Summary
이 프로토콜은 온전한 대두 결절로부터 진핵 폴리솜 정제를 위한 방법을 기술한다. 시퀀싱 후, 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인을 사용하여 전사체 및 트랜스라톰 수준에서 차등적으로 발현된 유전자를 식별할 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜의 목적은 대두의 진핵생물 번역(Glycine max) 공생 결절을 연구하기 위한 전략을 제공하는 것입니다. 이 논문은 RNA 시퀀싱을 사용하여 분석할 식물 유래 폴리리보솜 및 관련 mRNA를 분리하는 데 최적화된 방법을 설명합니다. 첫째, 세포질 용해물은 전체 냉동 대두 결절로부터 폴리솜 및 RNA 보존 조건에서 균질화를 통해 얻어진다. 그런 다음 저속 원심분리에 의해 용해물을 제거하고 상청액의 15%를 총 RNA(TOTAL) 분리에 사용합니다. 나머지 투명화된 용해물은 2층 슈크로스 쿠션(12% 및 33.5%)을 통한 초원심분리에 의해 폴리좀을 분리하는 데 사용됩니다. 폴리솜 관련 mRNA (PAR)는 재현탁 후 폴리솜 펠릿으로부터 정제된다. TOTAL과 PAR은 모두 RNA-seq에 대한 시퀀싱 라이브러리의 품질 표준을 충족하기 위해 고감도 모세관 전기영동으로 평가됩니다. 다운스트림 적용의 예로서, 시퀀싱 후, 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인을 사용하여 전사체 및 트랜스플라톰 수준에서 차등적으로 발현된 유전자를 수득할 수 있다. 요약하면,이 방법은 RNA-seq와 함께 공생 결절과 같은 복잡한 조직에서 진핵 mRNA의 번역 조절을 연구 할 수있게합니다.
Introduction
콩 (Glycine max)과 같은 콩과 식물은 뿌리 줄기라고하는 특정 토양 박테리아와 공생 할 수 있습니다. 이 상호 주의적 관계는 식물 뿌리에 새로운 기관인 공생 결절의 형성을 유도합니다. 결절은 박테리아를 숙주하는 식물 기관이며 세포질이 박테로이드라는 특수한 형태의 뿌리 줄기로 식민지화 된 숙주 세포로 구성됩니다. 이 박테로이드는 대기 질소 (N 2)의 암모니아로의 환원을 촉매하며, 암모니아는 탄수화물 1,2에 대한 대가로 식물로 옮겨집니다.
이 질소 고정 공생은 가장 잘 연구 된 식물-미생물 공생 중 하나이지만, 다양한 비 생물 적 스트레스 조건을받는 식물이 공생 파트너와의 상호 작용을 조절하는 방법과 이것이 결절 대사에 미치는 영향과 같은 많은 측면이 더 잘 이해되어야합니다. 이러한 과정은 결절 번역체 (즉, 활발히 번역 된 메신저 RNA [mRNA]의 하위 집합)를 분석함으로써 더 잘 이해 될 수있다. 폴리리보솜 또는 폴리솜은 mRNA와 관련된 여러 리보솜의 복합체로, 일반적으로 번역3을 연구하는 데 사용됩니다. 폴리솜 프로파일링 방법은 폴리솜과 관련된 mRNA의 분석으로 구성되며 다양한생물학적 과정에서 발생하는 유전자 발현을 제어하는 전사 후 메커니즘을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다4,5.
역사적으로 게놈 발현 분석은 주로 mRNA 풍부도 6,7,8,9를 결정하는 데 중점을 두었습니다. 그러나, 유전자 발현, 특히 번역10,11,12의 전사 후 조절의 상이한 단계로 인해 전사체와 단백질 수준 사이의 상관 관계가 부족하다. 더욱이, 전사체 수준에서의 변화와 트랜스 라톰13의 수준에서 발생하는 변화 사이에는 의존성이 관찰되지 않았다. 번역되는 mRNA 세트의 직접 분석을 통해 mRNA 수준 만 분석 할 때 얻은 것보다 세포 유전자 발현 (종말점이 단백질 풍부도)을보다 정확하고 완벽하게 측정 할 수 있습니다 14,15,16.
이 프로토콜은 식물 유래 폴리솜이 2층 자당 쿠션을 통한 차등 원심분리를 통해 온전한 대두 결절에서 정제되는 방법을 설명합니다(그림 1). 그러나 박테로이드 유래 리보솜도 결절에 존재하기 때문에 진핵 생물이 주요 분획 (90 % -95 %)을 나타내더라도 리보솜과 RNA 종의 혼합이 정제됩니다. 후속 RNA 분리, 정량화 및 품질 관리도 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 RNA-seq와 함께 공생 결절과 같은 복잡한 조직에서 진핵 mRNA의 번역 조절에 대한 실험 결과를 제공해야합니다.
그림 1: 공생 결절로부터 진핵 폴리솜 정제를 위해 제안된 방법론의 개략적인 개요. 이 계획은 (1) 식물 성장 및 (2) 결절 수확에서 (3) 세포질 추출물의 준비, (3) TOTAL 샘플 및 (4) PAR 샘플 획득, (5) RNA 추출 및 품질 관리에 이르기까지 프로토콜에서 따르는 단계에 대한 개요를 제공합니다. 약어: PEB = 폴리솜 추출 완충액; RB = 재현탁 완충액; 합계 = 총 RNA; PAR = 폴리솜 관련 mRNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 식물 생장 및 뿌리 줄기 접종
- 필요한 결절을 생성하려면 통제 된 조건에서 성장 챔버에서 선택한 기질에 선택한 대두 종자를 뿌립니다.
참고 :이 프로토콜에서 씨앗은 모래 : 질석 (1 : 1)의 혼합물로 채워진 0.5L 플라스틱 병에 뿌려졌습니다. 성장 챔버는 각각 28°C/20°C의 주야간 사이클 온도 및 각각 16h/8h의 명암/어둠 광주기로 설정되었습니다. 광합성 활성 방사선 강도는 620 μmol·m−2·s−1이었다. - 액체 효모 추출물 만니톨 (YEM) 배지를 미리 준비하십시오 ( 재료 표 참조). 매체를 오토 클레이브하십시오.
- 종자 파종 당일에 100mL의 YEM이 들어있는 플라스크 1 개에 Bradyrhizobium elkanii U1302 균주를 접종합니다. 플라스크를 28°C에서 100 rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션한다.
- 뿌리 줄기를 2 일 동안 자라게하고 묘목에 2mL의 배양 물을 접종하십시오.
2. 물 부족 처리 (선택 사항)
참고: 이 프로토콜은 콩 식물의 물 부족 처리를 간략하게 설명합니다. 이 부분은 당면한 실험 질문에 따라 완전히 변경되거나 생략 될 수 있습니다.
- 물 제한없이 19 일 (V2-3 발달 단계) 동안 콩 묘목을 재배하십시오. 기판을 0.5 mMKNO3로 보충된 B&D-배지17로 현장 용량으로 유지한다.
- 20 일째에 급수를 철회하십시오.
참고: 여기에서 수분 함량은 성장 및 물 부족 기간 동안 중량 측정(물 중량 함량)으로 매일 측정되었습니다. - 20 일부터 물 부족 기간이 끝날 때까지 제조업체의 지시에 따라 ( 재료 표 참조) 기공 측정기를 사용하여 축 방향 잎 표면에서 매일 3 회 기공 전도도를 측정하십시오.
참고 : 물 부족 기간의 끝은 기공 전도도 값이 파종 20 일째에 얻은 값의 약 50 % 일 때 각 식물에 대해 개별적으로 결정되었습니다.
3. 결절 수확
- 깨끗한 용기에 액체 질소를 수집하고 15mL 튜브에 라벨을 붙입니다 (각 식물에 하나씩).
주의 : 냉동 장갑, 안면 보호대 및 보안경을 착용하고 액체 질소를 취급하십시오. - 각 플랜트를 개별적으로 검색합니다. 공중 부분을 잘라내어 폐기하십시오. 뿌리를 물로 철저히 씻어 남아있는 기질을 제거하십시오.
- 뿌리에서 각 결절을 분리하고 미리 냉각 된 15mL 튜브에 모으십시오. 튜브를 스냅 동결하고 -80 ° C에서 보관하십시오.
4. 세포질 추출물의 제조
참고: 이 프로토콜의 최종 목표는 고품질 총 RNA(TOTAL) 및 폴리솜 관련 RNA(PAR)를 얻는 것입니다. 따라서 RNA 분해를 방지하는 조건에서 작업하고 항상 샘플을 4 ° C로 유지하고 RNase가없는 실험실 장비 및 용액을 사용하십시오. 명시되지 않는 한, 모든 용액은 멸균 초순수로 준비됩니다.
- 완충 원액의 준비
- 표 1에 나열된 오토클레이브 가능한 스톡 용액을 준비하고 15분 동안 오토클레이브한 다음 RT에 보관합니다.
- 표 1에 나열된 필터 멸균 가능한 스톡 용액을 준비하고 필터 멸균 한 다음 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 폴리솜 추출 완충액(PEB, 표 1 참조)을 준비하고 얼음 위에 보관합니다.
참고: 주어진 볼륨은 6개의 샘플에 대한 것입니다. - 원심분리기를 4°C로 냉각하고 2mL 미세 원심분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 칭량 접시에서 손상되지 않은 결절 약 0.2g을 칭량하고 이를 사전 냉각된 2mL 튜브로 옮깁니다.
알림: 샘플이 해동되지 않도록 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 대안적으로, 0.2 g 대신에 0.4-0.5 mL의 추정된 결절 부피가 사용될 수 있다. - 1.2mL의 PEB를 추가하고 샘플을 2분 동안 해동시킨 다음 결절이 완전히 파괴되고 균질화될 때까지 조직 분쇄기로 균질화합니다.
알림: 해동된 결절은 미세 원심분리기 튜브의 조직 분쇄기( 재료 표 참조)로 쉽게 파손될 수 있을 만큼 충분히 부드러워지므로 반드시 연마하십시오. 얼어 붙은 결절은 갈기가 어렵습니다. 또한 샘플을 시원하게 유지하면서 적절한 균질화를 위해 튜브를 벤치탑 냉각기(0°C)에 배치하는 것이 좋습니다. - 10분 동안 또는 모든 샘플이 처리될 때까지 부드럽게 교반하면서 얼음 위에서 샘플을 배양합니다.
- 16,000 ×g에서 4 ° C에서 15 분 동안 원 심 분리하여 파편을 펠릿합니다. 상청액을 회수하고 원심분리 단계를 반복한다.
- 정화된 세포질 추출물을 조심스럽게 회수하고 200μL 분취량을 깨끗한 1.5mL 미세원심분리 튜브로 옮겨 TOTAL 분리합니다(TOTAL 샘플, 섹션 7 참조).
5. 자당 쿠션의 제조
알림: 이 프로토콜은 12mL 초원심분리 튜브에 33.5겹 자당 쿠션(13.2% 및 13.2%)을 사용합니다( 재료 표 참조). 모든 용액은 멸균 초순수로 준비됩니다.
- 자당과 소금 원액을 준비하십시오.
- 2M 자당 용액 100mL를 준비합니다(68.5%, 표 1).
- 10x 소금 용액을 준비하십시오 (표 1).
- 수크로스 쿠션의 2층을 표 2에 기재된 바와 같이 준비한다. 항생제(CHX 및 CHL) 스톡 용액의 조성에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
알림: 주어진 볼륨은 6개의 쿠션용입니다. - 4.5mL의 33.5% 자당 층을 원심분리 튜브에 붓습니다. 그런 다음 P1000 마이크로피펫으로 12% 층 4.5mL를 조심스럽게 천천히 추가합니다. 정화 된 세포질 추출물이 첨가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 올려 놓으십시오.
6. 폴리솜 정제
- 정화된 세포질 추출물 1mL(단계 4.8)를 튜브의 측벽에 조심스럽게 피펫팅하여 자당 쿠션 위에 놓습니다.
- 초원심분리 튜브를 4°C에서 2시간 동안 217,874×g(기준 로터에서 35,000rpm)의 예냉식 버킷과 원심분리기로 옮깁니다.
- 남아 있는 시토졸 추출물 및 슈크로스 쿠션을 버리고, 폴리좀 펠렛을 200 μL의 예냉된 RB( 표 1에 따라 미리 제조됨)로 재현탁시킨다.
- 얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음 폴리솜 재현탁액을 1.5mL 예냉된 튜브로 옮깁니다. RNA 추출 (PAR 샘플)을 진행하십시오.
7. RNA 추출 및 품질 관리
참고 :이 단계는 TOTAL (4.8 단계) 및 PAR 샘플 (6.4 단계)에 대해 수행됩니다.
- 멸균 초순수로 75 % EtOH를 준비하고 -20 ° C로 냉각시킵니다. 또한 클로로포름과 이소프로판올을 -20 ° C로 냉각하십시오.
- 샘플을 750μL의 RNA 분리 시약으로 균질화하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 차가운 클로로포름 200μL를 넣고 튜브를 15초 동안 세게 흔듭니다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 상 분리를 위해 4°C에서 15 분 동안 12,000×g의 원심분리. 분홍색 유기상을 방해하지 않고 상부 수성상 500μL를 깨끗한 튜브로 옮기고 375μL의 차가운 이소프로판올과 0.5μL의 RNase가 없는 글리코겐을 추가합니다( 재료 표 참조). 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.
참고: 글리코겐은 알코올 침전으로부터 핵산 회수를 증가시키기 위해 공침제로 사용되는 운반체입니다. - 혼합물을 4°C에서 10분 동안 배양하고 12,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 상청액을 폐기하십시오.
- RNA 침전물을 차가운 75 % EtOH 1mL로 세척한다. 간단한 소용돌이로 혼합하십시오.
참고: 이 시점에서 샘플은 -20°C에서 밤새 보관할 수 있습니다. - 4°C에서 5 분 동안 7,500×g으로 원심분리하고, 마이크로피펫으로 상청액을 조심스럽게 제거하고, RNA 펠릿을 자연 건조시킨다.
- 펠릿을 RNase가 없는 물 50μL에 녹이고 65°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 고감도 모세관 전기영동18(재료 표 참조) 및/또는 2% RNase가 없는 아가로스 겔(19)에 대한 전기영동으로 RNA 농도 및 무결성을 평가합니다(재료 표 참조).
참고: RNA 샘플을 즉시 사용하지 않거나 RNA-seq 라이브러리 준비를 위해 시퀀싱 시설로 보내려는 경우 EtOH를 사용하여 침전시키는 것이 좋습니다.
8. RNA 침전
- 원심분리기 및 EtOH를 4°C로 냉각시킨다.
- 3M 아세트산 나트륨을 준비하십시오.
- 멸균 초순수로 70 % EtOH를 준비하고 -20 ° C로 냉각시킵니다.
- 샘플 부피를 추정합니다. 0.1 부피의 3M 아세트산 나트륨, 3 부피의 차가운 EtOH 및 0.5 μL의 RNase가없는 글리코겐을 추가하십시오. 철저히 섞는다.
- 필요할 때까지 -20 ° C에서 그대로 두십시오.
참고: RNA 침전 샘플은 -1°C에서 최대 80년 동안 보관할 수 있습니다.
9. 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인
- 신뢰할 수 있는 트랜스크립톰 및 트랜스라톰 데이터 분석을 위해 판독 길이가 >100bp인 평균 40M Illumina 쌍단 판독을 수행합니다.
참고: 표준 RNA-seq 데이터 분석에는 다음 단계 9.2-9.5가 포함됩니다. - FastQC(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) 또는 멀티샘플 MultiQC20을 사용하여 판독 품질 검사를 수행합니다.
- Trimmomatic 21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, 낫23 또는 Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)를 사용하여 어댑터 및 저품질 시퀀스를 제거합니다.
- 종에 대한 참조 게놈을 사용할 수 있는 경우 참조에 대한 읽기 매핑을 수행한 다음 다른 오픈 소스 도구 외에도 Bowtie224, TopHat2 25 또는 Salmon 26 및 featureCounts27을 사용하여 풍부도 정량화를 수행합니다.
- edgeR28, DESeq229 또는 limma30을 사용하여 차등 발현 유전자 식별을 위한 통계 분석을 수행합니다.
참고: 이러한 오픈 소스 소프트웨어는 명령줄을 통해 로컬로 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 이들은 그래픽 사용자 인터페이스를 제공하는 은하계(31 ) 또는 지오익스플로러(32)와 같은 공개 서버의 웹 브라우저를 통해 작동될 수 있어서, 그것들을 사용하기 위해 커맨드 라인 지식이 필요하지 않다.
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Representative Results
RNA 시퀀싱과 같은 대부분의 다운스트림 응용 분야에서 고품질 샘플이 라이브러리 준비 및 시퀀싱의 기본이기 때문에 위에서 언급한 절차로 정제된 TOTAL 및 PAR 분획의 양 및 품질 평가는 성공 여부를 결정하는 데 중요합니다. 더욱이, RNA 분자의 완전성은 샘플 수집순간 (18)에서 유전자 발현 프로파일의 스냅 샷의 캡처를 허용한다. 이러한 맥락에서 RNA 무결성 번호(RIN)는 바이오분석기를 사용하여 이러한 측정을 수행할 때 얻어집니다. RIN은 10(온전)에서 1(완전 저하)18 범위의 강력하고 안정적이며 사용자 독립적인 방식으로 무결성 값을 할당하는 데 사용됩니다.
그림 2A, B 는 여러 TOTAL 및 PAR 샘플 분획에 대한 고감도 모세관 전기 영동 시스템 (Bioanalyzer)의 표준 출력을 보여줍니다. 날카로운 리보솜 RNA (rRNA) 밴드가 번짐없이 시각화 될 수 있기 때문에 모든 샘플에서 매우 우수한 품질이 관찰됩니다. 그러나 RIN 값은 손상되지 않은 샘플에 해당하는 5.9에서 7.5 사이이므로 RIN 값에 반영되지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 앞서 언급한 바와 같이, 도 2C에서 볼 수 있는 바와 같이, 샘플 열화의 시각적 징후는 없다. 도 2D 는 비교를 위해 거의 완전히 분해된 샘플의 바이오분석기 결과의 예를 도시한다. 장비는 또한 TOTAL 및 PAR 샘플 모두에 대한 전기 페로 그램에서 볼 수 있듯이 18S 및 25S 피크를 식별하지 못했습니다 (그림 2B). 결과적으로 리보솜 밴드의 비율 (25S : 18S, RNA 무결성의 또 다른 지표)을 계산할 수 없었습니다. 고품질 RNA는 일반적으로 25S:18S 2:1 비율33을 나타냅니다.
그림 2: 총 RNA 및 폴리솜 관련 mRNA 양 및 품질 평가 . (A) 각각의 RIN 및 농도 값을 가진 12개의 샘플에서 고감도 모세관 전기영동(Bioanalyzer)의 대표적인 가상 겔 재구성 결과. 레인 1 내지 레인 6은 6개의 결절 샘플의 총 RNA(TOTAL) 분획에 대응하고, 레인 7 내지 레인 12는 동일한 샘플의 폴리솜-관련 mRNA (PAR) 분획에 대응한다. 녹색 선: 모든 차선에 있는 하단 마커. (B) 샘플 4 (TOTAL의 예) 및 샘플 10 (PAR의 예로서)에 대해 전기 페로 그램 표현이 표시됩니다. 18S 및 25S 피크가 표시됩니다. 16S 및 23S (원핵생물 rRNA)에 해당할 수 있는 피크는 *로 표시됩니다. 이러한 피크의 확대가 표시됩니다(B1 및 B2). 진핵생물 총 RNA 나노 분석을 바이오분석기에 사용하였다. (c) 6개의 샘플로부터의 대표적인 아가로스 겔 전기영동 결과(왼쪽): 10 μL의 TOTAL 및 PAR 분획을 2% 아가로스 겔에 로딩하고 분리하였다(35분 동안 80V). 오른쪽에는 원핵생물 rRNA를 더 명확하게 시각화할 수 있는 샘플 2의 또 다른 젤이 있습니다. 진핵생물 rRNA(18S 및 25S)는 검은색 화살촉으로, 원핵생물 rRNA(16S 및 23S)는 회색 화살촉으로 표시됩니다. (d) 분해된 샘플의 바이오분석기 결과의 예. L : 표준 사다리. 녹색 선: 모든 차선에 있는 하단 마커. 약어 : RIN = RNA 무결성 번호; PAR = 폴리솜-관련 mRNA; NT = 뉴클레오티드; L = 표준 사다리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 샘플은 진핵 생물과 원핵 생물이 공존하는 공생 결절에서 나온 것이기 때문에 정제 된 RNA는 두 종의 혼합입니다 (진핵 생물이 대다수 임에도 불구하고). 따라서 전기 페로그램에서 16S 및 23S rRNA에 해당하는 피크를 관찰 할 것으로 예상됩니다 (그림 2B 및 확대 B1 및 B2). 이러한 "추가" 피크는 얻어진 더 낮은 RIN 값을 설명할 수 있습니다.
이 장비는 또한 레인 1의 표준 래더를 기준으로 샘플 농도를 계산합니다. 예상대로, TOTAL 샘플은 PAR 샘플보다 더 높은 농도 값을 나타낸다. 그러나 이들의 경우에도 샘플 수량 요구 사항이 일반적으로 최소 1.0μg을 권장하기 때문에 라이브러리 준비 및 RNA-seq를 진행하기에 충분한 RNA가 있습니다.
| 실온에서 보관할 오토클레이브 솔루션 |
| 2 M 트리스-HCl pH 9.0 |
| 2 M KCl |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 (10 M NaOH로 조정됨) |
| 1 M 마그네슘 2 |
| 20%(v/v) PTE(용액을 피펫팅하기 전에 병을 흔듭니다) |
| 10% 독 |
| 20 % 세제 혼합 : 20 % (v / v) Brij L23, 20 % (v / v) Tritón X-100, Igepal CA 360, 20 % (v / v) 트윈 20 (60 ° C에서 가열하면서 용해) |
| -20°C에서 동결되는 필터 멸균 용액 |
| 0.5 미터 DTT |
| 0.5 미터 PMSF |
| 50 mg.mL-1 시클로 헥시 미드 (CHX) (EtOH에서) |
| 50 mg.mL-1 클로란 페니콜 (CHL) (EtOH) |
| 재고 솔루션 | 10 mL PEB의 부피 (μL) | 2 mL RB의 부피(μL) |
| 2 M KCl | 1,000 | 200 |
| 0.5 M 에그타 pH 8.0 | 500 | 100 |
| 1 M 마그네슘 2 | 356 | 70 |
| 20% (V/V) PTE | 500 | - |
| 10% 독 | 1,000 | - |
| 20% 세제 믹스 | 500 | - |
| 0.5 미터 DTT | 100 | 20 |
| 0.5 미터 PMSF | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 채널 | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 채널 | 10 | 2 |
| H2O | 5,004 | 1,406 |
| 2 M 자당 용액 (68.5 %) : 물에 68.5 g의 자당. 실온(RT)에서 보관하십시오. | ||
| 10x 염 용액 : 0.4 M 트리스-HCl pH 8.4, 0.2 M KCl, 0.1 MMgCl2; 오토클레이브를 15분간 방치하고 -20°C에서 동결시킨다. | ||
표 1: 이 프로토콜에 사용된 버퍼 및 솔루션. 주어진 부피는 6 개의 샘플에 대한 것입니다. 약어 : EGTA = 에틸렌 글리콜 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산; PTE = 폴리옥시에틸렌(10)트리데실 에테르; DOC = 나트륨 데 옥시 콜레이트; DTT = 디티오트레이톨; PMSF = 페닐메탄설포닐플루오라이드.
| 자당층(%) | 자당 2 M (mL) | 소금 용액 10x (mL) | CHX 50 mg.mL-1 (μL) | CHL 50 mg.mL-1 (μL) | H2O (mL) |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
표 2: 2개의 수크로오스 층의 조성(12% 및 33.5%). 주어진 양은 6 개의 쿠션을 준비하기위한 것입니다.
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Discussion
번역 수준에서 유전자 발현 조절을 연구하는 것은 세포 유전자 발현의 종말점이 단백질 풍부도이기 때문에 다양한 생물학적 과정을 더 잘 이해하는 데 중요합니다13,14. 이것은 다염색체 분획을 정제해야하는 관심 조직 또는 유기체의 트랜스 라톰을 분석하고 관련 mRNA를 분석 한 3,4,34,35,36을 분석하여 평가할 수 있습니다.
자당 쿠션을 통해 대두 공생 결절 폴리솜을 정제한 다음 TOTAL 및 PAR 추출을 수행하는 방법이 여기에 제시됩니다. 두 RNA 분획을 모두 얻는 것은 RNA-seq 및 유전자 발현을 위한 표준 파이프라인이 나중에 구현될 수 있기 때문에 이 프로토콜의 한 가지 관련 포인트입니다. 따라서, 결절의 전사체 및 트랜스 라톰을 연구 할 수있다.
폴리솜 정제를 위한 대안적인 방법은 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법이며, 여기서 리보솜 단백질 L18의 에피토프-태그된 버전의 발현은 리보솜37,38의 면역침전을 허용한다. 그러나 이 방법은 형질전환 식물의 생성을 필요로 하며, 이는 대두와 같은 일부 종에서는 어려울 수 있습니다. 또한, 폴리솜 정제 후 리보솜 보호된 mRNA 단편의 딥 시퀀싱을 포함하는 리보솜 프로파일링 또는 Ribo-seq 방법 15,39,40,41은 개별 mRNA에서 리보솜의 정확한 수와 위치를 평가할 수 있기 때문에 폴리솜 프로파일링보다 더 높은 분해능으로 트랜스라톰을 연구하기 위한 대안입니다. 그럼에도 불구하고 이 접근법은 더 힘들고 더 많은 양의 샘플이 필요하며 작은 RNA 단편이 회수되기 때문에 계산 집약적입니다.
폴리솜이 정제될 샘플의 품질, 특히 이 프로토콜의 경우와 같이 냉동 조직을 사용하는 경우와 같이 고려해야 할 몇 가지 중요한 실험 측면이 있습니다. 손상되지 않은 결절은 뿌리에서 분리하고 -80 ° C에서 보관하기 전에 즉시 액체 질소에서 냉동해야합니다. 우리의 경험에 따르면, 폴리솜 및 관련 mRNA는 저장 후 몇 개월 이내에 결절에서 성공적으로 정제될 수 있습니다. 또한 cDNA 합성 및 고처리량 시퀀싱과 같은 다운스트림 애플리케이션에 중요한 고품질 TOTAL 및 PAR을 얻기 위해 RNA 분해를 방지하는 조건에서 전체 프로토콜을 구현해야 합니다.
이 방법의 주요 한계는 초원심분리기인데, 이는 초원심분리기가 많은 실험실에서 널리 사용되지 않기 때문입니다. 또한, 원심분리 단계 후에 수득 된 펠릿은 폴리솜 이외에, 번역 활성이 아닌 다른 리보 핵 단백질 복합체를 함유 할 수있다. 또한, 여기에 제시된 프로토콜을 다른 대두 조직으로 수행하는 경우 한 가지 고려 사항은 샘플의 양, 샘플 : PEB 비율 및 균질화 절차를 최적화해야한다는 것입니다.
이 프로토콜에 사용 된 샘플이 식물 뿌리 세포와 박테리아 사이의 공생 상호 작용으로 인해 형성된 기관이라는 점을 고려할 때, 이중 RNA-seq 분석42 (TOTAL 및 PAR 샘플 포함)를 수행하면 두 유기체의 전사 및 번역 반응을 검사 할 수 있기 때문에 흥미로울 것입니다. 여기에 설명된 방법은 박테리아 RNA의 추출이 최적화된 경우 이 문제에 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 CSIC I+D 2020 보조금 번호 282, FVF 2017 보조금 번호 210 및 PEDECIBA(마리아 마사 사인즈)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
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