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Developmental Biology

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Abstract

Con una eficiencia, precisión y facilidad excepcionales, el sistema CRISPR / Cas9 ha mejorado significativamente la edición del genoma en cultivos celulares y experimentos con animales de laboratorio. Al generar modelos animales, la electroporación de cigotos ofrece una mayor eficiencia, simplicidad, costo y rendimiento como alternativa al método estándar de microinyección. La electroporación también es más suave, con mayor viabilidad, y suministra de manera confiable ribonucleoproteínas (RNP) Cas9 / ARN de guía única (sgRNA) en los cigotos de cepas comunes de ratones de laboratorio (por ejemplo, C57BL / 6J y C57BL / 6N) que se acerca al 100% de eficiencia de entrega. Esta técnica permite mutaciones de inserción/deleción (indeles), mutaciones puntuales, la deleción de genes enteros o exones, e inserciones pequeñas en el rango de 100-200 pb para insertar LoxP o etiquetas cortas como FLAG, HA o V5. Aunque se mejora constantemente, aquí presentamos el estado actual de CRISPR-EZ en un protocolo que incluye la producción de sgRNA a través de la transcripción in vitro , el procesamiento de embriones, el ensamblaje de RNP, la electroporación y el genotipado de embriones preimplantacionales. Un investigador de posgrado con experiencia mínima en la manipulación de embriones puede obtener embriones genéticamente editados en menos de 1 semana utilizando este protocolo. Aquí, ofrecemos un método sencillo, de bajo costo, eficiente y de alta capacidad que podría usarse con embriones de ratón.

Introduction

La edición del genoma en ratones vivos se ha simplificado considerablemente y se ha vuelto accesible y más asequible desde la aparición de la edición CRISPR 1,2,3. Los intentos iniciales de edición en animales utilizaron microinyección para administrar ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear 4,5,6. Si bien la microinyección es bastante efectiva, la cantidad de práctica requerida para dominarla completamente podría no ser apropiada para aprendices y estudiantes y también requiere equipos costosos que un laboratorio modestamente financiado no puede pagar. La microinyección normalmente es realizada por técnicos expertos en instalaciones transgénicas con horarios y precios de servicio que limitan la velocidad para muchos investigadores. Un enfoque más accesible es el de la electroporación, que ha demostrado ser bastante eficaz para la entrega de ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear7. Otras mejoras en las estrategias de edición y entrega del genoma CRISPR sugirieron que las RNP preensambladas que ya están comprometidas con sgRNAs pueden ser un medio eficaz para reducir el mosaicismo8.

La razón detrás del desarrollo y uso de este protocolo fue evitar muchas de las limitaciones y obstáculos asociados con la microinyección. Como su nombre lo indica, un método fácil, interno y rentable que pudiera determinar rápidamente si valdría la pena usar diseños de sgRNA no probados durante un experimento de microinyección sería un paso de control de calidad de primer paso muy conveniente (Figura 1). Si bien este método no puede reemplazar la microinyección para estrategias más complejas, como la introducción de secuencias largas de ADN del donante para resultados basados en la recombinación, es ideal para estrategias menos complejas como pequeñas deleciones o inserciones y etiquetado de genes. Este método es apropiado para investigadores con habilidades básicas de manipulación de embriones que tienen necesidades de edición simples, les gustaría probar su hipótesis dentro del marco de tiempo del desarrollo preimplantacional, o prefieren probar sgRNAs en embriones antes de programar una cita con un especialista en microinyección. Aquí, los reactivos de edición se administran transitoriamente en embriones en etapa pronuclear como RNP Cas9 / sgRNA a través de electroporación (una serie de pulsos eléctricos) para maximizar la eficiencia y disminuir el mosaicismo8. Utilizando un método de genotipado de embriones, los resultados de edición están disponibles en aproximadamente 1 semana9, lo que reduce la necesidad de varias aplicaciones de microinyección a un costo significativamente reducido.

La efectividad de este método alcanza su punto máximo en la etapa embrionaria pronuclear, cuando el embrión aún no ha fusionado los pronúcleos materno y paterno o no ha entrado en fase S (Figura 2). La superovulación se utiliza para maximizar el número de cigotos, pero produce cigotos pronucleares y óvulos no fertilizados. Los cigotos sanos también se pueden preseleccionar antes de la electroporación para aumentar la eficiencia general. Como otros protocolos de electroporación han editado eficientemente cigotos sin necesidad de incluir un paso similar 7,10,11,12,13,14,15, un paso opcional de este protocolo es la ligera erosión de la zona pelúcida (ZP). La ZP es una capa de glicoproteína que ayuda a la unión de los espermatozoides, la respuesta acrosómica y la fertilización que rodea a los embriones en etapa pronuclear. En nuestra experiencia, encontramos que una suave erosión a base de ácido de la ZP proporciona una entrega confiable de electroporación Cas9 RNP con solo un impacto marginal en la viabilidad.

Hemos observado tasas de entrega de RNP de hasta 100% de eficiencia a través de electroporación en cepas de ratón que se utilizan comúnmente en investigaciones como C57BL / 6J y C57BL / 6N 9,16. Grupos independientes también han desarrollado procedimientos basados en electroporación con eficiencias mayores o equivalentes a la microinyección 11,12,13,14,15,17, con protocolos de electroporación que funcionan bien en rata18,19, cerdo 20,21,22 y vaca 23 , por lo que sugerimos que los lectores comparen los protocolos para encontrar las condiciones que mejor se adapten a sus necesidades experimentales y de equipo. El sistema descrito aquí utiliza materiales y equipos comunes, que requieren solo habilidades básicas de manipulación de embriones. Esta técnica es efectiva para una variedad de estrategias de edición, lo que hace que este método sea ampliamente accesible para la comunidad de investigación.

El diseño de ARN guía pequeños ideales (sgRNAs) es esencial para una edición eficiente. Recomendamos cribar de dos a tres estrategias de sgRNA por sitio objetivo directamente en embriones de ratón, especialmente si se desea la generación de línea de ratón. Una vez diseñados, se recomiendan métodos libres de clonación como la transcripción in vitro (IVT) para producir sgRNAs de alta calidad3. Los RNPs y sgRNAs se mezclan con 30-50 embriones procesados en estadio pronuclear y se exponen a una serie de pulsos eléctricos para permeabilizar primero temporalmente la ZP y la membrana celular, con pulsos posteriores para mantener los poros abiertos y electrophorese los RNPs a través del cigoto24. Después de la optimización, encontramos que seis pulsos de 3 ms a 30 V para embriones a granel (~ 50) fueron óptimos para la efectividad y viabilidad de la edición, proporcionando una entrega de Cas9 / sgRNA RNP altamente eficiente 9,16,25. Los eventos de edición en mórulas individuales de ratón pueden confirmarse utilizando una variedad de estrategias de validación comunes para la edición CRISPR, como el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), la digestión de endonucleasas T7 y la secuenciación de Sanger de la región de interés26.

El método actual es más apropiado para esquemas de edición simples (Figura 3), como inserciones/deleciones (indeles), deleciones de tamaño de exón del orden de 500-2000 pb, y la entrega de mutaciones puntuales e inserciones pequeñas como etiquetas C- o N-Terminal (por ejemplo, FLAG, HA o V5)9,16,27. El potencial para la edición compleja del genoma, como grandes inserciones de etiquetas fluorescentes o alelos condicionales, sigue siendo incierto y es el foco actual de las próximas mejoras.

Este método se domina fácilmente y se puede utilizar para probar rápidamente sgRNAs en embriones de ratón cultivados en 1 semana9 (Figura 1). En este trabajo se presenta un protocolo de seis pasos, que incluye 1) diseño de sgRNA; 2) síntesis de sgRNA; 3) superovulación y apareamiento; 4) cultivo, recolección y procesamiento de embriones; 5) montaje y electroporación de RNP; 6) cultivo embrionario y genotipado. Se proporciona información sobre todos los materiales utilizados (Tabla de materiales). Como control positivo, los reactivos para editar el locus 9,16 de la tirosinasa (Tyr) se han incluido en la Tabla suplementaria 1.

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Protocol

Todo el cuidado y uso de animales a lo largo de este protocolo se adhirió a las políticas de la Ley de Bienestar Animal, la Guía ILAR para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y siguió las pautas de la AVMA para la eutanasia y las pautas y políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania (IACUC). El protocolo de cuidado y uso de animales fue revisado y aprobado por la Universidad de Pensilvania IACUC para este proyecto. Como cuestión de cumplimiento y precaución, busque todas las autorizaciones necesarias antes de intentar este protocolo.

1. sgRNA y diseño opcional de oligo donante

  1. Diseño de sgRNA
    1. Seleccione sgRNAs candidatos de cualquier algoritmo en línea ampliamente utilizado, como Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 o CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Como cada plataforma es única, lea atentamente las instrucciones del usuario para diseñar sgRNAs ideales. Para experimentos in/del, seleccione dos o tres sgRNAs para probar. Para las deleciones, se sugieren sgRNAs que flanquean la región objetivo, por ejemplo, dos sgRNAs aguas arriba del objetivo y dos sgRNAs aguas abajo del objetivo.
      NOTA: Si bien varios algoritmos de sgRNA en línea tienen en cuenta los objetivos fuera de los objetivos para evitar diseños de sgRNA defectuosos, la herramienta BLAST del NCBI es útil para confirmar la calidad de las secuencias de sgRNA seleccionadas.
    2. Insertar 19-20 nucleótidos (nt) determinados a partir del paso anterior (1.1.1) en la región variable del oligo de sgRNA (Tabla suplementaria 1) y comprar sgRNA sintetizados como oligos de ADN personalizados.
      NOTA: No se requiere purificación de PAGE.
  2. (Opcional) Diseño de oligo donante para knock-in mediado por reparación dirigida por homología (HDR).
    1. Diseñar el oligodesoxinucleótido monocatenario (ssODN) apropiado basado en el resultado experimental deseado (mutación puntual precisa, inserción de loxP, inserción de etiqueta pequeña, etc.), manteniendo la longitud total a 100-200 nt con brazos homólogos de 50 nt o más flanqueando la región central.
    2. Para garantizar una mayor eficiencia de knock-in, diseñe el sgRNA para que sea complementario al ssODN30 y reemplace la secuencia de motivos adyacentes al protoespaciador (PAM) con una mutación silenciosa para evitar el corte recurrente por la enzima Cas9.
    3. Ordene ssODN usando la opción oligo personalizada.

2. Síntesis de sgRNA

  1. Generación de plantillas para transcripción in vitro (IVT)
    1. Para generar la plantilla de ADN para la IVT de ARNg a través de PCR, prepare una reacción de IVT en un tubo de tira de PCR que esté libre de ARNasa. (véase el cuadro complementario 2).
    2. Utilice las siguientes condiciones del termociclador:
      95 °C durante 2 min; 30 ciclos de 95 °C durante 2 min, 57 °C durante 10 s y 72 °C durante 10 s; luego 72 °C durante 2 min
    3. Para verificar el éxito de la reacción PCR de la plantilla de ADN sgRNA, electroforese 5 μL del producto combinado con 1 μL de colorante de carga 6x en un gel de agarosa al 2% (peso / vol).
      NOTA: El tamaño de producto previsto es de 127 pb. Cualquier reacción de PCR restante puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 5 meses.
  2. Transcripción in vitro (IVT) de sgRNA
    1. Para generar el sgRNA, prepare la mezcla de reacción (T7 IVT según las instrucciones del fabricante) en un tubo de PCR y deslice para mezclar los reactivos.
      NOTA: Consulte la Tabla complementaria 3 para ver el ejemplo de configuración de reacciones. La reacción IVT es sensible a la contaminación por RNasa; por lo tanto, haga todo lo posible para proporcionar un entorno libre de RNasa.
    2. Para permitir que la reacción se inicie y proceda, incubar la mezcla de reacción IVT durante >18 h a 37 °C en un termociclador o en un bloque térmico.
    3. Para degradar la plantilla de ADN original (paso 2.1.3), introducir 1 μL de DNasa I (2 unidades por reacción) e incubar la reacción durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
    4. Para promover la unión del ARN a las perlas de purificación magnética, combine 129 μL de etanol al 100% en la reacción, que ahora será de 150 μL.
    5. Para resuspender las perlas de purificación, que tienden a asentarse durante el almacenamiento, voráige la alícuota durante al menos 10 s.
    6. Para purificar los sgRNAs, añadir 100 μL de las perlas resuspendidas (paso 2.2.5) a la reacción IVT (paso 2.2.4) y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10x.
    7. Para permitir la unión, deje reposar la mezcla a RT durante 5 minutos.
    8. Para aislar el sgRNA de los productos de reacción no incorporados, coloque la reacción en los soportes magnéticos durante 5 minutos en RT y espere hasta que se forme un pequeño gránulo.
    9. Para lavar los sgRNAs, primero deseche cuidadosamente el sobrenadante y luego agregue 200 μL de etanol al 80% del pellet.
      NOTA: Durante el paso de lavado con etanol al 80% (vol/vol), es fundamental evitar alterar el pellet mediante el pipeteo, ya que esto reducirá considerablemente las concentraciones de sgRNA. En su lugar, pipetear suavemente el etanol al 80% para que el pellet quede sumergido, y retire suavemente el volumen con una pipeta.
    10. Repita el paso anterior (paso 2.2.9) y seque al aire el pellet durante no más de 5-6 minutos o el sgRNA se asociará permanentemente con las perlas.
    11. Eluya el sgRNA con 20μL de agua libre de nucleasas pipeteando el pellet 10x, incubando durante 2 min at (RT), y luego colocándolo de nuevo en el soporte magnético para separar las perlas del sgRNA ahora purificado.
    12. Para evaluar la calidad y cantidad del sgRNA, use un instrumento como un espectrofotómetro o un bioanalizador. Alternativamente, en un gel de agarosa al 2%, ejecute 2 μL de sgRNAs, similar al paso 2.1.3.
      NOTA: La calidad se confirma mediante una sola banda transparente. El resto del sgRNA puede utilizarse inmediatamente o almacenarse en condiciones de -80 °C.

3. Superovulación

  1. Para proporcionar suficientes embriones para probar cada diseño de sgRNA, superovular de dos a tres hembras C57BL / 6J que tengan entre 3 y 5 semanas de edad, como se describió anteriormente9. Se recomienda electroporar 20-30 embriones por sgRNA para generar suficientes resultados para confirmar la efectividad.
    NOTA: Si la fertilización es exitosa, espere 10-20 embriones por apareamiento.
  2. Para inducir la ovulación, siga este programa de inyección de hormonas:
    1. Día 1: Administrar 5 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG) (100 μL) a través de una inyección intraperitoneal (IP) con una jeringa de 26 G en ratones hembra de 3-5 semanas de edad.
    2. Día 3: Después de 46-48 h de inyección de PMSG, inyecte 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG) (100 μL) a través de una inyección IP para inducir la ovulación.
    3. Para establecer la reproducción, empareje a las hembras 1: 1 con un macho de reproducción confiable justo después de la inyección de hCG.
      NOTA: Para evitar que las hormonas se degraden y pierdan actividad, realice inyecciones en menos de 30 minutos de descongelación.

4. Recolección y procesamiento de embriones

  1. Recolección de embriones
    1. Para practicar la eutanasia a las mujeres y recuperar el material necesario, como se describió anteriormente31, asegúrese de confirmar primero el método apropiado de acuerdo con las políticas institucionales. Por ejemplo, use asfixia porCO2 , dislocación cervical y/u otros métodos aprobados.
      NOTA: Normalmente, el >75% de las hembras estimuladas por hormonas muestran tapones copulatorios, lo que indica un apareamiento exitoso.
    2. Para evitar que los pelos dificulten la recolección de tejido, coloque a las hembras sacrificadas sobre sus espaldas y rocíe etanol al 70% (vol / vol) en la región del abdomen para abrirla quirúrgicamente.
      NOTA: A partir de este momento, se recomienda realizar los pasos quirúrgicos en una campana ventilada para mantener un ambiente aséptico y reducir el potencial de contaminación.
    3. Para abrir la cavidad abdominal y extraer los oviductos, corte la capa de piel/cabello (subcutánea) con tijeras quirúrgicas y localice los ovarios (Figura 4), que se encuentran cerca del riñón y comparten una sección de una almohadilla de grasa. Los oviductos se localizan proximales a los ovarios (Figura 4). Extirpar quirúrgicamente ambos oviductos de la hembra y colocarlos en gotitas individuales de 50 μL de medio M2+BSA (4 mg/mL BSA) (Figura 5A).
      NOTA: Las instrucciones detalladas para esta sección del procedimiento se pueden ver visualmente31 o seguir paso a paso9 utilizando protocolos publicados anteriormente.
    4. Para liberar los complejos cúmulo-ovocitos (CoC) que contienen ovocitos (Figura 4), use pinzas de disección para cortar la ampolla del oviducto mientras observa a través de un microscopio estereoscópico.
    5. Para reducir la cantidad de residuos (sangre, grasa, tejido), transfiera y combine cada CoC a una sola gota de 50 μL de medios M2 + BSA con una pipeta de mano ajustada a 20-30 μL para evitar el arrastre de desechos.
  2. Eliminación de células cúmulos
    1. Para comenzar la eliminación de las células cúmulos de los cigotos (Figura 4), transfiera CoC con el menor medio adicional posible a una gota de 100 μL M2 + hialuronidasa (Figura 5B), y mezcle suavemente pipeteando los CoC hasta que los embriones estén visiblemente separados de las células cúmulos mucho más pequeñas. Asegúrese de mantener la exposición de M2 + hialuronidasa a los embriones al mínimo, ya que podría afectar la viabilidad.
      NOTA: Se puede precalentar (37 °C) o añadir 50 μL adicionales de M2+hialuronidasa si los embriones no se separan de las células cúmulos en 2 min.
    2. Para diluir la hialuronidasa y eliminar las células cúmulos sueltas de los cigotos, use una pipeta operada por la boca para mover los cigotos a una gota fresca de 50 μL M2 + BSA.
      NOTA: La mayoría de los pasos más allá de este punto requieren el uso de una pipeta operada por la boca a menos que se indique lo contrario. Si bien el riesgo de contaminación por parte del usuario es bajo, se recomienda el uso de un filtro de aire en línea para mantener un ambiente aséptico. Por favor, consulte los métodos descritos anteriormente para preparar y utilizar este instrumento 9,31.
    3. Usando una pipeta bucal, pasar los embriones a través de al menos cuatro o cinco gotitas más de 50 μL M2 + BSA para reducir el número de células cúmulas.
  3. (OPCIONAL) Adelgazamiento de la zona pelúcida con solución de tiro ácido (AT).
    1. Para erosionar la zona pelúcida del embrión y reducir los obstáculos físicos adicionales para la administración del reactivo, transfiera los embriones a una gota precalentada (37 °C) de 100 μL de solución de AT en una placa de 60 mm (Figura 5C). Observar continuamente los cigotos utilizando un estereomicroscopio hasta que aproximadamente el 30% de la zona pelúcida se erosione9. La exposición total a AT debe ser de 60-90 s. La exposición prolongada a AT puede disolver completamente la zona pelúcida y poner en peligro la viabilidad embrionaria.
      NOTA: Para obtener instrucciones detalladas e imágenes de esta sección del procedimiento, consulte los métodos publicados anteriormente 9,16.
    2. Para diluir el AT, use una pipeta bucal para pasar los embriones a través de al menos cuatro gotitas de 50 μL de M2 + BSA.
    3. Para determinar si se ha procesado un número apropiado de embriones, use un microscopio estereoscópico para contar los embriones. Dependiendo del número de ratones hembra utilizados, se pueden esperar aproximadamente 10-20 cigotos viables por hembra.
      NOTA: En esta etapa, los embriones deben estar relativamente libres de desechos que impidan la evaluación de la cantidad y la calidad. Por ejemplo, si se usan cinco hembras, el número esperado de cigotos probablemente estaría entre 50-100, y un contador celular mecánico sería apropiado para realizar un seguimiento de los embriones. Es común perder alrededor del 10% -20% de los embriones debido a la falta de fertilización o la ovulación de ovocitos de baja calidad. Durante el siguiente paso, almacene brevemente los embriones en 50 μL de M2 + BSA durante no más de 30 minutos en una incubadora.

5. Montaje y electroporación de RNP

  1. Asamblea RNP
    1. Para ensamblar el complejo RNP, use las tablas de ejemplo adjuntas para combinar las mezclas de reacción apropiadas basadas en la estrategia de edición deseada en el tampón RNP (100 mM HEPES pH 7.5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% de glicerol y 100 mM de clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina [TCEP] en agua libre de nucleasa)
      NOTA: TCEP es un agente reductor conveniente, pero tiene una vida media corta en soluciones acuosas; por lo tanto, agregue TCEP justo antes del ensamblaje complejo RNP.
      1. Para los indeles mediados por unión de extremos no homólogos (NHEJ), consulte la Tabla complementaria 4.
      2. Para la edición mediada por reparación dirigida por homología (HDR), consulte la Tabla complementaria 5.
      3. Para las deleciones de ingeniería utilizando sgRNAs pareados, consulte la Tabla suplementaria 6.
        1. Independientemente de la estrategia, combine los reactivos deseados en RT en un tubo de PCR.
        2. Para permitir la formación del complejo RNP, incubar la mezcla durante 10 min a 37 °C.
          NOTA: El complejo RNP puede ser almacenado en RT por hasta 1 h.
  2. Electroporación
    1. Para diluir la BSA antes de la electroporación, pasar los embriones a través de al menos dos gotitas de 50 μL de medios séricos reducidos.
      NOTA: La BSA aumenta la resistencia durante la electroporación y podría dañar los cigotos.
    2. Para preparar y mezclar los cigotos (paso 4.3.2) con el complejo RNP (paso 5.1.1.2) para la electroporación, pipetear en la boca 25-30 embriones en una gota de 10 μL de medios séricos reducidos, y luego usar una pipeta de mano para agregar 10 μL del complejo RNP (paso 5.1.1.2).
    3. Para diluir el glicerol viscoso del complejo RNP y homogeneizar la muestra, mezclar pipeteando 10x o hasta que la mezcla ya no muestre signos de viscosidad (patrón de remolino) utilizando un estereomicroscopio.
    4. Para preparar la muestra para su inserción en el electroporador, pipetear esta mezcla de 20 μL de embrión + RNP en una cubeta de electroporación de 0,1 cm evitando burbujas.
    5. Para administrar los reactivos de edición en el cigoto, electroporar los embriones utilizando un protocolo de onda cuadrada con estas condiciones: 30 V, 4-6 pulsos, 3 ms de longitud de pulso e intervalos de pulso de 100.
    6. Para recuperar cigotos de la cubeta, use una pipeta de mano para administrar 50 μL de KSOM + BSA (1 mg / ml de BSA) en la parte superior de la cubeta para enjuagar los embriones que pueden haberse asentado en la parte inferior. Pipetear suavemente esta mezcla hacia afuera y sobre una placa de 60 mm.
    7. Repita el paso 5.2.6 al menos 2x-3x y combine cada lavado en una placa de 60 mm hasta que se recuperen la mayoría de los embriones.
      NOTA: Una recuperación típica es >90% de los embriones cargados originalmente. Para garantizar la supervivencia del embrión, pruebe la incubadora y verifique las fechas de vencimiento de todos los reactivos. Los embriones son susceptibles a condiciones de cultivo no ideales como la temperatura, el nivel deCO2 , la humedad y el pH.

6. Cultivo de embriones y genotipado

  1. Cultivo de embriones
    1. Para cultivar cigotos a una etapa deseada, use una pipeta bucal para transferir 20-30 cigotos a una gota de KSOM + BSA en una placa de cultivo preequilibrada y mueva los embriones a la gota (Figura 5D). Incubar la placa durante la noche enCO2 al 5%, a 37 °C, con 95% de humedad.
      NOTA: Pre-equilibrar colocando una placa de cultivo preparada de 35 mm en una incubadora el día anterior o al menos 4 h antes de la incubación (Figura 5D).
    2. Para promover las condiciones ideales de crecimiento, transfiera solo embriones de dos células al día siguiente a una gota fresca de mezcla KSOM + BSA utilizando un microscopio estereoscópico y regrese a la incubadora. Asegúrese de dejar o descartar los embriones muertos o no fertilizados.
      NOTA: Los embriones en estadio pronuclear generalmente crecen en mórulas después de 72 h de cultivo y blastocistos después de 84 h.
  2. Genotipado
    1. Para diluir los componentes del medio que podrían interferir con una reacción de PCR, lave los embriones de mórula/blastocisto con una pipeta bucal pasando a través de dos gotas de DPBS.
    2. Para cargar embriones individuales para lisis, transfiera embriones individuales a un pocillo de una tira de PCR de 8 pocillos ajustando una pipeta a 1 μL, y luego agregue 10 μL de tampón de lisis (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8.5, 2.5 mM MgCl 2, 0.1 mg / ml gelatina, 0.45% Nonidet P-40, 0.45% Tween 20,0.2 mg / ml proteinasa K en H2O libre de nucleasa).
      NOTA: Agregue proteinasa K justo antes de preparar el tampón de lisis.
    3. Para lisar los embriones, programar un termociclador a 55 °C durante 4 h, y luego inactivar la proteinasa K con una incubación de 10 min a 95 °C.
      NOTA: Particularmente para usuarios primerizos, intente un experimento de edición en Tyr loci. Este flujo de trabajo ha sido optimizado y puede servir como un control positivo. Si es necesario, conservar el lisado embrionario a 4 °C durante 2-3 días o en el congelador hasta 2 semanas antes del análisis por PCR. Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación.
    4. Para aumentar las posibilidades de un análisis de genotipado exitoso, realice una estrategia de PCR anidada amplificando fragmentos de ADN ligeramente más largos que flanquean el sitio objetivo, así como regiones que se utilizarán para amplificar un fragmento de ADN más preciso. Siga las condiciones de la Tabla Suplementaria 7.
    5. Siga las condiciones del termociclador mencionadas a continuación:
      95 °C durante 2 min
      30+ ciclos: 95 °C durante 2 min, 60 °C durante 10 s y 72 °C durante 10 s
      72 °C durante 2 min
    6. Para preparar la segunda etapa de una estrategia de PCR anidada, realice una dilución 1:10 del primer producto de PCR (paso 6.2.5) y cargue 2 μL de este en la siguiente reacción de PCR (con cebadores diseñados para estar dentro del amplicón anterior).
      NOTA: La primera reacción de PCR debe diluirse para reducir el arrastre de cebadores flanqueantes en la segunda reacción de PCR. Prepare la PCR anidada siguiendo los pasos de la Tabla suplementaria 8.
    7. Coloque la reacción de PCR en un termociclador utilizando las siguientes condiciones de ciclo:
      95 °C durante 2 min
      30 ciclos: 95 °C durante 2 min, 60 °C durante 10 s y 72 °C durante 10 s
      72 °C durante 2 min
      NOTA: Normalmente, el >90% de las reacciones de PCR son exitosas cuando el tamaño del amplicón es de 500 pb o menos.
    8. (Control opcional) Para mutaciones in/del mediadas por NHEJ que utilizan Tyr como control positivo, digerir 10 μL de los productos de PCR anidados del paso 6.2.7 incubando a 37 °C durante 4 h utilizando 10 U de HinfI en una reacción de 20 μL (ver Tabla complementaria 9). En un gel de agarosa al 2%, ejecute el producto digerido para evaluar la edición y use un producto de PCR no digerido como control de carga. Ejecute el gel a 135 V durante 30 min.
      NOTA: Se seleccionó el uso de HinfI como enzima de restricción apropiada debido a un sitio HinfI convenientemente ubicado presente dentro de la región diana de sgRNA que se predice que se ablacionará tras una edición exitosa de NHEJ. Un método detallado y resultados han sido descritos previamente 9,16.
    9. (Control opcional) Para las mutaciones mediadas por HDR que utilizan Tyr como control positivo, digerir 10 μL de los productos de PCR anidados del paso 6.2.7 incubando a 37 °C durante 4 h utilizando 10 U de EcoRI en una reacción de 20 μL (véase la Tabla complementaria 10). En un gel de agarosa al 2%, ejecute el producto digerido para evaluar la edición y use un producto de PCR no digerido como control de carga. Ejecute el gel a 135 V durante 30 min.
      NOTA: La elección de EcoRI como enzima de restricción diagnóstica aprovecha la secuencia original encontrada en la región diana de sgRNA, donde, tras un HDR exitoso, el sitio HinfI natural se reemplaza con un sitio EcoRI, y se fuerza una mutación de cambio de marco que interfiere con el gen Tyr. Para el análisis HDR, realice análisis NHEJ (paso 6.2.8) y HDR (paso 6.2.9) en cada muestra, ya que ambos resultados pueden ocurrir y pueden ayudar a determinar el mosaicismo. Un método detallado y resultados han sido descritos previamente 9,16.

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Representative Results

Este método genera más de 100 μg de sgRNA (20 μL a >concentración de 6,000 ng / L) para un ensamblaje eficiente de Cas9 / sgRNA RNP. El método de superovulación de rutina descrito aquí produce típicamente 10-20 embriones viables por hembra tapada. Debido a los errores de manejo y las pérdidas típicas asociadas con la manipulación embrionaria, se espera que el 80% de los embriones sean fertilizados, viables y en excelentes condiciones después de la electroporación. Para ayudar a los investigadores a ejecutar un experimento exitoso, hemos proporcionado una estrategia de ejemplo para apuntar al locus Tyr del ratón como control positivo (Figura 6), incluidos los diseños oligo (Figura 6A, Tabla suplementaria 1) y estrategias de genotipado para eventos NHEJ y HDR (Figura 6B) (paso 6.2). Ejemplos detallados de éxito experimental y resultados están disponibles 9,16.

En un esfuerzo previo para comparar este protocolo con la microinyección, colectivamente, más de 30 intentos de edición distintos que involucraron a siete laboratorios distintos para generar modelos de ratón tuvieron éxito 9,16. Además, este método fue utilizado para investigar y reportar sobre el primer retrotransposón esencial en el desarrollo de mamíferos27. Cuando se utilizó una estrategia simple como la entrega de un solo sgRNA, la administración de RNPs fue de hasta e incluyendo el 100% en las cepas de ratón C57BL/6J y C57BL/6N, con formación in/del ocurriendo al 50-100% y pequeños reemplazos basados en oligo que oscilaron entre 14% y 63%9,16 (Tabla 1). Al diseñar deleciones genómicas, la efectividad de edición puede variar del 3% al 100%, donde los factores contribuyentes incluyen la ubicación genómica, el diseño de sgRNA y el tamaño de la deleción (Tabla 2). Por ejemplo, las eliminaciones menores de 1.000 pb son más exitosas que las mayores de 1.000 pb 9,16.

Cuando se utilizan 60 embriones para electroporación, este protocolo supera la microinyección en términos de efectividad de edición, lo que resulta en 3-4 animales fundadores en comparación con un fundador de microinyección9. Para los experimentos de eliminación de genes en la cepa de ratones C57BL / 6N utilizando sgRNA idéntico, este método superó a la microinyección, produciendo un promedio de cuatro animales fundadores9 (Tabla 2). Para inserciones pequeñas, como el etiquetado V5 o HA, se han probado con éxito ssODN de hasta 162 nt, y actualmente se están realizando esfuerzos para escalar hasta 1000-2000 nt. El éxito de estos experimentos depende en gran medida de la efectividad del sgRNA utilizado para que los resultados del HDR sean robustos. Casi todos los resultados de HDR son mosaico, pero entre el 31% y el 64% de los embriones muestran alguna evidencia de inserciones 9,16.

Figure 1
Figura 1: Descripción general de CRISPR-EZ. Una descripción gráfica del flujo de trabajo. Una vez que se ha realizado una estrategia y diseño, se pueden generar embriones editados y probarlos en aproximadamente 1 semana. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. y Chen et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Momento ideal para realizar el procedimiento. El diagrama muestra características relevantes y puntos de tiempo durante la primera división celular después de la fertilización. Para llevar a cabo este enfoque, los investigadores reciben algunas pistas visibles, como cambios morfológicos, estimaciones del tiempo del ciclo celular y marcadores químicos observados con frecuencia antes de la primera escisión. Dado que se desconoce el momento exacto de la inseminación y la fertilización, una recomendación sensata sería considerar la hora 0 como medianoche. Antes de que el cigoto entre en la fase S es el momento ideal para entregar maquinaria de edición para NHEJ o HDR, lo que se traduce en ejecutar este protocolo entre las 7 AM y las 11 AM de la mañana. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Éxito de las estrategias de edición. Las estrategias simples, como un solo sgRNA, dan como resultado una reparación in/del a través de NHEJ o una mutación de precisión cuando se combinan con una plantilla ssODN a través de HDR. La reparación de NHEJ también se puede utilizar para deleciones utilizando múltiples sgRNA. En general, cuanto más simple es la estrategia, más efectivo es CRISPR-EZ sin una mayor optimización. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Localización del oviducto y ampolla. Después de aislar quirúrgicamente los tejidos reproductivos, se debe asegurar la región aplicando una presión suave a la almohadilla de grasa con fórceps. La almohadilla de grasa es una región relativamente segura para manipular para no dañar los ovarios / oviducto. El área en el cuadrado discontinuo debe eliminarse y colocarse en una gota de M2 para una mayor disección. Un diagrama de dibujos animados muestra la región de interés con las estructuras anatómicas relevantes etiquetadas. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Procesamiento sugerido y configuración de la placa de cultivo. Esquemas que muestran varias configuraciones de placas para ayudar a los investigadores a realizar tanto el procesamiento como el cultivo de embriones. (A) Placa de lavado típica M2 + BSA. (B) Placa M2+hialuronidasa para la eliminación de células cúmulos. (C) Placa de solución AT opcional para el adelgazamiento de Zona. (D) Placa KSOM+BSA para cultivo de embriones, con recubrimiento de aceite mineral necesario para mantener el pH, la humedad y la temperatura. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Ejemplo de genotipado para resultados NHEJ y HDR . (A) Un diagrama de dibujos animados de la región que rodea el gen Tyr en el genoma del ratón. A continuación se detallan la secuencia no editada (WT) donde se encuentra un sitio de restricción HinfI natural, que se encuentra dentro del sitio de reconocimiento objetivo del sgRNA (texto rojo). A continuación se muestra uno de los muchos resultados posibles después de una exitosa focalización CRISPR / Cas9 donde se forma un "in/del". La naturaleza exacta de esta edición es difícil de predecir, pero es casi seguro que interrumpirá el sitio de HinFi. Más abajo está la secuencia oligo donante que cambia dos pares de bases para convertir el sitio HinfI en un sitio de reconocimiento EcoRI. (B) Resultados representativos del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) después de la edición. Se muestran ejemplos de edición NHEJ (arriba) y HDR (abajo). Esta cifra ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Fenotipo y viabilidad de cigotos y ratones editados por Tyr. Esta tabla ha sido adaptada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Resultados de CRISPR-EZ y experimentos de eliminación por microinyección. Esta tabla ha sido adaptada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro complementario 1: Lista de oligos y ssODN de donantes. Esta tabla ha sido adaptada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Plantilla de ADN para la configuración de la reacción de sgRNA. Esta tabla ha sido adaptada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 3: Configuración de la transcripción in vitro . Esta tabla ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 4: Configuración del complejo RNP para la formación de NHEJ. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 5: Configuración compleja de RNP para la formación de HDR. Esta tabla ha sido adaptada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 6: Configuración compleja de RNP para la eliminación. Esta tabla ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 7: Configuración de la PCR de genotipado. Esta tabla ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 8: Configuración de PCR de genotipado anidado. Esta tabla ha sido modificada con permiso de Modzelewski et al.9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 9: Configuración del resumen de restricción HinfI. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 10: Configuración del resumen de restricción EcoRi. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Aquí se presenta una tecnología de edición del genoma del ratón sencilla y altamente eficiente. La electroporación se puede utilizar para generar embriones modificados en 1-2 semanas (Figura 1) y puede producir ratones editados dentro de las 6 semanas9. En comparación con los protocolos basados en electroporación desarrollados contemporáneamente que entregan RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, el método descrito aquí es conceptualmente similar y ofrece eficiencias en el mismo rango, con solo pequeñas diferencias en el desarrollo y los parámetros del reactivo. Por lo tanto, sugerimos que los lectores comparen y contrasten según las necesidades y el acceso al equipo. Como su nombre lo indica, este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta "el laboratorio de ratones promedio", con solo métodos comunes (IVT, PCR, electroforesis en gel), reactivos (consumibles estándar de cultivo de embriones y tejidos) o equipos (electroporador y cubetas comúnmente utilizados para la transfección bacteriana), que probablemente sean accesibles para la mayoría de los laboratorios que estén interesados y puedan recolectar embriones (o preguntando amablemente a los laboratorios vecinos). Los investigadores de nivel de estudiante graduado con habilidades básicas de manejo de embriones pueden probar la eficiencia de los sgRNAs o realizar experimentos de producción de datos varias veces dentro del marco de tiempo del desarrollo preimplantacional sin la necesidad de programar con una instalación central. Sin embargo, si el objetivo deseado es generar modelos animales sin necesidad de microinyección o manipulación embrionaria, se dispone de métodos menos intrusivos 10,32.

Se están investigando activamente muchos factores que afectan la eficiencia de Cas9, como la especificidad de un objetivo genómico, los parámetros de secuencia de sgRNA, la accesibilidad y topología del genoma y, especialmente, el tipo de célula. Por lo tanto, diseñar y probar sgRNAs es crucial para el éxito. Este protocolo y otros métodos de electroporación desarrollados independientemente se han optimizado para administrar RNP de proteína Cas9 / sgRNA de forma rápida y transitoria en embriones en etapa de cigoto, mejorando la eficiencia y minimizando el mosaicismo debido a la entrega en una etapa temprana del desarrollo y la corta vida media del RNP 7,9,10,11,12,13,14,15, 16,33,34.

Para las estrategias de edición del genoma más comunes y varias cepas de ratones, este método puede superar a las microinyecciones en términos de costo, eficiencia, inserciones pequeñas, mutaciones in/del, deleciones de exones, inserciones y mutaciones puntuales9. Con el protocolo actual, este método es ideal para la creación de mutaciones in/del y deleciones de hasta 2,6 kb, que es mucho más larga que la longitud típica de un exón codificante de proteínas de 170 pb35. Las eliminaciones largas son menos eficientes; Sin embargo, esta limitación no es exclusiva de este protocolo. Por lo tanto, a medida que se mejora la edición mediada por Cas9 y se desarrollan nuevas variantes de proteína Cas, la naturaleza modular de este método permite que estas mejoras aumenten directamente las capacidades de nuestro protocolo.

Si bien este método puede realizar una variedad de ediciones simples, su potencial para estrategias más grandes y complejas, como la inserción de alelos condicionales o etiquetas fluorescentes, se está probando actualmente en nuestro laboratorio. Las ssODN más largas podrían proporcionar un enfoque viable para la edición complicada del genoma y han demostrado éxito en la edición de embriones basada en microinyecciones36; sin embargo, los ssODN más largos son costosos de sintetizar y aún no se han probado ampliamente con electroporación37. El uso de virus adenoasociados (AAV) para introducir secuencias de donantes de hasta 3,3 kb también ha demostrado éxito, pero puede no ser accesible para la mayoría de los laboratorios25. Por el momento, recomendamos la edición estándar del genoma de células madre embrionarias y la microinyección para la ingeniería compleja del genoma del ratón.

Las preocupaciones sobre los efectos fuera del objetivo de Cas9 siguen siendo 8,38,39. Las variaciones de Cas9 modificadas podrían aumentar la especificidad del objetivo, aunque esto no se ha investigado completamente en estudios de electroporación embrionaria RNP. CRISPR-EZ podría ser un método útil para crear modelos de mutación compuesta para explorar genéticas complejas. Si bien las microinyecciones han hecho posible la edición simultánea de múltiples loci40, los métodos de electroporación como el descrito aquí hacen que esto sea más conveniente y efectivo.

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Disclosures

No hay declaraciones financieras pertinentes de los autores.

Acknowledgments

A.J.M. creó el concepto original que condujo al desarrollo de CRISPR-EZ y produjo las figuras. C.K.D. compiló y adaptó los protocolos internos y publicados para este manuscrito actual. A.J.M. es compatible con NIH (R00HD096108).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

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