Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv genomredigering af mus ved CRISPR-elektroporation af zygoter

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

Her beskriver vi en simpel teknik beregnet til effektiv generering af genetisk modificerede mus kaldet CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Denne metode leverer redigering af reagenser ved elektroporation i embryoner med en effektivitet, der nærmer sig 100%. Denne protokol er effektiv til punktmutationer, små genomiske indsættelser og deletioner i pattedyrembryoner.

Abstract

Med enestående effektivitet, nøjagtighed og lethed har CRISPR/Cas9-systemet forbedret genomredigering betydeligt i cellekultur og laboratoriedyreforsøg. Ved generering af dyremodeller tilbyder elektroporation af zygoter højere effektivitet, enkelhed, omkostninger og gennemstrømning som et alternativ til guldstandardmetoden til mikroinjektion. Elektroporation er også blidere, med højere levedygtighed og leverer pålideligt Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteiner (RNP'er) i zygoterne af almindelige laboratoriemusestammer (f.eks. C57BL / 6J og C57BL / 6N), der nærmer sig 100% leveringseffektivitet. Denne teknik muliggør insertion/deletion (indels) mutationer, punktmutationer, deletion af hele gener eller exoner og små insertioner i området 100-200 bp for at indsætte LoxP eller korte tags som FLAG, HA eller V5. Mens vi konstant forbedres, præsenterer vi her den aktuelle tilstand af CRISPR-EZ i en protokol, der inkluderer sgRNA-produktion gennem in vitro-transkription, embryobehandling, RNP-samling, elektroporation og genotypning af præimplantationsembryoner. En forsker på kandidatniveau med minimal erfaring med at manipulere embryoner kan få genetisk redigerede embryoner på mindre end 1 uge ved hjælp af denne protokol. Her tilbyder vi en enkel, billig, effektiv metode med høj kapacitet, der kan bruges med museembryoner.

Introduction

Genomredigering i levende mus er blevet betydeligt forenklet og er blevet tilgængelig og mere overkommelig siden fremkomsten af CRISPR-redigering 1,2,3. Indledende dyreredigeringsforsøg brugte mikroinjektion til at levere CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA i embryoneri nukleart stadium 4,5,6. Mens mikroinjektion er ret effektiv, er mængden af praksis, der kræves for fuldt ud at mestre det, muligvis ikke passende for praktikanter og studerende og kræver også dyrt udstyr, som et beskedent finansieret laboratorium ikke har råd til. Mikroinjektion udføres normalt af ekspertteknikere på transgene faciliteter med tidsplaner og servicepriser, der er hastighedsbegrænsende for mange forskere. En mere tilgængelig tilgang er elektroporation, som har vist sig at være ret effektiv til levering af CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA i embryoner i nukleart stadium7. Yderligere forbedringer i CRISPR-genomredigering og leveringsstrategier antydede, at færdigmonterede RNP'er, der allerede er involveret i sgRNA'er, kan være et effektivt middel til at reducere mosaikisme8.

Rationalet bag udviklingen og brugen af denne protokol var at omgå mange af de begrænsninger og forhindringer, der er forbundet med mikroinjektion. Som navnet antyder, ville en nem, intern og omkostningseffektiv metode, der hurtigt kunne afgøre, om uprøvede sgRNA-designs ville være umagen værd at bruge under et mikroinjektionseksperiment, være et meget praktisk kvalitetskontroltrin i første omgang (figur 1). Selvom denne metode ikke kan erstatte mikroinjektion til mere komplekse strategier, som at introducere lange donor-DNA-sekvenser til rekombinationsbaserede resultater, er den ideel til mindre komplekse strategier som små deletioner eller indsættelser og mærkning af gener. Denne metode er velegnet til forskere med grundlæggende embryomanipulationsfærdigheder, der har enkle redigeringsbehov, gerne vil teste deres hypotese inden for tidsrammen for præimplantationsudvikling eller foretrækker at teste sgRNA'er i embryoner, før de planlægger en aftale med en mikroinjektionsspecialist. Her leveres redigeringsreagenser forbigående til embryoner i nukleart stadium som Cas9 / sgRNA RNP'er via elektroporation (en række elektriske impulser) for at maksimere effektiviteten og samtidig reducere mosaikisme8. Ved hjælp af en embryogenotypemetode er redigeringsresultater tilgængelige i ca. 1 uge9, hvilket reducerer behovet for forskellige mikroinjektionsapplikationer til en betydeligt reduceret pris.

Denne metodes effektivitet topper på pronukleært embryostadiet, når embryoet endnu ikke har smeltet moderens og faderens pronuclei eller er gået ind i S-fase (figur 2). Superovulation bruges til at maksimere antallet af zygoter, men producerer både pronukleære zygoter og ubefrugtede æg. Sunde zygoter kan også vælges før elektroporation for at øge den samlede effektivitet. Da andre elektroporationsprotokoller effektivt har redigeret zygoter uden behov for at inkludere et lignende trin 7,10,11,12,13,14,15, er et valgfrit trin i denne protokol den lille erosion af zona pellucida (ZP). ZP er et glycoproteinlag, der hjælper spermatozobinding, akrosomrespons og befrugtning omkring embryoner i nukleart stadium. I vores erfaring fandt vi, at en mild syrebaseret erosion af ZP giver pålidelig Cas9 RNP-elektroporationslevering med kun en marginal indvirkning på levedygtigheden.

Vi har observeret RNP-leveringshastigheder på op til 100% effektivitet via elektroporation i musestammer, der almindeligvis anvendes i forskning som C57BL / 6J og C57BL / 6N 9,16. Uafhængige grupper har også udviklet elektroporationsbaserede procedurer med effektiviteter større end eller matchende mikroinjektion 11,12,13,14,15,17, hvor elektroporationsprotokoller fungerer godt hos rotter18,19, svin 20,21,22 og ko 23 , så vi foreslår, at læserne sammenligner protokollerne for at finde de forhold, der bedst passer til deres eksperimentelle og udstyrsbehov. Det her beskrevne system anvender almindelige materialer og udstyr, der kun kræver grundlæggende embryomanipulationsfærdigheder. Denne teknik er effektiv til en række redigeringsstrategier, hvilket gør denne metode bredt tilgængelig for forskersamfundet.

Design af ideelle små guide-RNA'er (sgRNA'er) er afgørende for effektiv redigering. Vi anbefaler screening af to til tre sgRNA-strategier pr. målsted direkte i museembryoner, især hvis muselinjegenerering ønskes. Når de er designet, anbefales kloningsfrie metoder som in vitro transkription (IVT) til fremstilling af sgRNA'er af høj kvalitet3. RNP'erne og sgRNA'erne blandes med 30-50 behandlede embryoner i nukleart stadium og udsættes for en række elektriske impulser for først midlertidigt at permeabilisere ZP og cellemembranen med efterfølgende impulser for at holde porerne åbne og elektroforese RNP'erne gennem zygoten24. Efter optimering fandt vi, at seks 3 ms impulser ved 30 V for bulkembryoner (~ 50) var optimale til redigering af effektivitet og levedygtighed, hvilket gav meget effektiv Cas9 / sgRNA RNP levering 9,16,25. Redigeringshændelser i individuelle musemorula kan bekræftes ved hjælp af en række valideringsstrategier, der er almindelige for CRISPR-redigering, såsom restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (RFLP), T7-endonukleasefordøjelse og Sanger-sekventering af interesseområdet26.

Den nuværende metode er mest velegnet til enkle redigeringsskemaer (figur 3), såsom indsættelse/sletninger (indels), sletninger i exon-størrelse i størrelsesordenen 500-2000 bp og levering af punktmutationer og små indsættelser såsom C- eller N-terminaltags (f.eks. FLAG, HA eller V5)9,16,27. Potentialet for kompleks genomredigering, som store indsættelser af fluorescerende tags eller betingede alleler, forbliver usikkert og er det nuværende fokus for kommende forbedringer.

Denne metode er let at mestre og kan bruges til hurtigt at teste sgRNA'er i dyrkede museembryoner i 1 uge9 (figur 1). Præsenteret i dette arbejde er en seks-trins protokol, som omfatter 1) sgRNA design; 2) sgRNA-syntese; 3) superovulation og parring; 4) embryonkultur, indsamling og behandling 5) RNP-samling og elektroporation; 6) Embryokultur og genotypebestemmelse. Oplysninger om alle anvendte materialer findes (Tabel over materialer). Som en positiv kontrol er reagenser til redigering af Tyrosinase (Tyr) locus 9,16 medtaget i den supplerende tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al dyrepleje og brug i hele denne protokol overholdt dyrevelfærdslovens politikker, ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals og fulgte retningslinjer fra AVMA for eutanasi og University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer og politikker. Protokollen for pasning og brug af dyr blev gennemgået og godkendt af University of Pennsylvania IACUC til dette projekt. Som et spørgsmål om overholdelse og forsigtighed skal du søge alle nødvendige tilladelser, før du forsøger denne protokol.

1. sgRNA og valgfrit donoroligo-design

  1. sgRNA design
    1. Vælg kandidat-sgRNA'er fra alle udbredte onlinealgoritmer, såsom Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 eller CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Da hver platform er unik, bedes du læse brugervejledningen omhyggeligt for at designe ideelle sgRNA'er. For in/del-eksperimenter skal du vælge to til tre sgRNA'er, der skal testes. Til deletioner foreslås sgRNA'er, der flankerer målområdet, for eksempel to sgRNA'er opstrøms for målet og to sgRNA'er nedstrøms for målet.
      BEMÆRK: Mens forskellige online sgRNA-algoritmer tager højde for off-targets for at undgå fejlbehæftede sgRNA-designs, er NCBIs BLAST-værktøj nyttigt til at bekræfte kvaliteten af de valgte sgRNA-sekvenser.
    2. Indsæt 19-20 nukleotider (nt) bestemt fra det foregående trin (1.1.1) i det variable område af sgRNA-oligoen (supplerende tabel 1) og køb syntetiseret sgRNA som brugerdefinerede DNA-oligoer.
      BEMÆRK: PAGE rensning er ikke påkrævet.
  2. (Valgfrit) Donor oligo design til homologi rettet reparation (HDR)-medieret knock-in.
    1. Design det passende enkeltstrengede oligodeoxynukleotid (ssODN) baseret på det ønskede eksperimentelle resultat (præcis punktmutation, loxP-indsættelse, indsættelse af små mærker osv.), Idet den samlede længde holdes til 100-200 nt med homologiarme på 50 nt eller mere, der flankerer det centrale område.
    2. For at sikre højere knock-in-effektivitet skal du designe sgRNA'et til at være komplementært til ssODN30 og erstatte protospacer-tilstødende motiv (PAM) sekvens med en lydløs mutation for at forhindre tilbagevendende skæring af Cas9-enzymet.
    3. Bestil ssODN ved hjælp af den brugerdefinerede oligo-indstilling.

2. sgRNA-syntese

  1. Skabelongenerering til in vitro-transkription (IVT)
    1. For at generere DNA-skabelonen til sgRNA IVT gennem PCR skal du forberede en IVT-reaktion i et PCR-striprør, der er RNAse-frit. (se supplerende tabel 2).
    2. Brug følgende termiske cykliske forhold:
      95 °C i 2 min; 30 cyklusser på 95 °C i 2 minutter, 57 °C i 10 s og 72 °C i 10 s derefter 72 °C i 2 minutter
    3. For at verificere succesen med sgRNA DNA-skabelonen PCR-reaktion, elektroforese 5 μL af produktet kombineret med 1 μL 6x belastningsfarvestof på en 2% (vægt / vol) agarosegel.
      BEMÆRK: Den forventede produktstørrelse er 127 bp. Eventuel resterende PCR-reaktion kan opbevares ved -20 °C i op til 5 måneder.
  2. In vitro transkription (IVT) af sgRNA
    1. For at generere sgRNA'et skal du forberede reaktionsblandingen (T7 IVT i henhold til producentens instruktioner) i et PCR-rør og svirpe for at blande reagenserne.
      BEMÆRK: Se supplerende tabel 3 for eksemplet med reaktionsopsætning. IVT-reaktionen er RNase-kontamineringsfølsom; gør derfor alt for at skabe et RNase-frit miljø.
    2. For at reaktionen kan initieres og fortsættes, inkuberes IVT-reaktionsblandingen i >18 timer ved 37 °C enten i en termisk cyklist eller varmeblok.
    3. For at nedbryde den oprindelige DNA-skabelon (trin 2.1.3) indføres 1 μL DNase I (2 enheder pr. reaktion) og inkuberes reaktionen i 20 minutter ved stuetemperatur (RT).
    4. For at fremme RNA-binding til de magnetiske oprensningsperler kombineres 129 μL 100% ethanol i reaktionen, som nu vil være 150 μL.
    5. For at resuspendere rensningsperlerne, som har tendens til at sætte sig under opbevaring, hvirvler alikvoten i mindst 10 s.
    6. For at rense sgRNA'erne tilsættes 100 μL af de resuspenderede perler (trin 2.2.5) til IVT-reaktionen (trin 2.2.4) og blandes forsigtigt ved pipettering op og ned 10x.
    7. For at muliggøre binding skal blandingen hvile ved RT i 5 minutter.
    8. For at isolere sgRNA'et fra de ikke-inkorporerede reaktionsprodukter skal du placere reaktionen på de magnetiske stativer i 5 minutter ved RT og vente, indtil der dannes en lille pellet.
    9. For at vaske sgRNA'erne skal supernatanten først kasseres forsigtigt, og derefter tilsættes 200 μL 80% ethanol væk fra pelleten.
      BEMÆRK: Under 80% (vol / vol) ethanolvasketrin er det vigtigt at undgå at forstyrre pelleten ved pipettering, da dette vil reducere sgRNA-koncentrationerne betydeligt. I stedet pipetteres forsigtigt 80% ethanol, så pelleten nedsænkes, og fjern forsigtigt volumenet med en pipette.
    10. Gentag det forrige trin (trin 2.2.9) og lufttør pelleten i højst 5-6 minutter, ellers vil sgRNA'et være permanent forbundet med perlerne.
    11. Eluer sgRNA'et med 20μL nukleasefrit vand ved at pipettere pellet 10x, inkubere i 2 minutter ved (RT) og derefter placere det tilbage på magnetstativet for at adskille perlerne fra det nu rensede sgRNA.
    12. For at evaluere kvaliteten og mængden af sgRNA'et skal du bruge et instrument som et spektrofotometer eller bioanalysator. Alternativt køres 2 μL sgRNA'er på en 2% agarosegel, svarende til trin 2.1.3.
      BEMÆRK: Kvaliteten bekræftes af et enkelt klart bånd. Resten af sgRNA'et kan enten anvendes med det samme eller opbevares under -80 °C-betingelser.

3. Superovulation

  1. For at give nok embryoner til at teste hvert sgRNA-design superægulerer to til tre C57BL/6J-hunner, der er mellem 3-5 uger gamle, som tidligere beskrevet9. Elektroporering af 20-30 embryoner pr. sgRNA anbefales for at generere nok resultater til at bekræfte effektiviteten.
    BEMÆRK: Hvis befrugtning er vellykket, forventer 10-20 embryoner pr. Parring.
  2. For at fremkalde ægløsning skal du følge denne hormoninjektionsplan:
    1. Dag 1: Administrer 5 IE drægtige hoppeserumgonadotropin (PMSG) (100 μL) gennem en intraperitoneal injektion (IP) ved hjælp af en 26 G sprøjte til 3-5 uger gamle hunmus.
    2. Dag 3: Efter 46-48 timers PMSG-injektion injiceres 5 IE humant choriongonadotropin (hCG) (100 μL) gennem en IP-injektion for at inducere ægløsning.
    3. For at oprette avl skal du parre hunner 1: 1 med en mand med pålidelig avl lige efter hCG-injektion.
      BEMÆRK: For at forhindre hormoner i at nedbrydes og miste aktivitet, udfør injektioner under 30 min optøning.

4. Indsamling og behandling af embryoner

  1. Indsamling af embryoner
    1. For at aflive kvinder og hente det nødvendige materiale, som tidligere beskrevet31, skal du først bekræfte den passende metode i overensstemmelse med institutionelle politikker. Brug for eksempel CO2 kvælning, cervikal dislokation og / eller andre godkendte metoder.
      BEMÆRK: Normalt viser >75% af hormonstimulerede hunner kopulatoriske stik, hvilket indikerer vellykket parring.
    2. For at forhindre hår i at gøre vævsindsamling vanskelig, skal du placere de aflivede hunner på ryggen og sprøjte 70% (vol / vol) ethanol på maveregionen, der skal åbnes kirurgisk.
      BEMÆRK: Fra dette tidspunkt anbefales det at udføre de kirurgiske trin i en ventileret hætte for at opretholde et aseptisk miljø og reducere risikoen for kontaminering.
    3. For at åbne bughulen og fjerne ovidukterne skal du klippe huden / håret (subkutant) lag med kirurgisk saks og lokalisere æggestokkene (figur 4), som findes nær nyrerne og dele en del af en fedtpude. Ovidukterne er placeret proksimalt til æggestokkene (figur 4). Begge ovidukter fjernes kirurgisk fra hunnen og anbringes i individuelle 50 μL dråber M2+BSA (4 mg/ml BSA) substrat (figur 5A).
      BEMÆRK: Detaljerede instruktioner til dette afsnit af proceduren kan ses visuelt31 eller følges trinvis9 ved hjælp af tidligere offentliggjorte protokoller.
    4. For at frigive cumulus-oocytkomplekserne (CoC'er) indeholdende oocytter (figur 4) skal du bruge dissektionspincet til at hakke oviduktens ampulla, mens du ser gennem et stereomikroskop.
    5. For at reducere mængden af snavs (blod, fedt, væv) skal du overføre og kombinere hver CoC til en enkelt 50 μL dråbe M2+BSA-medier med en håndholdt pipette indstillet til 20-30 μL for at undgå overførsel af snavs.
  2. Fjernelse af cumulusceller
    1. For at begynde fjernelsen af cumulusceller fra zygoterne (figur 4) overføres CoC'er med så lidt ekstra medier som muligt til en dråbe på 100 μL M2+hyaluronidase (figur 5B) og blandes forsigtigt ved pipettering af CoC'erne, indtil embryonerne er synligt adskilt fra de meget mindre cumulusceller. Sørg for at holde eksponeringen af M2+hyaluronidase for embryonerne på et minimum, da det kan påvirke levedygtigheden.
      BEMÆRK: Man kan enten forvarme (37 °C) eller tilføje yderligere 50 μL M2+hyaluronidase, hvis embryonerne ikke adskilles fra cumuluscellerne inden for 2 min.
    2. For at fortynde hyaluronidase og fjerne løse cumulusceller fra zygoterne skal du bruge en mundbetjent pipette til at flytte zygoterne til en frisk 50 μL M2+BSA-dråbe.
      BEMÆRK: De fleste trin ud over dette punkt kræver brug af en mundbetjent pipette, medmindre andet er angivet. Mens risikoen for kontaminering fra brugeren er lav, anbefales det at bruge et inline-luftfilter for at opretholde et aseptisk miljø. Der henvises til tidligere beskrevne metoder til forberedelse og brug af dette instrument 9,31.
    3. Brug en mundpipette til at føre embryonerne gennem mindst fire til fem yderligere 50 μL M2+BSA-dråber for at reducere antallet af cumulusceller.
  3. (VALGFRIT) Udtynding af zona pellucida med sur tyrode (AT) opløsning.
    1. For at nedbryde embryonets zona pellucida og reducere yderligere fysiske hindringer for levering af reagens overføres embryonerne til en forvarmet (37 °C) 100 μL dråbe AT-opløsning på en 60 mm plade (figur 5C). Kontinuerligt observere zygoterne ved hjælp af et stereomikroskop, indtil ca. 30% af zona pellucida er eroderet9. Den samlede AT-eksponering skal være 60-90 s. Langvarig eksponering for AT kan helt opløse zona pellucida og bringe embryoets levedygtighed i fare.
      BEMÆRK: For detaljerede instruktioner og billeder af dette afsnit af proceduren henvises til tidligere offentliggjorte metoder 9,16.
    2. For at fortynde AT, brug en mundpipette til at føre embryonerne gennem mindst fire 50 μL dråber M2+BSA.
    3. For at afgøre, om et passende antal embryoner er blevet behandlet, skal du bruge et stereomikroskop til at tælle embryonerne. Afhængigt af antallet af anvendte hunmus kan man forvente ca. 10-20 levedygtige zygoter pr. hun.
      BEMÆRK: På dette stadium bør embryoner være relativt fri for affald, der forhindrer evaluering af kvantitet og kvalitet. For eksempel, hvis man bruger fem kvinder, vil det forventede zygotetal sandsynligvis være mellem 50-100, og en mekanisk celletæller ville være passende til at holde styr på embryoner. Det er almindeligt at miste ca. 10% -20% af embryonerne på grund af manglende befrugtning eller ægløsning af lav kvalitet. I næste trin opbevares embryonerne kortvarigt i 50 μL M2+BSA i højst 30 minutter i en inkubator.

5. RNP-samling og elektroporation

  1. RNP-samling
    1. For at samle RNP-komplekset skal du bruge de vedhæftede eksempeltabeller til at kombinere de relevante reaktionsblandinger baseret på den ønskede redigeringsstrategi i RNP-buffer (100 mM HEPES pH 7,5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% glycerol og 100 mM Tris (2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid [TCEP] i nukleasefrit vand)
      BEMÆRK: TCEP er et praktisk reduktionsmiddel, men har en kort halveringstid i vandige opløsninger; Tilføj derfor TCEP lige før RNP-kompleks samling.
      1. For ikke-homologe endesammenføjningsled (NHEJ)-medierede indels henvises til supplerende tabel 4.
      2. For homologirettet reparation (HDR)-medieret redigering henvises til supplerende tabel 5.
      3. For tekniske sletninger ved hjælp af parrede sgRNA'er henvises til supplerende tabel 6.
        1. Uanset strategi kombineres de ønskede reagenser ved RT i et PCR-rør.
        2. For at tillade dannelse af RNP-komplekset inkuberes blandingen i 10 minutter ved 37 °C.
          BEMÆRK: RNP-kompleks kan opbevares på RT i op til 1 time.
  2. Elektroporation
    1. For at fortynde BSA før elektroporation føres embryonerne gennem mindst to dråber på 50 μL reduceret serummedium.
      BEMÆRK: BSA øger modstanden under elektroporation og kan beskadige zygoterne.
    2. For at forberede og blande zygoterne (trin 4.3.2) med RNP-komplekset (trin 5.1.1.2) til elektroporation, mundpipetter 25-30 embryoner i en 10 μL dråbe reduceret serummedie og derefter bruge en håndholdt pipette til at tilføje 10 μL af RNP-komplekset (trin 5.1.1.2).
    3. For at fortynde den viskøse glycerol fra RNP-komplekset og homogenisere prøven blandes ved pipettering 10x, eller indtil blandingen ikke længere viser tegn på viskositet (hvirvelmønster) ved hjælp af et stereomikroskop.
    4. For at forberede prøven til indsættelse i elektroporatoren pipetteres denne 20 μL embryo + RNP-blanding i en 0,1 cm elektroporationskuvette, samtidig med at bobler undgås.
    5. For at levere redigeringsreagenserne i zygoten elektroporate embryonerne ved hjælp af en firkantbølgeprotokol med disse betingelser: 30 V, 4-6 impulser, 3 ms pulslængde og 100 pulsintervaller.
    6. For at hente zygoter fra kuvetten skal du bruge en håndpipette til at levere 50 μL KSOM+BSA (1mg/ml BSA) i toppen af kuvetten for at skylle de embryoner, der kan have lagt sig til bunden. Denne blanding pipetteres forsigtigt ud og på en 60 mm plade.
    7. Trin 5.2.6 gentages mindst 2x-3x, og hver skylning kombineres på en 60 mm plade, indtil de fleste embryoner er genvundet.
      BEMÆRK: En typisk bedring er >90% af de oprindeligt indlæste embryoner. For at sikre embryooverlevelse skal du teste inkubatoren og kontrollere udløbsdatoerne for alle reagenser. Embryoner er modtagelige for ikke-ideelle dyrkningsforhold såsom temperatur, CO2 -niveau, fugtighed og pH.

6. Embryokultur og genotypebestemmelse

  1. Embryo kultur
    1. For at dyrke zygoter til et ønsket stadium skal du bruge en mundpipette til at overføre 20-30 zygoter til en dråbe KSOM+BSA i en præekvilibreret kulturplade og flytte embryonerne til dråben (figur 5D). Pladen inkuberes natten over i 5 % CO2 ved 37 °C med 95 % fugtighed.
      BEMÆRK: Forligevægt ved at placere en forberedt 35 mm dyrkningsplade i en inkubator enten dagen før eller mindst 4 timer før inkubation (figur 5D).
    2. For at fremme ideelle vækstbetingelser overføres kun tocellede embryoner den følgende dag til en frisk dråbe KSOM+BSA-blanding ved hjælp af et stereomikroskop og vender tilbage til inkubatoren. Sørg for at forlade eller kassere de døde eller ubefrugtede embryoner.
      BEMÆRK: Pronukleare embryoner vokser typisk til morulae efter 72 timers kultur og blastocyster efter 84 timer.
  2. Genotypebestemmelse
    1. For at fortynde de komponenter i mediet, der kan forstyrre en PCR-reaktion, skal morula/blastocystembryonerne vaskes med en mundpipette ved at passere gennem to dråber DPBS.
    2. For at indlæse enkelte embryoner til lysis overføres individuelle embryoner til en brønd i en 8-brønds PCR-strimmel ved at indstille en pipette til 1 μL og derefter tilsættes 10 μL lysisbuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8,5, 2,5 mMMgCl2, 0,1 mg/ml gelatine, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20, 0,2 mg/ml proteinase K i nukleasefri H2O).
      BEMÆRK: Tilsæt proteinase K lige før tilberedning af lysisbufferen.
    3. For at lyse embryonerne programmeres en termisk cyklist til 55 °C i 4 timer, og derefter inaktiveres proteinasen K med en 10 minutters inkubation ved 95 °C.
      BEMÆRK: Især for førstegangsbrugere, prøv et redigeringseksperiment på Tyr loci. Denne arbejdsgang er optimeret og kan fungere som en positiv kontrol. Opbevar om nødvendigt embryolysaterne ved 4 °C i 2-3 dage eller i fryseren i op til 2 uger før PCR-analyse. Undgå gentagne fryse-optøningscyklusser.
    4. For at øge chancerne for vellykket genotypeanalyse skal du udføre en indlejret PCR-strategi ved at forstærke lidt længere DNA-fragmenter, der flankerer det målrettede sted, samt regioner, der vil blive brugt til at forstærke et mere præcist DNA-fragment. Følg betingelserne i supplerende tabel 7.
    5. Følg nedenstående termiske cykliske forhold:
      95 °C i 2 min
      30+ cyklusser: 95 °C i 2 minutter, 60 °C i 10 sekunder og 72 °C i 10 sekunder
      72 °C i 2 min
    6. For at forberede anden fase af en indlejret PCR-strategi skal du foretage en 1:10 fortynding af det første PCR-produkt (trin 6.2.5) og indlæse 2 μL af dette i den næste PCR-reaktion (med primere designet til at være inde i den forrige amplicon).
      BEMÆRK: Den første PCR-reaktion skal fortyndes for at reducere overførslen af flankerende primere i den anden PCR-reaktion. Forbered den indlejrede PCR ved at følge trinnene i supplerende tabel 8.
    7. Anbring PCR-reaktionen i en termisk cyklist under anvendelse af følgende cykelbetingelser:
      95 °C i 2 min
      30 cyklusser: 95 °C i 2 minutter, 60 °C i 10 sekunder og 72 °C i 10 sek
      72 °C i 2 min
      BEMÆRK: Normalt er >90% af PCR-reaktioner vellykkede, når amplionstørrelsen er 500 bp eller mindre.
    8. (Valgfri kontrol) For NHEJ-medierede in/del-mutationer, hvor Tyr anvendes som positiv kontrol, fordøjes 10 μL af de indlejrede PCR-produkter fra trin 6.2.7 ved inkubation ved 37 °C i 4 timer ved anvendelse af 10 U HinfI i en 20 μL reaktion (se supplerende tabel 9). På en 2% agarosegel skal du køre det fordøjede produkt for at evaluere redigering og bruge et ikke-fordøjet PCR-produkt som belastningskontrol. Kør gelen ved 135 V i 30 min.
      BEMÆRK: Brugen af HinfI som et passende restriktionsenzym blev valgt på grund af et bekvemt placeret Hinfi-sted, der er til stede i sgRNA-målområdet, og som forventes at blive ableret efter en vellykket NHEJ-redigering. En detaljeret metode og resultater er tidligere beskrevet 9,16.
    9. (Valgfri kontrol) For HDR-medierede mutationer, hvor Tyr anvendes som positiv kontrol, fordøjes 10 μL af de indlejrede PCR-produkter fra trin 6.2.7 ved inkubation ved 37 °C i 4 timer ved hjælp af 10 U EcoRI i en 20 μL reaktion (se supplerende tabel 10). På en 2% agarosegel skal du køre det fordøjede produkt for at evaluere redigering og bruge et ikke-fordøjet PCR-produkt som belastningskontrol. Kør gelen ved 135 V i 30 min.
      BEMÆRK: Valget af EcoRI som et diagnostisk restriktionsenzym udnytter den oprindelige sekvens, der findes i sgRNA-målområdet, hvor det naturligt forekommende HinfI-sted efter vellykket HDR erstattes med et EcoRI-sted, og der tvinges en frameshift-mutation, der forstyrrer Tyr-genet. Til HDR-analyse skal du udføre både NHEJ (trin 6.2.8) og HDR (trin 6.2.9) analyser på hver prøve, da begge resultater kan forekomme og kan hjælpe med at bestemme mosaik. En detaljeret metode og resultater er tidligere beskrevet 9,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metode genererer mere end 100 μg sgRNA (20 μL ved >6.000 ng/L koncentration) til effektiv Cas9/sgRNA RNP-samling. Den rutinemæssige superovulationsmetode, der er beskrevet her, producerer typisk 10-20 levedygtige embryoner pr. Tilsluttet kvinde. På grund af håndteringsfejl og typiske tab forbundet med embryomanipulation forventes det, at 80% af embryonerne befrugtes, levedygtige og i fremragende stand efter elektroporation. For at hjælpe forskere med at udføre et vellykket eksperiment har vi givet et eksempel på en strategi til at målrette musens Tyr-locus som en positiv kontrol (figur 6), herunder oligodesign (figur 6A, supplerende tabel 1) og genotypestrategier for både NHEJ- og HDR-begivenheder (figur 6B) (trin 6.2). Detaljerede eksempler på eksperimentel succes og resultater er tilgængelige 9,16.

I et tidligere forsøg på at sammenligne denne protokol med mikroinjektion var samlet over 30 forskellige redigeringsforsøg, der involverede syv forskellige laboratorier til at generere musemodeller, alle vellykkede 9,16. Desuden blev denne metode anvendt til at undersøge og rapportere om den første væsentlige retrotransposon i pattedyrs udvikling27. Ved anvendelse af en simpel strategi såsom levering af et enkelt sgRNA var leveringen af RNP'er op til og med 100% i C57BL/6J- og C57BL/6N-musestammerne, hvor in/del-dannelse forekom ved 50-100% og små oligobaserede udskiftninger fra 14%-63%9,16 (tabel 1). Ved konstruktion af genomiske sletninger kan redigeringseffektiviteten variere fra 3% til 100%, hvor bidragende faktorer inkluderer genomisk placering, sgRNA-design og størrelsen af sletningen (tabel 2). For eksempel er sletninger, der er mindre end 1.000 bp, mere vellykkede end dem, der er større end 1.000 bp 9.16.

Ved brug af 60 embryoner til elektroporation overgår denne protokol mikroinjektion med hensyn til redigeringseffektivitet, hvilket resulterer i 3-4 grundlæggerdyr sammenlignet med en grundlægger fra mikroinjektion9. For gen-knockout-eksperimenter i C57BL/6N-musestammen, der anvendte identisk sgRNA, klarede denne metode sig bedre end mikroinjektion, hvilket gav et gennemsnit på fire grundlæggerdyr9 (tabel 2). For små indsættelser, såsom V5- eller HA-mærkning, er ssODN'er op til 162 nt blevet testet med succes, og indsatsen er i øjeblikket rettet mod at skalere op til 1000-2000 nt. Succesen med disse eksperimenter afhænger i høj grad af effektiviteten af det sgRNA, der bruges til HDR-resultater, for at være robust. Næsten alle HDR-resultater er mosaik, men mellem 31% -64% af embryonerne viser nogle tegn på indsættelser 9,16.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over CRISPR-EZ. En grafisk oversigt over arbejdsgangen. Når en strategi og design er lavet, kan redigerede embryoner genereres og testes på ca. 1 uge. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. og Chen et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Ideel timing til at udføre proceduren. Diagrammet viser relevante funktioner og tidspunkter under den første cellulære opdeling efter befrugtning. For at udføre denne tilgang får forskere nogle synlige spor, såsom morfologiske ændringer, estimater af cellecyklustid og kemiske markører, der ofte observeres før den første spaltning. Da det nøjagtige tidspunkt for insemination og befrugtning er ukendt, ville en fornuftig anbefaling være at betragte time 0 som midnat. Før zygoten går ind i S-fasen er det ideelle tidspunkt at levere redigeringsmaskiner til enten NHEJ eller HDR, hvilket oversættes til at udføre denne protokol mellem kl. 7 og 11 om morgenen. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Redigeringsstrategiernes succes. Simple strategier såsom et enkelt sgRNA resulterer i en in/del via NHEJ-reparation eller en præcisionsmutation, når den kombineres med en ssODN-skabelon gennem HDR. NHEJ-reparation kan også bruges til sletninger ved hjælp af flere sgRNA'er. Generelt gælder det, at jo enklere strategien er, jo mere effektiv er CRISPR-EZ uden yderligere optimering. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Lokalisering af ovidukt og ampulla. Efter kirurgisk isolering af reproduktionsvævet skal man sikre regionen ved at anvende let tryk på fedtpuden med tang. Fedtpuden er en relativt sikker region at manipulere for ikke at skade æggestokkene / ovidukten. Området i den stiplede firkant skal fjernes og placeres i en dråbe M2 for yderligere dissektion. Et tegneseriediagram viser interesseområdet med de relevante anatomiske strukturer mærket. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Foreslået opsætning af bearbejdnings- og kulturplader. Skemaer, der viser forskellige pladeopsætninger for at hjælpe forskere med at udføre både embryobehandling og kultur. (A) Typisk M2+BSA-vaskeplade. B) M2+hyaluronidaseplade til fjernelse af cumulusceller. (C) Valgfri AT-opløsningsplade til Zona-udtynding. (D) KSOM+BSA-plade til embryokultur med mineraloliebelægning, der er nødvendig for at opretholde pH, fugtighed og temperatur. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Genotypeeksempel for NHEJ- og HDR-resultater . (A) Et tegneseriediagram over området omkring Tyr-genet i musegenomet. Nedenfor er detaljer om den uredigerede (WT) sekvens, hvor der findes et naturligt forekommende HinfI-restriktionssted, som er inden for målgenkendelsesstedet for sgRNA'et (rød tekst). Nedenfor er et af mange mulige resultater efter vellykket CRISPR/Cas9-målretning, hvor der dannes en "in/del". Den nøjagtige karakter af denne redigering er vanskelig at forudsige, men vil næsten helt sikkert forstyrre Hinfi-webstedet. Længere nedenfor er donoroligosekvensen, der ændrer to basepar for at gøre Hinfi-stedet til et EcoRI-genkendelsessted. (B) Repræsentative restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (RFLP) resultater efter redigering. NHEJ (øverst) og HDR (nederst) redigeringseksempler vises. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Fænotype og levedygtighed af Tyr-redigerede zygoter og mus. Denne tabel er tilpasset med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Resultater af CRISPR-EZ og mikroinjektionsdeletionseksperimenter. Denne tabel er tilpasset med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 1: Liste over oligoer og donor ssODN. Denne tabel er tilpasset med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: DNA-skabelon til sgRNA-reaktionsopsætningen. Denne tabel er tilpasset med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 3: In vitro transkriptionsopsætning. Denne tabel er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 4: RNP-kompleks opsætning til NHEJ-dannelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 5: RNP-kompleks opsætning til HDR-dannelse. Denne tabel er tilpasset med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 6: RNP-kompleks opsætning til sletning. Denne tabel er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 7: Genotyping PCR-opsætning. Denne tabel er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 8: Indlejret genotype-PCR-opsætning. Denne tabel er blevet ændret med tilladelse fra Modzelewski et al.9. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 9: Opsætning af HinfI restriction digest. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 10: EcoRi restriktionsdigest opsætning. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Præsenteret her er en ligetil og yderst effektiv musegenomredigeringsteknologi. Elektroporation kan bruges til at generere modificerede embryoner på 1-2 uger (figur 1) og kan producere redigerede mus inden for 6 uger9. Sammenlignet med samtidigt udviklede elektroporationsbaserede protokoller, der leverer RNP'er 7,10,11,12,13,14,15,17,32, er metoden som beskrevet her konceptuelt ens og tilbyder effektivitetsgevinster i samme område med kun mindre forskelle i reagensudvikling og parametre. Derfor foreslår vi, at læserne sammenligner og kontrasterer baseret på behov og adgang til udstyr. Som navnet antyder, blev denne protokol udviklet med "det gennemsnitlige muselaboratorium" i tankerne med kun almindelige metoder (IVT, PCR, gelelektroforese), reagenser (standard embryo- og vævskulturforbrug) eller udstyr (elektroporator og kuvetter, der almindeligvis anvendes til bakteriel transfektion), som sandsynligvis er tilgængelige for de fleste laboratorier, der er interesserede og i stand til at indsamle embryoner (eller ved venligt at spørge nabolaboratorier). Forskere på kandidatniveau med grundlæggende embryohåndteringsfærdigheder kan teste sgRNA'er for effektivitet eller udføre dataproducerende eksperimenter flere gange inden for tidsrammen for præimplantationsudvikling uden behov for at planlægge med en kernefacilitet. Men hvis det ønskede mål er at generere dyremodeller uden behov for hverken mikroinjektion eller embryomanipulation, er mindre påtrængende metoder tilgængelige10,32.

Mange faktorer, der påvirker Cas9-effektiviteten, undersøges aktivt, såsom specificiteten af et genomisk mål, sgRNA-sekvensparametre, genomtilgængelighed og topologi og især celletype. Derfor er design og test af sgRNA'er afgørende for succes. Denne protokol og andre uafhængigt udviklede elektroporationsmetoder er optimeret til at levere Cas9-protein / sgRNA RNP'er hurtigt og forbigående i embryoner i zygote-stadiet, hvilket øger effektiviteten, samtidig med at mosaikisme minimeres på grund af levering på et tidligt udviklingsstadium og den korte halveringstid for RNP 7,9,10,11,12,13,14,15, 16,33,34.

For de mest almindelige genomredigeringsstrategier og forskellige stammer af mus kan denne metode overgå mikroinjektioner med hensyn til omkostninger, effektivitet, små indsættelser, in / del-mutationer, exon-deletioner, insertioner og punktmutationer9. Med den nuværende protokol er denne metode ideel til oprettelse af in/del-mutationer og deletioner op til 2,6 kb, hvilket er meget længere end den typiske længde af en proteinkodende exon på 170 bp35. Lange sletninger er mindre effektive; Denne begrænsning er dog ikke unik for denne protokol. Efterhånden som Cas9-medieret redigering forbedres, og nye Cas-proteinvarianter udvikles, giver denne metodes modulære karakter mulighed for, at disse forbedringer direkte øger mulighederne i vores protokol.

Selvom denne metode kan udføre en række enkle redigeringer, testes dens potentiale for større og mere komplekse strategier, såsom indsættelse af betingede alleler eller fluorescerende tags, i øjeblikket i vores laboratorium. Længere ssODN'er kunne give en levedygtig tilgang til kompliceret genomredigering og har vist succes med mikroinjektionsbaseret embryoredigering36; dog er længere ssODN'er dyre at syntetisere og er endnu ikke testet grundigt med elektroporation37. Brugen af adeno-associerede vira (AAV) til at introducere op til 3,3 kb donorsekvenser har også vist succes, men er muligvis ikke tilgængelig for de fleste laboratorier25. Indtil videre anbefaler vi standard embryonal stamcellegenomredigering og mikroinjektion til kompleks musegenomteknik.

Bekymringer om Cas9 off-target effekter forbliver 8,38,39. Manipulerede Cas9-variationer kan øge målspecificiteten, selvom dette ikke er blevet undersøgt fuldt ud i RNP-embryoelektroporationsstudier. CRISPR-EZ kunne være en nyttig metode til at skabe sammensatte mutationsmodeller til at udforske kompleks genetik. Mens mikroinjektioner har gjort samtidig redigering af flere loci mulige40, gør elektroporationsmetoder som den, der er beskrevet her, dette mere praktisk og effektivt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der er ingen relevante finansielle erklæringer fra forfatterne.

Acknowledgments

A.J.M. skabte det oprindelige koncept, der førte til udviklingen af CRISPR-EZ og producerede figurerne. C.K.D. samlede og tilpassede de interne og offentliggjorte protokoller til dette aktuelle manuskript. A.J.M. understøttes af NIH (R00HD096108).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Tags

Udviklingsbiologi nummer 190
Effektiv genomredigering af mus ved CRISPR-elektroporation af zygoter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J.… More

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J. Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes. J. Vis. Exp. (190), e64302, doi:10.3791/64302 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter