Summary
Este protocolo describe un método para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos de soja intactos. Después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para identificar genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo.
Abstract
El objetivo de este protocolo es proporcionar una estrategia para estudiar el translatomo eucariota del nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este documento describe métodos optimizados para aislar polirribosomas derivados de plantas y sus ARNm asociados para ser analizados mediante secuenciación de ARN. En primer lugar, los lisados citoplasmáticos se obtienen mediante homogeneización en condiciones de preservación de polisomas y ARN a partir de nódulos de soja enteros congelados. Luego, los lisados se eliminan por centrifugación a baja velocidad, y el 15% del sobrenadante se usa para el aislamiento de ARN total (TOTAL). El lisado eliminado restante se utiliza para aislar polisomas por ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa de dos capas (12% y 33,5%). El ARNm asociado a polisomas (PAR) se purifica a partir de gránulos polisomales después de la resuspensión. Tanto TOTAL como PAR se evalúan mediante electroforesis capilar altamente sensible para cumplir con los estándares de calidad de las bibliotecas de secuenciación para RNA-seq. Como ejemplo de una aplicación posterior, después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para obtener genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo. En resumen, este método, en combinación con RNA-seq, permite estudiar la regulación traslacional de los ARNm eucariotas en un tejido complejo como es el nódulo simbiótico.
Introduction
Las plantas leguminosas, como la soja (Glycine max), pueden establecer simbiosis con bacterias específicas del suelo llamadas rizobios. Esta relación mutualista provoca la formación de nuevos órganos, los nódulos simbióticos, en las raíces de las plantas. Los nódulos son los órganos de la planta que albergan las bacterias y consisten en células huésped cuyo citoplasma está colonizado con una forma especializada de rizobios llamados bacteroides. Estos bacteroides catalizan la reducción del nitrógeno atmosférico (N2) en amoníaco, que se transfiere a la planta a cambio de carbohidratos 1,2.
Aunque esta simbiosis fijadora de nitrógeno es una de las simbiosis planta-microbio mejor estudiadas, quedan muchos aspectos por comprender mejor, como cómo las plantas sometidas a diferentes condiciones de estrés abiótico modulan su interacción con su pareja simbiótica y cómo esto afecta el metabolismo de los nódulos. Estos procesos podrían entenderse mejor analizando el translatomo de nódulos (es decir, el subconjunto de ARN mensajeros [ARNm] traducidos activamente). Los polirribosomas o polisomas son complejos de múltiples ribosomas asociados con el ARNm, comúnmente utilizados para estudiar la traducción3. El método de perfilado de polisomas consiste en el análisis de los ARNm asociados a polisomas y ha sido utilizado con éxito para estudiar los mecanismos posttranscripcionales que controlan la expresión génica que ocurre en diversos procesos biológicos 4,5.
Históricamente, el análisis de expresión del genoma se ha centrado principalmente en determinar la abundancia de ARNm 6,7,8,9. Sin embargo, existe una falta de correlación entre la transcripción y los niveles de proteínas debido a las diferentes etapas de la regulación posttranscripcional de la expresión génica, particularmente la traducción10,11,12. Además, no se ha observado dependencia entre los cambios a nivel del transcriptoma y los que ocurren a nivel del translatomo13. El análisis directo del conjunto de ARNm que se están traduciendo permite una medición más precisa y completa de la expresión génica celular (cuyo punto final es la abundancia de proteínas) que la obtenida cuando sólo se analizan los niveles de ARNm14,15,16.
Este protocolo describe cómo los polisomas derivados de plantas se purifican a partir de nódulos de soja intactos mediante centrifugación diferencial a través de un cojín de sacarosa de dos capas (Figura 1). Sin embargo, dado que los ribosomas derivados de bacteroides también están presentes en los nódulos, se purifica una mezcla de ribosomas y especies de ARN, aunque los eucariotas representan la fracción principal (90%-95%). También se describe el posterior aislamiento, cuantificación y control de calidad del ARN (Figura 1). Este protocolo, en combinación con RNA-seq, debería proporcionar resultados experimentales sobre la regulación traslacional de los ARNm eucariotas en un tejido complejo como el nódulo simbiótico.
Figura 1: Resumen esquemático de la metodología propuesta para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos simbióticos. El esquema ofrece una visión general de los pasos seguidos en el protocolo desde (1) crecimiento de plantas y (2) recolección de nódulos hasta (3) preparación de los extractos citosólicos, (3) obtención de muestras TOTAL y (4) muestras PAR, y (5) extracción de ARN y control de calidad. Abreviaturas: PEB = tampón de extracción de polisomas; RB = tampón de resuspensión; TOTAL = ARN total; PAR = ARNm asociado a polisomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
1. Crecimiento de plantas e inoculación de rizobios
- Para generar los nódulos requeridos, siembre las semillas de soja de elección en el sustrato seleccionado en una cámara de crecimiento bajo condiciones controladas.
NOTA: En este protocolo, las semillas se sembraron en una botella de plástico de 0,5 L llena de una mezcla de arena: vermiculita (1:1). La cámara de crecimiento se estableció con una temperatura de ciclo día/noche de 28 °C / 20 °C, respectivamente, y un fotoperíodo de luz/oscuridad de 16 h/8 h, respectivamente. La intensidad de radiación fotosintéticamente activa fue de 620 μmol·m−2·s−1. - Prepare por adelantado el medio líquido de manitol de extracto de levadura (YEM) (consulte la Tabla de materiales). Autoclave el medio.
- El mismo día de la siembra de semillas, inocular un matraz que contenga 100 ml de YEM con la cepa Bradyrhizobium elkanii U1302. Incubar el matraz a 28 °C en un agitador orbital a 100 rpm.
- Deje que los rizobios crezcan durante 2 días e inocule las plántulas con 2 ml del cultivo.
2. Tratamiento del déficit hídrico (opcional)
NOTA: Este protocolo describe el tratamiento del déficit hídrico de las plantas de soja. Esta parte puede ser cambiada u omitida por completo dependiendo de la pregunta experimental en cuestión.
- Cultive las plántulas de soja durante 19 días (etapa de desarrollo V2-3) sin restricción de agua. Mantenga el sustrato a su capacidad de campo con B&D-medium17 suplementado con 0,5 mM KNO3.
- El día 20, retirar el riego.
NOTA: Aquí, el contenido de agua se midió diariamente por gravimetría (contenido gravimétrico de agua) durante los períodos de crecimiento y déficit de agua. - Mida la conductancia estomática por triplicado diariamente en la superficie abaxial de la hoja con un porómetro, según las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales), desde el día 20 hasta el final del período de déficit hídrico.
NOTA: El final del período de déficit hídrico se determinó individualmente para cada planta cuando el valor de conductancia estomática fue aproximadamente del 50% del obtenido el día 20 de la siembra.
3. Recolección de nódulos
- Recoja el nitrógeno líquido en un recipiente limpio y etiquete los tubos de 15 ml (uno para cada planta).
PRECAUCIÓN: Manipule el nitrógeno líquido con guantes criogénicos, protectores faciales y gafas de seguridad. - Recupere cada planta individualmente. Cortar y desechar la parte aérea. Lave bien la raíz con agua para eliminar cualquier sustrato restante.
- Separe cada nódulo de la raíz y recójalos en un tubo preenfriado de 15 ml. Congele los tubos a presión y guárdelos a -80 °C.
4. Preparación de extractos citosólicos
NOTA: El objetivo final de este protocolo es obtener ARN total (TOTAL) y ARN asociado a polisomas (PAR) de alta calidad. Por lo tanto, trabaje en condiciones que eviten la degradación del ARN, manteniendo siempre las muestras a 4 °C y utilizando equipos y soluciones de laboratorio libres de RNasa. A menos que se especifique, todas las soluciones se preparan con agua ultrapura estéril.
- Preparación de soluciones de la reserva reguladora
- Preparar las soluciones madre esterilizables en autoclave enumeradas en la Tabla 1, esterilizarlas en autoclave durante 15 minutos y mantenerlas en RT.
- Preparar las soluciones madre esterilizables por filtración enumeradas en la Tabla 1, esterilizarlas por filtración y mantenerlas a −20 °C.
- Prepare el tampón de extracción de polisomas (PEB, ver Tabla 1) y manténgalo en hielo.
NOTA: Los volúmenes dados son para seis muestras. - Enfriar la centrífuga a 4 °C y colocar 2 ml de tubos de microcentrífuga sobre hielo.
- Pesar aproximadamente 0,2 g de nódulos intactos en una fuente de pesaje y transferirlos a un tubo preenfriado de 2 ml.
NOTA: Realice este paso rápidamente para evitar la descongelación de las muestras. Alternativamente, se puede utilizar un volumen de nódulo estimado de 0,4-0,5 ml en lugar de 0,2 g. - Agregue 1.2 ml de PEB, deje que la muestra se descongele durante 2 minutos y homogeneice con un molinillo de tejido hasta la interrupción y homogeneización completas de los nódulos.
NOTA: Asegúrese de moler los nódulos una vez descongelados, ya que serán lo suficientemente suaves como para ser fácilmente interrumpidos con molinos de tejido (consulte la Tabla de materiales) en tubos de microcentrífuga. Los nódulos congelados son difíciles de moler. Además, se recomienda colocar los tubos en un refrigerador de sobremesa (0 ° C) para una homogeneización adecuada mientras se mantienen las muestras frescas. - Incubar las muestras en hielo con una agitación suave durante 10 minutos o hasta que todas las muestras hayan sido procesadas.
- Centrifugar a 16.000 × g durante 15 min a 4 °C para granular los residuos. Recupere el sobrenadante y repita el paso de centrifugación.
- Recuperar cuidadosamente el extracto citosólico clarificado y transferir una alícuota de 200 μL a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml para el aislamiento TOTAL (muestras TOTAL; ver sección 7).
5. Preparación de cojines de sacarosa
NOTA: Este protocolo utiliza un cojín de sacarosa de dos capas (12% y 33.5%) en tubos de ultracentrífuga de 13.2 ml (consulte la Tabla de materiales). Todas las soluciones se preparan con agua ultrapura estéril.
- Prepare las soluciones caldo de sacarosa y sal.
- Preparar 100 mL de solución de sacarosa 2 M (68,5%, Tabla 1).
- Prepare una solución salina 10x (Tabla 1).
- Prepare las dos capas del cojín de sacarosa como se describe en la Tabla 2. Ver Tabla 1 para la composición de las soluciones madre de antibióticos (CHX y CHL).
NOTA: Los volúmenes dados son para seis cojines. - Vierta 4,5 ml de la capa de sacarosa al 33,5% en los tubos de la centrífuga. Luego, agregue 4.5 ml de la capa al 12% con cuidado y lentamente con una micropipeta P1000. Poner los tubos en hielo hasta la adición del extracto citosólico clarificado.
6. Purificación de polisomas
- Cargar 1 ml del extracto citosólico clarificado (paso 4.8) sobre el cojín de sacarosa pipeteando cuidadosamente sobre la pared lateral del tubo.
- Transfiera los tubos de la ultracentrífuga a cucharones preenfriados y centrífuga a 217.874 × g (35.000 rpm en el rotor de referencia [consulte la tabla de materiales]) durante 2 h a 4 °C.
- Desechar el extracto citosólico restante y el cojín de sacarosa, y resuspender el pellet polisómico con 200 μL de RB preenfriado (previamente preparado según la Tabla 1).
- Incubar durante 30 minutos en hielo y luego transferir la resuspensión polisomal a tubos preenfriados de 1,5 ml. Proceder con la extracción de ARN (muestras PAR).
7. Extracción de ARN y control de calidad
NOTA: Este paso se realiza para las muestras TOTAL (paso 4.8) y PAR (paso 6.4).
- Preparar EtOH al 75% con agua ultrapura estéril y enfriar a -20 °C. Además, enfriar el cloroformo y el isopropanol a -20 °C.
- Homogeneizar las muestras con 750 μL del reactivo de aislamiento de ARN e incubar durante 5 min a RT.
- Añadir 200 μL de cloroformo frío y agitar los tubos vigorosamente durante 15 s. Incubar en RT durante 10 min.
- Centrifugar a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C para la separación de fases. Transfiera 500 μL de la fase acuosa superior a un tubo limpio sin alterar la fase orgánica rosada, y agregue 375 μL de isopropanol frío y 0,5 μL de glucógeno libre de RNasa (consulte la Tabla de materiales). Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
NOTA: El glucógeno es un portador utilizado como coprecipitante para aumentar la recuperación de ácidos nucleicos de la precipitación de alcohol. - Incubar la mezcla durante 10 min a 4 °C y centrifugar a 12.000 × g durante 15 min. Deseche el sobrenadante.
- Lavar el precipitado de ARN con 1 mL de EtOH frío al 75%. Mezclar por vórtice breve.
NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a -20 °C durante la noche. - Centrifugar a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C, retirar con cuidado el sobrenadante con una micropipeta y secar al aire el pellet de ARN.
- Disolver el pellet en 50 μL de agua libre de RNasa e incubar a 65 °C durante 5 min.
- Evaluar la concentración e integridad de ARN con electroforesis capilar altamente sensible18 (ver la Tabla de materiales) y/o electroforesis en un gel de agarosa libre de RNasa al 2%19 (ver la Tabla de materiales).
NOTA: Si las muestras de ARN no se van a utilizar inmediatamente o se van a enviar a la instalación de secuenciación para la preparación de la biblioteca de ARN-seq, se recomienda utilizar EtOH para precipitarlas.
8. Precipitación de ARN
- Enfriar la centrífuga y EtOH a 4 °C.
- Preparar acetato de sodio 3 M.
- Prepare EtOH al 70% con agua ultrapura estéril y enfríela a -20 °C.
- Estimar el volumen de la muestra. Agregue 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M, 3 volúmenes de EtOH frío y 0.5 μL de glucógeno libre de RNasa. Homogeneizar.
- Dejar a -20 °C hasta que sea necesario.
NOTA: Las muestras precipitadas de ARN pueden almacenarse hasta 1 año a −80 °C.
9. Tubería estándar para el análisis de la expresión génica
- Realice un promedio de 40 millones de lecturas de extremo emparejado de Illumina, con una longitud de lectura >100 pb, para un análisis confiable de datos de transcriptoma y translatomo.
NOTA: El análisis de datos estándar de RNA-seq incluye los siguientes pasos 9.2-9.5. - Realice inspecciones de calidad de lectura utilizando FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) o MultiQC20 multimuestra.
- Retire el adaptador y las secuencias de baja calidad utilizando Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt 22, hoz23 o Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), entre otros.
- Si se dispone de un genoma de referencia para la especie, realice un mapeo de lectura contra la referencia, seguido de la cuantificación de la abundancia, utilizando Bowtie2 24, TopHat225 o Salmon26, y featureCounts27, además de otras herramientas de código abierto.
- Realizar análisis estadísticos para la identificación diferencial de genes expresados utilizando edgeR28, DESeq229 o limma30, entre otros.
NOTA: Este software de código abierto se puede utilizar localmente, a través de la línea de comandos. Alternativamente, pueden ser operados a través de un navegador web en un servidor público, como Galaxy31 o GEOexplorer32, que ofrecen una interfaz gráfica de usuario, por lo que no se requieren conocimientos de línea de comandos para su uso.
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Representative Results
La evaluación de la cantidad y calidad de las fracciones TOTAL y PAR purificadas con el procedimiento mencionado anteriormente es clave para determinar su éxito, ya que para la mayoría de las aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN, las muestras de alta calidad son fundamentales para la preparación y secuenciación de bibliotecas. Además, la integridad de las moléculas de ARN permite la captura de una instantánea del perfil de expresión génica en el momento de la recolección de la muestra18. En este contexto, se obtiene un número de integridad de ARN (RIN) al realizar estas mediciones utilizando un Bioanalizador. El RIN se utiliza para asignar valores de integridad de una manera robusta, confiable e independiente del usuario, que van desde 10 (intacto) a 1 (totalmente degradado)18.
La Figura 2A,B muestra la salida estándar del sistema de electroforesis capilar de alta sensibilidad (Bioanalyzer) para varias fracciones de muestra TOTAL y PAR. Se observa muy buena calidad para todas las muestras, ya que las bandas afiladas de ARN ribosómico (ARNr) se pueden visualizar sin ninguna apariencia manchada. Sin embargo, esto no se refleja en los valores de RIN, ya que oscilan entre 5,9 y 7,5, lo que corresponde a muestras no intactas. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, no hay signos visuales de degradación de la muestra, como se puede ver en la Figura 2C. La Figura 2D muestra un ejemplo de un resultado de un bioanalizador de una muestra casi completamente degradada para su comparación. El equipo tampoco pudo identificar los picos 18S y 25S, como se ve en los electroferogramas tanto para muestras TOTAL como PAR (Figura 2B). En consecuencia, no se pudo calcular la proporción de las bandas ribosómicas (25S: 18S; otro indicador de la integridad del ARN). El ARN de alta calidad generalmente exhibe una relación 25S: 18S 2: 133.
Figura 2: Evaluación de la cantidad y calidad del ARN total y del ARNm asociado a polisomas . (A) La reconstrucción en gel virtual representativa de electroforesis capilar de alta sensibilidad (Bioanalyzer) resulta de 12 muestras con sus respectivos valores de RIN y concentración. Los carriles 1 a 6 corresponden a fracciones totales de ARN (TOTAL) de seis muestras de nódulos, y los carriles 7 a 12 corresponden a fracciones de ARNm asociado a polisomas (PAR) de las mismas muestras. Línea verde: marcador inferior presente en todos los carriles. (B) La representación del electroferograma se muestra para la muestra 4 (como ejemplo de TOTAL) y la muestra 10 (como ejemplo de PAR). Se indican los picos 18S y 25S. Los picos posiblemente correspondientes a 16S y 23S (ARNr procariotas) se indican con *. Se muestran zoom-ins en estos picos (B1 y B2). El ensayo Eukaryote Total RNA Nano se utilizó en el Bioanalyzer. (C) Resultados representativos de la electroforesis en gel de agarosa de seis muestras (izquierda): 10 μL de fracciones TOTAL y PAR se cargaron en un gel de agarosa al 2% y se separaron (80 V durante 35 min). A la derecha, hay otro gel de la muestra 2 solamente, donde los ARNr procariotas se pueden visualizar con mayor claridad. Los ARNr eucariotas (18S y 25S) están indicados por puntas de flecha negras y los ARNr procariotas (16S y 23S) por puntas de flecha grises. (D) Ejemplo de un resultado de Bioanalizador de una muestra degradada. L: escalera estándar. Línea verde: marcador inferior presente en todos los carriles. Abreviaturas: RIN = número de integridad del ARN; PAR = ARNm asociado a polisomas; nt = nucleótidos; L = escalera estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Dado que estas muestras son de nódulos simbióticos donde coexisten ARN eucariotas y procariotas, el ARN purificado es una mezcla de ambas especies (aunque los eucariotas son la mayoría). Por lo tanto, se espera observar picos correspondientes a 16S y 23S rRNA en los electroferogramas (Figura 2B y zoom B1 y B2). Estos picos "extra" podrían explicar los menores valores de NIR obtenidos.
El equipo también calcula las concentraciones de muestra considerando como referencia la escalera estándar en el carril 1. Como era de esperar, las muestras TOTAL presentan valores de concentración más altos que las muestras PAR. Aún así, incluso para estos, hay suficiente ARN para proceder con la preparación de la biblioteca y RNA-seq, ya que los requisitos de cantidad de muestra generalmente recomiendan al menos 1.0 μg.
| Soluciones esterilizables en autoclave para almacenar a temperatura ambiente |
| 2 M Tris-HCl pH 9.0 |
| 2 M KCl |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 (ajustado con 10 M NaOH) |
| 1 M MgCl2 |
| 20% (v/v) PTE (agitar el frasco antes de pipetear la solución) |
| 10% DOC |
| 20% Mezcla detergente: 20% (p/v) Brij L23, 20% (v/v) Tritón X-100, Igepal CA 360, 20% (v/v) Tween 20 (disolver mientras se calienta a 60 °C) |
| Soluciones esterilizables por filtro para congelar a -20 °C |
| 0,5 m TDT |
| PMSF de 0,5 m |
| 50 mg.mL-1 cicloheximida (CHX) (en EtOH) |
| 50 mg.mL-1 cloranfenicol (CHL) (en EtOH) |
| Solución de stock | Volumen (μL) para 10 ml PEB | Volumen (μL) para 2 ml RB |
| 2 M KCl | 1,000 | 200 |
| 0,5 m EGTA pH 8,0 | 500 | 100 |
| 1 M MgCl2 | 356 | 70 |
| 20% (v/v) PTE | 500 | - |
| 10% DOC | 1,000 | - |
| 20% Mezcla de detergente | 500 | - |
| 0,5 m TDT | 100 | 20 |
| PMSF de 0,5 m | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 CHX | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 CHL | 10 | 2 |
| H2O | 5,004 | 1,406 |
| Solución de sacarosa 2 M (68,5%): 68,5 g de sacarosa en agua. Mantener a temperatura ambiente (RT). | ||
| 10x solución salina: 0.4 M Tris-HCl pH 8.4, 0.2 M KCl, 0.1 M MgCl2; autoclave durante 15 min, congelar a -20 °C. | ||
Tabla 1: Tampones y soluciones utilizadas en este protocolo. Los volúmenes dados son para seis muestras. Abreviaturas: EGTA = etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético; PTE = polioxietileno (10) tridecil éter; DOC = desoxicolato de sodio; TDT = ditiothreitol; PMSF = fluoruro de fenilmetanosulfonilo.
| Capa de sacarosa (%) | Sacarosa 2 M (ml) | Solución salina 10x (mL) | CHX 50 mg.mL-1 (μL) | CHL 50 mg.mL-1 (μL) | H2O (mL) |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
Tabla 2: Composición de las dos capas de sacarosa (12% y 33,5%). Los volúmenes dados son para la preparación de seis cojines.
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Discussion
El estudio de la regulación de la expresión génica a nivel traslacional es fundamental para comprender mejor los diferentes procesos biológicos, ya que el punto final de la expresión génica celular es la abundancia de proteínas13,14. Esto se puede evaluar analizando el translatomo del tejido u organismo de interés para el cual se debe purificar la fracción polisomal y analizar sus ARNm asociados 3,4,34,35,36.
Aquí se presenta un método para purificar los polisomas de nódulos simbióticos de soja a través de cojines de sacarosa, seguido de la extracción TOTAL y PAR. La obtención de ambas fracciones de ARN es un punto relevante de este protocolo, ya que RNA-seq y las tuberías estándar para la expresión génica podrían implementarse posteriormente. Por lo tanto, el transcriptoma y el translatomo del nódulo pueden ser estudiados.
Un método alternativo para la purificación de polisomas es el método de purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP), en el que la expresión de una versión marcada con epítopos de la proteína ribosómica L18 permite la inmunoprecipitación de ribosomas37,38. Sin embargo, este método requiere la generación de plantas transgénicas, lo que puede ser un desafío para algunas especies como la soja. Además, el perfil ribosómico o método Ribo-seq 15,39,40,41, que implica la secuenciación profunda de fragmentos de ARNm protegidos con ribosomas después de la purificación de polisomas, es una alternativa para estudiar el translatomo con mayor resolución que el perfil de polisomas, ya que se puede evaluar el número exacto y la posición de los ribosomas en ARNm individuales. Sin embargo, este enfoque es más laborioso, requiere mayores cantidades de muestra y es computacionalmente intensivo, ya que se recuperan pequeños fragmentos de ARN.
Hay varios aspectos experimentales críticos a considerar, como la calidad de la muestra a partir de la cual se purificarán los polisomas, especialmente si se utiliza tejido congelado, como es el caso en este protocolo. Los nódulos intactos deben separarse de la raíz y congelarse inmediatamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlos a -80 °C. En nuestra experiencia, los polisomas y sus ARNm asociados se pueden purificar con éxito a partir de nódulos a los pocos meses de almacenamiento. Además, todo el protocolo debe implementarse en condiciones que eviten la degradación del ARN para obtener TOTAL y PAR de alta calidad, lo cual es crítico para aplicaciones posteriores como la síntesis de ADNc y la secuenciación de alto rendimiento.
Una limitación importante del método es la etapa de ultracentrifugación, ya que las ultracentrífugas no están ampliamente disponibles en muchos laboratorios. Además, es relevante mencionar que el pellet obtenido después de la etapa de centrifugación podría contener, además de polisomas, otros complejos de ribonucleoproteínas que no son traduccionalmente activos. Además, una consideración si se realiza el protocolo presentado aquí con otro tejido de soja es que probablemente requerirá optimizar la cantidad de muestra, la relación muestra: PEB y el procedimiento de homogeneización.
Teniendo en cuenta que la muestra utilizada en este protocolo es un órgano formado debido a una interacción simbiótica entre una célula radicular de una planta y una bacteria, sería interesante realizar un análisis Dual RNA-seq42 (con muestras TOTAL y PAR) ya que permitiría examinar las respuestas transcripcionales y traslacionales de ambos organismos. El método descrito aquí podría ser útil para este asunto si se optimiza la extracción de los ARN bacterianos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido financiada por la subvención I+D 2020 del CSIC nº 282, la subvención FVF 2017 nº 210 y PEDECIBA (María Martha Sainz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
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