di malattia. Grazie alla loro progressione tumorale rapida e riproducibile, sono ampiamente utilizzati negli studi preclinici. Qui, mostriamo pratiche comuni per generare questi modelli, iniettando colture di PDAC murino singeneico nel pancreas.
Abstract
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una malattia molto complessa caratterizzata da un microambiente tumorale eterogeneo costituito da uno stroma diversificato, cellule immunitarie, vasi, nervi e componenti della matrice extracellulare. Nel corso degli anni, sono stati sviluppati diversi modelli murini di PDAC per affrontare le sfide poste dalla sua progressione, dal potenziale metastatico e dall'eterogeneità fenotipica. Gli allotrapianti ortotopici immunocompetenti di PDAC hanno mostrato buone promesse grazie alla loro progressione tumorale rapida e riproducibile rispetto ai modelli murini geneticamente modificati. Inoltre, combinati con la loro capacità di imitare le caratteristiche biologiche osservate nel PDAC autoctono, i modelli murini di allotrapianto ortotopico basati su linee cellulari consentono esperimenti in vivo su larga scala. Pertanto, questi modelli sono ampiamente utilizzati negli studi preclinici per analisi rapide genotipo-fenotipo e farmaco-risposta. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un approccio riproducibile e robusto per iniettare con successo colture cellulari primarie di PDAC di topo nel pancreas di topi riceventi singeneici. Oltre ai dettagli tecnici, vengono fornite informazioni importanti che devono essere considerate prima di eseguire questi esperimenti.
Introduction
Recentemente, il PDAC è diventato la terza causa di decessi correlati al cancro nel mondo occidentale1. Provoca il più alto tasso di mortalità tra tutti i tumori e un tasso di sopravvivenza globale a 10 anni di ~ 1%, che non è cambiato per decenni2. A causa della mancanza di progressi nel trattamento del PDAC, questa malattia dovrebbe diventare la seconda causa di decessi correlati al cancro entro il prossimo decennio3.
I tumori PDAC sono entità complesse caratterizzate da un diverso microambiente tumorale (TME) composto da un assemblaggio eterogeneo di componenti della matrice stroma, vascolare, immunitaria ed extracellulare4. Le differenze nella composizione della TME influenzano la prognosi della malattia e la risposta alla terapia 4,5,6. Infatti, molti studi hanno dimostrato che il sottotipo basale mesenchimale del PDAC è associato ad una TME altamente immunosoppressiva e mostra una diminuzione della sopravvivenza e della mancanza di risposta alle terapie 7,8,9,10,11,12. Pertanto, una comprensione più profonda delle differenze nella composizione della TME e di come queste caratteristiche influenzano la biologia dei tumori rimane un fattore importante per lo sviluppo di terapie molecolarmente precise. Per comprendere meglio la biologia alla base di questo complesso fenotipo e identificare strategie terapeutiche in grado di superare la barriera che la TME del PDAC costituisce, i modelli in vivo sono indispensabili.
Un aspetto chiave per qualsiasi sistema modello preclinico di cancro è che dovrebbe imitare i fenotipi umani, ricapitolando sia l'eterogeneità genetica che l'ambiente che incorpora la moltitudine di popolazioni stromali e immunitarie che compongono la TME. Pertanto, quando si scelgono modelli murini per la ricerca preclinica, devono essere presi in considerazione diversi aspetti. Per studiare l'interazione tumore-immune, linee cellulari tumorali istocompatibili possono essere iniettate in topi immunocompetenti singeneici. Nella maggior parte dei casi, questi vengono iniettati per via sottocutanea nel fianco del topo, consentendo un facile monitoraggio del tumore mediante palpazione o ispezione visiva. Tuttavia, i modelli risultanti non imitano la crescita delle cellule tumorali nel loro organo di origine. Pertanto, i trapianti ortotopici sono diventati il gold standard per i modelli di allotrapianto.
Gli allotrapianti ortotopici di topo hanno diversi vantaggi: sono economici, possono essere generati con una procedura relativamente semplice e si traducono in modelli con composizione molecolare nota, nonché una progressione e un fenotipo del tumore riproducibili e prevedibili. Infatti, mentre i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente rappresentano accuratamente il comportamento delle cellule PDAC umane, la necessità di impianto in topi immunodeficienti per evitare il rigetto del trapianto limita l'analisi delle interazioni tumore-immune e tumore-stroma, consentendo ai ricercatori di catturare solo un'immagine parziale della complessità di questi tumori. Gli allotrapianti ortotopici singeneici di PDAC hanno un vantaggio in questo senso anche rispetto ai modelli murini geneticamente modificati (GEMM). I GEMM ricapitolano accuratamente la tumorigenesi PDAC umana e l'eterogeneità osservata nei pazienti PDAC. Tuttavia, a causa di queste caratteristiche, i tumori GEMM possono mostrare un'elevata varianza nel loro corredo genetico, progressione tumorale, aggressività, differenziazione istologica e composizione TME. Mentre questo può essere un vantaggio in alcuni studi, limita gli studi genotipo-fenotipo e l'indagine mirata dei fenotipi PDAC13. Pertanto, gli allotrapianti ortotopici di topo costituiscono un buon compromesso e modello per eseguire studi sull'ospite tumorale e sul trattamento in vivo. Questo documento delinea un protocollo per esperimenti di trapianto ortotopico di cellule PDAC murine nel pancreas del topo.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) delle autorità locali dell'Università tecnica di Monaco e della Regierung von Oberbayern.
1. Informazioni da prendere in considerazione prima della procedura
- Garantire l'approvazione del protocollo animale e del personale da parte delle autorità locali prima di iniziare qualsiasi sperimentazione animale.
- Selezionare i mouse destinatari.
- Selezionare topi di età simile per l'impianto (topi riceventi C57Bl/6J con una fascia di età compresa tra 2 mesi e 4 mesi).
- Assicurarsi che il sesso e il background genetico degli animali riceventi corrispondano al sesso e al background genetico degli animali da cui ha avuto origine la linea cellulare utilizzata per l'impianto (allotrapianti singeneici).
- Preparare i topi per l'impianto.
NOTA: Maneggiare i topi secondo gli standard igienici della struttura locale per animali.- Il giorno dell'impianto, non nutrire i topi 4 ore prima della procedura per evitare complicazioni dovute alla somministrazione di anestetici.
- Pesare i topi prima dell'impianto per calcolare la quantità di anestetici necessari.
- Trasferire i topi in sala operatoria.
- Selezionare le linee di celle PDAC.
- Assicurarsi che il background genetico e il sesso dei topi da cui derivano le linee cellulari corrispondano al background e al sesso dei topi riceventi (ad esempio, le linee cellulari PDAC PDAC 1-3 precedentemente generate da GEMM PDAC su uno sfondo C57Bl/6J in laboratorio con i seguenti genotipi, come descritto in precedenza14: PDAC 1 e 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H).
- Selezionare le linee cellulari che non esprimono proteine potenzialmente immunogeniche.
- Coltura delle linee cellulari PDAC.
NOTA: Eseguire il lavoro di coltura cellulare sotto una cappa a flusso laminare. Disinfettare i guanti, lo spazio di lavoro e i materiali prima di lavorare.- Scongelare le cellule 1 settimana prima dell'impianto risospendendo il pellet in 5 ml di terreno di coltura cellulare. Ruotare le cellule, aspirare il surnatante, risospendere il pellet in 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e ruotare nuovamente le cellule. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e lo 0,1% di penicillina-streptomicina (PS). Trasferire la sospensione cellulare in un matraccio di 25 cm².
- Far passare le linee cellulari almeno una volta prima dell'impianto.
- Rimuovere il mezzo cellulare, lavare 1 volta con PBS e aggiungere 0,5 ml di tripsina per staccare le cellule dal pallone. Incubare le cellule a 37 °C fino a quando non si staccano dal matraccio (a seconda della linea cellulare, questo richiede di solito 5-10 minuti). Quando le cellule sono staccate, risospendere le cellule in 10 ml di DMEM con FBS al 10% e PS allo 0,1% e trasferire la sospensione cellulare in un matraccio di 75 cm².
NOTA: poiché FBS inattiva la tripsina, ostacolerebbe la tripsinizzazione.
- Rimuovere il mezzo cellulare, lavare 1 volta con PBS e aggiungere 0,5 ml di tripsina per staccare le cellule dal pallone. Incubare le cellule a 37 °C fino a quando non si staccano dal matraccio (a seconda della linea cellulare, questo richiede di solito 5-10 minuti). Quando le cellule sono staccate, risospendere le cellule in 10 ml di DMEM con FBS al 10% e PS allo 0,1% e trasferire la sospensione cellulare in un matraccio di 75 cm².
- Garantire la confluenza di ~ 70% -80% il giorno dell'impianto.
- Materiale necessario per l'impianto
- Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici.
- Tieni pronti gli anestetici in base alla licenza di sperimentazione animale.
- Utilizzare meloxicam per l'analgesia con almeno 5 minuti di anticipo come analgetico di lunga durata con proprietà antinfiammatorie.
- Per la chirurgia, utilizzare una combinazione di midazolam, medetomidina e fentanil (MMF) per l'analgosedazione.
- Utilizzare una combinazione di atipamezolo, flumazenil e naloxone (AFN) per antagonizzare l'analgosedazione MMF dopo l'impianto.
- Preparare un drappeggio sterile, un tappetino riscaldante, un rasoio, guanti, crema per gli occhi, scrub chirurgico a base di cloruro di sodio allo 0,9%, iodio o clorexidina, etanolo all'80%, sutura solubile, clip per ferite, una siringa per volume di iniezione da 50 μL e nastro adesivo.
2. Preparazione delle linee cellulari prima dell'impianto
NOTA: Preparare le cellule tumorali solo quando i topi sono pronti per l'impianto. Garantire un breve lasso di tempo tra la raccolta o la raccolta delle cellule e l'impianto.
- Riscaldare tutti i liquidi a 37 °C prima dell'uso.
- Preparare le cellule (a partire da 1x T75 (un matraccio di coltura di 75 cm 2) come descritto al punto 1.5.2.1 fino a quando non si staccano dal pallone. Risospendere le cellule in 10 mL di DMEM con FBS al 10% e PS allo 0,1% e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml.
- Centrifugare le cellule a 200 × g per 5 minuti in una centrifuga. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un volume adeguato di DMEM senza additivi in base alla concentrazione finale richiesta delle cellule per l'iniezione. Utilizzare 10 μL della sospensione cellulare per contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer e calcolare il numero di celle disponibili.
- Diluire le cellule fino al numero finale richiesto di cellule iniettabili (ad esempio, 2.500 cellule in 20 μL) in DMEM senza additivi. Trasferire 1 mL della sospensione cellulare diluita in un tubo da 1,5 mL. Posizionare il tubo su un rotatore fino all'impianto per evitare che le cellule si aggreghino.
3. Impianto ortotopico di cellule PDAC
NOTA: In caso di insufficiente esperienza chirurgica, praticare prima con i cadaveri e ottenere una formazione adeguata, ad esempio, all'interno di un protocollo di addestramento degli animali. Il personale che esegue l'intervento chirurgico e gli esperimenti sugli animali deve soddisfare i criteri delle rispettive autorità e le linee guida istituzionali.
- Utilizzare meloxicam come analgesico perioperatorio e applicare 5 mg/kg di peso corporeo per via sottocutanea.
- Iniettare MMF per via intraperitoneale in base al peso corporeo di ciascun topo (midazolam [5,0 mg/kg], medetomidin [0,5 mg/kg] e fentanil [0,05 mg/kg]).
- Rimetti il mouse nella gabbia per 10-15 minuti.
- Applicare la crema per gli occhi quando il mouse dorme.
- Controllare un'analgosedazione sufficiente dopo 10 minuti testando il riflesso di ritiro del pedale (pizzicare sui cuscinetti dei piedi di entrambi i piedi posteriori). In caso di risposta, applicare 1/3 della dose originale di analgosedazione. Dopo 10 minuti, ripetere la procedura e procedere solo in assenza di un riflesso di ritiro del pedale.
- Radere il fianco addominale laterale sinistro del topo. Posizionare il mouse sdraiato sul lato destro su un tappetino riscaldante sterile e fissare le gambe alla superficie. Disinfettare l'addome utilizzando uno scrub chirurgico a base di iodio o clorexidina seguito da etanolo all'80% con un movimento circolare e ripetere la procedura tre volte. Per mantenere la sterilità del campo chirurgico, utilizzare un drappeggio chirurgico.
- Indossare guanti nuovi e disinfettarli. Utilizzare forbici chirurgiche per tagliare la pelle e il tessuto adiposo sottocutaneo longitudinalmente sul fianco sinistro dove viene proiettata la milza. Eseguire un taglio di circa 1 cm di lunghezza.
- Usando forbici e pinze, separare la pelle dal peritoneo per ottenere un accesso più facile al peritoneo.
- Cambia il paio di forbici. Apri il peritoneo nella posizione della milza con un taglio longitudinale di 1 cm.
- Mobilitare la milza e il pancreas attaccato usando una pinza smussata e a punta fine. Assicurarsi che gli organi non siano attaccati ad altri tessuti e controllare la fornitura di vasi sanguigni per evitare di ferire i vasi o il tessuto circostante quando si maneggia il pancreas.
NOTA: Non afferrare direttamente la milza per prevenire il sanguinamento. - Estrarre con attenzione il pancreas dall'incisione per consentire un accesso più facile alla coda dell'organo e osservare la milza che segue il pancreas. Utilizzare la mano non dominante per afferrare il pancreas con una pinza e tagliare con cura i legamenti che impediscono al pancreas di extracorporalizzarsi. Assicurarsi che l'organo non sia piegato durante l'iniezione e che la capsula dell'organo sia tenuta sotto tensione nel sito di penetrazione dell'ago per evitare fuoriuscite.
- Usi la mano dominante per effettuare l'iniezione. Penetrare con cautela nella capsula dell'organo con l'ago della siringa seguendo l'asse longitudinale dell'organo. Mirare a un pezzo di tessuto pancreatico tra i vasi sanguigni visibili per ridurre al minimo il rischio di perforazione o iniezione in un vaso. Iniettare lentamente un numero adeguato di cellule secondo il piano sperimentale (qui, 2.500 cellule in 20 μL di DMEM) con una cannula da 27 G e una siringa da 50 μL nella zona della coda del pancreas.
NOTA: Una bolla trasparente si forma dopo l'iniezione riuscita nel tessuto. - Tenere il pancreas e la siringa inserita ferma per circa 1 minuto per evitare la fuoriuscita delle cellule tumorali. Rimuovere con cautela l'ago dal sito di iniezione.
NOTA: Cambiare gli aghi tra i topi e utilizzare una nuova siringa sterile per l'iniezione di una nuova linea cellulare. - Riorganizzare attentamente gli organi all'interno dell'addome. Fare attenzione a non ferire il tessuto per evitare la fuoriuscita delle cellule. Versare 1 mL di cloruro di sodio allo 0,9% sugli organi per evitare l'adesione degli organi.
- Suturare accuratamente il peritoneo utilizzando la semplice tecnica di sutura interrotta e chiudere la pelle utilizzando da due a tre clip avvolte in acciaio inossidabile da 9 mm.
NOTA: Rimuovere le clip della ferita 7 giorni dopo l'impianto se l'incisione chirurgica è guarita. - Se necessario, prevenire la disidratazione degli animali dovuta alla procedura e all'anestesia iniettando 0,5 ml di cloruro di sodio per via sottocutanea.
- Dopo l'impianto, antagonizzare l'analgosedazione mediante MMF con un'iniezione sottocutanea di AFN (atipamezolo [2,5 mg/kg], flumazenil [0,5 mg/kg], naloxon [1,2 mg/kg]), in base al peso corporeo del topo.
- Porre il mouse in una camera riscaldata a 37 °C fino a quando non è sveglio e completamente attivo. Quindi, rimetti il mouse nella sua gabbia originale. Monitorare lo stato di salute del topo controllando la pelliccia, il colore della pelle e l'attività e ripetere questo 3-4 ore dopo l'intervento chirurgico.
4. Assistenza post-vendita per i topi
- Dare ai topi l'accesso all'acqua e al cibo quando tornano nella struttura per animali.
- Continuare l'applicazione sottocutanea o orale di meloxicam (5 mg/kg) ogni 6-12 ore per 2-3 giorni dopo l'intervento.
- Monitorare regolarmente lo stato di salute dei topi secondo il protocollo animale e le linee guida istituzionali.
- A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, monitorare la crescita del tumore ogni settimana o più frequentemente mediante palpazione, ecografia, bioluminescenza (BLI) o risonanza magnetica (MRI).
NOTA: In base al metodo scelto, al tasso di crescita e al numero di cellule impiantate, un tumore può essere rilevato già 1 settimana dopo l'iniezione.
5. Raccolta di innesti tumorali
- Raccogliere i tumori alla fine dell'esperimento o quando i topi devono essere eutanasizzati, seguendo i criteri dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali o della licenza di sperimentazione animale.
- Eutanasia del topo usando un metodo consentito dalla licenza di sperimentazione animale.
NOTA: Eseguire passaggi con una perdita di tempo minima per ridurre al minimo il tempo di ischemia. Pertanto, la dislocazione cervicale è raccomandata in quanto è un metodo rapido e il momento della morte può essere determinato esattamente, in contrasto con il sanguinamento terminale o i metodi chimici. - Posizionare il topo supino su un tappetino sterile e fissare le zampe alla superficie. Utilizzare etanolo all'80% per disinfettare l'addome.
- Indossare guanti nuovi e disinfettarli. Utilizzare forbici chirurgiche per tagliare la pelle longitudinalmente sull'addome centrale.
- Usando forbici e pinze, separare la pelle dal peritoneo per ottenere un accesso più facile al peritoneo.
- Cambia il paio di forbici. Apri il peritoneo all'addome centrale con un taglio longitudinale di 5 cm.
- Mobilitare la milza e il pancreas attaccato usando una pinza smussata e a punta fine. Staccare con cura il tumore dal tessuto circostante usando una pinza e forbici chirurgiche.
- Conservare il tessuto tumorale in un mezzo adatto per esperimenti a valle. Trattare immediatamente i tessuti o, se necessario, mantenere il campione a 4 °C per un massimo di 6 ore fino a ulteriore lavorazione.
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Representative Results
Nel contesto di uno studio di risposta farmacologica su larga scala, abbiamo impiantato con successo più di 170 topi (topi riceventi C75Bl6 / J, sesso di topi maschi e femmine abbinati alle linee cellulari PDAC iniettate) utilizzando il protocollo sopra descritto, esemplificato nelle sue fasi principali nella Figura 112. In questo protocollo, abbiamo impiantato ortotopicamente tre linee cellulari PDAC guidate da KrasG12D (PDAC 1 e 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), precedentemente generati in laboratorio. L'attecchimento delle cellule PDAC può essere palpato addominale prima a circa 7 giorni dopo l'intervento, a seconda del numero di cellule iniettate e delle caratteristiche di aggressività e crescita della linea cellulare inoculata. La risonanza magnetica (Figura 2A), l'ecografia e il BLI dell'addome del topo possono essere utilizzati per misurazioni quantitative del volume del tumore. A seconda delle caratteristiche intrinseche delle cellule tumorali delle linee cellulari, la sopravvivenza dei topi impiantati risultanti può variare (Figura 2B). Le iniezioni intrapancreatiche di successo portano a tumori conclamati nel pancreas del topo (Figura 2C, D). Al contrario, gli impianti non riusciti possono causare l'assenza di tumori pancreatici a causa di a) iniezione di cellule non vitali, b) rigetto delle cellule impiantate (ad esempio, se le cellule non erano singeneiche al topo ricevente), o c) un numero insufficiente di cellule iniettate. Esiti negativi alternativi possono portare all'assenza di un tumore primario nel pancreas, ma alla presenza di un tumore al peritoneo, corrispondente al sito di iniezione (ad esempio, attraverso la fuoriuscita della sospensione di cellule tumorali dal sito di iniezione pancreatica).
Figura 1: Rappresentazione schematica delle fasi principali del protocollo . (A) Le cellule PDAC devono essere fatte passare almeno una volta prima dell'impianto. (B) Le cellule vengono tripsinizzate per staccarle dal pallone, trasferite in un tubo da 15 ml e contate. (C) La diluizione cellulare appropriata viene posta in un tubo e portata nella stanza di impianto. (D) Il topo ricevente viene anestetizzato, rasato e disinfettato nella regione in cui avrà luogo l'intervento. (E) Viene effettuato un taglio di 1 cm all'addome del topo corrispondente alla posizione della coda del pancreas. (F) Il numero desiderato di cellule viene iniettato nella coda del pancreas. Abbreviazione: PDAC = adenocarcinoma duttale pancreatico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Esempi di risultati positivi su allotrapianti ortotopici singeneici di topo. (A) Risonanza magnetica rappresentativa di un topo 2 settimane dopo il trapianto ortotopico di cellule PDAC primarie di topo. Il contorno tratteggiato denota il tumore. Barra della scala = 5 mm. (B) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier di tre diverse linee cellulari PDAC di topo (PDAC 1-3) trapiantate ortotopicamente nel pancreas di topi immunocompetenti singeneici (background C57Bl/6J). (C) Immagine rappresentativa di un tumore isolato all'endpoint dalla linea cellulare PDAC1 iniettata ortotopicamente. Sia un tumore pancreatico derivante da un'iniezione intrapancreatica riuscita di cellule tumorali che la milza sono mostrati nella fotografia. Barra della scala = 5 mm. (D) Barplot raffigurante i pesi tumorali medi dei tumori trapiantati ortotopicamente da PDAC 1-3. I punti rappresentano singoli topi. Abbreviazioni: PDAC = adenocarcinoma duttale pancreatico; MRI = risonanza magnetica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Gli allotrapianti ortotopici singeneici di topo rappresentano un modello robusto per gli studi preclinici grazie al loro rapporto costo-efficacia, riproducibilità e procedure sperimentali relativamente semplici13,15. Questi modelli non solo consentono lo studio delle interazioni tumore-ospite, ma garantiscono anche la conservazione dell'eterogeneità genetica dei tumori da cui provengono quando le colture primarie di cellule di topo vengono utilizzate per l'esperimento.
Questo protocollo presenta una procedura semplice e veloce per l'impianto ortotopico di colture cellulari PDAC di topo nel pancreas. Per ottenere risultati riproducibili, è necessario tenere presenti diverse considerazioni tecniche, tra cui la qualità della tecnica chirurgica. Poiché le pratiche chirurgiche variano, è consigliabile che una persona esegua tutte le iniezioni ortotopiche all'interno dello stesso esperimento.
L'iniezione di cellule nel pancreas deve essere effettuata con cautela. Le cellule versate, il perforamento del pancreas o il danneggiamento del tessuto possono causare l'attecchimento delle cellule in altri siti di organi al di fuori del pancreas. Ciò potrebbe complicare la valutazione clinica (ad esempio, dimensioni e infiltrazione locale) del tumore primario, così come la sua diffusione metastatica locale e a distanza. Pertanto, si raccomanda di documentare e valutare la formazione di bolle e qualsiasi informazione sulla fuoriuscita di cellule per ciascun topo impiantato. I tagli nella pelle e nel peritoneo devono essere fatti ad una dimensione appropriata per consentire un accesso ottimale al pancreas mantenendo le ferite il più piccole possibile.
Il numero di cellule impiantate può essere regolato a seconda del piano sperimentale. Mentre un numero maggiore di cellule impiantate porta a tumori a crescita fisiologicamente rapida e a una rapida progressione dei sintomi clinici, un numero di cellule più piccolo aumenta il rischio che i tumori non si attecchino. Inoltre, si raccomandano piccoli volumi di sospensioni cellulari poiché volumi maggiori (>20 μL) sono associati ad un aumentato potenziale di formazione di un nucleo cistico13. Abbiamo scoperto che l'impianto di 2.500-5.000 cellule in un volume di 20 μL di terreno di coltura cellulare è una quantità ottimale per gli studi terapeutici preclinici garantendo la crescita del tumore per più settimane. Tuttavia, per altre applicazioni, è possibile impiantare fino a 1,6 × 106 cellule.
Oltre al terreno di coltura cellulare, Matrigel può essere utilizzato come mezzo ricco di sostanze nutritive per risospendere le cellule PDAC, il che aumenta anche la viscosità della soluzione iniettabile, prevenendo così la fuoriuscita delle cellule tumorali13. Le iniezioni nella zona della coda del pancreas sono preferite con questo protocollo poiché la coda del pancreas è facilmente accessibile e l'accesso alla testa del pancreas è limitato. I protocolli per iniettare con successo le cellule nella testa del pancreas sono descritti altrove13,15. Per eseguire la procedura chirurgica, i topi vengono tenuti sotto analgosedazione utilizzando una combinazione di farmaci, tra cui midazolam, medetomidin e fentanil, nonché meloxicam come analgesico peri- e postoperatorio. In alternativa, l'isoflurano in combinazione con analgesici appropriati può essere usato come anestesia inalante a flusso costante. La scelta del metodo di analgosedazione scelto per la licenza animale dipende dalle linee guida istituzionali e dalle rispettive autorità locali.
Un'attenta scelta delle linee cellulari e dei topi riceventi è imperativa. Infatti, è importante assicurarsi che il background genetico dei topi riceventi corrisponda al background genetico delle linee cellulari selezionate per evitare l'immunogenicità e il rigetto dell'innesto delle cellule PDAC. Inoltre, le proteine esogene immunogeniche, come gli alleli reporter fluorescenti o Cas9, espresse dalle cellule tumorali impiantate influenzano la risposta dell'ospite e possono portare a una reazione immunogenica. Pertanto, la crescita tumorale e la composizione della TME possono essere influenzate e causare pregiudizi.
Rispetto ai GEMM, gli allotrapianti ortotopici singenetici di topo mostrano una ridotta quantità di desmoplasia e, in alcuni casi, un tasso inferiore di disseminazione metastatica, limitando, in parte, la somiglianza con i tumori umani. Inoltre, la necessità di un intervento chirurgico aumenta la complessità della procedura. Impianti non riusciti con conseguente assenza di tumori pancreatici nella posizione desiderata a causa di iniezione cellulare non vitale, il rigetto delle cellule impiantate, un basso numero di cellule iniettate e perdite di iniezione possono impedire il completamento della procedura sperimentale.
Nonostante queste limitazioni, i modelli di allotrapianto singeneico ortotopico di PDAC hanno dimostrato di affrontare efficacemente molte delle sfide dello studio del PDAC e della sua eterogeneità. Con i loro fenotipi altamente riproducibili e i modelli di crescita tumorale, così come le interazioni tumore-TME, rappresentano una risorsa inestimabile che può essere ottenuta rapidamente seguendo un protocollo relativamente semplice.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la struttura per animali TUM e la struttura principale di imaging del Dipartimento di Medicina Nucleare, Klinikum rechts der Isar, per l'eccellente supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dal German Cancer Consortium (DKTK), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, dall'SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 e S01) al DS, dalla Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 e 2017.091.2) al DS e dal Consiglio europeo della ricerca (ERC CoG n. 648521, al DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
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