Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Epstein-Barr Virüsünün P3HR1 Hücre Hattından İzolasyonu ve Nicelleştirilmesi

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64279
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

Summary

Bu protokol, Epstein-Barr virüs parçacıklarının, forbol 12-miristat 13-asetat ile viral litik döngüyü indükledikten sonra insan P3HR1 hücre hattından izole edilmesine izin verir. DNA daha sonra viral preparattan çıkarılır ve viral parçacık konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı PCR'ye tabi tutulur.

Abstract

Resmi olarak İnsan herpes virüsü 4 (HHV-4) olarak adlandırılan Epstein-Barr virüsü (EBV), ilk izole insan tümör virüsüdür . Dünyadaki yetişkin nüfusun yaklaşık% 90-95'i EBV tarafından enfekte edilmiştir. Moleküler biyoloji ve immünolojideki son gelişmelerle birlikte, hem in vitro hem de in vivo deneysel modellerin uygulanması, birçok hastalıkta EBV'nin patogenezi ve EBV ile ilişkili tümörigenez hakkında derin ve anlamlı bir bakış açısı sağlamıştır. Bu görselleştirilmiş deney çalışmasının amacı, EBV viral parçacıklarının P3HR1 hücre hattının hücrelerinden izolasyonuna genel bir bakış sağlamak ve ardından viral preparatın nicelleştirilmesidir. Aslen bir insan Burkitt lenfomasından izole edilen P3HR1 hücreleri, tip 2 EBV suşu olan bir P3HR1 virüsü üretebilir. EBV litik döngüsü, bu P3HR1 hücrelerinde forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ile tedavi edilerek indüklenebilir ve EBV viral parçacıkları elde edilebilir.

EBV parçacıklarının izolasyonu için bu protokolü kullanarak, P3HR1 hücreleri 37 ° C'de 5 gün ve% 5 CO2 35 ng / mL PMA içeren tam RPMI-1640 ortamında kültürlenir. Daha sonra, kültür ortamı, hücreleri peletlemek için 8 dakika boyunca 120 x g hızında santrifüj edilir. Virüs içeren süpernatant daha sonra toplanır ve EBV parçacıklarını peletlemek için 90 dakika boyunca 16.000 x g hızında döndürülür. Viral pelet daha sonra tam bir RPMI-1640 ortamında yeniden askıya alınır. Bunu, preparattaki EBV parçacıklarının konsantrasyonunu değerlendirmek için DNA ekstraksiyonu ve kantitatif gerçek zamanlı PCR izler.

Introduction

Epstein-Barr virüsü (EBV), izole edilen ilk insan tümör virüsüdür1. Resmi olarak İnsan herpes virüsü 4 (HHV-4)2 olarak adlandırılan EBV, herpes virüsü ailesinin gama herpes virüsü alt ailesinin bir parçasıdır ve Lenfokriptovirüs cinsinin prototipidir. Dünyadaki yetişkin nüfusun yaklaşık% 90-95'i virüs tarafından enfekteedilmiştir 3. Çoğu durumda, ilk enfeksiyon yaşamın ilk 3 yılında ortaya çıkar ve asemptomatiktir, ancak enfeksiyon ergenlik döneminde daha sonra ortaya çıkarsa, bulaşıcı mononükleoz4 olarak adlandırılan bir hastalığa yol açabilir. EBV, istirahat eden B hücrelerini enfekte edebilir ve onları virüsün latent olarak enfekte olmuş bir durum oluşturduğu ve koruduğu proliferatif B lenfoblastları haline getirebilir5. EBV herhangi bir zamanda yeniden aktive olabilir ve böylece tekrarlayan enfeksiyonlara yol açabilir6.

Son 50 yılda, bazı virüsler ile insan malignitelerinin gelişimi arasındaki ilişki giderek daha belirgin hale gelmiştir ve bugün tüm insan kanserlerinin% 15 ila% 20'sinin viral enfeksiyonlarla ilişkili olduğu tahmin edilmektedir7. EBV de dahil olmak üzere herpes virüsleri, bu tip tümör virüslerinin en iyi çalışılan örneklerinden bazılarıdır8. Aslında, EBV, Burkitt lenfoma (BL), Hodgkin lenfoma (HL), diffüz büyük B hücreli lenfoma ve immün sistemi baskılanmış konakçılarda lenfoproliferatif hastalıklar gibi birçok insan malignitesine neden olabilir 9,10. EBV'nin sistemik otoimmün hastalıkların gelişimi ile ilişkili olduğu da gösterilmiştir. Bu otoimmün hastalıkların bazı örnekleri romatoid artrit (RA), polimiyozit-dermatomiyozit (PM-DM), sistemik lupus eritematozus (SLE), karışık bağ dokusu hastalığı (MCTD) ve Sjögren sendromudur (SS)11. EBV ayrıca inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gelişimi ile ilişkilidir12.

Bu hastalıkların çoğu, hücre kültürü, fareler veya EBV ile enfekte olmuş diğer organizmalar kullanılarak incelenebilir veya modellenebilir. Bu nedenle, in vitro veya in vivo modeller13,14,15,16 olsun, hücreleri veya organizmaları enfekte etmek için EBV parçacıklarına ihtiyaç vardır, bu nedenle viral parçacıkların düşük maliyetle izole edilmesini sağlayan bir teknik geliştirme ihtiyacı vardır. Burada açıklanan protokol, EBV parçacıklarını nispeten erişilebilir bir hücre hattından güvenilir bir şekilde izole etmenin ve uygun maliyetli ve çoğu laboratuvar için kolayca bulunabilen gerçek zamanlı PCR kullanarak parçacıkları ölçmenin kolay bir yolu için kılavuzlar sağlar. Bu, EBV'yi farklı hücre hatlarından izole etmek için tarif edilen diğer birkaç yöntemle karşılaştırıldığında17,18,19,20.

P3HR-1, süspansiyonda büyüyen ve bir EBV tip 2 suşu ile gizli olarak enfekte olan bir BL hücre hattıdır. Bu hücre hattı bir EBV üreticisidir ve viral parçacıklar üretmek için indüklenebilir. Bu makalenin amacı, EBV parçacıklarının P3HR-1 hücre hattından izole edilmesine izin veren bir yöntemi sergilemek ve ardından daha sonra hem in vitro hem de in vivo EBV deneysel modelleri için kullanılabilecek viral stokun nicelleştirilmesidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: EBV potansiyel olarak biyotehlikeli bir malzeme olarak kabul edilmeli ve bu nedenle Biyogüvenlik Seviye 2 veya daha yüksek bir muhafaza altında kullanılmalıdır. Eldivenlerin yanı sıra laboratuvar önlüğü de giyilmelidir. Sıçramalara maruz kalma potansiyeli varsa, göz koruması da dikkate alınmalıdır. Aşağıdaki prosedür bir Biyolojik Güvenlik Dolabında yapılmalıdır.

1. P3HR1 hücrelerini sayma

  1. Santrifüj ve resüspane edici hücreler
    1. Hücre süspansiyonunu, devam eden bir P3HR1 hücre kültürünün 100 mm'lik bir kültür plakasından (veya T-25 şişesinden) %80 akıcılıkta 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. P3HR-1 hücrelerinin tohumlama yoğunluğu 1 x 106 hücre / mL'dir. Tam RPMI kültür ortamında (% 79 RPMI kültür ortamı,% 20 Fetal Sığır Serumu,% 1 Pen-Strep antibiyotik) 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun ve her 3-4 günde bir geçin.
    2. 120 x g'da 8 dakika santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın, hücre peletini 1 mL'lik tam RPMI kültür ortamında yeniden askıya alın ve iyice karıştırın (bu çözeltiye süspansiyon A adı verilecektir).
  2. Hücre süspansiyonunun sayım için hazırlanması
    1. 2 μL hücre süspansiyonu A'yı 8 μL kültür ortamı ile karıştırarak seyreltilmiş bir hücre süspansiyonu B hazırlayın. Süspansiyon elde etmek için B süspansiyonuna 10 μL% 0,4 tripan mavisi ekleyin C. Yumuşak pipetleme ile hazırlığı iyice karıştırın.
  3. Hemositometre kullanarak hücreleri sayma
    1. Hemositometreye bir cam kapak kayması yerleştirin ve 10 μL süspansiyon yükleyin C. Hemositometreyi bir ışık mikroskobu altına yerleştirin ve 40x mikroskop hedefini kullanarak hemositometre odasının dört kadranının her birinde maviye boyanmamış hücrelerin sayısını sayın (Şekil 1).
    2. Tripan mavisi ölü hücreleri maviye boyar; bu hücreleri veya her hemositometre kadranının üst, alt, sağ veya sol kenarlıklarından herhangi birine dokunan hücreleri saymayın.
    3. Aşağıdaki formülü kullanarak mL başına hücre konsantrasyonunu hesaplayın:
      Equation 1
      NOT: Sayılan kadran sayısı dörttür ve 10-4 mL, hemositometre üzerindeki karelerin hacmidir. Sayılması gereken dört kadran Şekil 1'de yeşil renkle gösterilmiştir. Formülde Sayılan Toplam Hücreler , 1, 2, 3 ve 4 kadranlarındaki hücre sayılarının toplamıdır. Şekil 1'de mavi renkle temsil edilen hücreler sayılmalı, kırmızı renkteki hücreler ise kadranın üst, sağ, alt veya sol kenarlıklarına dokundukları için sayılmamalıdır.

Figure 1
Şekil 1: Bir hemositometre odası kullanılarak hücre sayımı. Dört kadran bir ışık mikroskobu kullanılarak sayılır; bu kadranlar yeşil renkle temsil edilir. Burada açıklanan protokolün 1.3.3 adımında belirtilen formülde sayılan Toplam Hücreler , 1, 2, 3 ve 4 kadranlarındaki hücre sayısının toplamıdır. Mavi renkle gösterilen hücreler sayılmalı, kırmızı renkteki hücreler ise kadranının üst, sağ, alt veya sol kenarlıklarına dokundukları için sayılmamalıdır Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Tabağın kültür için hazırlanması

  1. 15 mL'lik bir konik tüpe bir hücre süspansiyonu A hacmi yerleştirin. Gerekli hacim, hücre sayısına bağlıdır. Ses seviyesini, 100 mm'lik bir kültür plakası için hücre sayısı kabaca 2,2 x 106 hücre olacak şekilde ayarlayın.
  2. Tüpe 5 mL komple kültür ortamı ekleyin ve ardından tüpün içeriğini 100 mm'lik bir kültür plakasına aktarın. Kültür plakasına 80 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
    NOT: DMSO ışığa duyarlıdır, bu nedenle ışığa dayanıklı bir kapta saklanmalı veya alüminyum folyo gibi opak bir malzeme ile kaplanmalıdır.
  3. Tüpe 350 μL 1 mg / mL forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ekleyin. PMA'nın nihai konsantrasyonu 35 ng / mL olmalı ve DMSO'nunki% 0.08 olmalıdır.
    DİKKAT: PMA toksik, aşındırıcı ve kanserojendir, bu nedenle aşırı dikkatle kullanılmalıdır. PMA ışığa duyarlıdır, bu nedenle ışığa dayanıklı bir kapta saklanmalı veya alüminyum folyo gibi opak bir malzeme ile kaplanmalıdır.
  4. Toplam hacmin 10 mL olması için 4,27 mL kültür ortamı ekleyin. Borunun içeriğini eğerek karıştırın, ardından içeriği 100 mm'lik bir kültür plakasına aktarın. Plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de,% 5 CO2'de 5 gün bekletin.

3. Epstein-Barr virüs parçacıklarının indüksiyonu ve izolasyonu

  1. İnkübatörde 5 gün sonra, hücreleri peletlemek için plakanın içeriğini 8 dakika boyunca 120 x g'de santrifüj yapın. Hücresiz, virüs içeren süpernatantı toplayın ve hücre peletini atın.
  2. Virüs parçacıklarını peletlemek için süpernatantı 4 ° C'de 90 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve virüs peletini 5 mL kültür ortamında yeniden askıya alın.
    NOT: Fosfat tamponlu salin (PBS), virüs peletini kültür ortamı yerine yeniden askıya almak için kullanılabilir.
  3. Aliquot, her biri 250 μL viral süspansiyon içeren 20 tüp halinde elde edilen viral süspansiyondur. Süspansiyonu -80 °C'de saklayın.

4. Viral parçacıklardan DNA ekstraksiyonu

DİKKAT: Fenol kullanılırken aşırı özen gösterilmelidir, çünkü toksik ve aşındırıcıdır ve ciddi yanıklara neden olma yeteneğine sahiptir. Fenol ışığa duyarlıdır ve ışık veya hava ile temas ettiğinde oksitlenir. Işığa dayanıklı bir kapta saklayın veya alternatif olarak fenol tüpünü alüminyum folyo gibi opak bir malzeme ile örtün.

  1. Proteinlerin DNA'dan ayrılması
    1. 250 μL tüplerden birine 500 μL TrisCl doymuş fenol ekleyin. Pembe bir emülsiyon elde etmek için 100 μL su (sulu fazın hacmini arttırmak için) ve vorteks kuyusu ekleyin. 9650 x g'da 15 dakika santrifüj.
  2. DNA çökeltmesi
    1. Süpernatantı (şeffaf, sulu faz) toplayın ve yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. Süpernatanın soğuk sodyum asetat hacminin 1/10'una eşdeğer bir miktar ekleyin (3 M, pH 5.2) ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. 1 μL 20 mg/mL glikojen ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır, ancak glikojen ilavesi DNA çökelmesini arttırır ve DNA peletini görselleştirmeyi kolaylaştırır.
    3. Süper natantın soğuk% 100 etanol hacminin üç katını ekleyin. Gece boyunca -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Prosedür daha sonra devam etmek üzere burada durdurulabilir. Numune -80 °C'de 1 saat veya alternatif olarak gece boyunca saklanabilir. Gece boyunca depolama, DNA çökelmesini arttırır ve bu nedenle tavsiye edilir.
  3. Viral DNA'nın izole edilmesi
    1. Ertesi gün, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 9650 x g'de santrifüj yapın ve bir DNA peleti elde etmek için süpernatantı atın.
    2. Peleti 1 mL soğuk% 70 etanol ile üç kez yıkayın, 15 dakika boyunca 9650 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
    3. Peleti yaklaşık 10 dakika boyunca hava ile kurulayın. Peleti 10-50 μL nükleaz içermeyen damıtılmış suda (DNA peletinin boyutuna bağlı olarak) yeniden askıya alın.
    4. Numuneleri daha sonraki işlemler için -20 ° C'de veya maksimum DNA çözünmesini sağlamak için gece boyunca 4 ° C'de saklayın ve ardından -20 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, doğrudan adım 5 ile devam edin.

5. DNA konsantrasyonunu ve saflığını kontrol etmek

  1. Bir mikrospektrofotometrenin kaidesini hassas bir görev sileceği ile temizledikten sonra, DNA preparatının 1 μL'sini yükleyin.
  2. Numunedeki DNA konsantrasyonuna dikkat edin. Her ikisinde de Equation 2 absorbans oranlarını kontrol edin ve Equation 3. DNA 260 nm'de, proteinler 280 nm'de emilecek ve fenol gibi organik maddeler 230 nm'de emecektir. Gerçek zamanlı PCR için 1.8-2 oranı yeterli kabul edilir.

6. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile nicelleştirme

  1. PCR reaksiyon karışımlarının hazırlanması
    1. 5 μL SYBR yeşil gerçek zamanlı PCR karışımını 0,2 mL PCR tüplerine yerleştirin. Her tüpe 1 μL 7.5 pmol / μL ileri astar ve 1 μL 7.5 mmol / μL ters astar ekleyin. İleri astar dizisi: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; ters astar dizisi: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. EBV genom kopya sayısını belirlemek için güçlendirilen gen, Epstein-Barr virüsü küçük RNA 2 (EBER-2) genidir.
    2. Tüplerden birine, adım 4'ten 2 μL nükleaz içermeyen su ve 1 μL viral DNA ekleyin. Reaksiyon karışımının toplam hacmi 10 μL'dir.
      NOT: Numunedeki DNA konsantrasyonuna bağlı olarak, bir seyreltme adımı gerekebilir. Seyreltme faktörü F not edilmeli ve adım 6.3'teki formüle entegre edilecektir.
    3. Bilinen EBV genom kopya numaraları (1000, 2000, 5000, 10.000 ve 54.000 kopya) ile standart olarak kullanılacak diğer tüpleri hazırlayın.
  2. PCR karışımlarını 5 dakika boyunca 95 ° C'de aktivasyonun ilk adımından başlayarak, daha sonra sırasıyla 15 s ve 30 s için 95 ° C'de 40 döngü ve 58 ° C'de (tavlama) çalıştırın.
  3. Standartların Ct değerlerini, standart tüp başına EBV genom kopyası sayısının günlüğüne göre çizerek bir qPCR standart eğrisi oluşturun. Standart eğri grafiği denklemini kullanarak, indüklenen viral DNA'yı içeren PCR tüpündeki EBV genom kopyalarının sayısını türetir. Ardından, indüklenen viral preparatın konsantrasyonunu hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
    Equation 4
    Burada X, standart eğriden türetilen EBV genom kopyalarının sayısıdır ve F, PCR reaksiyonu başına kullanılan DNA'yı ayarlamak için kullanılan seyreltme faktörüdür.

7. Viral parçacıkların biyolojik aktivitesinin/bulaşıcılığının kontrolü

  1. BC-3 hücrelerini %80 akıcılıkta 100 mm'lik bir kültür plakasından 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. P3HR-1 hücrelerinin tohumlama yoğunluğu 1 x 106 hücre / mL'dir. Tam RPMI kültür ortamında (% 79 RPMI kültür ortamı,% 20 Fetal Sığır Serumu,% 1 Pen-Strep antibiyotik) 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun ve her 3-4 günde bir geçin.
  2. BC-3 hücrelerini, adım 1'i izleyerek P3HR-1 hücrelerinin sayıldığı gibi sayın. 96 kuyucuklu bir plakaya, her bir kuyucuğa 10adet 5 BC-3 hücresi ekleyin. Sonuçların önemini sağlamak ve hataları en aza indirmek için üç, altı, dokuz veya 12 kuyu kullanın.
  3. Adım 6.3'te belirlenen viral preparatın konsantrasyonuna bağlı olarak her bir kuyucuğa bir miktar viral stok ekleyin. MOI değişebilir ve bu protokolün optimizasyonu enfeksiyon için en iyi MOI'yi ortaya çıkaracaktır (2-50'lik bir MOI aralığı önerilir). Her bir kuyucukta bulunan karışımın toplam hacminin 250 μL olduğundan emin olun.
    1. Gerekli hacmi belirlemek için, viral stokun konsantrasyonu bilinmeli ve bir MOI seçilmelidir. Örneğin, MOI 2 ise, eklenen viral parçacıkların sayısı hücre sayısının iki katı olmalıdır. Formülü kullanarak gerekli viral stokun V hacmini hesaplayın: , n, ihtiyaç duyulan viral parçacıkların sayısı ve C viral stokun bilinen konsantrasyonudur. Equation 5
  4. 96 kuyucuklu plakanın içeriğini 5 gün boyunca inkübe edin. 5 gün sonra, her bir kuyucuğun içeriğini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  5. Hücreleri virüs içeren kültür ortamından ayırmak için tüpleri 8 dakika boyunca 120 x g'de santrifüj yapın. Hücre peletlerini ve süpernatantları DNA ekstraksiyonuna tabi tutun, ardından her fraksiyonda viral genomların varlığını kontrol etmek için gerçek zamanlı PCR nicelemesi yapın, böylece viral parçacıkların bulaşıcılığını değerlendirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu prosedürün amacı, EBV parçacıklarını, daha sonra EBV enfeksiyonunu modellemek için kullanılabilecek bilinen viral titreye sahip bir süspansiyonda izole etmektir. Bu nedenle, prosedürden en yüksek EBV verimini elde etmek için farklı reaktiflerin optimal konsantrasyonlarının kullanılması son derece önemlidir.

En yüksek sayıda EBV partikülü verecek PMA ve DMSO konsantrasyonlarını belirlemek için bir optimizasyon denemesi yapılmıştır (Şekil 2). % 0.8'lik bir DMSO konsantrasyonu ve 35 ng / μL'lik bir PMA konsantrasyonu optimaldi ve yüksek EBV konsantrasyonlarına neden oldu. Optimizasyon protokolünden elde edilen viral parçacıkların konsantrasyonu 917.471 viral partikül / μL idi.

Figure 2
Şekil 2: P3HR-1 hücrelerinin forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ile indüklenmesi üzerine elde edilen EBV DNA kopyaları/mL. P3HR-1 hücreleri (105 hücre) tek başına kültürlendi veya burada açıklanan protokol kullanılarak farklı PMA ve DMSO konsantrasyonları ile indüklendi. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bir öğrencinin t-testi, PMA / PMA ve DMSO ile tedavi edilen hücreleri kontrol hücreleri ile karşılaştırarak gerçekleştirildi; * p < 0,05 gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokolün etkili olarak kabul edilmesi için, adım 6 makul bir viral partikül konsantrasyonunu ortaya çıkarmalı ve adım 7 bu viral parçacıkların gerçekten bulaşıcı olduğunu göstermelidir. Adım 7'de kullanılan BC-3 hücre hattı EBV-negatiftir, bu nedenle negatif kontrollerdeki EBV genom kopya sayılarının nicelleştirilmesi üzerine (bu protokole tabi tutulmayan), EBV DNA'sı tespit edilmemelidir.

Bununla birlikte, EBV DNA'sı, aşağıdaki nedenlerden dolayı deney kuyularının (bu protokole tabi tutulan) hem hücrelerinde hem de kültür ortamında tespit edilmelidir: BC-3 hücrelerini enfekte eden EBV, bu hücrelerin içinde çoğalacak, EBV DNA'sının hücre peletinde tespit edileceği ve replikasyon üzerine, BC-3 hücrelerinin viral parçacıkları dışarıya dökeceği gerçeğini hesaba katacaktır; Böylece, EBV DNA'sı kültür ortamı süpernatantında (DNA ekstraksiyonundan sonra) tespit edilecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

EBV parçacıklarının üretimi, bu virüsün biyolojisini ve ilişkili hastalıklarını anlamak için gereklidir. Burada bu parçacıkların üretimini P3HR-1 hücre hattından tanımladık. Bu hücre hattı tek EBV üretici hattı değildir; Aslında, EBV parçacıkları ayrıca B95-8 hücreleri21,22 ve Raji hücre hattı18,19'dan izole edilmiştir. EBV litik döngüsü bu hücrelerde n-bütirat ile indüklenmiştir. Alternatif olarak, forbol 12-miristat-13-asetat (PMA) olarak da bilinen 12-O-tetradekanoylphorbol-13-asetat (TPA) gibi forbol esterleri kullanılabilir. Genel olarak, burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, P3HR-1 hattı yerine bu hücreleri kullanarak kullanılabilir. Bununla birlikte, B95-8 hattı, şu anda kritik olarak nesli tükenmekte olan bir primat türü olarak sınıflandırılan pamuk üstü bir tamarinden (Saguinus oidipus) türetilmiştir23; Bu nedenle, bu hat nadiren satış ve nakliyesinde kısıtlamalar olan satıcılar tarafından satılmaktadır. Birleşik Krallık dışındaki tüm siparişler için nesli tükenmekte olan yabani fauna ve flora türlerinin (CITES) uluslararası ticaretine ilişkin sözleşme uyarınca bir lisans da gereklidir. Raji hücre hattı ticari olarak temin edilebilirken, replikatif viral DNA'nın sentezi ve viral kapsid antijeninin (VCA) üretimi, kimyasallar tarafından indüksiyondan sonra bu hücrelerde gerçekleşmez24,25. Bununla birlikte, bunlar P3HR-1 hücrelerinden izole edilen EBV ile süperenfeksiyon sonrası kompleman ile kolayca indüklenebilir20.

EBV partikülleri26'nın sayımı için doğrudan plak testinin bulunmaması nedeniyle, gerçek zamanlı bir polimeraz zincir reaksiyonuna güvendik. İmmünofloresan veya gelişmiş özgüllük sunabilecek floresan probları kullanan PCR gibi amacımız için eşit derecede iyi çalışabilecek başka niceleme yöntemleri de vardır. Genom kopya standartlarını kullanan gerçek zamanlı PCR seçimi, bunun çoğu laboratuvar için kolayca erişilebilir olması, daha az zahmetli, teknik olarak daha az zorlayıcı ve daha uygun maliyetli olması gerçeğine dayanmaktadır27. Bu nedenle, diğer niceleme yöntemleri eşit derecede iyi çalışabilir ve kullanılabilirlik ve deneyime dayanarak kullanılabilir.

Burada detaylandırılan protokoldeki en kritik adımlardan biri, adım 2.1'deki hücrelerin kaplanması ve plakanın boyutu için önerilen aralıkta bir hücre numarası ile tohumlanmasıdır. Düşük sayıda hücre, düşük konsantrasyonda viral parçacıklar verirken, çok sayıda hücre plakayı doldurur, hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını engeller ve dolayısıyla virüsün litik döngüsünü yavaşlatır. Bu nedenle, 1. adımdaki hücreleri sayarken, gerekli süspansiyon A hacmini hesaplarken ve son olarak 2. adımda hücreleri kaplarken aşırı özen gösterilmelidir.

Protokolün bir sınırlaması, EBV genomunun bir kopyasının bir viral parçacığa karşılık geldiği varsayımıdır. Bu varsayım makul olsa da, bu tür parçacıkların kusurlu veya eksik olup olmadığı bu tahlil kullanılarak tespit edilemez. Diğer birçok virüs için olduğu gibi EBV için plak oluşum testleri olmadığından, DNA ekstraksiyonu ve ardından gerçek zamanlı PCR, viral preparatı ölçmek için kabul edilen bir yöntem olmaya devam etmektedir. Diğer bir sınırlama, virüsün, birçok geçiş turunda mutasyonlar biriktirebilecek sürekli bir memeli hücre hattından indüklenmesidir. Bu tür mutasyonlar virüsün kendisini etkileyebilir ve muhtemelen virüsün in vivo veya ex vivo özelliklerinin değişmesine neden olabilir. Potansiyel bir çözüm, hücresel ve viral genomu düzenli olarak dizilemek olacaktır. Alternatif olarak, hücreler birkaç pasajdan sonra atılabilir, ve kültür, düşük sayıda önceki pasajlara sahip sıvı azot depolanmış bir hücre örneğinden yeniden başlatılabilir. P3HR-1 hücre hattından elde edilen EBV parçacıklarının, genellikle EBV ile latent olarak enfekte olmuş B lenfositlerinde eksprese edilen EBNA2 antijeninden yoksun olduğunu da belirtmek gerekir. toplam28. EBNA2 proteini, EBV gecikmesinin tip III ile ilişkili proteinleri eksprese eden genlerin promotörlerini aktive eder. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, EBNA2 eksikliği olan EBV'nin CBH farelerde tümörler oluşturabildiğini ve P3HR-1 hücre hattının bu nedenle EBV pozitif lenfomaların29'unun yararlı bir modeli olmaya devam ettiğini göstermiştir. Öte yandan, P3HR-1 hücrelerinden EBV, EBNA2-pozitif bir EBV'yi kontrol olarak kullanırken EBNA2'nin oynadığı rolleri incelemek için kullanılabilir. Özetle, sürekli bir P3HR-1 hücre hattından elde edilen EBV, önemli bir araştırma değerine sahiptir; EBV'nin biyolojisini, blötivitesini, virülansını ve diğer birçok özelliğini incelemek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışmanın finansmanı, Asmar Araştırma Fonu, Lübnan Ulusal Bilimsel Araştırma Konseyi (L-CNRS) ve Beyrut Amerikan Üniversitesi'ndeki Tıbbi Uygulama Planı'ndan (MPP) ER'ye yapılan hibelerle desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL thin-walled PCR tubes Thermo Scientific AB0620 Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips Corning 4807 Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette BrandTech 704770
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4488
1000 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette Eppendorf 3123000063
100x20 mm Cuture Plates Sarstedt 83.1802
10-100 µL Pipette BrandTech 704774
15 mL Conical Tubes Corning 430791
200 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette Eppendorf 3123000055
50 mL Conical Tubes Corning 430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler Bio-Rad 184-1000
DMSO Amresco 0231
DNase/RNase Free Water Zymo Research W1001-1
EBER Primers Macrogen N/A Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards) Vircell MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) Fischer Chemical E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum Sigma F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge Thermo Scientific 10651805
Glycogen Solution Qiagen 158930
Hemocytometer BOECO BOE 01
Inverted Light Microscope Zeiss Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5121
Microcentrifuge Tube Costar (Corning) 3621 Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line ATCC HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution Biowest L0022
Phenol VWR 20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Pipette Filler Thermo Scientific 9501
Precision Wipes Kimtech 7552
RPMI-1640 Culture Medium Sigma R7388
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030
Sodium Acetate Riedel-de Haën (Honeywell) 25022
Spectrophotomer DeNovix DS-11
Tris-HCl Sigma T-3253
Trypan Blue Solution Sigma T8154
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 4121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
  2. Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
  3. Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
  4. Manet, E. Encyclopedia of Cancer. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).
  5. Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
  6. Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
  7. Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
  8. El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
  9. Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
  10. Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
  11. Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
  12. Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
  13. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
  14. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  15. Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
  16. Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
  17. Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
  18. Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
  19. Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
  20. Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  21. Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
  22. Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
  23. Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
  24. Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
  25. Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  26. Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
  27. Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
  28. Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
  29. Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 187
Epstein-Barr Virüsünün P3HR1 Hücre Hattından İzolasyonu ve Nicelleştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S.,… More

Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S., Rahal, E. A. Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line. J. Vis. Exp. (187), e64279, doi:10.3791/64279 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter