Summary
Los aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) recapitulan la biología, los fenotipos y las respuestas terapéuticas de los subtipos de enfermedades. Debido a su progresión tumoral rápida y reproducible, son ampliamente utilizados en estudios preclínicos. Aquí, mostramos prácticas comunes para generar estos modelos, inyectando cultivos singénicos murinos de PDAC en el páncreas.
Abstract
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es una enfermedad muy compleja caracterizada por un microambiente tumoral heterogéneo compuesto por un estroma diverso, células inmunitarias, vasos, nervios y componentes de la matriz extracelular. A lo largo de los años, se han desarrollado diferentes modelos de PDAC en ratones para abordar los desafíos planteados por su progresión, potencial metastásico y heterogeneidad fenotípica. Los aloinjertos ortotópicos de ratón inmunocompetentes de PDAC han demostrado ser muy prometedores debido a su progresión tumoral rápida y reproducible en comparación con los modelos de ratón modificados genéticamente. Además, combinado con su capacidad para imitar las características biológicas observadas en PDAC autóctono, los modelos de ratón de aloinjerto ortotópico basados en líneas celulares permiten experimentos in vivo a gran escala. Por lo tanto, estos modelos son ampliamente utilizados en estudios preclínicos para análisis rápidos de genotipo-fenotipo y farmacorrespuesta. El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque reproducible y robusto para inyectar con éxito cultivos primarios de células PDAC de ratón en el páncreas de ratones receptores singénicos. Además de los detalles técnicos, se da información importante que debe considerarse antes de realizar estos experimentos.
Introduction
Recientemente, PDAC se convirtió en la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en el mundo occidental1. Causa la tasa de mortalidad más alta entre todos los cánceres y una tasa de supervivencia general a 10 años de ~ 1%, que no ha cambiado durante las décadas2. Debido a la falta de progreso en el tratamiento de PDAC, se espera que esta enfermedad se convierta en la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en la próxima década3.
Los tumores PDAC son entidades complejas caracterizadas por un microambiente tumoral diverso (EMT) compuesto por un conjunto heterogéneo de componentes del estroma, vasculares, inmunes y de la matriz extracelular4. Las diferencias en la composición del EMT influyen en el pronóstico de la enfermedad y en la respuesta al tratamiento 4,5,6. De hecho, muchos estudios han demostrado que el subtipo mesenquimal basal de PDAC se asocia con un TME altamente inmunosupresor y muestra disminución de la supervivencia y falta de respuesta a las terapias 7,8,9,10,11,12. Por lo tanto, una comprensión más profunda de las diferencias en la composición de TME y cómo estas características influyen en la biología tumoral sigue siendo un factor importante para el desarrollo de terapias molecularmente precisas. Para comprender mejor la biología detrás de este complejo fenotipo e identificar estrategias terapéuticas capaces de superar la barrera que constituye el TME de PDAC, los modelos in vivo son indispensables.
Un aspecto clave para cualquier sistema modelo preclínico de cáncer es que debe imitar fenotipos humanos, recapitulando tanto la heterogeneidad genética como el medio incorporando la multitud de poblaciones estromales e inmunes que componen el TME. Por lo tanto, al elegir modelos de ratón para la investigación preclínica, se deben tener en cuenta varios aspectos. Para investigar la interacción tumor-inmune, se pueden inyectar líneas celulares de cáncer histocompatibles en ratones inmunocompetentes singénicos. En la mayoría de los casos, estos se inyectan por vía subcutánea en el flanco del ratón, lo que permite un fácil monitoreo del tumor por palpación o inspección visual. Sin embargo, los modelos resultantes no imitan el crecimiento de las células tumorales en su órgano de origen. Por lo tanto, los trasplantes ortotópicos se convirtieron en el estándar de oro para los modelos de aloinjertos.
Los aloinjertos ortotópicos de ratón tienen varias ventajas: son rentables, se pueden generar con un procedimiento relativamente simple y dan como resultado modelos con composición molecular conocida, así como una progresión tumoral y un fenotipo reproducibles y predecibles. De hecho, mientras que los modelos de xenoinjertos derivados del paciente representan el comportamiento de las células PDAC humanas con precisión, la necesidad de implantación en ratones inmunodeficientes para evitar el rechazo del injerto limita el análisis de las interacciones tumor-inmune y tumor-estroma, lo que permite a los investigadores capturar solo una imagen parcial de la complejidad de estos tumores. Los aloinjertos ortotópicos singénicos de PDAC tienen una ventaja en este sentido también en comparación con los modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM). Los GEMM recapitulan con precisión la tumorigénesis del PDAC humano y la heterogeneidad observada en los pacientes con PDAC. Sin embargo, debido a estas características, los tumores GEMM pueden mostrar una alta varianza en su composición genética, progresión tumoral, agresividad, diferenciación histológica y composición de TME. Si bien esto puede ser una ventaja en ciertos estudios, limita los estudios de genotipo a fenotipo y la investigación enfocada de los fenotipos PDAC13. Por lo tanto, los aloinjertos ortotópicos de ratón constituyen una buena compensación y modelo para realizar estudios tumor-huésped y tratamiento in vivo. Este documento describe un protocolo para experimentos de trasplante ortotópico de células PDAC murinas en el páncreas de ratón.
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Protocol
Los experimentos con animales fueron aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC) de las autoridades locales de la Universidad Técnica de Munich y Regierung von Oberbayern.
1. Información a tener en cuenta antes del procedimiento
- Asegurar la aprobación del protocolo animal y del personal por parte de las autoridades locales antes de comenzar cualquier experimentación con animales.
- Seleccione ratones destinatarios.
- Seleccionar ratones de edades similares para la implantación (ratones receptores C57Bl/6J con un rango de edad entre 2 meses y 4 meses).
- Asegúrese de que el sexo y los antecedentes genéticos de los animales receptores coincidan con el sexo y los antecedentes genéticos de los animales de los que se originó la línea celular utilizada para la implantación (aloinjertos singénicos).
- Preparar a los ratones para la implantación.
NOTA: Manipule los ratones de acuerdo con los estándares higiénicos de la instalación local para animales.- El día de la implantación, no alimentar a los ratones 4 h antes del procedimiento para evitar complicaciones debido a la administración de anestésicos.
- Pesar los ratones antes de la implantación para calcular la cantidad de los anestésicos necesarios.
- Transfiera los ratones a la sala de operaciones.
- Seleccione las líneas celulares PDAC.
- Asegúrese de que los antecedentes genéticos y el sexo de los ratones de los que se derivan las líneas celulares coincidan con los antecedentes y el sexo de los ratones receptores (por ejemplo, las líneas celulares PDAC PDAC 1-3 generadas previamente a partir de PDAC GEMM en un fondo C57Bl/6J en el laboratorio con los siguientes genotipos, como se describió anteriormente14: PDAC 1 y 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53 R172H/R172H).
- Seleccione las líneas celulares que no expresan proteínas que son potencialmente inmunogénicas.
- Cultivar las líneas celulares PDAC.
NOTA: Realice el trabajo de cultivo celular bajo una campana de flujo laminar. Desinfecte los guantes, el espacio de trabajo y los materiales antes de trabajar.- Descongelar las células 1 semana antes de la implantación resuspendiendo el pellet en 5 mL de medio de cultivo celular. Gire hacia abajo las células, aspire el sobrenadante, resuspenda el pellet en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y gire hacia abajo las células nuevamente. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 5 ml de Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 0.1% de penicilina-estreptomicina (PS). Transferir la suspensión celular a un matraz de 25 cm².
- Pasar las líneas celulares al menos una vez antes de la implantación.
- Retire el medio celular, lave 1x con PBS y agregue 0.5 ml de tripsina para separar las células del matraz. Incubar las células a 37 °C hasta que se desprendan del matraz (dependiendo de la línea celular, esto suele tardar entre 5 y 10 minutos). Cuando las células estén separadas, resuspender las células en 10 ml de DMEM con 10% FBS y 0,1% PS y transferir la suspensión celular a un matraz de 75 cm².
NOTA: Como FBS inactiva la tripsina, dificultaría la tripsinización.
- Retire el medio celular, lave 1x con PBS y agregue 0.5 ml de tripsina para separar las células del matraz. Incubar las células a 37 °C hasta que se desprendan del matraz (dependiendo de la línea celular, esto suele tardar entre 5 y 10 minutos). Cuando las células estén separadas, resuspender las células en 10 ml de DMEM con 10% FBS y 0,1% PS y transferir la suspensión celular a un matraz de 75 cm².
- Asegurar la confluencia de ~70%-80% el día de la implantación.
- Material necesario para la implantación
- Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos.
- Mantenga los anestésicos listos según la licencia de experimento con animales.
- Use meloxicam para analgesia con al menos 5 minutos de anticipación como analgésico de larga duración con propiedades antiinflamatorias.
- Para la cirugía, use una combinación de midazolam, medetomidina y fentanilo (MMF) para la analgosedación.
- Use una combinación de atipamezol, flumazenil y naloxona (AFN) para antagonizar la analgosedación MMF después de la implantación.
- Prepare un paño estéril, una estera calefactora, una afeitadora, guantes, crema para los ojos, cloruro de sodio al 0,9%, exfoliante quirúrgico a base de yodo o clorhexidina, etanol al 80%, sutura soluble, clips para heridas, una jeringa de volumen de inyección de 50 μL y cinta.
2. Preparación de las líneas celulares antes de la implantación
NOTA: Prepare las células tumorales solo cuando los ratones estén listos para la implantación. Asegurar un corto período de tiempo entre la recolección o recolección de células y la implantación.
- Calentar todos los líquidos a 37 °C antes de su uso.
- Preparar las células (a partir de 1x T75 (matraz de cultivo de 75 cm 2) como se describe en el paso 1.5.2.1 hasta que se desprendan del matraz. Resuspender las células en 10 mL de DMEM con 10% FBS y 0,1% PS y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 mL.
- Girar las celdas a 200 × g durante 5 minutos en una centrífuga. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en un volumen adecuado de DMEM sin aditivos en función de la concentración final requerida de las células para inyección. Utilice 10 μL de la suspensión celular para contar las células utilizando una cámara Neubauer y calcular el número de células disponibles.
- Diluir las células al número final requerido de células para inyección (por ejemplo, 2.500 células en 20 μL) en DMEM sin aditivos. Transfiera 1 ml de la suspensión celular diluida a un tubo de 1,5 ml. Coloque el tubo en un rotador hasta la implantación para evitar que las células se agreguen.
3. Implantación ortotópica de células PDAC
NOTA: En caso de experiencia quirúrgica insuficiente, practique primero con cadáveres y obtenga el entrenamiento adecuado, por ejemplo, dentro de un protocolo de entrenamiento animal. El personal que realiza la cirugía y los experimentos con animales deben cumplir con los criterios de las autoridades respectivas y las directrices institucionales.
- Use meloxicam como analgésico perioperatorio y aplique 5 mg/kg de peso corporal por vía subcutánea.
- Inyectar MMF por vía intraperitoneal de acuerdo con el peso corporal de cada ratón (midazolam [5,0 mg/kg], medetomidina [0,5 mg/kg] y fentanilo [0,05 mg/kg]).
- Vuelva a colocar el ratón en la jaula durante 10-15 minutos.
- Aplique crema para los ojos cuando el ratón esté dormido.
- Compruebe suficientemente la analgosedación después de 10 minutos probando el reflejo de retirada del pedal (pellizco en las almohadillas de los pies de ambas patas traseras). En caso de respuesta, aplicar 1/3 de la dosis original de analgosedación. Después de 10 minutos, repita el procedimiento y proceda solo en ausencia de un reflejo de retirada del pedal.
- Afeite el flanco abdominal lateral izquierdo del ratón. Coloque el ratón acostado sobre el lado derecho sobre una estera calefactora estéril y pegue sus patas a la superficie. Desinfecte el abdomen con un exfoliante quirúrgico a base de yodo o clorhexidina seguido de etanol al 80% en un movimiento circular y repita el procedimiento tres veces. Para mantener la esterilidad del campo quirúrgico, use una cortina quirúrgica.
- Use guantes nuevos y desinfectarlos. Use tijeras quirúrgicas para cortar la piel y el tejido graso subcutáneo longitudinalmente en el flanco izquierdo donde se proyecta el bazo. Realizar un corte de aproximadamente 1 cm de longitud.
- Usando tijeras y fórceps, separe la piel del peritoneo para obtener un acceso más fácil al peritoneo.
- Cambia el par de tijeras. Abra el peritoneo en la ubicación del bazo con un corte longitudinal de 1 cm.
- Movilizar el bazo y el páncreas adherido con fórceps romos y de punta fina. Asegúrese de que los órganos no estén unidos a otro tejido y verifique si hay vasos sanguíneos de suministro para evitar lesionar los vasos o el tejido circundante al manipular el páncreas.
NOTA: No agarre el bazo directamente para evitar el sangrado. - Tire cuidadosamente del páncreas de la incisión para permitir un acceso más fácil a la cola del órgano y observe el bazo siguiendo el páncreas. Use la mano no dominante para agarrar el páncreas con fórceps y corte cuidadosamente los ligamentos que evitan que el páncreas se extracorporalice. Asegúrese de que el órgano no esté doblado durante la inyección y que la cápsula del órgano se mantenga bajo tensión en el sitio de penetración de la aguja para evitar derrames.
- Use la mano dominante para llevar a cabo la inyección. Penetre cuidadosamente la cápsula del órgano con la aguja de la jeringa siguiendo el eje longitudinal del órgano. Apunte a un pedazo de tejido pancreático entre los vasos sanguíneos visibles para minimizar el riesgo de perforar o inyectar en un vaso. Inyecte lentamente un número adecuado de células de acuerdo con el plan experimental (aquí, 2.500 células en 20 μL de DMEM) con una cánula de 27 G y una jeringa de 50 μL en el área de la cola del páncreas.
NOTA: Se forma una burbuja transparente tras la inyección exitosa en el tejido. - Mantenga el páncreas y la jeringa insertada quietos durante aproximadamente 1 minuto para evitar el derrame de las células tumorales. Retire la aguja con cuidado del lugar de la inyección.
NOTA: Cambie las agujas entre ratones y use una nueva jeringa estéril para la inyección de una nueva línea celular. - Reorganice los órganos dentro del abdomen cuidadosamente. Tenga cuidado de no dañar el tejido para evitar el derrame de las células. Vierta 1 ml de cloruro de sodio al 0,9% en los órganos para evitar la adhesión de los órganos.
- Suturar cuidadosamente el peritoneo utilizando la técnica de sutura interrumpida simple y cerrar la piel con dos o tres clips de acero inoxidable de 9 mm.
NOTA: Retire los clips de la herida 7 días después de la implantación si la incisión quirúrgica ha cicatrizado. - Si es necesario, evite la deshidratación de los animales debido al procedimiento y la anestesia inyectando 0,5 ml de cloruro de sodio por vía subcutánea.
- Después de la implantación, antagonizar la analgosedación por MMF con una inyección subcutánea de AFN (atipamezol [2,5 mg/kg], flumazenil [0,5 mg/kg], naloxón [1,2 mg/kg]), según el peso corporal del ratón.
- Coloque el ratón en una cámara calentada a 37 °C hasta que esté despierto y completamente activo. Luego, vuelva a colocar el mouse en su jaula original. Controle el estado de salud del ratón verificando el pelaje, el color de la piel y la actividad y repita esto 3-4 h después de la cirugía.
4. Cuidados posteriores para los ratones
- Dé a los ratones acceso a agua y comida cuando regresen a la instalación de animales.
- Continuar la aplicación subcutánea u oral de meloxicam (5 mg/kg) cada 6-12 h durante 2-3 días después de la cirugía.
- Monitorear el estado de salud de los ratones regularmente de acuerdo con el protocolo animal y las pautas institucionales.
- Dependiendo del objetivo del experimento, monitoree el crecimiento del tumor cada semana o con mayor frecuencia mediante palpaciones, imágenes de ultrasonido, bioluminiscencia (BLI) o imágenes de resonancia magnética (MRI).
NOTA: Según el método de elección, la tasa de crecimiento y el número de células implantadas, un tumor se puede detectar tan pronto como 1 semana después de la inyección.
5. Recolección de injertos tumorales
- Cosechar los tumores al final del experimento o cuando los ratones necesiten ser sacrificados siguiendo los criterios de los comités institucionales de cuidado y uso de animales o licencia de experimento animal.
- Eutanasia al ratón utilizando un método permitido por la licencia de experimentación animal.
NOTA: Realice pasos con una pérdida de tiempo mínima para minimizar el tiempo de isquemia. Por lo tanto, se recomienda la luxación cervical ya que es un método rápido y el momento de la muerte se puede determinar exactamente, en contraste con el sangrado terminal o los métodos químicos. - Coloque el ratón en decúbito supino sobre una estera estéril y pegue sus patas a la superficie. Use etanol al 80% para desinfectar el abdomen.
- Use guantes nuevos y desinfectarlos. Use tijeras quirúrgicas para cortar la piel longitudinalmente en el abdomen central.
- Usando tijeras y fórceps, separe la piel del peritoneo para obtener un acceso más fácil al peritoneo.
- Cambia el par de tijeras. Abra el peritoneo en el abdomen central con un corte longitudinal de 5 cm.
- Movilizar el bazo y el páncreas adherido con fórceps romos y de punta fina. Separe cuidadosamente el tumor del tejido circundante con fórceps y tijeras quirúrgicas.
- Almacene el tejido tumoral en un medio adecuado para experimentos posteriores. Procesar los tejidos inmediatamente o, si es necesario, conservar la muestra a 4 °C durante un máximo de 6 h hasta su posterior procesamiento.
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Representative Results
En el contexto de un estudio de respuesta a fármacos a gran escala, implantamos con éxito más de 170 ratones (ratones receptores de C75Bl6 / J, sexo de ratones machos y hembras emparejados con las líneas celulares PDAC inyectadas) utilizando el protocolo descrito anteriormente, ejemplificado en sus pasos principales en la Figura 112. En este protocolo, implantamos ortotópicamente tres líneas celulares PDAC impulsadas por KrasG12D (PDAC 1 y 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), que se generaron previamente en el laboratorio. El injerto de células PDAC se puede palpar abdominalmente más temprano aproximadamente 7 días después de la cirugía, dependiendo del número de células inyectadas y las características de agresividad y crecimiento de la línea celular inoculada. La resonancia magnética (Figura 2A), la ecografía y el BLI del abdomen del ratón se pueden usar para mediciones cuantitativas del volumen del tumor. Dependiendo de las características intrínsecas de las células tumorales de las líneas celulares, la supervivencia de los ratones implantados resultantes puede variar (Figura 2B). Las inyecciones intrapancreáticas exitosas conducen a tumores en toda regla en el páncreas del ratón (Figura 2C, D). Por el contrario, los implantes fallidos pueden resultar en la ausencia de tumores pancreáticos debido a a) inyección de células no viables, b) rechazo de las células implantadas (por ejemplo, si las células no eran singénicas para el ratón receptor), o c) un número insuficiente de células inyectadas. Los resultados negativos alternativos pueden conducir a la ausencia de un tumor primario en el páncreas, pero a la presencia de un tumor en el peritoneo, correspondiente al sitio de inyección (p. ej., a través del derrame de la suspensión de células tumorales del sitio de inyección pancreática).
Figura 1: Representación esquemática de los pasos principales del protocolo . (A) Las células PDAC deben pasar al menos una vez antes de la implantación. (B) Las células se tripsinizan para separarlas del matraz, se transfieren a un tubo de 15 ml y se cuentan. (C) La dilución celular apropiada se coloca en un tubo y se lleva a la sala de implantación. (D) El ratón receptor es anestesiado, afeitado y desinfectado en la región donde se llevará a cabo la cirugía. (E) Se realiza un corte de 1 cm en el abdomen del ratón correspondiente a la ubicación de la cola del páncreas. (F) El número deseado de células se inyecta en la cola del páncreas. Abreviatura: PDAC = adenocarcinoma ductal pancreático. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplos de resultados exitosos en aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón. (A) Resonancia magnética representativa de un ratón 2 semanas después del trasplante ortotópico de células PDAC primarias de ratón. El contorno discontinuo denota el tumor. Barra de escala = 5 mm. (B) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de tres líneas celulares PDAC de ratón diferentes (PDAC 1-3) trasplantadas ortotópicamente en el páncreas de ratones inmunocompetentes singénicos (fondo C57Bl/6J). (C) Imagen representativa de un tumor aislado en el punto final de la línea celular PDAC1 inyectada ortotópicamente. Tanto un tumor pancreático resultante de una inyección intrapancreática exitosa de células tumorales como el bazo se muestran en la fotografía. Barra de escala = 5 mm. (D) Diagrama de barras que representa el peso tumoral promedio de los tumores trasplantados ortotópicamente de PDAC 1-3. Los puntos representan ratones individuales. Abreviaturas: PDAC = adenocarcinoma ductal pancreático; MRI = resonancia magnética. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón representan un modelo robusto para estudios preclínicos debido a su costo-efectividad, reproducibilidad y procedimientos experimentales relativamente simples13,15. Estos modelos no solo permiten el estudio de las interacciones tumor-huésped, sino que también garantizan la preservación de la heterogeneidad genética de los tumores de los que se originan cuando se utilizan cultivos primarios de células de ratón para el experimento.
Este protocolo presenta un procedimiento simple y rápido para la implantación ortotópica de cultivos celulares PDAC de ratón en el páncreas. Para obtener resultados reproducibles, se deben tener en cuenta varias consideraciones técnicas, incluida la calidad de la técnica quirúrgica. Como las prácticas quirúrgicas varían, es aconsejable que una persona realice todas las inyecciones ortotópicas dentro del mismo experimento.
La inyección de células en el páncreas debe llevarse a cabo con precaución. Las células derramadas, la perforación del páncreas o la lesión del tejido pueden hacer que las células se injerten en otros sitios de órganos fuera del páncreas. Esto podría complicar la evaluación clínica (por ejemplo, tamaño e infiltración local) del tumor primario, así como su diseminación metastásica local y distante. Por lo tanto, se recomienda documentar y evaluar la formación de burbujas y cualquier información sobre el derrame celular para cada ratón implantado. Los cortes en la piel y el peritoneo deben hacerse en un tamaño adecuado para permitir un acceso óptimo al páncreas mientras se mantienen las heridas lo más pequeñas posible.
El número de células implantadas se puede ajustar dependiendo del plan experimental. Mientras que un mayor número de células implantadas conduce a tumores de crecimiento fisiológicamente rápido y una progresión rápida de los síntomas clínicos, un número más pequeño de células aumenta el riesgo de que los tumores no se injerten. Además, se recomiendan pequeños volúmenes de suspensiones celulares ya que volúmenes mayores (>20 μL) se asocian con un mayor potencial de formación de un núcleo quístico13. Encontramos que implantar 2,500-5,000 células en un volumen de 20 μL de medio de cultivo celular es una cantidad óptima para estudios terapéuticos preclínicos al garantizar el crecimiento tumoral durante varias semanas. Sin embargo, para otras aplicaciones, se pueden implantar hasta 1,6 × 106 células.
Además del medio de cultivo celular, Matrigel se puede utilizar como un medio rico en nutrientes para resuspender las células PDAC, lo que también aumenta la viscosidad de la solución inyectable, evitando así la fuga de las células tumorales13. Las inyecciones en el área de la cola del páncreas son preferidas con este protocolo ya que la cola del páncreas es fácilmente accesible y el acceso a la cabeza del páncreas es limitado. Los protocolos para inyectar con éxito células en la cabeza del páncreas se describen en otra parte13,15. Para realizar el procedimiento quirúrgico, los ratones se mantienen bajo analgosedación utilizando una combinación de medicamentos, que incluye midazolam, medetomidina y fentanilo, así como meloxicam como analgésico peri y postoperatorio. Alternativamente, el isoflurano en combinación con analgésicos apropiados se puede utilizar como anestesia inhalante bajo flujo constante. La selección del método de analgosedación de elección para la licencia del animal depende de las directrices institucionales y de las respectivas autoridades locales.
La elección cuidadosa de las líneas celulares y los ratones receptores es imperativa. De hecho, es importante asegurarse de que el fondo genético de los ratones receptores coincida con el fondo genético de las líneas celulares seleccionadas para evitar la inmunogenicidad y el rechazo del injerto de las células PDAC. Además, las proteínas exógenas inmunogénicas, como los alelos reporteros fluorescentes o Cas9, expresadas por las células tumorales implantadas influyen en la respuesta del huésped y pueden conducir a una reacción inmunogénica. Por lo tanto, el crecimiento tumoral y la composición del EMT pueden verse afectados y causar sesgo.
En comparación con los GEMM, los aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón muestran una cantidad reducida de desmoplasia y, en algunos casos, una menor tasa de diseminación metastásica, lo que limita, en parte, la similitud con los tumores humanos. Además, la necesidad de intervención quirúrgica aumenta la complejidad del procedimiento. Los implantes fallidos que resultan en la ausencia de tumores pancreáticos en la ubicación deseada debido a la inyección de células no viables, el rechazo de las células implantadas, el bajo número de células inyectadas y la fuga de inyección pueden impedir la finalización del procedimiento experimental.
A pesar de estas limitaciones, se ha demostrado que los modelos de aloinjerto de ratón ortotópico singénico de PDAC abordan eficazmente muchos de los desafíos del estudio de PDAC y su heterogeneidad. Con sus fenotipos altamente reproducibles y patrones de crecimiento tumoral, así como las interacciones tumor-TME, representan un recurso invaluable que se puede obtener rápidamente siguiendo un protocolo relativamente simple.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a la instalación de animales TUM y a la instalación central de imágenes del Departamento de Medicina Nuclear, Klinikum rechts der Isar, por su excelente apoyo técnico. Este estudio fue apoyado por el Consorcio Alemán del Cáncer (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 y S01) a D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 y 2017.091.2) a D.S., y el Consejo Europeo de Investigación (ERC CoG No. 648521, a D.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
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