Summary
Questo protocollo consente l'isolamento delle particelle virali di Epstein-Barr dalla linea cellulare umana P3HR1 inducendo il ciclo litico virale con forbolo 12-miristato 13-acetato. Il DNA viene successivamente estratto dalla preparazione virale e sottoposto a PCR in tempo reale per quantificare la concentrazione di particelle virali.
Abstract
Il virus di Epstein-Barr (EBV), formalmente designato come herpesvirus umano 4 (HHV-4), è il primo virus tumorale umano isolato. Quasi il 90-95% della popolazione adulta mondiale è infettata da EBV. Con i recenti progressi nella biologia molecolare e nell'immunologia, l'applicazione di modelli sperimentali sia in vitro che in vivo ha fornito informazioni approfondite e significative sulla patogenesi dell'EBV in molte malattie e sulla tumorigenesi associata all'EBV. Lo scopo di questo esperimento visualizzato è quello di fornire una panoramica dell'isolamento delle particelle virali EBV dalle cellule della linea cellulare P3HR1, seguita dalla quantificazione della preparazione virale. Le cellule P3HR1, originariamente isolate da un linfoma di Burkitt umano, possono produrre un virus P3HR1, che è un ceppo EBV di tipo 2. Il ciclo litico EBV può essere indotto in queste cellule P3HR1 mediante trattamento con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA), producendo particelle virali EBV.
Utilizzando questo protocollo per l'isolamento delle particelle EBV, le cellule P3HR1 vengono coltivate per 5 giorni a 37 °C e al 5% di CO2 in mezzo RPMI-1640 completo contenente 35 ng/mL PMA. Successivamente, il terreno di coltura viene centrifugato ad una velocità di 120 x g per 8 minuti per pellettare le cellule. Il surnatante contenente virus viene quindi raccolto e fatto girare ad una velocità di 16.000 x g per 90 minuti per pellettare le particelle EBV. Il pellet virale viene quindi risospeso in un mezzo RPMI-1640 completo. Questo è seguito dall'estrazione del DNA e dalla PCR quantitativa in tempo reale per valutare la concentrazione di particelle EBV nel preparato.
Introduction
Il virus di Epstein-Barr (EBV) è il primo virus tumorale umano ad essere stato isolato1. EBV, formalmente indicato come Human herpesvirus 4 (HHV-4) 2, fa parte della sottofamiglia gamma herpes virus della famiglia dei virus dell'herpes ed è il prototipo del genere Lymphocryptovirus . Quasi il 90-95% della popolazione adulta mondiale è infettata dal virus3. Nella maggior parte dei casi, l'infezione iniziale si verifica entro i primi 3 anni di vita ed è asintomatica, tuttavia, se l'infezione si verifica più tardi durante l'adolescenza, può dare origine a una malattia denominata mononucleosi infettiva4. L'EBV è in grado di infettare le cellule B a riposo inducendole a diventare linfoblasti B proliferativi in cui il virus stabilisce e mantiene uno stato latente di infezione5. L'EBV può riattivarsi in qualsiasi momento e quindi portare a infezioni ricorrenti6.
Negli ultimi 50 anni, l'associazione tra alcuni virus e lo sviluppo di tumori maligni umani è diventata sempre più evidente e oggi si stima che dal 15% al 20% di tutti i tumori umani siano correlati a infezioni virali7. I virus dell'herpes, tra cui EBV, sono alcuni degli esempi meglio studiati di questi tipi di virus tumorali8. Infatti, l'EBV può causare molti tipi di tumori maligni umani, come il linfoma di Burkitt (BL), il linfoma di Hodgkin (HL), il linfoma diffuso a grandi cellule B e le malattie linfoproliferative negli ospiti immunocompromessi 9,10. L'EBV ha anche dimostrato di essere associato allo sviluppo di malattie autoimmuni sistemiche. Alcuni esempi di questi disturbi autoimmuni sono l'artrite reumatoide (RA), la polimiosite-dermatomiosite (PM-DM), il lupus eritematoso sistemico (LES), la malattia mista del tessuto connettivo (MCTD) e la sindrome di Sjögren (SS)11. L'EBV è anche associato allo sviluppo della malattia infiammatoria intestinale (IBD)12.
Molte di queste malattie possono essere studiate o modellate utilizzando colture cellulari, topi o altri organismi infetti da EBV. Ecco perché le particelle EBV sono necessarie per infettare cellule o organismi, sia in vitro che in vivo modelli13,14,15,16, da qui la necessità di sviluppare una tecnica che consenta l'isolamento delle particelle virali a basso costo. Il protocollo qui descritto fornisce linee guida per un modo semplice per isolare in modo affidabile le particelle EBV da una linea cellulare relativamente accessibile e per quantificare le particelle utilizzando la PCR in tempo reale, che è economica e prontamente disponibile per la maggior parte dei laboratori. Questo è in confronto a molti altri metodi che sono stati descritti per isolare EBV da diverse linee cellulari17,18,19,20.
P3HR-1 è una linea cellulare BL che cresce in sospensione ed è latente infettata da un ceppo EBV di tipo 2. Questa linea cellulare è un produttore di EBV e può essere indotta a produrre particelle virali. L'obiettivo di questo manoscritto è quello di mostrare un metodo che consente l'isolamento delle particelle EBV dalla linea cellulare P3HR-1, seguito dalla quantificazione dello stock virale che potrebbe essere successivamente utilizzato per modelli sperimentali EBV sia in vitro che in vivo .
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Protocol
NOTA: l'EBV deve essere considerato un materiale potenzialmente biopericoloso e quindi deve essere manipolato con un livello di contenimento 2 o superiore. È necessario indossare un camice da laboratorio e guanti. Se esiste un potenziale di esposizione agli schizzi, dovrebbe essere presa in considerazione anche la protezione degli occhi. La seguente procedura deve essere condotta in un gabinetto di sicurezza biologica.
1. Conteggio delle celle P3HR1
- Centrifugazione e risospensione delle celle
- Trasferire la sospensione cellulare da una piastra di coltura da 100 mm (o pallone T-25) di una coltura cellulare P3HR1 in corso all'80% di confluenza in un tubo conico da 15 ml. La densità di semina delle cellule P3HR-1 è 1 x 106 cellule / ml. Mantenere in completo terreno di coltura RPMI (79% RPMI terreno di coltura, 20% siero bovino fetale, 1% antibiotico Pen-Streptococco) a 37 °C e 5% CO2, e passare ogni 3-4 giorni.
- Centrifugare per 8 min a 120 x g. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura RPMI completo e mescolare bene (questa soluzione sarà indicata come sospensione A).
- Preparazione della sospensione cellulare per il conteggio
- Preparare una sospensione cellulare diluita B mescolando 2 μL di sospensione cellulare A con 8 μL di terreno di coltura. Aggiungere 10 μL di blu tripano allo 0,4% alla sospensione B per ottenere la sospensione C. Mescolare bene la preparazione mediante pipettaggio delicato.
- Conteggio delle cellule mediante emocitometro
- Posizionare un vetrino di vetro sull'emocitometro e caricare 10 μL di sospensione C. Posizionare l'emocitometro al microscopio ottico e contare il numero di cellule che non sono colorate di blu in ciascuno dei quattro quadranti della camera dell'emocitometro utilizzando l'obiettivo del microscopio 40x (Figura 1).
- Il blu di Trypan colora le cellule morte di blu; Non contare queste cellule, né le cellule che toccano uno qualsiasi dei bordi superiore, inferiore, destro o sinistro di ciascun quadrante emocitometrico.
- Calcolare la concentrazione di cellule per ml utilizzando la seguente formula:
NOTA: Il numero di quadranti contati è quattro e 10-4 ml è il volume dei quadrati sull'emocitometro. I quattro quadranti che devono essere contati sono rappresentati in verde nella figura 1. Celle totali contate nella formula è la somma del numero di celle nei quadranti 1, 2, 3 e 4. Le celle rappresentate in blu nella Figura 1 devono essere contate, mentre le celle in rosso non devono essere contate poiché toccano i bordi superiore, destro, inferiore o sinistro del quadrante.
Figura 1: Conteggio delle cellule utilizzando una camera emocitometrica. Quattro quadranti sono contati usando un microscopio ottico; Questi quadranti sono rappresentati in verde. Totale Celle Contate nella formula indicata al punto 1.3.3 del protocollo qui descritto è la somma del numero di celle nei quadranti 1, 2, 3 e 4. Le celle indicate in blu devono essere contate, mentre le celle in rosso non devono essere contate poiché toccano i bordi superiore, destro, inferiore o sinistro del quadrante Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Preparare il piatto per la cultura
- Posizionare un volume di sospensione cellulare A in un tubo conico da 15 ml. Il volume richiesto dipende dal numero di cellule. Regolare il volume in modo tale che il numero di celle sia di circa 2,2 x 106 celle per una piastra di coltura da 100 mm.
- Aggiungere 5 ml di terreno di coltura completo alla provetta e quindi trasferire il contenuto della provetta in una piastra di coltura da 100 mm. Aggiungere 80 μL di dimetilsolfossido (DMSO) alla piastra di coltura.
NOTA: DMSO è sensibile alla luce, quindi deve essere conservato in un contenitore resistente alla luce o coperto con un materiale opaco come un foglio di alluminio. - Aggiungere 350 μL di 1 mg/mL di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) al tubo. La concentrazione finale di PMA dovrebbe essere di 35 ng/ml e quella di DMSO dovrebbe essere dello 0,08%.
ATTENZIONE: la PMA è tossica, corrosiva e cancerogena, quindi deve essere maneggiata con estrema cura. PMA è sensibile alla luce, quindi dovrebbe essere conservato in un contenitore resistente alla luce o coperto con un materiale opaco come un foglio di alluminio. - Aggiungere 4,27 ml di terreno di coltura in modo che il volume totale sia di 10 ml. Mescolare il contenuto del tubo inclinandolo, quindi trasferire il contenuto in una piastra di coltura da 100 mm. Lasciare la piastra in un incubatore per colture cellulari per 5 giorni a 37 °C, 5% CO2.
3. Induzione e isolamento delle particelle virali di Epstein-Barr
- Dopo 5 giorni nell'incubatore, centrifugare il contenuto della piastra a 120 x g per 8 minuti per pellettare le celle. Raccogliere il surnatante privo di cellule, contenente virus e scartare il pellet cellulare.
- Centrifugare il surnatante a 16.000 x g per 90 minuti a 4 °C per pellettare le particelle virali. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet virale in 5 ml di terreno di coltura.
NOTA: La soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) può essere utilizzata per risospendere il pellet virale anziché il terreno di coltura. - Aliquot la sospensione virale ottenuta in 20 provette, ciascuna contenente 250 μL della sospensione virale. Conservare la sospensione a -80 °C.
4. Estrazione del DNA da particelle virali
ATTENZIONE: È necessario prestare estrema attenzione quando si maneggia il fenolo, poiché è tossico e corrosivo e ha la capacità di causare gravi ustioni. Il fenolo è sensibile alla luce e si ossida a contatto con la luce o l'aria. Conservalo in un contenitore resistente alla luce o in alternativa coprire il tubo di fenolo con un materiale opaco come un foglio di alluminio.
- Separazione delle proteine dal DNA
- Aggiungere 500 μL di fenolo saturo di TrisCl in uno dei tubi da 250 μL. Aggiungere 100 μL di acqua (per aumentare il volume della fase acquosa) e vortice bene per ottenere un'emulsione rosa. Centrifugare per 15 minuti a 9650 x g.
- Precipitazione del DNA
- Raccogliere il surnatante (fase acquosa trasparente) e trasferirlo in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere un equivalente di 1/10 del volume di acetato di sodio freddo del surnatante (3 M, pH 5,2) e mescolare mediante pipettaggio su e giù. Aggiungere 1 μL di 20 mg/mL di glicogeno e mescolare mediante pipettaggio.
NOTA: Questo passaggio è facoltativo, ma l'aggiunta di glicogeno migliora la precipitazione del DNA e rende più facile visualizzare il pellet di DNA. - Aggiungere tre volte il volume del supernatante di etanolo freddo al 100%. Conservare a -80 °C durante la notte.
NOTA: la procedura può essere interrotta qui per essere ripresa in un secondo momento. Il campione può essere conservato a -80 °C per 1 ora o, in alternativa, durante la notte. La conservazione durante la notte migliora la precipitazione del DNA ed è quindi raccomandata.
- Isolare il DNA virale
- Il giorno seguente, centrifugare a 9650 x g per 15 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante per ottenere una pallina di DNA.
- Lavare il pellet tre volte con 1 ml di etanolo freddo al 70%, centrifugare a 9650 x g per 15 minuti e scartare il surnatante.
- Asciugare all'aria il pellet per circa 10 minuti. Risospendere il pellet in 10-50 μL di acqua distillata priva di nucleasi (a seconda delle dimensioni del pellet di DNA).
- Conservare i campioni a -20 °C per la lavorazione successiva o a 4 °C durante la notte per garantire la massima dissoluzione del DNA seguita dalla conservazione a -20 °C. In alternativa, procedere direttamente con il passaggio 5.
5. Controllo della concentrazione e della purezza del DNA
- Dopo aver pulito il piedistallo di un microspettrofotometro con un delicato tergicristallo, caricare 1 μL della preparazione del DNA.
- Notare la concentrazione del DNA nel campione. Controllare i rapporti di assorbanza in entrambi
e 
. Il DNA assorbirà a 260 nm, le proteine a 280 nm e le sostanze organiche come il fenolo assorbiranno a 230 nm. Un rapporto di 1,8-2 è considerato sufficiente per la PCR in tempo reale.
e 
. Il DNA assorbirà a 260 nm, le proteine a 280 nm e le sostanze organiche come il fenolo assorbiranno a 230 nm. Un rapporto di 1,8-2 è considerato sufficiente per la PCR in tempo reale.6. Quantificazione mediante reazione a catena della polimerasi in tempo reale
- Preparazione delle miscele di reazione PCR
- Posizionare 5 μL di una miscela di PCR in tempo reale verde SYBR in provette da 0,2 mL di PCR. Aggiungere a ciascun tubo 1 μL di primer in avanti da 7,5 pmol/μL e 1 μL di primer inverso da 7,5 pmol/μL. Sequenza di primer in avanti: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; sequenza di primer inversa: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. Il gene amplificato per determinare il numero di copie del genoma EBV è il gene Epstein-Barr virus small RNA 2 (EBER-2).
- A una delle provette, aggiungere 2 μL di acqua priva di nucleasi e 1 μL di DNA virale dal punto 4. Il volume totale della miscela di reazione è di 10 μL.
NOTA: A seconda della concentrazione di DNA nel campione, può essere necessaria una fase di diluizione. Il fattore di diluizione F deve essere annotato e sarà integrato nella formula al punto 6.3. - Preparare altre provette che verranno utilizzate come standard con numeri di copia del genoma EBV noti (1000, 2000, 5000, 10.000 e 54.000 copie).
- Eseguire le miscele PCR iniziando con una fase iniziale di attivazione a 95 °C per 5 minuti, quindi 40 cicli a 95 °C e 58 °C (ricottura) per 15 s e 30 s, rispettivamente.
- Generare una curva standard qPCR tracciando i valori Ct degli standard rispetto al log del numero di copie del genoma EBV per provetta standard. Utilizzando l'equazione del grafico della curva standard, derivare il numero di copie del genoma EBV nella provetta PCR contenente il DNA virale indotto. Quindi, utilizzare la seguente formula per calcolare la concentrazione della preparazione virale indotta:
Dove X è il numero di copie del genoma EBV derivate dalla curva standard e F è il fattore di diluizione utilizzato per impostare il DNA utilizzato per reazione PCR.
7. Controllo dell'attività biologica/infettività delle particelle virali
- Trasferire le cellule BC-3 da una piastra di coltura da 100 mm alla confluenza dell'80% a un tubo conico da 15 ml. La densità di semina delle cellule P3HR-1 è 1 x 106 cellule / ml. Mantenere in completo terreno di coltura RPMI (79% RPMI terreno di coltura, 20% siero bovino fetale, 1% antibiotico Pen-Streptococco) a 37 °C e 5% CO2, e passare ogni 3-4 giorni.
- Contare le cellule BC-3 nello stesso modo in cui sono state contate le cellule P3HR-1 seguendo il passaggio 1. A una piastra da 96 pozzetti, aggiungere 10celle 5 BC-3 a ciascun pozzetto. Utilizzare tre, sei, nove o 12 pozzetti per garantire l'importanza dei risultati e ridurre al minimo gli errori.
- Aggiungere un volume di stock virale a ciascun pozzetto, a seconda della concentrazione della preparazione virale determinata nel passaggio 6.3. Il MOI può variare e l'ottimizzazione di questo protocollo rivelerà il miglior MOI per l'infezione (si raccomanda un intervallo MOI di 2-50). Assicurarsi che il volume totale della miscela presente in ciascun pozzetto sia di 250 μL.
- Per determinare il volume richiesto, è necessario conoscere la concentrazione dello stock virale e selezionare un MOI. Ad esempio, se il MOI è 2, il numero di particelle virali aggiunte dovrebbe essere il doppio del numero di cellule. Calcolare il volume V dello stock virale richiesto utilizzando la formula:
, dove n è il numero di particelle virali necessarie e C la concentrazione nota dello stock virale
- Per determinare il volume richiesto, è necessario conoscere la concentrazione dello stock virale e selezionare un MOI. Ad esempio, se il MOI è 2, il numero di particelle virali aggiunte dovrebbe essere il doppio del numero di cellule. Calcolare il volume V dello stock virale richiesto utilizzando la formula:
- Incubare il contenuto della piastra a 96 pozzetti per 5 giorni. Dopo 5 giorni, trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un tubo da 1,5 ml.
- Centrifugare le provette a 120 x g per 8 minuti per separare le cellule dal terreno di coltura contenente virus. Sottoporre i pellet cellulari e i surnatanti all'estrazione del DNA seguita da quantificazione PCR in tempo reale per verificare la presenza di genomi virali in ogni frazione, valutando così l'infettività delle particelle virali.
, dove n è il numero di particelle virali necessarie e C la concentrazione nota dello stock viraleSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'obiettivo di questa procedura è quello di isolare le particelle di EBV in una sospensione con titolo virale noto, che potrebbe successivamente essere utilizzato per modellare l'infezione da EBV. Pertanto, è della massima importanza utilizzare concentrazioni ottimali dei diversi reagenti per ottenere la massima resa EBV dalla procedura.
È stato eseguito uno studio di ottimizzazione per determinare le concentrazioni di PMA e DMSO che produrrebbero il maggior numero di particelle EBV (Figura 2). Una concentrazione di DMSO dello 0,8% e una concentrazione di PMA di 35 ng/μL sono state ottimali e hanno portato a concentrazioni elevate di EBV. La concentrazione di particelle virali ottenuta dal protocollo di ottimizzazione era di 917.471 particelle virali / μL.
Figura 2: Copie del DNA EBV/mL ottenute dopo induzione di cellule P3HR-1 con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA). Le cellule P3HR-1 (10cellule 5 ) sono state coltivate da sole o indotte con diverse concentrazioni di PMA e DMSO utilizzando il protocollo qui descritto. Le barre di errore indicano la deviazione standard. È stato eseguito un t-test di Student confrontando le cellule trattate con PMA / PMA e DMSO con le cellule di controllo; * indica p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Affinché questo protocollo sia considerato efficace, il passo 6 dovrebbe rivelare una ragionevole concentrazione di particelle virali e il passo 7 dovrebbe mostrare che queste particelle virali sono effettivamente infettive. La linea cellulare BC-3 utilizzata nella fase 7 è EBV-negativa, quindi dopo la quantificazione del numero di copie del genoma EBV nei controlli negativi (che non sono stati sottoposti a questo protocollo), non dovrebbe essere rilevato DNA EBV.
Tuttavia, il DNA EBV dovrebbe essere rilevato sia nelle cellule che nel terreno di coltura dei pozzetti sperimentali (che sono stati sottoposti a questo protocollo), per i seguenti motivi: EBV che infetta le cellule BC-3 si replicherà all'interno di queste cellule, tenendo conto del fatto che il DNA EBV sarà rilevato nel pellet cellulare e dopo la replicazione, le cellule BC-3 rilasceranno particelle virali all'esterno; pertanto, il DNA EBV sarà rilevato nel terreno di coltura surnatante (dopo l'estrazione del DNA).
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Discussion
La produzione di particelle EBV è necessaria per comprendere la biologia di questo virus e le sue malattie associate. Qui abbiamo descritto la produzione di queste particelle dalla linea cellulare P3HR-1. Questa linea cellulare non è l'unica linea produttrice di EBV; infatti, particelle EBV sono state isolate anche dalle cellule B95-821,22 e dalla linea cellulare Raji18,19. Il ciclo litico EBV è stato indotto in queste cellule con n-butirrato. In alternativa, è possibile utilizzare esteri di forbolo come 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), noto anche come forbolo 12-miristate-13-acetato (PMA). Nel complesso, il protocollo qui descritto può essere utilizzato utilizzando queste celle invece della linea P3HR-1. Tuttavia, la linea B95-8 è stata derivata da un tamarino dal cotone-top (Saguinus oedipus) che è attualmente classificato come una specie di primate in pericolo critico23; Quindi, questa linea è raramente venduta da venditori con restrizioni sulla sua vendita e spedizione. Una licenza è richiesta anche dalla convenzione sul commercio internazionale delle specie di flora e fauna selvatiche minacciate di estinzione (CITES) per tutti gli ordini al di fuori del Regno Unito. Mentre la linea cellulare Raji è disponibile in commercio, la sintesi del DNA virale replicativo e la produzione di antigene del capside virale (VCA) non si verificano in queste cellule dopo l'induzione da parte di sostanze chimiche24,25. Tuttavia, questi possono essere facilmente indotti dalla complementazione dopo superinfezione con EBV isolato dalle cellule P3HR-120.
A causa dell'assenza di un saggio diretto della placca per l'enumerazione delle particelle EBV26, ci siamo basati su una reazione a catena della polimerasi in tempo reale. Ci sono altri metodi di quantificazione che possono funzionare altrettanto bene per il nostro scopo, come l'immunofluorescenza o la PCR che impiegano sonde fluorescenti che possono offrire una maggiore specificità. La scelta della PCR in tempo reale utilizzando gli standard di copia del genoma si basa sul fatto che questo è facilmente accessibile alla maggior parte dei laboratori, meno laborioso, meno tecnicamente impegnativo e più economico27. Pertanto, altri metodi di quantificazione potrebbero funzionare altrettanto bene e potrebbero essere utilizzati in base alla disponibilità e all'esperienza.
Uno dei passaggi più critici nel protocollo qui descritto è la placcatura delle celle nel passaggio 2.1 e la semina con un numero di cella all'interno dell'intervallo raccomandato per la dimensione della piastra. Un basso numero di cellule produce una bassa concentrazione di particelle virali, mentre un gran numero di cellule affolla la piastra, inibisce la crescita e la replicazione delle cellule e quindi rallenta il ciclo litico del virus. Questo è il motivo per cui è necessario prestare estrema attenzione durante il conteggio delle celle nella fase 1, il calcolo del volume richiesto della sospensione A e, infine, la placcatura delle celle nella fase 2.
Una limitazione del protocollo è l'assunzione che una copia del genoma EBV corrisponda a una particella virale. Sebbene questa ipotesi sia plausibile, non è possibile rilevare se tali particelle siano difettose o incomplete utilizzando questo test. Poiché non esistono test di formazione della placca per l'EBV come per molti altri virus, l'estrazione del DNA seguita dalla PCR in tempo reale rimane un metodo accettato per quantificare la preparazione virale. Un'altra limitazione è che il virus è indotto da una linea cellulare continua di mammiferi che può accumulare mutazioni su molti cicli di passaggio. Tali mutazioni possono influenzare il virus stesso, con conseguente alterazione delle proprietà in vivo o ex vivo del virus. Una potenziale soluzione sarebbe quella di sequenziare regolarmente il genoma cellulare e virale. In alternativa, le cellule possono essere scartate dopo alcuni passaggi e la coltura può essere riavviata nuovamente da un campione di cellule azotate liquide con un basso numero di passaggi precedenti. Vale anche la pena notare che le particelle EBV ottenute dalla linea cellulare P3HR-1 mancano dell'antigene EBNA2, che di solito è espresso nei linfociti B che sono latentemente infettati da EBV, come parte di sei proteine nucleari virali in totale28. La proteina EBNA2 attiva i promotori di geni che esprimono proteine associate al tipo III di latenza EBV. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che l'EBV carente di EBNA2 è in grado di formare tumori nei topi CBH e che la linea cellulare P3HR-1 rimane quindi un modello utile di linfomi EBV positivi29. D'altra parte, l'EBV delle cellule P3HR-1 può essere utilizzato per studiare i ruoli svolti da EBNA2 utilizzando un EBV EBNA2-positivo come controllo. In sintesi, l'EBV ottenuto da una linea cellulare continua P3HR-1 ha un significativo valore di ricerca; può essere utilizzato per studiare la biologia, l'infettività, la virulenza e molte altre proprietà dell'EBV.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il finanziamento per questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a ER dal Fondo di ricerca Asmar, dal Consiglio nazionale libanese per la ricerca scientifica (L-CNRS) e dal Piano di pratica medica (MPP) presso l'Università americana di Beirut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100x20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
References
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