Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv genomredigering av mus ved CRISPR-elektroporering av zygoter

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

Her beskriver vi en enkel teknikk beregnet på effektiv generering av genmodifiserte mus kalt CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Denne metoden leverer redigeringsreagenser ved elektroporering til embryoer med en effektivitet som nærmer seg 100%. Denne protokollen er effektiv for punktmutasjoner, små genomiske innsettinger og delesjoner i pattedyrembryoer.

Abstract

Med eksepsjonell effektivitet, nøyaktighet og letthet har CRISPR / Cas9-systemet betydelig forbedret genomredigering i cellekultur og laboratorieforsøk. Ved generering av dyremodeller gir elektroporering av zygoter høyere effektivitet, enkelhet, kostnad og gjennomstrømning som et alternativ til gullstandardmetoden for mikroinjeksjon. Elektroporering er også mildere, med høyere levedyktighet, og leverer pålitelig Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteiner (RNP) inn i zygotene til vanlige laboratoriemusestammer (f.eks. C57BL / 6J og C57BL / 6N) som nærmer seg 100% leveringseffektivitet. Denne teknikken muliggjør innsetting / sletting (indels) mutasjoner, punktmutasjoner, sletting av hele gener eller eksoner, og små innsettinger i området 100-200 bp for å sette inn LoxP eller korte koder som FLAG, HA eller V5. Mens vi stadig forbedres, presenterer vi her den nåværende tilstanden til CRISPR-EZ i en protokoll som inkluderer sgRNA-produksjon gjennom in vitro-transkripsjon, embryobehandling, RNP-montering, elektroporering og genotyping av preimplantasjonsembryoer. En forsker på høyere nivå med minimal erfaring med å manipulere embryoer kan få genetisk redigerte embryoer på mindre enn 1 uke ved hjelp av denne protokollen. Her tilbyr vi en enkel, billig, effektiv, høykapasitetsmetode som kan brukes med museembryoer.

Introduction

Genomredigering i levende mus har blitt betydelig forenklet og har blitt tilgjengelig og rimeligere siden fremveksten av CRISPR-redigering 1,2,3. Innledende dyreredigeringsforsøk brukte mikroinjeksjon for å levere CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA til embryoer i pronukleære stadier 4,5,6. Mens mikroinjeksjon er ganske effektiv, kan mengden praksis som kreves for å mestre det, ikke være hensiktsmessig for praktikanter og studenter, og krever også dyrt utstyr som et beskjedent finansiert laboratorium ikke har råd til. Mikroinjeksjon utføres normalt av ekspertteknikere ved transgene anlegg med tidsplaner og servicepriser som er hastighetsbegrensende for mange forskere. En mer tilgjengelig tilnærming er elektroporering, som har vist seg å være ganske effektiv for levering av CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA til pronukleære embryoer7. Ytterligere forbedringer i CRISPR-genomredigerings- og leveringsstrategier antydet at forhåndsmonterte RNP-er som allerede er engasjert med sgRNA, kan være et effektivt middel for å redusere mosaikk8.

Begrunnelsen for utviklingen og bruken av denne protokollen var å omgå mange av begrensningene og hindringene forbundet med mikroinjeksjon. Som navnet antyder, vil en enkel, intern og kostnadseffektiv metode som raskt kan avgjøre om uprøvde sgRNA-design vil være verdt å bruke under et mikroinjeksjonseksperiment, være et veldig praktisk kvalitetskontrolltrinn i første pass (figur 1). Selv om denne metoden ikke kan erstatte mikroinjeksjon for mer komplekse strategier, som å introdusere lange donor-DNA-sekvenser for rekombinasjonsbaserte resultater, er den ideell for mindre komplekse strategier som små delesjoner eller innsettinger og merking av gener. Denne metoden er egnet for forskere med grunnleggende embryomanipulasjonsferdigheter som har enkle redigeringsbehov, ønsker å teste hypotesen sin innen tidsrammen for preimplantasjonsutvikling, eller foretrekker å teste sgRNA i embryoer før de planlegger en avtale med en mikroinjeksjonsspesialist. Her blir redigeringsreagenser forbigående levert inn i embryoer i pronukleære stadier som Cas9 / sgRNA RNP via elektroporering (en serie elektriske pulser) for å maksimere effektiviteten samtidig som mosaikken reduseres8. Ved hjelp av en embryogenotypingsmetode er redigeringsresultater tilgjengelige etter ca. 1 uke9, og reduserer dermed behovet for ulike mikroinjeksjonsapplikasjoner til en betydelig redusert kostnad.

Denne metodens effektivitet topper seg på det pronukleære embryostadiet, når embryoet ennå ikke har smeltet sammen mors og fars pronuclei eller gått inn i S-fase (figur 2). Superovulasjon brukes til å maksimere antall zygoter, men produserer både pronukleære zygoter og ubefruktede egg. Sunn zygoter kan også forhåndsvelges før elektroporering for å øke den totale effektiviteten. Siden andre elektroporasjonsprotokoller effektivt har redigert zygoter uten å måtte inkludere et lignende trinn 7,10,11,12,13,14,15, er et valgfritt trinn i denne protokollen den svake erosjonen av zona pellucida (ZP). ZP er et glykoproteinlag som hjelper spermatozoabinding, akrosomrespons og befruktning rundt embryoer i pronukleære stadier. Etter vår erfaring fant vi ut at en mild syrebasert erosjon av ZP gir pålitelig Cas9 RNP-elektroporasjonslevering med bare en marginal innvirkning på levedyktigheten.

Vi har observert RNP-leveringshastigheter på opptil 100% effektivitet via elektroporering i musestammer som ofte brukes i forskning som C57BL / 6J og C57BL / 6N 9,16. Uavhengige grupper har også utviklet elektroporasjonsbaserte prosedyrer med effektivitet større enn eller matchende mikroinjeksjon 11,12,13,14,15,17, med elektroporasjonsprotokoller som fungerer godt hos rotte18,19, gris 20,21,22 og ku 23 , så vi foreslår at leserne sammenligner protokollene for å finne forholdene som best passer deres eksperimentelle og utstyrsbehov. Systemet beskrevet her bruker vanlige materialer og utstyr, og krever bare grunnleggende embryomanipulasjonsferdigheter. Denne teknikken er effektiv for en rekke redigeringsstrategier, noe som gjør denne metoden bredt tilgjengelig for forskersamfunnet.

Å designe ideelle små guide-RNA (sgRNA) er avgjørende for effektiv redigering. Vi anbefaler screening to til tre sgRNA-strategier per målsted direkte i museembryoer, spesielt hvis muselinjegenerering er ønsket. Når de er designet, anbefales kloningsfrie metoder som in vitro-transkripsjon (IVT) for å produsere sgRNA av høy kvalitet3. RNPene og sgRNAene blandes med 30-50 behandlede pronukleære embryoer og utsettes for en serie elektriske pulser for først midlertidig å permeabilisere ZP og cellemembranen, med påfølgende pulser for å holde porene åpne og elektroforese RNPene gjennom zygote24. Etter optimalisering fant vi ut at seks 3 ms pulser ved 30 V for bulkembryoer (~ 50) var optimale for redigeringseffektivitet og levedyktighet, og ga svært effektiv Cas9 / sgRNA RNP-levering 9,16,25. Redigering av hendelser i individuelle musemorula kan bekreftes ved hjelp av en rekke valideringsstrategier som er vanlige for CRISPR-redigering, for eksempel restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP), T7 endonukleasefordøyelse og Sanger-sekvensering av interesseområdet26.

Den nåværende metoden er mest hensiktsmessig for enkle redigeringsskjemaer (figur 3), for eksempel innsetting / slettinger (indels), eksonstore slettinger i størrelsesorden 500-2000 bp, og levering av punktmutasjoner og små innsettinger som C- eller N-terminalkoder (f.eks. FLAG, HA eller V5) 9,16,27. Potensialet for kompleks genomredigering, som store innsettinger av fluorescerende koder eller betingede alleler, er fortsatt usikkert og er det nåværende fokuset for kommende forbedringer.

Denne metoden er lett å mestre og kan brukes til raskt å teste sgRNA i dyrkede museembryoer i 1 uke9 (figur 1). Presentert i dette arbeidet er en seks-trinns protokoll, som inkluderer 1) sgRNA-design; 2) sgRNA-syntese; 3) superovulasjon og parring; 4) embryokultur, innsamling og behandling; 5) RNP-montering og elektroporering; 6) embryokultur og genotyping. Informasjon om alle materialene som brukes er gitt (Materialfortegnelse). Som en positiv kontroll er reagenser for å redigere tyrosinase (Tyr) locus 9,16 inkludert i tilleggstabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All dyrepleie og bruk i hele denne protokollen fulgte retningslinjene for dyrevelferdsloven, ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals og fulgte retningslinjene fra AVMA for eutanasi og University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer og retningslinjer. Dyrepleie- og bruksprotokollen ble gjennomgått og godkjent av University of Pennsylvania IACUC for dette prosjektet. Som et spørsmål om overholdelse og forsiktighet, vennligst søk alle nødvendige autorisasjoner før du prøver denne protokollen.

1. sgRNA og valgfri donor oligo design

  1. sgRNA-design
    1. Velg kandidat-sgRNA fra alle mye brukte nettbaserte algoritmer, for eksempel Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 eller CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Siden hver plattform er unik, må du lese bruksanvisningen nøye for å designe ideelle sgRNAer. For in/del-eksperimenter, velg to til tre sgRNAer for å teste. For slettinger foreslås sgRNAer som flankerer målområdet, for eksempel to sgRNAer oppstrøms for målet og to sgRNA nedstrøms for målet.
      MERK: Mens ulike online sgRNA-algoritmer faktoriserer off-targets for å unngå feilaktige sgRNA-design, er NCBIs BLAST-verktøy nyttig for å bekrefte kvaliteten på de valgte sgRNA-sekvensene.
    2. Sett inn 19-20 nukleotider (nt) bestemt fra forrige trinn (1.1.1) i den variable regionen av sgRNA-oligo (tilleggstabell 1) og kjøp syntetisert sgRNA som tilpassede DNA-oligoer.
      MERK: SIDERENSING er ikke nødvendig.
  2. (Valgfritt) Donor oligo design for homologisk rettet reparasjon (HDR) -mediert innbanking.
    1. Design det passende enkeltstrengede oligodeoksynukleotidet (ssODN) basert på ønsket eksperimentelt resultat (presis punktmutasjon, loxP-innsetting, liten taginnsetting, etc.), og hold den totale lengden til 100-200 nt med homologiske armer på 50 nt eller mer som flankerer den sentrale regionen.
    2. For å sikre høyere innslagseffektivitet, design sgRNA for å være komplementært til ssODN30, og erstatt protospacer tilstøtende motivsekvens (PAM) med en stille mutasjon for å forhindre tilbakevendende kutting av Cas9-enzymet.
    3. Bestill ssODN ved å bruke det tilpassede oligo-alternativet.

2. sgRNA-syntese

  1. Malgenerering for in vitro transkripsjon (IVT)
    1. For å generere DNA-malen for sgRNA IVT gjennom PCR, lag en IVT-reaksjon i et PCR-striperør som er RNAse-fritt. (se tilleggstabell 2).
    2. Bruk følgende forhold for termisk syklist:
      95 °C i 2 minutter; 30 sykluser på 95 °C i 2 minutter, 57 °C i 10 s og 72 °C i 10 s; deretter 72 °C i 2 min
    3. For å verifisere suksessen til sgRNA DNA-mal-PCR-reaksjonen, elektroforese 5 μL av produktet kombinert med 1 μL 6x lastefargestoff på en 2% (wt / vol) agarosegel.
      MERK: Den forventede produktstørrelsen er 127 bp. Enhver gjenværende PCR-reaksjon kan oppbevares ved −20 °C i opptil 5 måneder.
  2. In vitro transkripsjon (IVT) av sgRNA
    1. For å generere sgRNA, klargjør reaksjonsblandingen (T7 IVT i henhold til produsentens instruksjoner) i et PCR-rør og flikk for å blande reagensene.
      MERK: Se tilleggstabell 3 for eksempelet med reaksjonsoppsett. IVT-reaksjonen er RNase-forurensningsfølsom; Gjør derfor vårt ytterste for å gi et RNase-fritt miljø.
    2. For å tillate reaksjonen å initiere og fortsette, inkuber IVT-reaksjonsblandingen i >18 timer ved 37 ° C i enten en termisk syklist eller varmeblokk.
    3. For å nedbryte den opprinnelige DNA-malen (trinn 2.1.3), introduser 1 μL DNase I (2 enheter per reaksjon) og inkuber reaksjonen i 20 minutter ved romtemperatur (RT).
    4. For å fremme RNA-binding til magnetiske renseperler, kombiner 129 μL 100% etanol i reaksjonen, som nå vil være 150 μL.
    5. For å resuspendere renseperlene, som har en tendens til å bosette seg under lagring, virvel alikoten i minst 10 s.
    6. For å rense sgRNAene, tilsett 100 μL av de resuspenderte kulene (trinn 2.2.5) til IVT-reaksjonen (trinn 2.2.4) og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned 10x.
    7. For å tillate binding, la blandingen hvile ved RT i 5 minutter.
    8. For å isolere sgRNA fra de ikke-inkorporerte reaksjonsproduktene, plasser reaksjonen på magnetstativene i 5 minutter ved RT og vent til en liten pellet dannes.
    9. For å vaske sgRNAene, kast først supernatanten forsiktig og tilsett deretter 200 μL 80% etanol bort fra pelleten.
      MERK: Under vasketrinnet på 80% (vol/vol) er det viktig å unngå å forstyrre pelleten ved pipettering, da dette vil redusere sgRNA-konsentrasjonene betraktelig. I stedet pipetterer du forsiktig 80 % etanolen slik at pelleten senkes ned, og fjerner volumet forsiktig med en pipette.
    10. Gjenta forrige trinn (trinn 2.2.9) og lufttørk pelleten i ikke mer enn 5-6 minutter, ellers vil sgRNA være permanent forbundet med perlene.
    11. Elute sgRNA med 20μL nukleasefritt vann ved å pipetere pelleten 10x, inkubere i 2 minutter ved (RT), og deretter plassere den tilbake på magnetstativet for å skille perlene fra det nå rensede sgRNA.
    12. For å evaluere kvaliteten og kvantiteten til sgRNA, bruk et instrument som et spektrofotometer eller bioanalysator. Alternativt, på en 2% agarosegel, kjør 2 μL sgRNA, lik trinn 2.1.3.
      MERK: Kvaliteten bekreftes av et enkelt klart bånd. Resten av sgRNA kan enten brukes umiddelbart eller lagres i -80 ° C forhold.

3. Superovulasjon

  1. For å gi nok embryoer til å teste hver sgRNA-design, superovulere to til tre C57BL/6J-hunner som er mellom 3-5 uker gamle, som tidligere beskrevet9. Elektroporering av 20-30 embryoer per sgRNA anbefales for å generere nok resultater til å bekrefte effektiviteten.
    MERK: Hvis befruktning er vellykket, forvent 10-20 embryoer per parring.
  2. For å indusere eggløsning, følg denne hormoninjeksjonsplanen:
    1. Dag 1: Administrer 5 IE drektig mare serum gonadotropin (PMSG) (100 μL) gjennom en intraperitoneal (IP) injeksjon ved hjelp av en 26 G sprøyte i 3-5 uker gamle hunnmus.
    2. Dag 3: Etter 46-48 timer med PMSG-injeksjon, injiser 5 IE humant choriongonadotropin (hCG) (100 μL) gjennom en IP-injeksjon for å indusere eggløsning.
    3. For å sette opp avl, par hunner 1: 1 med en hann med pålitelig avl rett etter hCG-injeksjon.
      MERK: For å forhindre at hormoner nedbrytes og mister aktivitet, utfør injeksjoner under 30 minutter med tining.

4. Embryoinnsamling og behandling

  1. Embryo samling
    1. For å avlive kvinner og hente det nødvendige materialet, som tidligere beskrevet31, må du først bekrefte riktig metode i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Bruk for eksempel CO2 -kvelning, cervikal dislokasjon og / eller andre godkjente metoder.
      MERK: Normalt viser >75% av hormonstimulerte kvinner kopulerende plugger, noe som indikerer vellykket parring.
    2. For å forhindre at hårene gjør vevsoppsamling vanskelig, legg de avlivede hunnene på ryggen og spray 70% (vol / vol) etanol på mageområdet som skal åpnes kirurgisk.
      MERK: Fra dette tidspunktet anbefales det å utføre de kirurgiske trinnene i en ventilert hette for å opprettholde et aseptisk miljø og redusere risikoen for forurensning.
    3. For å åpne bukhulen og fjerne oviduktene, klipp hud/hår (subkutant) laget med kirurgisk saks, og finn eggstokkene (figur 4), som finnes nær nyrene og deler en del av en fettpute. Oviduktene ligger proksimalt for eggstokkene (figur 4). Fjern kirurgisk begge oviduktene fra hunnen og plasser dem i individuelle 50 μL dråper M2+BSA (4 mg/ml BSA) medium (figur 5A).
      MERK: Detaljerte instruksjoner for denne delen av prosedyren kan vises visuelt31 eller følges trinnvis9 ved hjelp av tidligere publiserte protokoller.
    4. For å frigjøre cumulus-oocyttkompleksene (CoC) som inneholder oocytter (figur 4), bruk disseksjonstangen til å hakke ampulla til ovidukten mens du ser gjennom et stereomikroskop.
    5. For å redusere mengden rusk (blod, fett, vev), overfør og kombiner hver CoC til en enkelt 50 μL dråpe M2+BSA-medier med en håndholdt pipette satt til 20-30 μL for å unngå overføring av rusk.
  2. Fjerning av cumulusceller
    1. For å begynne fjerningen av cumulusceller fra zygotene (figur 4), overfør CoCs med så lite ekstra media som mulig til en dråpe på 100 μL M2 + hyaluronidase (figur 5B), og bland forsiktig ved å pipetere CoCs til embryoene er synlig skilt fra de mye mindre cumuluscellene. Sørg for å holde eksponeringen av M2 + hyaluronidase til embryoene til et minimum, da det kan påvirke levedyktigheten.
      MERK: Man kan enten forvarme (37 °C) eller tilsette ytterligere 50 μL M2+hyaluronidase hvis embryoene ikke skiller seg fra cumuluscellene innen 2 minutter.
    2. For å fortynne hyaluronidase og fjerne løse cumulusceller fra zygotene, bruk en munnoperert pipette for å flytte zygotene til en frisk 50 μL M2 + BSA-dråpe.
      MERK: De fleste trinn utover dette punktet krever bruk av en munnoperert pipette med mindre annet er angitt. Selv om risikoen for kontaminering fra brukeren er lav, anbefales bruk av et inline-luftfilter for å opprettholde et aseptisk miljø. Se tidligere beskrevne metoder for å forberede og bruke dette instrumentet 9,31.
    3. Bruk en munnpipette, pass embryoene gjennom minst fire til fem flere 50 μL M2 + BSA-dråper for å redusere antall cumulusceller.
  3. (VALGFRITT) Tynning av zona pellucida med syretyrode (AT) løsning.
    1. For å erodere zona pellucida av embryoet og redusere ytterligere fysiske hindringer for reagenslevering, overfør embryoene til en forvarmet (37 ° C) 100 μL dråpe AT-oppløsning på en 60 mm plate (figur 5C). Observer zygotene kontinuerlig ved hjelp av et stereomikroskop til ca. 30% av zona pellucida er erodert9. Den totale AT-eksponeringen må være 60-90 s. Langvarig eksponering for AT kan helt oppløse zona pellucida og sette embryoets levedyktighet i fare.
      MERK: For detaljerte instruksjoner og bilder av denne delen av prosedyren, se tidligere publiserte metoder 9,16.
    2. For å fortynne AT, bruk en munnpipette for å passere embryoene gjennom minst fire 50 μL dråper M2 + BSA.
    3. For å avgjøre om et passende antall embryoer har blitt behandlet, bruk et stereomikroskop for å telle embryoene. Avhengig av antall kvinnelige mus som brukes, kan man forvente omtrent 10-20 levedyktige zygoter per kvinne.
      MERK: På dette stadiet bør embryoer være relativt fri for rusk som vil forhindre evaluering av kvantitet og kvalitet. For eksempel, hvis du bruker fem kvinner, vil de forventede zygote-tallene sannsynligvis være mellom 50-100, og en mekanisk celleteller vil være hensiktsmessig for å holde styr på embryoer. Det er vanlig å miste ca 10% -20% av embryoene på grunn av manglende befruktning eller lavkvalitets oocytter som eggløsning. I løpet av neste trinn, lagre embryoene kort i 50 μL M2 + BSA i ikke mer enn 30 minutter i en inkubator.

5. RNP-montering og elektroporering

  1. RNP-montering
    1. For å montere RNP-komplekset, bruk de vedlagte eksempeltabellene for å kombinere passende reaksjonsblandinger basert på ønsket redigeringsstrategi i RNP-buffer (100 mM HEPES pH 7,5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% glyserol og 100 mM Tris (2-karboksyetyl)fosfinhydroklorid [TCEP] i nukleasefritt vann)
      MERK: TCEP er et praktisk reduksjonsmiddel, men har kort halveringstid i vandige løsninger; Legg derfor til TCEP like før RNP-kompleksmontering.
      1. For ikke-homologe endekoblinger (NHEJ)-medierte indels, se tilleggstabell 4.
      2. For homologisk rettet reparasjon (HDR)-mediert redigering, se tilleggstabell 5.
      3. For tekniske slettinger ved bruk av parede sgRNAer, se tilleggstabell 6.
        1. Uansett strategi, kombiner de ønskede reagensene ved RT i et PCR-rør.
        2. For å tillate dannelse av RNP-kompleks, inkuber blandingen i 10 minutter ved 37 °C.
          MERK: RNP-kompleks kan lagres ved RT i opptil 1 time.
  2. Elektroporering
    1. For å fortynne BSA før elektroporering, pass embryoene gjennom minst to dråper på 50 μL redusert serummedium.
      MERK: BSA øker motstanden under elektroporering og kan skade zygotene.
    2. For å forberede og blande zygotene (trinn 4.3.2) med RNP-komplekset (trinn 5.1.1.2) for elektroporering, munnpipett 25-30 embryoer i en 10 μL dråpe redusert serummedium, og bruk deretter en håndholdt pipette for å legge til 10 μL av RNP-komplekset (trinn 5.1.1.2).
    3. For å fortynne den viskøse glyserolen fra RNP-komplekset og homogenisere prøven, bland ved å pipettere 10x eller til blandingen ikke lenger viser tegn på viskositet (virvelmønster) ved å bruke et stereomikroskop.
    4. For å klargjøre prøven for innsetting i elektroporatoren, pipetter du denne 20 μL embryo + RNP-blandingen i en 0,1 cm elektroporeringskyvette mens du unngår bobler.
    5. For å levere redigeringsreagensene inn i zygoten, elektroporer embryoene ved hjelp av en firkantbølgeprotokoll med disse forholdene: 30 V, 4-6 pulser, 3 ms pulslengde og 100 pulsintervaller.
    6. For å hente zygoter fra kyvetten, bruk en håndpipette for å levere 50 μL KSOM + BSA (1 mg / ml BSA) inn i toppen av kyvetten for å skylle embryoene som kan ha lagt seg til bunnen. Pipetter denne blandingen forsiktig ut og på en 60 mm plate.
    7. Gjenta trinn 5.2.6 minst 2x-3x og bland hver flush på en 60 mm plate til de fleste embryoer er gjenfunnet.
      MERK: En typisk utvinning er >90% av de opprinnelig belastede embryoene. For å sikre embryooverlevelse, test inkubatoren og kontroller utløpsdatoene for alle reagenser. Embryoer er utsatt for ikke-ideelle kulturforhold som temperatur, CO2 -nivå, fuktighet og pH.

6. Embryokultur og genotyping

  1. Embryo kultur
    1. For å dyrke zygoter til et ønsket stadium, bruk en munnpipette for å overføre 20-30 zygoter til en dråpe KSOM + BSA i en pre-likevektsdyrkningsplate og flytt embryoene til dråpen (figur 5D). Inkuber platen over natten i 5% CO2, ved 37 ° C, med 95% fuktighet.
      MERK: Pre-likevekt ved å plassere en forberedt 35mm kultur plate i en inkubator enten dagen før eller minst 4 timer før inkubasjon (figur 5D).
    2. For å fremme ideelle vekstforhold, overfør bare tocelleembryoer neste dag til en fersk dråpe KSOM + BSA-blanding ved hjelp av et stereomikroskop og gå tilbake til inkubatoren. Sørg for å forlate eller kaste bort de døde eller ubefruktede embryoene.
      MERK: Pronukleære embryoer vokser vanligvis til morulae etter 72 timers kultur og blastocyster etter 84 timer.
  2. Genotyping
    1. For å fortynne komponentene i mediet som kan forstyrre en PCR-reaksjon, vask morula / blastocystembryoene med en munnpipette ved å passere gjennom to dråper DPBS.
    2. For å laste enkeltembryoer for lysis, overfør individuelle embryoer til en brønn i en 8-brønns PCR-stripe ved å sette en pipette til 1 μL, og tilsett deretter 10 μL lysisbuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8,5, 2,5 mM MgCl 2, 0,1 mg / ml gelatin, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% mellom 20, 0,2 mg / ml proteinase K i nukleasefri H2 O).
      MERK: Tilsett proteinase K like før klargjøring av lysisbufferen.
    3. For å lyse embryoene, programmer en termisk syklist til 55 ° C i 4 timer, og inaktiver deretter proteinase K med en 10 min inkubasjon ved 95 ° C.
      MERK: Spesielt for førstegangsbrukere, prøv et redigeringseksperiment på Tyr loci. Denne arbeidsflyten er optimalisert og kan fungere som en positiv kontroll. Oppbevar om nødvendig embryolysatene ved 4 °C i 2-3 dager eller i fryseren i opptil 2 uker før PCR-analyse. Forhindre gjentatte fryse-tine sykluser.
    4. For å øke sjansene for vellykket genotypingsanalyse, utfør en nestet PCR-strategi ved å forsterke litt lengre DNA-fragmenter som flankerer det målrettede stedet, samt regioner som vil bli brukt til å amplifisere et mer presist DNA-fragment. Følg betingelsene i tilleggstabell 7.
    5. Følg forholdene for termisk syklist nedenfor:
      95 °C i 2 min
      30+ sykluser: 95 °C i 2 minutter, 60 °C i 10 s og 72 °C i 10 s
      72 °C i 2 min
    6. For å forberede den andre fasen av en nestet PCR-strategi, gjør en 1:10 fortynning av det første PCR-produktet (trinn 6.2.5) og last 2 μL av dette inn i neste PCR-reaksjon (med primere designet for å være inne i forrige forsterker).
      MERK: Den første PCR-reaksjonen må fortynnes for å redusere overføringen av flankerende primere i den andre PCR-reaksjonen. Klargjør nestet PCR ved å følge trinnene i tilleggstabell 8.
    7. Plasser PCR-reaksjonen i en termisk syklist ved å bruke følgende sykkelforhold:
      95 °C i 2 min
      30 sykluser: 95 °C i 2 minutter, 60 °C i 10 s og 72 °C i 10 s
      72 °C i 2 min
      MERK: Normalt er >90% av PCR-reaksjonene vellykkede når amplionstørrelsen er 500 bp eller mindre.
    8. (Valgfri kontroll) For NHEJ-medierte in/del-mutasjoner med Tyr som positiv kontroll, fordøy 10 μL av de nestede PCR-produktene fra trinn 6.2.7 ved å inkubere ved 37 °C i 4 timer ved bruk av 10 E HinfI i en reaksjon på 20 μL (se tilleggstabell 9). På en 2% agarosegel, kjør det fordøyde produktet for å evaluere redigering og bruk et ikke-fordøyd PCR-produkt som lastekontroll. Kjør gelen på 135 V i 30 minutter.
      MERK: Bruken av HinfI som et passende restriksjonsenzym ble valgt på grunn av et beleilig plassert Hinfi-sted som er tilstede i sgRNA-målområdet som forventes å bli ablert ved en vellykket NHEJ-redigering. En detaljert metode og resultater er tidligere beskrevet 9,16.
    9. (Valgfri kontroll) For HDR-medierte mutasjoner med Tyr som positiv kontroll, fordøy 10 μL av de nestede PCR-produktene fra trinn 6.2.7 ved å inkubere ved 37 °C i 4 timer ved bruk av 10 E EcoRI i en reaksjon på 20 μL (se tilleggstabell 10). På en 2% agarosegel, kjør det fordøyde produktet for å evaluere redigering og bruk et ikke-fordøyd PCR-produkt som lastekontroll. Kjør gelen på 135 V i 30 minutter.
      MERK: Valget av EcoRI som et diagnostisk restriksjonsenzym utnytter den opprinnelige sekvensen som finnes i sgRNA-målområdet, hvor, etter vellykket HDR, det naturlig forekommende HinfI-stedet erstattes med et EcoRI-sted, og en frameshift-mutasjon blir tvunget som forstyrrer Tyr-genet. For HDR-analyse, utfør både NHEJ (trinn 6.2.8) og HDR (trinn 6.2.9) analyser på hver prøve, da begge utfallene kan forekomme og kan bidra til å bestemme mosaikk. En detaljert metode og resultater er tidligere beskrevet 9,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metoden genererer mer enn 100 μg sgRNA (20 μL ved >6,000 ng / L-konsentrasjon) for effektiv Cas9 / sgRNA RNP-montering. Den rutinemessige superovulasjonsmetoden beskrevet her produserer vanligvis 10-20 levedyktige embryoer per plugget kvinne. På grunn av håndteringsfeil og typiske tap forbundet med embryomanipulasjon, er en forventet 80% av embryoene befruktet, levedyktig og i utmerket stand etter elektroporering. For å hjelpe forskere med å utføre et vellykket eksperiment, har vi gitt et eksempel på strategi for å målrette musens Tyr-lokus som en positiv kontroll (figur 6), inkludert oligodesign (figur 6A, tilleggstabell 1) og genotypingsstrategier for både NHEJ- og HDR-hendelser (figur 6B) (trinn 6.2). Detaljerte eksempler på eksperimentell suksess og resultater er tilgjengelige 9,16.

I et tidligere forsøk på å sammenligne denne protokollen med mikroinjeksjon, samlet, over 30 forskjellige redigeringsforsøk som involverte syv forskjellige laboratorier for å generere musemodeller, var alle vellykkede 9,16. I tillegg ble denne metoden brukt til å undersøke og rapportere om den første essensielle retrotransposon i pattedyrutvikling27. Ved bruk av en enkel strategi som å levere et enkelt sgRNA, var leveransen av RNP opp til og med 100% i C57BL/6J og C57BL/6N musestammer, med in/del-dannelse som forekommer ved 50-100% og små oligobaserte erstatninger fra 14%-63%9,16 (tabell 1). Ved konstruksjon av genomiske delesjoner kan redigeringseffektiviteten variere fra 3% til 100%, hvor bidragende faktorer inkluderer genomisk plassering, sgRNA-design og størrelsen på slettingen (tabell 2). For eksempel er slettinger mindre enn 1,000bp mer vellykkede enn de som er større enn 1,000 bp 9,16.

Når du bruker 60 embryoer til elektroporering, overgår denne protokollen mikroinjeksjon når det gjelder redigeringseffektivitet, noe som resulterer i 3-4 grunnleggerdyr sammenlignet med en grunnlegger fra mikroinjeksjon9. For gen-knockout-eksperimenter i C57BL/6N-musestammen ved bruk av identisk sgRNA, utkonkurrerte denne metoden mikroinjeksjon, noe som ga gjennomsnittlig fire grunnleggerdyr9 (tabell 2). For små innsettinger, for eksempel V5- eller HA-merking, har ssODN-er opp til 162 nt blitt testet, og innsatsen er for tiden rettet mot å skalere opp til 1000-2000 nt. Suksessen til disse eksperimentene avhenger i stor grad av effektiviteten til sgRNA som brukes til HDR-utfall for å være robust. Nesten alle HDR-utfall er mosaikk, men mellom 31% -64% av embryoene viser noen tegn på innsetting 9,16.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over CRISPR-EZ. En grafisk oversikt over arbeidsflyten. Når en strategi og design er laget, kan redigerte embryoer genereres og testes på omtrent 1 uke. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Modzelewski et al.9. og Chen et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Ideell timing for å utføre prosedyren. Diagrammet viser relevante funksjoner og tidspunkter under den første celledelingen etter befruktning. For å utføre denne tilnærmingen får forskere noen synlige ledetråder, for eksempel morfologiske endringer, estimering av cellesyklustid og kjemiske markører som ofte observeres før den første spaltningen. Siden det nøyaktige tidspunktet for inseminasjon og befruktning er ukjent, vil en fornuftig anbefaling være å betrakte time 0 som midnatt. Før zygoten går inn i S-fase er det ideelle øyeblikket å levere redigeringsmaskiner for enten NHEJ eller HDR, noe som betyr å utføre denne protokollen mellom klokken 7 og 11 om morgenen. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Suksessen med redigeringsstrategier. Enkle strategier som et enkelt sgRNA resulterer i en in / del via NHEJ-reparasjon eller en presisjonsmutasjon når den kombineres med en ssODN-mal gjennom HDR. NHEJ-reparasjon kan også brukes til slettinger ved hjelp av flere sgRNAer. Generelt, jo enklere strategien er, desto mer effektiv er CRISPR-EZ uten ytterligere optimalisering. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Lokalisering av ovidukt og ampulla. Etter kirurgisk isolering av reproduktive vev, bør man sikre regionen ved å påføre forsiktig trykk på fettputen med tang. Fettputen er et relativt trygt område å manipulere for ikke å skade eggstokkene/ovidukten. Området i den stiplede firkanten skal fjernes og plasseres i en dråpe M2 for videre disseksjon. Et tegneseriediagram viser interesseområdet med de relevante anatomiske strukturer merket. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Foreslått behandling og oppsett av kulturplater. Skjemaer som viser ulike plateoppsett for å hjelpe forskere med å gjennomføre både embryobehandling og kultur. (A) Typisk M2+BSA vaskeplate. (B) M2 + hyaluronidaseplate for fjerning av cumulusceller. (C) Valgfri AT-løsningsplate for Zona-tynning. (D) KSOM + BSA-plate for embryokultur, med mineraloljeoverlegg nødvendig for å opprettholde pH, fuktighet og temperatur. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på genotyping for NHEJ- og HDR-utfall . (A) Et tegneseriediagram over regionen rundt Tyr-genet i musegenomet. Nedenfor er detaljer om den uredigerte (WT) sekvensen der et naturlig forekommende HinfI-begrensningssted er funnet, som er innenfor målgjenkjenningsstedet til sgRNA (rød tekst). Under dette er ett av mange mulige utfall etter vellykket CRISPR/Cas9-målretting der det dannes en «in/del». Den nøyaktige naturen til denne redigeringen er vanskelig å forutsi, men vil nesten helt sikkert forstyrre Hinfi-nettstedet. Videre nedenfor er donoroligosekvensen som endrer to basepar for å gjøre Hinfi-stedet til et EcoRI-gjenkjenningssted. (B) Representative restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP) resultater etter redigering. Redigeringseksempler på NHEJ (øverst) og HDR (nederst) vises. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Fenotype og levedyktighet av Tyr-redigerte zygoter og mus. Denne tabellen er tilpasset med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Resultater av CRISPR-EZ og eksperimenter med delesjon av mikroinjeksjoner. Denne tabellen er tilpasset med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggstabell 1: Liste over oligoer og donor ssODN. Denne tabellen er tilpasset med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 2: DNA-mal for sgRNA-reaksjonsoppsettet. Denne tabellen er tilpasset med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 3: Oppsett av in vitro transkripsjon. Denne tabellen er endret med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 4: RNP-kompleksoppsett for NHEJ-formasjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 5: RNP-kompleksoppsett for HDR-dannelse. Denne tabellen er tilpasset med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 6: RNP-komplekst oppsett for sletting. Denne tabellen er endret med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 7: Genotyping PCR-oppsett. Denne tabellen er endret med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 8: Nestet PCR-oppsett for genotyping. Denne tabellen er endret med tillatelse fra Modzelewski et al.9. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 9: Oppsett av HinfI-restriksjonssammendrag. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 10: Oppsett av EcoRi-restriksjonsfordøyelse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Presentert her er en enkel og svært effektiv musegenomredigeringsteknologi. Elektroporering kan brukes til å generere modifiserte embryoer i løpet av 1-2 uker (figur 1) og kan produsere redigerte mus innen 6 uker9. Sammenlignet med samtidig utviklede elektroporasjonsbaserte protokoller som leverer RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, er metoden som beskrevet her konseptuelt lik og gir effektivitet i samme område, med bare mindre forskjeller i reagensutvikling og parametere. Derfor foreslår vi at leserne sammenligner og kontrasterer basert på behov og tilgang til utstyr. Som navnet antyder, ble denne protokollen utviklet med "det gjennomsnittlige muselaboratoriet" i tankene, med bare vanlige metoder (IVT, PCR, gelelektroforese), reagenser (standard embryo- og vevskulturforbruk) eller utstyr (elektroporator og kyvetter som vanligvis brukes til bakteriell transfeksjon), som sannsynligvis er tilgjengelige for de fleste laboratorier som er interessert og i stand til å samle embryoer (eller ved å spørre nærliggende laboratorier). Forskere på studentnivå med grunnleggende embryohåndteringsferdigheter kan teste sgRNA for effektivitet eller gjennomføre dataproduserende eksperimenter flere ganger innenfor tidsrammen for preimplantasjonsutvikling uten å måtte planlegge med et kjerneanlegg. Men hvis det ønskede målet er å generere dyremodeller uten behov for verken mikroinjeksjon eller embryomanipulasjon, er mindre påtrengende metoder tilgjengelige10,32.

Mange faktorer som påvirker Cas9-effektiviteten blir aktivt undersøkt, for eksempel spesifisiteten til et genomisk mål, sgRNA-sekvensparametere, genomtilgjengelighet og topologi, og spesielt celletype. Derfor er design og testing av sgRNA avgjørende for suksess. Denne protokollen og andre uavhengig utviklede elektroporeringsmetoder er optimalisert for å levere Cas9-protein / sgRNA RNP raskt og forbigående inn i zygote-stadium embryoer, øke effektiviteten samtidig som mosaikk minimeres på grunn av levering på et tidlig utviklingsstadium og den korte halveringstiden til RNP 7,9,10,11,12,13,14,15, 16,33,34.

For de vanligste genomredigeringsstrategiene og forskjellige musestammer kan denne metoden overgå mikroinjeksjoner når det gjelder kostnad, effektivitet, små innsettinger, in/del-mutasjoner, ekson-delesjoner, innsettinger og punktmutasjoner9. Med den nåværende protokollen er denne metoden ideell for opprettelse av in/del-mutasjoner og delesjoner opp til 2,6 kb, noe som er mye lengre enn den typiske lengden på et proteinkodende ekson på 170 bp35. Lange slettinger er mindre effektive; Denne begrensningen er imidlertid ikke unik for denne protokollen. Derfor, ettersom Cas9-mediert redigering forbedres og nye Cas-proteinvarianter utvikles, tillater den modulære naturen til denne metoden at disse forbedringene direkte øker egenskapene til protokollen vår.

Selv om denne metoden kan utføre en rekke enkle redigeringer, blir potensialet for større og mer komplekse strategier, for eksempel å sette inn betingede alleler eller fluorescerende koder, for tiden testet i laboratoriet vårt. Lengre ssODN-er kan gi en levedyktig tilnærming til komplisert genomredigering og har vist suksess i mikroinjeksjonsbasert embryoredigering36; Imidlertid er lengre ssODN-er dyre å syntetisere og har ennå ikke blitt testet omfattende med elektroporering37. Bruken av adenoassosierte virus (AAV) for å introdusere opptil 3,3 kb donorsekvenser har også vist suksess, men er kanskje ikke tilgjengelig for de fleste laboratorier25. For tiden anbefaler vi standard embryonal stamcellegenomredigering og mikroinjeksjon for kompleks musegenomteknikk.

Bekymringer om Cas9 off-target effekter forblir 8,38,39. Konstruerte Cas9-variasjoner kan øke målspesifisiteten, selv om dette ikke er fullstendig undersøkt i RNP-embryoelektroporasjonsstudier. CRISPR-EZ kan være en nyttig metode for å lage sammensatte mutasjonsmodeller for å utforske kompleks genetikk. Mens mikroinjeksjoner har gjort samtidig redigering av flere loci mulig40, gjør elektroporasjonsmetoder som den som er beskrevet her dette mer praktisk og effektivt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det foreligger ingen relevante økonomiske erklæringer fra forfatterne.

Acknowledgments

A.J.M. skapte det opprinnelige konseptet som førte til utviklingen av CRISPR-EZ og produserte figurene. C.K.D. samlet og tilpasset de interne og publiserte protokollene for dette aktuelle manuskriptet. A.J.M. støttes av NIH (R00HD096108).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 190
Effektiv genomredigering av mus ved CRISPR-elektroporering av zygoter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J.… More

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J. Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes. J. Vis. Exp. (190), e64302, doi:10.3791/64302 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter