Summary
이 프로토콜은 phorbol 12-myristate 13-아세테이트로 바이러스 용해 주기를 유도할 때 인간 P3HR1 세포주에서 Epstein-Barr 바이러스 입자의 분리를 허용합니다. 이어서 바이러스 제제에서 DNA를 추출하고 실시간 PCR을 수행하여 바이러스 입자 농도를 정량화합니다.
Abstract
공식적으로 인간 헤르페스 바이러스 4 (HHV-4)로 지정된 엡스타인-바 바이러스 (EBV)는 최초의 분리 된 인간 종양 바이러스입니다. 전 세계 성인 인구의 거의 90-95%가 EBV에 감염되어 있습니다. 최근 분자생물학 및 면역학의 발전으로 시험관 내 및 생체 내 실험 모델의 적용은 EBV 관련 종양 발생뿐만 아니라 많은 질병에서 EBV의 발병 기전에 대한 깊고 의미 있는 통찰력을 제공했습니다. 이 시각화된 실험 논문의 목적은 P3HR1 세포주의 세포에서 EBV 바이러스 입자를 분리한 후 바이러스 제제를 정량화하는 개요를 제공하는 것입니다. 원래 인간 버킷 림프종에서 분리된 P3HR1 세포는 제2형 EBV 균주인 P3HR1 바이러스를 생성할 수 있습니다. EBV 용균 주기는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 처리하여 이러한 P3HR1 세포에서 유도되어 EBV 바이러스 입자를 생성할 수 있습니다.
EBV 입자의 분리를 위해 이 프로토콜을 사용하여 P3HR1 세포를 35ng/mL PMA를 포함하는 완전한 RPMI-1640 배지에서 37°C 및 5%CO2 에서 5일 동안 배양합니다. 이어서, 배양 배지를 120 x g 의 속도로 8분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 그런 다음 바이러스 함유 상청액을 수집하고 16,000 x g 의 속도로 90분 동안 회전시켜 EBV 입자를 펠릿화합니다. 그런 다음 바이러스 펠릿을 완전한 RPMI-1640 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 DNA 추출 및 정량적 실시간 PCR을 수행하여 제제에서 EBV 입자의 농도를 평가합니다.
Introduction
엡스타인-바 바이러스(EBV)는 분리된 최초의 인간 종양 바이러스입니다1. 공식적으로 인간 헤르페스 바이러스 4 (HHV-4)2라고하는 EBV는 헤르페스 바이러스 계열의 감마 헤르페스 바이러스 아과의 일부이며 림프 암호 바이러스 속의 원형입니다. 전 세계 성인 인구의 거의 90-95%가 바이러스에 감염됩니다3. 대부분의 경우 초기 감염은 생후 3 년 이내에 발생하며 무증상이지만 청소년기에 늦게 감염이 발생하면 전염성 단핵구증4이라고하는 질병이 발생할 수 있습니다. EBV는 휴지기 B 세포를 감염시켜 바이러스가 잠복 감염 상태를 확립하고 유지하는 증식성 B 림프구가 되도록 유도할 수 있습니다5. EBV는 언제든지 재활성화될 수 있으므로 재발성 감염으로 이어질 수 있습니다6.
지난 50년 동안, 일부 바이러스와 인간 악성 종양의 발달 사이의 연관성이 점점 더 명백해졌고, 오늘날 모든 인간 암의 15% 내지 20%가 바이러스 감염과 관련이 있는 것으로 추정된다7. EBV를 포함한 헤르페스 바이러스는 이러한 유형의 종양 바이러스8에 대해 가장 잘 연구 된 예 중 일부입니다. 실제로 EBV는 버킷 림프종(BL), 호지킨 림프종(HL), 미만성 거대 B 세포 림프종 및 면역저하 숙주 9,10의 림프증식성 질환과 같은 다양한 유형의 인간 악성 종양을 유발할 수 있습니다. EBV는 또한 전신성 자가면역 질환의 발병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 자가면역 질환의 예로는 류마티스 관절염(RA), 다발성 근염-피부근염(PM-DM), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 혼합 결합 조직 질환(MCTD) 및 쇼그렌 증후군(SS)11이 있습니다. EBV는 또한 염증성 장 질환(IBD)의 발병과 관련이 있습니다12.
이러한 질병의 대부분은 세포 배양, 마우스 또는 EBV에 감염된 기타 유기체를 사용하여 연구하거나 모델링할 수 있습니다. 그렇기 때문에 EBV 입자는 시험관 내 또는 생체 내 모델13,14,15,16에 관계없이 세포 또는 유기체를 감염시키는 데 필요하므로 저렴한 비용으로 바이러스 입자를 분리 할 수있는 기술을 개발해야합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 상대적으로 접근 가능한 세포주에서 EBV 입자를 안정적으로 분리하고 대부분의 실험실에서 비용 효율적이고 쉽게 사용할 수 있는 real-time PCR을 사용하여 입자를 정량하는 쉬운 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이는 상이한 세포주17,18,19,20으로부터 EBV를 단리하기 위해 기술된 몇몇 다른 방법과 비교된다.
P3HR-1은 현탁액에서 자라며 EBV 유형 2 균주에 잠복하는 BL 세포주입니다. 이 세포주는 EBV 생산자이며 바이러스 입자를 생성하도록 유도 될 수 있습니다. 이 원고의 목표는 P3HR-1 세포주에서 EBV 입자를 분리한 다음 나중에 시험관 내 및 생체 내 EBV 실험 모델 모두에 사용할 수 있는 바이러스 스톡의 정량화를 허용하는 방법을 선보이는 것입니다.
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Protocol
알림: EBV는 잠재적으로 생물학적 위험 물질로 간주되어야 하므로 생물안전 레벨 2 이상의 격리에서 취급해야 합니다. 실험실 코트와 장갑을 착용해야합니다. 튀김에 노출 될 가능성이있는 경우 눈 보호도 고려해야합니다. 다음 절차는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.
1. P3HR1 세포 계수
- 세포 원심분리 및 재현탁
- 진행 중인 P3HR1 세포 배양의 100mm 배양 플레이트(또는 T-25 플라스크)에서 80% 컨플루언시로 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. P3HR-1 세포의 파종 밀도는 1 x 106 세포/mL입니다. 완전한 RPMI 배양 배지(79% RPMI 배양 배지, 20% 소 태아 혈청, 1% Pen-Strep 항생제)를 37°C 및 5%CO2에서 유지하고, 3-4일마다 계대배양한다.
- 120 x g에서 8분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 1mL의 완전한 RPMI 배양 배지에 재현탁시키고, 잘 혼합한다(이 용액을 현탁액 A라고 함).
- 계수를 위한 세포 현탁액 준비
- 2 μL의 세포 현탁액 A를 8 μL의 배양 배지와 혼합하여 희석된 세포 현탁액 B를 제조한다. 현탁액 B에 0.4% 트리판 블루 10μL를 추가하여 현탁액 C를 얻습니다.
- 혈구계를 사용한 세포 계수
- 혈구계에 유리 커버슬립을 놓고 현탁액 C 10μL를 로드합니다. 혈구계를 광학 현미경 아래에 놓고 40x 현미경 대물렌즈를 사용하여 혈구계 챔버의 4개 사분면 각각에서 파란색으로 염색되지 않은 세포 수를 계산합니다(그림 1).
- 트리판 블루는 죽은 세포를 파란색으로 염색합니다. 이러한 세포나 각 혈구계 사분면의 위쪽, 아래쪽, 오른쪽 또는 왼쪽 경계에 닿는 세포는 계산하지 마십시오.
- 다음 공식을 사용하여 mL 당 세포 농도를 계산하십시오.
참고 : 계산 된 사분면의 수는 4 개이며 10-4mL 는 혈구 측정기의 사각형 부피입니다. 계산해야 하는 4개의 사분면은 그림 1에서 녹색으로 표시됩니다. 수식에서 계산된 총 셀 수는 1, 2, 3 및 4 사분면에 있는 셀 수의 합계입니다. 그림 1 에서 파란색으로 표시된 셀은 계산해야 하지만 빨간색으로 표시된 셀은 사분면의 위쪽, 오른쪽, 아래쪽 또는 왼쪽 테두리에 닿기 때문에 계산해서는 안 됩니다.
그림 1: 혈구계 챔버를 사용한 세포 계수. 4 개의 사분면은 광학 현미경을 사용하여 계산됩니다. 이 사분면은 녹색으로 표시됩니다. 여기에 설명된 프로토콜의 단계 1.3.3에 표시된 공식에서 계수된 총 세포 수는 사분면 1, 2, 3 및 4에 있는 세포 수의 합입니다. 파란색으로 표시된 셀은 계산해야 하지만 빨간색으로 표시된 셀은 사분면의 위쪽, 오른쪽, 아래쪽 또는 왼쪽 테두리에 닿기 때문에 계산해서는 안 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 문화를위한 접시 준비
- 부피의 세포 현탁액 A를 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 필요한 부피는 셀 수에 따라 다릅니다. 세포 수가 100mm 배양 플레이트에 대해 대략 2.2 x 106 세포가 되도록 부피를 조정합니다.
- 5mL의 완전한 배양 배지를 튜브에 추가한 다음 튜브의 내용물을 100mm 배양 플레이트로 옮깁니다. 80μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 배양 플레이트에 추가합니다.
알림: DMSO는 빛에 민감하므로 내광성 용기에 보관하거나 알루미늄 호일과 같은 불투명 한 재료로 덮어야합니다. - 350 μL의 1 mg/mL 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 튜브에 추가합니다. PMA의 최종 농도는 35ng/mL이어야 하고 DMSO의 최종 농도는 0.08%여야 합니다.
주의 : PMA는 독성, 부식성 및 발암 성이므로 극도의주의를 기울여 취급해야합니다. PMA는 빛에 민감하므로 내광성 용기에 보관하거나 알루미늄 호일과 같은 불투명 한 물질로 덮어야합니다. - 총 부피가 10mL가 되도록 배양액 4.27mL를 추가합니다. 튜브의 내용물을 기울여 혼합한 다음 내용물을 100mm 배양 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 5일 동안 세포 배양 배양기에 방치한다.
3. 엡스타인-바 바이러스 입자의 유도 및 분리
- 인큐베이터에서 5일 후, 플레이트의 내용물을 120 x g 에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 무세포, 바이러스-함유 상청액을 수집하고 세포 펠릿을 폐기한다.
- 상청액을 16,000 x g 에서 4°C에서 90분 동안 원심분리하여 바이러스 입자를 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 바이러스 펠릿을 5mL의 배양 배지에 재현탁시킵니다.
알림: 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 배양 배지 대신 바이러스 펠릿을 재현탁할 수 있습니다. - 수득한 바이러스 현탁액을 각각 250μL의 바이러스 현탁액을 함유하는 20개의 튜브로 분취한다. 현탁액을 -80°C에서 보관한다.
4. 바이러스 입자에서 DNA 추출
주의 : 페놀은 독성과 부식성이 있으며 심각한 화상을 입을 수 있으므로 취급 할 때는 각별히주의해야합니다. 페놀은 빛에 민감하며 빛이나 공기와 접촉하면 산화됩니다. 내광성 용기에 보관하거나 알루미늄 호일과 같은 불투명 한 물질로 페놀 튜브를 덮으십시오.
- DNA에서 단백질 분리
- 500μL 튜브 중 하나에 250μL의 TrisCl 포화 페놀을 추가합니다. 100 μL의 물 (수성 상의 부피를 증가시키기 위해)을 첨가하고 잘 와동시켜 분홍색 에멀젼을 얻는다. 9650 x g에서 15분 동안 원심분리합니다.
- DNA 침전
- 상청액(투명, 수성 상)을 수집하여 새로운 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 상청액 부피의 1/10에 해당하는 차가운 아세트산나트륨(3M, pH 5.2)을 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 20mg/mL 글리코겐 1μL를 넣고 피펫팅으로 혼합합니다.
참고: 이 단계는 선택 사항이지만 글리코겐을 추가하면 DNA 침전이 향상되고 DNA 펠릿을 더 쉽게 시각화할 수 있습니다. - 상청액의 차가운 100 % 에탄올 부피의 3 배를 첨가하십시오. -80°C에서 밤새 보관하십시오.
참고: 이 절차는 나중에 다시 시작하기 위해 여기에서 중지할 수 있습니다. 샘플은 -80°C에서 1시간 동안 또는 대안적으로 밤새 보관할 수 있습니다. 하룻밤 보관은 DNA 침전을 향상 시키므로 권장됩니다.
- 바이러스 DNA 분리
- 다음날, 4°C에서 15분 동안 9650 x g 에서 원심분리하고, 상층액을 버리고 DNA 펠렛을 얻었다.
- 펠릿을 차가운 70% 에탄올 1mL로 3회 세척하고 9650 x g 에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
- 펠릿을 약 10분 동안 자연 건조시킵니다. 10-50 μL의 뉴클레아제가 없는 증류수에 펠릿을 재현탁합니다(DNA 펠릿의 크기에 따라 다름).
- 나중에 처리를 위해 샘플을 -20 ° C에서 보관하거나 최대 DNA 용해를 보장하기 위해 밤새 4 ° C에서 보관 한 다음 -20 ° C에서 보관하십시오. 또는 5단계로 직접 진행합니다.
5. DNA 농도 및 순도 확인
- 섬세한 작업 와이퍼로 마이크로 분광 광도계의 받침대를 청소 한 후 1 μL의 DNA 제제를로드합니다.
- 샘플의 DNA 농도에 유의하십시오. 와
의 
흡광도 비율을 모두 확인하십시오. DNA는 260nm에서, 단백질은 280nm에서, 페놀과 같은 유기 물질은 230nm에서 흡수합니다. 1.8-2의 비율은 실시간 PCR에 충분한 것으로 간주됩니다.
의 
흡광도 비율을 모두 확인하십시오. DNA는 260nm에서, 단백질은 280nm에서, 페놀과 같은 유기 물질은 230nm에서 흡수합니다. 1.8-2의 비율은 실시간 PCR에 충분한 것으로 간주됩니다.6. 실시간 중합효소연쇄반응에 의한 정량화
- PCR 반응 혼합물의 제조
- 5 μL의 SYBR 녹색 실시간 PCR 혼합물을 0.2 mL PCR 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 1μL의 7.5pmol/μL 정방향 프라이머와 1μL의 7.5pmol/μL 역방향 프라이머를 추가합니다. 순방향 프라이머 서열: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACA-3'; 역 프라이머 서열 : 5'- ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. EBV 게놈 복제 수를 결정하기 위해 증폭 된 유전자는 엡스타인-바 바이러스 작은 RNA 2 (EBER-2) 유전자입니다.
- 튜브 중 하나에 2μL의 뉴클레아제가 없는 물과 1μL의 4단계의 바이러스 DNA를 추가합니다. 반응 혼합물의 총 부피는 10 μL이다.
알림: 샘플의 DNA 농도에 따라 희석 단계가 필요할 수 있습니다. 희석 계수 F에 유의해야하며 6.3 단계에서 공식에 통합됩니다. - 알려진 EBV 게놈 복제 번호(1000, 2000, 5000, 10,000 및 54,000 사본)를 가진 표준으로 사용할 다른 튜브를 준비합니다.
- PCR 혼합물을 95°C에서 5분 동안 활성화하는 초기 단계부터 시작하여 95°C 및 58°C에서 각각 15초 및 30초 동안 40사이클(어닐링)하여 실행합니다.
- 표준 튜브당 EBV 게놈 사본 수의 로그에 대해 표준물질의 Ct 값을 플로팅하여 qPCR 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선 플롯 방정식을 사용하여, 유도된 바이러스 DNA를 포함하는 PCR 튜브 내의 EBV 게놈 카피의 수를 도출한다. 그런 다음 다음 공식을 사용하여 유도 된 바이러스 제제의 농도를 계산하십시오.
여기서 X는 표준 곡선에서 파생된 EBV 게놈 사본의 수이고 F는 PCR 반응당 활용되는 DNA를 설정하는 데 사용되는 희석 계수입니다.
7. 바이러스 입자의 생물학적 활성/감염성 확인
- BC-3 세포를 80% 컨플루언시의 100mm 배양 플레이트에서 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. P3HR-1 세포의 파종 밀도는 1 x 106 세포/mL입니다. 완전한 RPMI 배양 배지(79% RPMI 배양 배지, 20% 소 태아 혈청, 1% Pen-Strep 항생제)를 37°C 및 5%CO2에서 유지하고, 3-4일마다 계대배양한다.
- BC-3 세포를 계수하는 것은 P3HR-1 세포와 동일한 방법으로 1단계를 수행하여 계수하였다. 96웰 플레이트에 각 웰에 10개의5 BC-3 셀을 추가합니다. 3개, 6개, 9개 또는 12개의 웰을 사용하여 결과의 중요성을 보장하고 오류를 최소화합니다.
- 단계 6.3에서 결정된 바이러스 제제의 농도에 따라 각 웰에 부피의 바이러스 스톡을 추가합니다. MOI는 다양할 수 있으며 이 프로토콜을 최적화하면 감염에 가장 적합한 MOI가 나타납니다(MOI 범위 2-50 권장). 각 웰에 존재하는 혼합물의 총 부피가 250μL인지 확인하십시오.
- 필요한 부피를 결정하려면 바이러스 주식의 농도를 알아야하며 MOI를 선택해야합니다. 예를 들어, MOI가 2이면 추가되는 바이러스 입자의 수는 세포 수의 두 배가되어야합니다. 공식을 사용하여 필요한 바이러스 스톡의 부피 V 를 계산하십시오 :
n은 필요한 바이러스 입자의 수이고 C는 바이러스 스톡의 알려진 농도입니다.
- 필요한 부피를 결정하려면 바이러스 주식의 농도를 알아야하며 MOI를 선택해야합니다. 예를 들어, MOI가 2이면 추가되는 바이러스 입자의 수는 세포 수의 두 배가되어야합니다. 공식을 사용하여 필요한 바이러스 스톡의 부피 V 를 계산하십시오 :
- 96-웰 플레이트의 내용물을 5일 동안 배양한다. 5일 후 각 웰의 내용물을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 튜브를 120 x g 에서 8분 동안 원심분리하여 바이러스 함유 배양 배지에서 세포를 분리합니다. 세포 펠릿과 상청액을 DNA 추출 후 실시간 PCR 정량화하여 각 분획에 바이러스 게놈이 있는지 확인하여 바이러스 입자의 감염성을 평가합니다.
n은 필요한 바이러스 입자의 수이고 C는 바이러스 스톡의 알려진 농도입니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 절차의 목표는 알려진 바이러스 역가를 가진 현탁액에서 EBV 입자를 분리하여 나중에 EBV 감염을 모델링하는 데 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 따라서 절차에서 가장 높은 EBV 수율을 얻기 위해 다양한 시약의 최적 농도를 사용하는 것이 가장 중요합니다.
가장 많은 수의 EBV 입자를 생성하는 PMA 및 DMSO의 농도를 결정하기 위해 최적화 시험이 수행되었습니다(그림 2). 0.8%의 DMSO 농도와 35ng/μL의 PMA 농도가 최적이었고 높은 EBV 농도를 초래했습니다. 최적화 프로토콜에서 얻은 바이러스 입자의 농도는 917,471 바이러스 입자 / μL였습니다.
그림 2: 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 P3HR-1 세포 유도 시 얻은 EBV DNA 사본/mL. P3HR-1 세포 (105 세포)를 단독으로 배양하거나 본원에 기재된 프로토콜을 사용하여 상이한 농도의 PMA 및 DMSO로 유도하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 학생의 t- 테스트는 PMA / PMA 및 DMSO 처리 세포를 대조군 세포와 비교하여 수행되었습니다. *는 p < 0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜이 효과적인 것으로 간주되기 위해서는 6단계에서 바이러스 입자의 합리적인 농도를 나타내야 하고 7단계는 이러한 바이러스 입자가 실제로 전염성이 있음을 보여야 합니다. 7단계에서 사용된 BC-3 세포주는 EBV 음성이므로 음성 대조군(이 프로토콜을 적용받지 않은)에서 EBV 게놈 복제 수를 정량화할 때 EBV DNA가 검출되지 않아야 합니다.
그러나 EBV DNA는 다음과 같은 이유로 (이 프로토콜의 적용을 받은) 실험 웰의 세포와 배양 배지 모두에서 검출되어야 합니다: BC-3 세포를 감염시키는 EBV는 이러한 세포 내부에서 복제되며, EBV DNA가 세포 펠릿에서 검출되고 복제 시 BC-3 세포가 바이러스 입자를 외부로 방출한다는 사실을 설명합니다. 따라서 EBV DNA는 배양 배지 상청액에서 검출됩니다(DNA 추출 후).
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Discussion
EBV 입자의 생산은이 바이러스의 생물학 및 관련 질병을 이해하는 데 필요합니다. 여기에서는 P3HR-1 세포주에서 이러한 입자의 생산에 대해 설명했습니다. 이 세포주는 유일한 EBV 생산자 계통이 아닙니다. 실제로 EBV 입자는 B95-8 세포21,22 및 Raji 세포 주18,19에서도 분리되었습니다. EBV 용균 주기는 n-부티레이트로 이들 세포에서 유도되었다. 대안적으로, 포볼 12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA)로도 알려진 12-O-테트라데카노일포볼-13-아세테이트 (TPA)와 같은 포르볼 에스테르가 사용될 수 있다. 전반적으로 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 P3HR-1 라인 대신 이러한 셀을 사용하여 사용할 수 있습니다. 그러나 B95-8 라인은 현재 멸종 위기에 처한 영장류 종23으로 분류되는 면화 타마린 (Saguinus oedipus)에서 파생되었습니다. 따라서 이 라인은 판매 및 배송에 제한이 있는 공급업체에서 거의 판매하지 않습니다. 멸종 위기에 처한 야생 동식물 종의 국제 거래에 관한 협약 (CITES)은 영국 이외의 모든 주문에 대해서도 면허가 필요합니다. Raji 세포주가 상업적으로 이용 가능한 동안, 복제 바이러스 DNA의 합성 및 바이러스 캡시드 항원 (VCA)의 생산은 화학 물질24,25에 의한 유도 후에 이들 세포에서 발생하지 않는다. 그러나, 이들은 P3HR-1 세포(20)로부터 단리된 EBV로 슈퍼감염된 후 상보에 의해 용이하게 유도될 수 있다.
EBV 입자26의 열거를 위한 직접적인 플라크 분석이 없기 때문에, 우리는 실시간 중합효소-연쇄 반응에 의존하였다. 향상된 특이성을 제공할 수 있는 형광 프로브를 사용하는 면역형광 또는 PCR과 같이 우리의 목적에 똑같이 잘 작동할 수 있는 다른 정량 방법이 있습니다. 게놈 복제 표준을 사용한 real-time PCR의 선택은 대부분의 실험실에서 쉽게 접근할 수 있고, 덜 힘들고, 기술적으로 덜 도전적이며, 더 비용 효율적이라는 사실에 근거합니다27. 따라서 다른 정량화 방법도 똑같이 잘 작동 할 수 있으며 가용성과 경험을 기반으로 사용할 수 있습니다.
여기에 자세히 설명된 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 2.1단계에서 셀을 도금하고 플레이트 크기에 권장되는 범위 내의 셀 번호로 시딩하는 것입니다. 적은 수의 세포는 낮은 농도의 바이러스 입자를 생성하는 반면, 많은 수의 세포는 플레이트를 붐비고 세포의 성장과 복제를 억제하여 바이러스의 용균주기를 늦 춥니 다. 그렇기 때문에 1단계에서 세포를 계수하고 필요한 현탁액 A의 부피를 계산하고 마지막으로 2단계에서 세포를 도금할 때 극도의 주의를 기울여야 합니다.
프로토콜의 한계는 EBV 게놈의 사본 하나가 하나의 바이러스 입자에 해당한다는 가정입니다. 이 가정은 그럴듯하지만 이러한 입자가 결함이 있거나 불완전한지 여부는 이 분석을 사용하여 감지할 수 없습니다. 다른 많은 바이러스와 마찬가지로 EBV에 대한 플라크 형성 분석이 없기 때문에 DNA 추출 후 실시간 PCR은 바이러스 제제를 정량화하는 데 허용되는 방법으로 남아 있습니다. 또 다른 한계는 바이러스가 연속적인 포유류 세포주로부터 유도되어 여러 차례의 계대 배양시 돌연변이를 축적 할 수 있다는 것입니다. 이러한 돌연변이는 바이러스 자체에 영향을 미쳐 바이러스의 생체 내 또는 생체 외 특성을 변경할 수 있습니다. 잠재적 인 해결책은 세포 및 바이러스 게놈을 정기적으로 시퀀싱하는 것입니다. 대안적으로, 세포는 몇 번의 계대 후에 폐기될 수 있고, 적은 수의 이전 계대배양을 갖는 액체 질소-저장된 세포 샘플로부터 배양이 새롭게 재시작될 수 있다. P3HR-1 세포주에서 얻은 EBV 입자에는 총28 개의 바이러스 핵 단백질의 일부로 EBV에 잠복 감염된 B 림프구에서 일반적으로 발현되는 EBNA2 항원이 부족하다는 점도 주목할 가치가 있습니다. EBNA2 단백질은 EBV 잠복기의 III형과 관련된 단백질을 발현하는 유전자의 프로모터를 활성화시킨다. 그러나, 최근의 연구는 EBNA2-결핍 EBV가 CBH 마우스에서 종양을 형성할 수 있고, 따라서 P3HR-1 세포주가 EBV 양성 림프종29의 유용한 모델로 남아 있음을 보여주었다. 반면에 P3HR-1 세포의 EBV는 EBNA2 양성 EBV를 대조군으로 사용하면서 EBNA2가 수행하는 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 요약하면, 연속 P3HR-1 세포주에서 얻은 EBV는 상당한 연구 가치를 가지고 있습니다. EBV의 생물학, 감염성, 독성뿐만 아니라 다른 많은 특성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업에 대한 자금은 Asmar Research Fund, 레바논 국립 과학 연구위원회 (L-CNRS) 및 베이루트 아메리칸 대학교의 의료 실무 계획 (MPP)의 응급실 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100x20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
References
- Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
- Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
- Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
- Manet, E. Encyclopedia of Cancer. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).
- Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
- Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
- Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
- El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
- Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
- Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
- Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
- Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
- Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
- Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
- Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
- Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
- Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
- Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
- Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
- Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
- Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
- Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
- Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
- Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
- Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).
