Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv genomredigering av möss genom CRISPR-elektroporering av zygoter

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

Här beskriver vi en enkel teknik avsedd för effektiv generering av genetiskt modifierade möss som kallas CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Denna metod levererar redigeringsreagens genom elektroporering till embryon med en effektivitet som närmar sig 100%. Detta protokoll är effektivt för punktmutationer, små genomiska insättningar och deletioner i däggdjursembryon.

Abstract

Med exceptionell effektivitet, noggrannhet och lätthet har CRISPR / Cas9-systemet avsevärt förbättrat genomredigering i cellodling och laboratoriedjurförsök. Vid generering av djurmodeller erbjuder elektroporering av zygoter högre effektivitet, enkelhet, kostnad och genomströmning som ett alternativ till guldstandardmetoden för mikroinjektion. Elektroporering är också mildare, med högre livskraft, och levererar tillförlitligt Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteiner (RNP) i zygoterna hos vanliga laboratoriemusstammar (t.ex. C57BL / 6J och C57BL / 6N) som närmar sig 100% leveranseffektivitet. Denna teknik möjliggör infogning/deletion (indels) mutationer, punktmutationer, deletion av hela gener eller exoner och små infogningar i intervallet 100-200 bp för att infoga LoxP eller korta taggar som FLAG, HA eller V5. Samtidigt som vi ständigt förbättras presenterar vi här det aktuella tillståndet för CRISPR-EZ i ett protokoll som inkluderar sgRNA-produktion genom in vitro-transkription, embryobehandling, RNP-montering, elektroporering och genotypning av preimplantatoriska embryon. En forskare på forskarnivå med minimal erfarenhet av att manipulera embryon kan få genetiskt redigerade embryon på mindre än 1 vecka med hjälp av detta protokoll. Här erbjuder vi en enkel, billig, effektiv, högkapacitetsmetod som kan användas med musembryon.

Introduction

Genomredigering hos levande möss har förenklats avsevärt och har blivit tillgänglig och billigare sedan uppkomsten av CRISPR-redigering 1,2,3. Initiala djurredigeringsförsök använde mikroinjektion för att leverera CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA till embryon i pronukleärt stadium 4,5,6. Medan mikroinjektion är ganska effektiv, kanske mängden övning som krävs för att fullt ut behärska det inte är lämpligt för praktikanter och studenter och kräver också dyr utrustning som ett blygsamt finansierat laboratorium inte har råd med. Mikroinjektion utförs normalt av experttekniker vid transgena anläggningar med scheman och servicepriser som är hastighetsbegränsande för många forskare. Ett mer tillgängligt tillvägagångssätt är elektroporering, vilket har visat sig vara ganska effektivt för leverans av CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA till embryon i pronukleärt stadium7. Ytterligare förbättringar av CRISPR-genomredigering och leveransstrategier föreslog att förmonterade RNP som redan är engagerade i sgRNA kan vara ett effektivt sätt att minska mosaicism8.

Logiken bakom utvecklingen och användningen av detta protokoll var att kringgå många av de begränsningar och hinder som är förknippade med mikroinjektion. Som namnet antyder skulle en enkel, intern och kostnadseffektiv metod som snabbt kan avgöra om otestade sgRNA-mönster skulle vara värda att använda under ett mikroinjektionsexperiment vara ett mycket bekvämt första pass kvalitetskontrollsteg (figur 1). Även om denna metod inte kan ersätta mikroinjektion för mer komplexa strategier, som att introducera långa donator-DNA-sekvenser för rekombinationsbaserade resultat, är den idealisk för mindre komplexa strategier som små deletioner eller infogningar och taggningsgener. Denna metod är lämplig för forskare med grundläggande embryomanipulationsförmåga som har enkla redigeringsbehov, vill testa sin hypotes inom tidsramen för preimplantatorisk utveckling eller föredrar att testa sgRNA i embryon innan de bokar ett möte med en mikroinjektionsspecialist. Här levereras redigeringsreagens tillfälligt till embryon i pronukleärt stadium som Cas9 / sgRNA RNP via elektroporering (en serie elektriska pulser) för att maximera effektiviteten samtidigt som mosaicism minskar8. Med hjälp av en embryogenotypningsmetod finns redigeringsresultat tillgängliga i cirka 1 vecka9, vilket minskar behovet av olika mikroinjektionsapplikationer till en betydligt lägre kostnad.

Denna metods effektivitet toppar vid det pronukleära embryostadiet, när embryot ännu inte har smält samman moderns och faderns pronuclei eller gått in i S-fas (figur 2). Superovulation används för att maximera antalet zygoter men producerar både pronucleära zygoter och obefruktade ägg. Friska zygoter kan också väljas före elektroporering för att öka den totala effektiviteten. Eftersom andra elektroporeringsprotokoll effektivt har redigerat zygoter utan att behöva inkludera ett liknande steg 7,10,11,12,13,14,15, är ett valfritt steg i detta protokoll den lilla erosionen av zona pellucida (ZP). ZP är ett glykoproteinskikt som hjälper spermatozoabindning, akrosomrespons och befruktning kring embryon i pronukleärt stadium. Enligt vår erfarenhet fann vi att en mild syrabaserad erosion av ZP ger tillförlitlig Cas9 RNP-elektroporeringsleverans med endast en marginell inverkan på livskraften.

Vi har observerat RNP-leveranshastigheter på upp till 100% effektivitet via elektroporering i musstammar som vanligtvis används i forskning som C57BL / 6J och C57BL / 6N 9,16. Oberoende grupper har också utvecklat elektroporeringsbaserade procedurer med effektivitet större än eller matchande mikroinjektion 11,12,13,14,15,17, med elektroporeringsprotokoll som fungerar bra hos råtta18,19, gris 20,21,22 och ko 23 , så vi föreslår att läsarna jämför protokollen för att hitta de förhållanden som bäst passar deras experimentella och utrustningsbehov. Systemet som beskrivs här använder vanliga material och utrustning, vilket endast kräver grundläggande embryomanipulationsfärdigheter. Denna teknik är effektiv för en rad redigeringsstrategier, vilket gör denna metod allmänt tillgänglig för forskarsamhället.

Att designa ideala små guide-RNA (sgRNA) är avgörande för effektiv redigering. Vi rekommenderar screening av två till tre sgRNA-strategier per målplats direkt i musembryon, särskilt om muslinjegenerering önskas. När de väl är utformade rekommenderas kloningsfria metoder som in vitro-transkription (IVT) för att producera högkvalitativa sgRNA3. RNP och sgRNA blandas med 30-50 bearbetade embryon i pronukleärt stadium och utsätts för en serie elektriska pulser för att först tillfälligt permeabilisera ZP och cellmembranet, med efterföljande pulser för att hålla porerna öppna och elektrofores RNP genom zygoten24. Efter optimering fann vi att sex 3 ms pulser vid 30 V för bulkembryon (~ 50) var optimala för redigeringseffektivitet och livskraft, vilket gav mycket effektiv Cas9 / sgRNA RNP-leverans 9,16,25. Redigeringshändelser i enskilda musmorula kan bekräftas med hjälp av en mängd olika valideringsstrategier som är vanliga för CRISPR-redigering, såsom restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP), T7-endonukleassmältning och Sanger-sekvensering av området av intresse26.

Den nuvarande metoden är mest lämplig för enkla redigeringsscheman (figur 3), såsom infogning/raderingar (indels), exon-stora raderingar i storleksordningen 500-2000 bp och leverans av punktmutationer och små infogningar som C- eller N-terminaltaggar (t.ex. FLAG, HA eller V5)9,16,27. Potentialen för komplex genomredigering, som stora infogningar av fluorescerande taggar eller villkorade alleler, är fortfarande osäker och är för närvarande fokus för kommande förbättringar.

Denna metod är lätt att bemästra och kan användas för att snabbt testa sgRNA i odlade musembryon i 1 vecka9 (figur 1). I detta arbete presenteras ett sexstegsprotokoll, som inkluderar 1) sgRNA-design; 2) sgRNA-syntes; 3) superovulation och parning; 4) embryoodling, insamling och bearbetning; 5) RNP-montering och elektroporering; 6) embryoodling och genotypning. Information om alla material som används tillhandahålls (Materialförteckning). Som en positiv kontroll har reagenser för att redigera tyrosinas (Tyr) lokus 9,16 tagits med i tilläggstabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All djurvård och användning i hela detta protokoll följde Animal Welfare Act-policyer, ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals och följde riktlinjer från AVMA för eutanasi och University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) riktlinjer och policyer. Djurvårds- och användningsprotokollet granskades och godkändes av University of Pennsylvania IACUC för detta projekt. Som en fråga om överensstämmelse och försiktighet, vänligen sök efter alla nödvändiga tillstånd innan du försöker detta protokoll.

1. sgRNA och valfri donatoroligodesign

  1. sgRNA-design
    1. Välj kandidat-sgRNA från alla allmänt använda onlinealgoritmer, såsom Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 eller CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Eftersom varje plattform är unik, läs noggrant användarinstruktionerna för att designa ideala sgRNA. För in/del-experiment, välj två till tre sgRNA att testa. För deletioner föreslås sgRNA som flankerar målregionen, till exempel två sgRNA uppströms målet och två sgRNA nedströms målet.
      OBS: Medan olika online sgRNA-algoritmer faktor i off-targets för att undvika felaktiga sgRNA-mönster, är NCBI: s BLAST-verktyg till hjälp för att bekräfta kvaliteten på de valda sgRNA-sekvenserna.
    2. För in 19-20 nukleotider (nt) bestämda från föregående steg (1.1.1) i det variabla området av sgRNA-oligo (kompletterande tabell 1) och köp syntetiserat sgRNA som anpassade DNA-oligos.
      OBS: PAGE-rening krävs inte.
  2. (Valfritt) Donor oligo design för homologi riktad reparation (HDR)-medierad knock-in.
    1. Utforma lämplig enkelsträngad oligodeoxinukleotid (ssODN) baserat på önskat experimentellt resultat (exakt punktmutation, loxP-insättning, insättning av små taggar etc.), vilket håller den totala längden till 100-200 nt med homologiarmar på 50 nt eller mer som flankerar den centrala regionen.
    2. För att säkerställa högre knock-in-effektivitet, designa sgRNA så att det kompletterar ssODN30 och ersätt protospacer intilliggande motiv (PAM) -sekvensen med en tyst mutation för att förhindra återkommande skärning av Cas9-enzymet.
    3. Beställ ssODN med alternativet anpassad oligo.

2. sgRNA-syntes

  1. Mallgenerering för in vitro-transkription (IVT)
    1. För att generera DNA-mallen för sgRNA IVT genom PCR, förbered en IVT-reaktion i ett PCR-remsrör som är RNAse-fritt. (se kompletterande tabell 2).
    2. Använd följande termiska cykler:
      95 °C i 2 minuter; 30 cykler vid 95 °C i 2 minuter, 57 °C i 10 sekunder och 72 °C i 10 sekunder. därefter 72 °C i 2 min
    3. För att verifiera framgången med sgRNA DNA-mallen PCR-reaktion, elektrofores 5 μL av produkten kombinerat med 1 μL 6x laddningsfärg på en 2% (wt / vol) agarosgel.
      OBS: Den förväntade produktstorleken är 127 bp. Eventuella återstående PCR-reaktioner kan förvaras vid −20 °C i upp till 5 månader.
  2. In vitro-transkription (IVT) av sgRNA
    1. För att generera sgRNA, förbered reaktionsblandningen (T7 IVT enligt tillverkarens instruktioner) i ett PCR-rör och snärta för att blanda reagenserna.
      Se kompletterande tabell 3 för exemplet på reaktionsinställningar. IVT-reaktionen är känslig för RNas-kontaminering; gör därför allt för att tillhandahålla en RNase-fri miljö.
    2. För att reaktionen ska kunna initieras och fortsätta, inkubera IVT-reaktionsblandningen i >18 timmar vid 37 °C i antingen en termisk cykler eller ett värmeblock.
    3. För att bryta ned den ursprungliga DNA-mallen (steg 2.1.3), inför 1 μl DNas I (2 enheter per reaktion) och inkubera reaktionen i 20 minuter vid rumstemperatur (RT).
    4. För att främja RNA-bindning till magnetiska reningspärlor, kombinera 129 μL 100% etanol i reaktionen, som nu blir 150 μL.
    5. För att återsuspendera reningspärlorna, som tenderar att sätta sig under lagring, virvla alikvoten i minst 10 sekunder.
    6. För att rena sgRNA, tillsätt 100 μL av de återsuspenderade pärlorna (steg 2.2.5) till IVT-reaktionen (steg 2.2.4) och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner 10x.
    7. För att möjliggöra bindning, låt blandningen vila vid rumstemperatur i 5 minuter.
    8. För att isolera sgRNA från de icke-inkorporerade reaktionsprodukterna, placera reaktionen på magnetstativen i 5 minuter vid RT och vänta tills en liten pellets bildas.
    9. För att tvätta sgRNA, kassera först försiktigt supernatanten och tillsätt sedan 200 μL 80% etanol bort från pelleten.
      OBS: Under 80% (vol / vol) etanoltvättsteget är det viktigt att undvika att störa pelleten genom pipettering, eftersom detta kommer att minska sgRNA-koncentrationerna avsevärt. Pipettera istället försiktigt 80% etanol så att pelleten är nedsänkt och ta försiktigt bort volymen med en pipett.
    10. Upprepa föregående steg (steg 2.2.9) och lufttorka pelleten i högst 5-6 minuter, annars kommer sgRNA att vara permanent associerat med pärlorna.
    11. Eluera sgRNA med 20μL nukleasfritt vatten genom att pipettera pelleten 10x, inkubera i 2 minuter vid (RT) och sedan placera den tillbaka på magnetstativet för att separera pärlorna från det nu renade sgRNA.
    12. För att utvärdera kvaliteten och kvantiteten av sgRNA, använd ett instrument som en spektrofotometer eller bioanalysator. Alternativt, på en 2% agarosgel, kör 2 μL sgRNA, liknande steg 2.1.3.
      OBS: Kvaliteten bekräftas av ett enda klart band. Resten av sgRNA kan antingen användas omedelbart eller lagras under −80 °C-förhållanden.

3. Superovulation

  1. För att ge tillräckligt med embryon för att testa varje sgRNA-design, superägglossa två till tre C57BL / 6J-honor som är mellan 3-5 veckor gamla, som tidigare beskrivits9. Elektroporering av 20-30 embryon per sgRNA rekommenderas för att generera tillräckligt med resultat för att bekräfta effektiviteten.
    OBS: Om befruktningen lyckas, förvänta dig 10-20 embryon per parning.
  2. För att inducera ägglossning, följ detta hormoninjektionsschema:
    1. Dag 1: Administrera 5 IE serumgonadotropin (PMSG) (100 μl) genom en intraperitoneal (IP) injektion med en 26 G spruta i 3-5 veckor gamla honmöss.
    2. Dag 3: Efter 46-48 timmars PMSG-injektion, injicera 5 IE humant koriongonadotropin (hCG) (100 μL) genom en IP-injektion för att inducera ägglossning.
    3. För att ställa in avel, para ihop honor 1: 1 med en hane med pålitlig avel direkt efter hCG-injektion.
      OBS: För att förhindra hormoner från att försämras och förlora aktivitet, utför injektioner under 30 min upptining.

4. Insamling och bearbetning av embryon

  1. Embryo insamling
    1. För att avliva kvinnor och hämta det nödvändiga materialet, som tidigare beskrivits31, var noga med att först bekräfta lämplig metod i enlighet med institutionell politik. Använd till exempel CO 2-kvävning, cervikal dislokation och / eller andra godkända metoder.
      OBS: Normalt uppvisar >75% av hormonstimulerade honor copulatoriska pluggar, vilket indikerar framgångsrik parning.
    2. För att förhindra att hårstrån gör vävnadsinsamling svår, placera de avlivade honorna på ryggen och spraya 70% (vol / vol) etanol på bukregionen som ska öppnas kirurgiskt.
      OBS: Från och med nu rekommenderas det att utföra de kirurgiska stegen i en ventilerad huva för att upprätthålla en aseptisk miljö och minska risken för kontaminering.
    3. För att öppna bukhålan och ta bort äggledarna, klipp av huden / håret (subkutant) lager med kirurgisk sax och lokalisera äggstockarna (figur 4), som finns nära njurarna och delar en del av en fettkudde. Ovidukterna ligger proximala mot äggstockarna (Figur 4). Avlägsna båda äggledarna kirurgiskt från honan och placera dem i individuella 50 μL droppar M2 + BSA (4 mg / ml BSA) medium (figur 5A).
      OBS: Detaljerade instruktioner för detta avsnitt av proceduren kan ses visuellt31 eller följas stegvis9 med tidigare publicerade protokoll.
    4. För att frigöra cumulus-oocytkomplexen (CoC) innehållande oocyter (figur 4), använd dissektionspincett för att nicka oviduktens ampulla medan du tittar genom ett stereomikroskop.
    5. För att minska mängden skräp (blod, fett, vävnad), överför och kombinera varje CoC till en enda 50 μL droppe M2 + BSA-media med en handhållen pipett inställd på 20-30 μL för att undvika överföring av skräp.
  2. Avlägsnande av cumulusceller
    1. För att börja avlägsna cumulusceller från zygoterna (figur 4), överför CoCs med så lite extra media som möjligt till en droppe på 100 μL M2 + hyaluronidas (figur 5B) och blanda försiktigt genom pipettering av CoC tills embryona är synligt separerade från de mycket mindre cumuluscellerna. Var noga med att hålla exponeringen av M2 + hyaluronidas för embryon till ett minimum, eftersom det kan påverka livskraften.
      OBS: Man kan antingen förvärma (37 °C) eller tillsätta ytterligare 50 μL M2+hyaluronidas om embryona inte separeras från cumuluscellerna inom 2 minuter.
    2. För att späda hyaluronidas och rensa bort lösa cumulusceller från zygoterna, använd en mundriven pipett för att flytta zygoterna till en ny 50 μL M2 + BSA-droppe.
      OBS: De flesta steg utöver denna punkt kräver användning av en mundriven pipett om inte annat anges. Även om risken för kontaminering från användaren är låg rekommenderas användning av ett inline-luftfilter för att upprätthålla en aseptisk miljö. Se tidigare beskrivna metoder för att förbereda och använda detta instrument 9,31.
    3. Använd en munpipett och passera embryona genom minst fyra till fem ytterligare 50 μL M2 + BSA-droppar för att minska antalet cumulusceller.
  3. (VALFRITT) Förtunning av zona pellucida med sur tyrodlösning (AT).
    1. För att urholka embryots zona pellucida och minska ytterligare fysiska hinder för reagenstillförsel, överför embryona till en förvärmd (37 °C) 100 μL droppe AT-lösning på en 60 mm platta (figur 5C). Observera kontinuerligt zygoterna med hjälp av ett stereomikroskop tills cirka 30% av zona pellucida är eroderad9. Den totala AT-exponeringen måste vara 60-90 s. Långvarig exponering för AT kan helt lösa upp zona pellucida och äventyra embryots livskraft.
      OBS: För detaljerade instruktioner och bilder av detta avsnitt av proceduren, se tidigare publicerade metoder 9,16.
    2. För att späda ut AT, använd en munpipett för att leda embryon genom minst fyra 50 μL droppar M2 + BSA.
    3. För att avgöra om ett lämpligt antal embryon har bearbetats, använd ett stereomikroskop för att räkna embryon. Beroende på antalet kvinnliga möss som används kan man förvänta sig cirka 10-20 livskraftiga zygoter per kvinna.
      OBS: I detta skede bör embryon vara relativt fria från skräp som skulle förhindra utvärdering av kvantitet och kvalitet. Till exempel, om man använder fem honor, skulle det förväntade zygotantalet sannolikt vara mellan 50-100, och en mekanisk cellräknare skulle vara lämplig för att hålla reda på embryon. Det är vanligt att förlora cirka 10% -20% av embryon på grund av misslyckande med befruktning eller ägglossning av låg kvalitet. Under nästa steg, förvara embryona kort i 50 μL M2 + BSA i högst 30 minuter i en inkubator.

5. RNP-montering och elektroporering

  1. RNP-montering
    1. För att montera RNP-komplexet, använd de bifogade exempeltabellerna för att kombinera lämpliga reaktionsblandningar baserat på önskad redigeringsstrategi i RNP-buffert (100 mM HEPES pH 7,5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% glycerol och 100 mM Tris (2-karboxietyl) fosfinhydroklorid [TCEP] i nukleasfritt vatten)
      TCEP är ett praktiskt reduktionsmedel men har en kort halveringstid i vattenlösningar. Lägg därför till TCEP precis före RNP-komplex montering.
      1. För icke-homologa ändfogningsmedierade indeler (NHEJ), se kompletterande tabell 4.
      2. För redigering med HDR-medierad (homologiriktad reparation), se kompletterande tabell 5.
      3. För tekniska deletioner med parade sgRNA, se kompletterande tabell 6.
        1. Oavsett strategi, kombinera de önskade reagenserna vid RT i ett PCR-rör.
        2. För att möjliggöra RNP-komplexbildning, inkubera blandningen i 10 minuter vid 37 °C.
          OBS: RNP-komplexet kan lagras vid RT i upp till 1 h.
  2. Elektroporering
    1. För att späda BSA före elektroporering, passera embryon genom minst två droppar med 50 μL reducerat serummedium.
      OBS: BSA ökar motståndet under elektroporering och kan skada zygoterna.
    2. För att bereda och blanda zygoterna (steg 4.3.2) med RNP-komplexet (steg 5.1.1.2) för elektroporering, pipettera 25-30 embryon i munnen till en 10 μL droppe reducerat serummedium och använd sedan en handhållen pipett för att tillsätta 10 μL av RNP-komplexet (steg 5.1.1.2).
    3. För att späda den viskösa glycerolen från RNP-komplexet och homogenisera provet, blanda genom pipettering 10x eller tills blandningen inte längre visar tecken på viskositet (virvelmönster) med hjälp av ett stereomikroskop.
    4. Förbered provet för införande i elektroporatorn, pipettera denna 20 μL embryo + RNP-blandning till en 0,1 cm elektroporeringskyvett samtidigt som bubblor undviks.
    5. För att leverera redigeringsreagenserna i zygoten, elektroporera embryon med hjälp av ett fyrkantvågsprotokoll med dessa förhållanden: 30 V, 4-6 pulser, 3 ms pulslängd och 100 pulsintervall.
    6. För att hämta zygoter från kyvetten, använd en handpipett för att leverera 50 μL KSOM + BSA (1 mg / ml BSA) i toppen av kyvetten för att spola embryon som kan ha satt sig till botten. Pipettera försiktigt ut blandningen och på en 60 mm platta.
    7. Upprepa steg 5.2.6 minst 2x-3x och kombinera varje spolning på en 60 mm platta tills de flesta embryon har återvunnits.
      OBS: En typisk återhämtning är >90% av de ursprungligen laddade embryona. För att säkerställa embryoöverlevnad, testa inkubatorn och kontrollera utgångsdatum för alla reagens. Embryon är mottagliga för icke-idealiska odlingsförhållanden såsom temperatur, CO2-nivå , fuktighet och pH.

6. Embryoodling och genotypning

  1. Embryoodling
    1. För att odla zygoter till ett önskat stadium, använd en munpipett för att överföra 20-30 zygoter till en droppe KSOM + BSA i en förbalanserad odlingsplatta och flytta embryon till droppen (figur 5D). Inkubera plattan över natten i 5%CO2, vid 37 °C, med 95% luftfuktighet.
      Anmärkning: Förjämvikt genom att placera en beredd 35 mm odlingsplatta i en inkubator antingen dagen före eller minst 4 timmar före inkubationen (figur 5D).
    2. För att främja ideala tillväxtförhållanden, överför endast tvåcelliga embryon följande dag till en ny droppe KSOM + BSA-blandning med hjälp av ett stereomikroskop och återgå till inkubatorn. Var noga med att lämna eller kassera de döda eller obefruktade embryon.
      OBS: Pronukleära embryon växer vanligtvis till moruler efter 72 timmars odling och blastocyster efter 84 timmar.
  2. Genotypning
    1. För att späda ut de komponenter i mediet som kan störa en PCR-reaktion, tvätta morula/blastocystembryon med en munpipett genom att passera genom två droppar DPBS.
    2. För att ladda enskilda embryon för lys, överför enskilda embryon till en brunn av en 8-brunns PCR-remsa genom att ställa in en pipett på 1 μL och tillsätt sedan 10 μL lysbuffert (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8,5, 2,5 mM MgCl 2, 0,1 mg / ml gelatin, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20, 0,2 mg / ml proteinas K i nukleasfritt H2O).
      OBS: Tillsätt proteinas K precis innan lysbufferten förbereds.
    3. För att lysera embryona, programmera en termisk cykler till 55 °C i 4 timmar och inaktivera sedan proteinas K med en 10 minuters inkubation vid 95 °C.
      OBS: Särskilt för förstagångsanvändare, försök ett redigeringsexperiment på Tyr loci. Det här arbetsflödet har optimerats och kan fungera som en positiv kontroll. Förvara vid behov embryolysaten vid 4 °C i 2–3 dagar eller i frysen i upp till 2 veckor före PCR-analysen. Förhindra upprepade frys-tina cykler.
    4. För att öka chanserna för framgångsrik genotypanalys, utför en kapslad PCR-strategi genom att förstärka något längre DNA-fragment som flankerar den riktade platsen samt regioner som kommer att användas för att förstärka ett mer exakt DNA-fragment. Följ villkoren i kompletterande tabell 7.
    5. Följ nedanstående termiska cykler:
      95 °C i 2 min
      30+ cykler: 95 °C i 2 minuter, 60 °C i 10 sekunder och 72 °C i 10 s
      72 °C i 2 min
    6. För att förbereda det andra steget i en kapslad PCR-strategi, gör en 1:10 utspädning av den första PCR-produkten (steg 6.2.5) och ladda 2 μL av detta i nästa PCR-reaktion (med primers utformade för att vara inuti föregående amplikon).
      OBS: Den första PCR-reaktionen måste spädas för att minska överföringen av flankerande primrar i den andra PCR-reaktionen. Förbered den kapslade PCR genom att följa stegen i kompletterande tabell 8.
    7. Placera PCR-reaktionen i en termisk cykler med följande cykelförhållanden:
      95 °C i 2 min
      30 cykler: 95 °C i 2 minuter, 60 °C i 10 sekunder och 72 °C i 10 s
      72 °C i 2 min
      OBS: Normalt är >90% av PCR-reaktionerna framgångsrika när ampliconstorleken är 500 bp eller mindre.
    8. (Valfri kontroll) För NHEJ-medierade in/del-mutationer med Tyr som positiv kontroll, smält 10 μL av de kapslade PCR-produkterna från steg 6.2.7 genom inkubering vid 37 °C i 4 timmar med 10 U HinfI i en 20 μL-reaktion (se kompletterande tabell 9). På en 2% agarosgel, kör den smälta produkten för att utvärdera redigering och använd en icke-smält PCR-produkt som laddningskontroll. Kör gelen på 135 V i 30 min.
      OBS: Användningen av HinfI som ett lämpligt restriktionsenzym valdes på grund av en bekvämt belägen HinfI-plats som finns inom sgRNA-målregionen som förutspås ableras vid en framgångsrik NHEJ-redigering. En detaljerad metod och resultat har tidigare beskrivits 9,16.
    9. (Valfri kontroll) För HDR-medierade mutationer med Tyr som positiv kontroll, smält 10 μl av de kapslade PCR-produkterna från steg 6.2.7 genom inkubering vid 37 °C i 4 timmar med 10 U EcoRI i en 20 μL-reaktion (se kompletterande tabell 10). På en 2% agarosgel, kör den smälta produkten för att utvärdera redigering och använd en icke-smält PCR-produkt som laddningskontroll. Kör gelen på 135 V i 30 min.
      OBS: Valet av EcoRI som ett diagnostiskt restriktionsenzym utnyttjar den ursprungliga sekvensen som hittades i sgRNA-målregionen, där, vid framgångsrik HDR, den naturligt förekommande HinfI-platsen ersätts med en EcoRI-plats och en frameshift-mutation tvingas som stör Tyr-genen. För HDR-analys, utför både NHEJ (steg 6.2.8) och HDR (steg 6.2.9) analyser på varje prov eftersom båda resultaten kan inträffa och kan hjälpa till att bestämma mosaicism. En detaljerad metod och resultat har tidigare beskrivits 9,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna metod genererar mer än 100 μg sgRNA (20 μL vid >6,000 ng / L koncentration) för effektiv Cas9 / sgRNA RNP-montering. Den rutinmässiga superovulationsmetoden som beskrivs här producerar vanligtvis 10-20 livskraftiga embryon per pluggad hona. På grund av hanteringsfel och typiska förluster i samband med embryomanipulation är en förväntad 80% av embryon befruktade, livskraftiga och i utmärkt skick efter elektroporering. För att hjälpa forskare att genomföra ett framgångsrikt experiment har vi tillhandahållit en exempelstrategi för att rikta musens Tyr-lokus som en positiv kontroll (figur 6), inklusive oligodesign (figur 6A, kompletterande tabell 1) och genotypstrategier för både NHEJ- och HDR-händelser (figur 6B) (steg 6.2). Detaljerade exempel på experimentell framgång och resultat finns tillgängliga 9,16.

I ett tidigare försök att jämföra detta protokoll med mikroinjektion lyckades tillsammans över 30 distinkta redigeringsförsök med sju distinkta laboratorier för att generera musmodeller 9,16. Dessutom användes denna metod för att undersöka och rapportera om den första väsentliga retrotransposonen i däggdjursutveckling27. När man använde en enkel strategi som att leverera ett enda sgRNA var leveransen av RNP upp till och med 100% i musstammarna C57BL / 6J och C57BL / 6N, med in/del-bildning vid 50-100% och små oligobaserade ersättningar från 14%-63%9,16 (tabell 1). Vid konstruktion av genomiska deletioner kan redigeringseffektiviteten variera från 3% till 100%, där bidragande faktorer inkluderar genomisk plats, sgRNA-design och storleken på raderingen (tabell 2). Borttagningar som är mindre än 1 000 bp lyckas till exempel mer än de som är större än 1 000 bp 9,16.

Vid användning av 60 embryon för elektroporering överträffar detta protokoll mikroinjektion när det gäller redigeringseffektivitet, vilket resulterar i 3-4 grunddjur jämfört med en grundare från mikroinjektion9. För genknockoutexperiment i C57BL / 6N-mössstammen med identiskt sgRNA överträffade denna metod mikroinjektion, vilket gav i genomsnitt fyra grunddjur9 (tabell 2). För små insättningar, till exempel V5- eller HA-taggning, har ssODN upp till 162 nt testats framgångsrikt, och ansträngningar syftar för närvarande till att skala upp till 1000-2000 nt. Framgången för dessa experiment beror till stor del på effektiviteten hos sgRNA som används för att HDR-resultat ska vara robusta. Nästan alla HDR-resultat är mosaik, men mellan 31% -64% av embryon visar några bevis på infogningar 9,16.

Figure 1
Figur 1: Översikt över CRISPR-EZ. En grafisk översikt över arbetsflödet. När en strategi och design har gjorts kan redigerade embryon genereras och testas på cirka 1 vecka. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Modzelewski et al.9. och Chen et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Perfekt timing för att utföra proceduren. Diagrammet visar relevanta funktioner och tidpunkter under den första celldelningen efter befruktning. För att genomföra detta tillvägagångssätt får forskare några synliga ledtrådar, såsom morfologiska förändringar, uppskattningar av cellcykeltid och kemiska markörer som ofta observeras före den första klyvningen. Eftersom den exakta tidpunkten för insemination och befruktning är okänd, skulle en förnuftig rekommendation vara att betrakta timme 0 som midnatt. Innan zygoten går in i S-fas är det perfekta ögonblicket att leverera redigeringsmaskiner för antingen NHEJ eller HDR, vilket innebär att detta protokoll körs mellan klockan 7 och 11 på morgonen. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Redigeringsstrategiernas framgång. Enkla strategier som ett enda sgRNA resulterar i en in/del via NHEJ-reparation eller en precisionsmutation i kombination med en ssODN-mall via HDR. NHEJ-reparation kan också användas för deletioner med flera sgRNA. I allmänhet, ju enklare strategin är, desto effektivare är CRISPR-EZ utan ytterligare optimering. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Lokalisering av ovidukten och ampullen. Efter kirurgisk isolering av reproduktionsvävnaderna bör man säkra regionen genom att applicera försiktigt tryck på fettkudden med pincett. Fettkudden är en relativt säker region att manipulera för att inte skada äggstockarna / äggledaren. Området i den streckade fyrkanten ska avlägsnas och placeras i en droppe M2 för ytterligare dissektion. Ett tecknat diagram visar intresseområdet med relevanta anatomiska strukturer märkta. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Föreslagen bearbetning och inställning av kulturskyltar. Scheman som visar olika plattuppsättningar för att hjälpa forskare att genomföra både embryobearbetning och odling. (A) Typisk M2 + BSA tvättplatta. (B) M2 + hyaluronidasplatta för borttagning av cumulusceller. (C) Valfri AT-lösningsplatta för zonförtunning. (D) KSOM + BSA-platta för embryoodling, med mineraloljeöverlagring nödvändig för att bibehålla pH, fuktighet och temperatur. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Genotypexempel för NHEJ- och HDR-resultat . (A) Ett tecknat diagram över regionen kring Tyr-genen i musgenomet. Nedan finns detaljer om den oredigerade (WT) sekvensen där ett naturligt förekommande HinfI-restriktionsställe finns, vilket ligger inom måligenkänningsstället för sgRNA (röd text). Nedan är ett av många möjliga utfall efter framgångsrik CRISPR/Cas9-inriktning där en "in/del" bildas. Den exakta karaktären av denna redigering är svår att förutsäga men kommer nästan säkert att störa HinfI-webbplatsen. Längre ner är donatoroligosekvensen som ändrar två baspar för att förvandla HinfI-platsen till en EcoRI-igenkänningsplats. (B) Resultat av representativ restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP) efter redigering. Exempel på redigering av NHEJ (överst) och HDR (nederst) visas. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Fenotyp och livskraft hos Tyr-redigerade zygoter och möss. Denna tabell har anpassats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Resultat av CRISPR-EZ och mikroinjektionsdeletionsexperiment. Denna tabell har anpassats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell 1: Förteckning över oligos och donator-ssODN. Denna tabell har anpassats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 2: DNA-mall för sgRNA-reaktionsinställningen. Denna tabell har anpassats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 3: Uppställning av transkription in vitro. Denna tabell har ändrats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 4: RNP-komplex inställning för NHEJ-bildning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 5: RNP-komplex inställning för HDR-bildning. Denna tabell har anpassats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 6: RNP komplex inställning för borttagning. Denna tabell har ändrats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 7: Genotypning av PCR-inställning. Denna tabell har ändrats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 8: Kapslad PCR-inställning för genotypning. Denna tabell har ändrats med tillstånd från Modzelewski et al.9. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 9: Inställningar för sammanfattning av HinfI-restriktion. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 10: EcoRi-restriktionssammanfattning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenteras en enkel och mycket effektiv redigeringsteknik för musgenom. Elektroporering kan användas för att generera modifierade embryon på 1-2 veckor (figur 1) och kan producera redigerade möss inom 6 veckor9. Jämfört med samtidigt utvecklade elektroporeringsbaserade protokoll som levererar RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, är metoden som beskrivs här konceptuellt likartad och erbjuder effektivitet i samma intervall, med endast mindre skillnader i reagensutveckling och parametrar. Därför föreslår vi att läsarna jämför och kontrasterar utifrån behov och tillgång till utrustning. Som namnet antyder utvecklades detta protokoll med "det genomsnittliga muslaboratoriet" i åtanke, med endast vanliga metoder (IVT, PCR, gelelektrofores), reagens (standardembryo och vävnadsodlingsförbrukningsvaror) eller utrustning (elektroporator och kyvetter som vanligtvis används för bakteriell transfektion), som sannolikt är tillgängliga för de flesta laboratorier som är intresserade och kan samla embryon (eller genom att vänligen fråga angränsande laboratorier). Forskare på doktorandnivå med grundläggande embryohanteringsförmåga kan testa sgRNA för effektivitet eller genomföra dataproducerande experiment flera gånger inom tidsramen för preimplantatorisk utveckling utan att behöva schemalägga med en kärnanläggning. Men om det önskade målet är att generera djurmodeller utan behov av vare sig mikroinjektion eller embryomanipulation, finns mindre påträngande metoder tillgängliga10,32.

Många faktorer som påverkar Cas9-effektiviteten undersöks aktivt, såsom specificiteten hos ett genomiskt mål, sgRNA-sekvensparametrar, genomtillgänglighet och topologi, och särskilt celltyp. Därför är design och testning av sgRNA avgörande för framgång. Detta protokoll och andra oberoende utvecklade elektroporeringsmetoder har optimerats för att leverera Cas9-protein / sgRNA RNP snabbt och övergående till embryon i zygotstadiet, vilket förbättrar effektiviteten samtidigt som mosaicism minimeras på grund av leverans i ett tidigt utvecklingsstadium och den korta halveringstiden för RNP 7,9,10,11,12,13,14,15, 16,33,34.

För de vanligaste genomredigeringsstrategierna och olika stammar av möss kan denna metod överträffa mikroinjektioner när det gäller kostnad, effektivitet, små insättningar, in / del-mutationer, exon-deletioner, infogningar och punktmutationer9. Med det nuvarande protokollet är denna metod idealisk för att skapa in/del-mutationer och deletioner upp till 2,6 kb, vilket är mycket längre än den typiska längden på en proteinkodande exon på 170 bp35. Långa raderingar är mindre effektiva; Denna begränsning är dock inte unik för detta protokoll. Därför, eftersom Cas9-medierad redigering förbättras och nya Cas-proteinvarianter utvecklas, möjliggör den modulära karaktären hos denna metod dessa förbättringar för att direkt öka kapaciteten i vårt protokoll.

Även om denna metod kan utföra en mängd enkla redigeringar, testas dess potential för större och mer komplexa strategier, såsom att infoga villkorliga alleler eller fluorescerande taggar, för närvarande i vårt labb. Längre ssODN kan ge ett livskraftigt tillvägagångssätt för komplicerad genomredigering och har visat framgång i mikroinjektionsbaserad embryoredigering36; Längre ssODN är dock dyra att syntetisera och har ännu inte testats i stor utsträckning med elektroporering37. Användningen av adenoassocierade virus (AAV) för att introducera upp till 3,3 kb donatorsekvenser har också visat framgång men kanske inte är tillgänglig för de flesta laboratorier25. För närvarande rekommenderar vi standardredigering och mikroinjektion av embryonala stamcellsgenomer för komplex musgenomteknik.

Oro för Cas9 off-target effekter förblir 8,38,39. Konstruerade Cas9-variationer kan öka målspecificiteten, även om detta inte har undersökts fullständigt i RNP-embryoelektroporeringsstudier. CRISPR-EZ kan vara en användbar metod för att skapa sammansatta mutationsmodeller för att utforska komplex genetik. Medan mikroinjektioner har gjort samtidig redigering av flera loci möjlig40, gör elektroporeringsmetoder som den som beskrivs här detta mer bekvämt och effektivt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det finns inga relevanta ekonomiska deklarationer från författarna.

Acknowledgments

A.J.M. skapade det ursprungliga konceptet som ledde till utvecklingen av CRISPR-EZ och producerade figurerna. C.K.D. sammanställde och anpassade de interna och publicerade protokollen för detta aktuella manuskript. A.J.M. stöds av NIH (R00HD096108).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 190
Effektiv genomredigering av möss genom CRISPR-elektroporering av zygoter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J.… More

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J. Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes. J. Vis. Exp. (190), e64302, doi:10.3791/64302 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter