Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Abstract

Met uitzonderlijke efficiëntie, nauwkeurigheid en gemak heeft het CRISPR/Cas9-systeem de genoombewerking in celkweek en proefdierproeven aanzienlijk verbeterd. Bij het genereren van diermodellen biedt de elektroporatie van zygoten een hogere efficiëntie, eenvoud, kosten en doorvoer als alternatief voor de gouden standaardmethode van micro-injectie. Elektroporatie is ook zachter, met een hogere levensvatbaarheid, en levert op betrouwbare wijze Cas9/ single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteïnen (RRP's) in de zygoten van gewone laboratoriummuisstammen (bijv. C57BL / 6J en C57BL / 6N) die 100% leveringsefficiëntie benaderen. Deze techniek maakt insertie/deletie (indels) mutaties, puntmutaties, de deletie van hele genen of exonen en kleine inserties in het bereik van 100-200 bp mogelijk om LoxP of korte tags zoals FLAG, HA of V5 in te voegen. Hoewel voortdurend wordt verbeterd, presenteren we hier de huidige staat van CRISPR-EZ in een protocol dat sgRNA-productie omvat door in vitro transcriptie, embryoverwerking, RNP-assemblage, elektroporatie en de genotypering van pre-implantatieembryo's. Een onderzoeker op graduate niveau met minimale ervaring in het manipuleren van embryo's kan genetisch bewerkte embryo's verkrijgen in minder dan 1 week met behulp van dit protocol. Hier bieden we een eenvoudige, goedkope, efficiënte methode met hoge capaciteit die kan worden gebruikt met muizenembryo's.

Introduction

Genoombewerking bij levende muizen is aanzienlijk vereenvoudigd en is toegankelijker en betaalbaarder geworden sinds de opkomst van CRISPR-bewerking 1,2,3. Initiële bewerkingspogingen bij dieren gebruikten micro-injectie om CRISPR Cas9-mRNA/sgRNA af te leveren in embryo's in het pronucleaire stadium 4,5,6. Hoewel micro-injectie vrij effectief is, is de hoeveelheid oefening die nodig is om het volledig onder de knie te krijgen misschien niet geschikt voor stagiairs en studenten en vereist het ook dure apparatuur die een bescheiden gefinancierd laboratorium zich niet kan veroorloven. Micro-injectie wordt normaal gesproken uitgevoerd door deskundige technici in transgene faciliteiten met schema's en serviceprijzen die voor veel onderzoekers snelheidsbeperkend zijn. Een meer toegankelijke benadering is die van elektroporatie, waarvan is aangetoond dat deze vrij effectief is voor de afgifte van CRISPR Cas9-mRNA / sgRNA in embryo's in het pronucleaire stadium7. Verdere verbeteringen in CRISPR-genoombewerkings- en leveringsstrategieën suggereerden dat voorgeassembleerde RRP's die al betrokken zijn bij sgRNA's een effectief middel kunnen zijn om mozaïcisme te verminderen8.

De reden achter de ontwikkeling en het gebruik van dit protocol was om veel van de beperkingen en obstakels in verband met micro-injectie te omzeilen. Zoals de naam al aangeeft, zou een eenvoudige, interne en kosteneffectieve methode die snel zou kunnen bepalen of niet-geteste sgRNA-ontwerpen de moeite waard zouden zijn om te gebruiken tijdens een micro-injectie-experiment, een zeer handige first pass kwaliteitscontrolestap zijn (figuur 1). Hoewel deze methode micro-injectie niet kan vervangen voor complexere strategieën, zoals het introduceren van lange donor-DNA-sequenties voor op recombinatie gebaseerde uitkomsten, is het ideaal voor minder complexe strategieën zoals kleine deleties of inserties en tagginggenen. Deze methode is geschikt voor onderzoekers met elementaire embryomanipulatievaardigheden die eenvoudige bewerkingsbehoeften hebben, hun hypothese willen testen binnen het tijdsbestek van pre-implantatieontwikkeling, of liever sgRNA's in embryo's testen voordat ze een afspraak plannen met een micro-injectiespecialist. Hier worden bewerkingsreagentia tijdelijk afgeleverd in embryo's in het pronucleaire stadium als Cas9 / sgRNA RNPs via elektroporatie (een reeks elektrische pulsen) om de efficiëntie te maximaliseren en tegelijkertijd het mozaïcisme te verminderen8. Met behulp van een embryogenotyperingsmethode zijn bewerkingsresultaten beschikbaar in ongeveer 1 week9, waardoor de behoefte aan verschillende micro-injectietoepassingen tegen aanzienlijk lagere kosten wordt verminderd.

De effectiviteit van deze methode piekt in het pronucleaire embryostadium, wanneer het embryo de maternale en vaderlijke pronuclei nog niet heeft gefuseerd of in de S-fase is gekomen (figuur 2). Superovulatie wordt gebruikt om het aantal zygoten te maximaliseren, maar produceert zowel pronucleaire zygoten als onbevruchte eieren. Gezonde zygoten kunnen ook vooraf worden geselecteerd vóór elektroporatie om de algehele efficiëntie te verhogen. Aangezien andere elektroporatieprotocollen efficiënt bewerkte zygoten hebben zonder de noodzaak om een vergelijkbare stap 7,10,11,12,13,14,15 op te nemen, is een optionele stap van dit protocol de lichte erosie van de zona pellucida (ZP). De ZP is een glycoproteïnelaag die spermatozoabinding, acrosoomrespons en bevruchting rond embryo's in het pronucleaire stadium helpt. In onze ervaring ontdekten we dat een zachte op zuur gebaseerde erosie van de ZP een betrouwbare Cas9 RNP-elektroporatieafgifte biedt met slechts een marginale impact op de levensvatbaarheid.

We hebben RNP-toedieningspercentages tot 100% efficiëntie waargenomen via elektroporatie in muizenstammen die vaak worden gebruikt in onderzoek zoals C57BL / 6J en C57BL / 6N 9,16. Onafhankelijke groepen hebben ook op elektroporatie gebaseerde procedures ontwikkeld met efficiënties groter dan of overeenkomend met micro-injectie 11,12,13,14,15,17, waarbij elektroporatieprotocollen goed functioneren bij rat 18,19, varken 20,21,22 en koe 23 , dus we raden lezers aan de protocollen te vergelijken om de omstandigheden te vinden die het beste passen bij hun experimentele en apparatuurbehoeften. Het hier beschreven systeem maakt gebruik van gemeenschappelijke materialen en apparatuur, waarvoor alleen elementaire embryomanipulatievaardigheden nodig zijn. Deze techniek is effectief voor een reeks bewerkingsstrategieën, waardoor deze methode breed toegankelijk is voor de onderzoeksgemeenschap.

Het ontwerpen van ideale kleine gids-RNA's (sgRNA's) is essentieel voor efficiënte bewerking. We raden aan om twee tot drie sgRNA-strategieën per doellocatie direct in muizenembryo's te screenen, vooral als het genereren van muizenlijnen gewenst is. Eenmaal ontworpen, worden kloonvrije methoden zoals in vitro transcriptie (IVT) aanbevolen om hoogwaardige sgRNA's te produceren3. De RRP's en sgRNA's worden gemengd met 30-50 verwerkte embryo's in het pronucleaire stadium en blootgesteld aan een reeks elektrische pulsen om eerst tijdelijk het ZP- en celmembraan te doordringen, met daaropvolgende pulsen om de poriën open te houden en de RRP's door de zygote24 te elektroforeren. Na optimalisatie ontdekten we dat zes pulsen van 3 ms bij 30 V voor bulkembryo's (~ 50) optimaal waren voor het bewerken van effectiviteit en levensvatbaarheid, waardoor zeer efficiënte Cas9 / sgRNA RNP-afgifte 9,16,25 werd geboden. Bewerkingsgebeurtenissen in individuele muismorula kunnen worden bevestigd met behulp van een verscheidenheid aan validatiestrategieën die gebruikelijk zijn voor CRISPR-bewerking, zoals restrictief fragmentlengtepolymorfisme (RFLP), T7-endonucleasevertering en Sanger-sequencing van het interessegebied26.

De huidige methode is het meest geschikt voor eenvoudige bewerkingsschema's (figuur 3), zoals insertie/deleties (indels), exon-formaat deleties in de orde van 500-2000 bp, en de levering van puntmutaties en kleine inserties zoals C- of N-Terminal-tags (bijv. FLAG, HA of V5)9,16,27. Het potentieel voor complexe genoombewerking, zoals grote inserties van fluorescerende tags of voorwaardelijke allelen, blijft onzeker en is de huidige focus van aankomende verbeteringen.

Deze methode is gemakkelijk onder de knie te krijgen en kan worden gebruikt om sgRNA's snel te testen in gekweekte muizenembryo's in 1 week9 (figuur 1). Gepresenteerd in dit werk is een zesstappenprotocol, dat 1) sgRNA-ontwerp omvat; 2) sgRNA-synthese; 3) superovulatie en paring; 4) embryocultuur, -verzameling en -verwerking; 5) RNP-assemblage en elektroporatie; 6) embryocultuur en genotypering. Informatie over alle gebruikte materialen wordt verstrekt (Tabel van materialen). Als positieve controle zijn reagentia voor het bewerken van de Tyrosinase (Tyr) locus 9,16 opgenomen in de aanvullende tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierverzorging en -gebruik in dit protocol hielden zich aan het beleid van de Animal Welfare Act, de ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals en volgden de richtlijnen en het beleid van de AVMA voor euthanasie en de University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Het protocol voor dierverzorging en -gebruik werd beoordeeld en goedgekeurd door de IACUC van de Universiteit van Pennsylvania voor dit project. Als een kwestie van naleving en voorzichtigheid, vraag dan alle benodigde autorisaties voordat u dit protocol probeert.

1. sgRNA en optioneel donor-oligoontwerp

  1. sgRNA-ontwerp
    1. Selecteer kandidaat-sgRNA's uit veelgebruikte online algoritmen, zoals Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 of CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Aangezien elk platform uniek is, lees dan zorgvuldig de gebruikersinstructies om ideale sgRNA's te ontwerpen. Voor in/del experimenten selecteert u twee tot drie sgRNA's om te testen. Voor verwijderingen worden sgRNA's voorgesteld die het doelgebied flankeren, bijvoorbeeld twee sgRNA's stroomopwaarts van het doel en twee sgRNA's stroomafwaarts van het doel.
      OPMERKING: Hoewel verschillende online sgRNA-algoritmen rekening houden met off-targets om gebrekkige sgRNA-ontwerpen te voorkomen, is de BLAST-tool van NCBI nuttig bij het bevestigen van de kwaliteit van de geselecteerde sgRNA-sequenties.
    2. Plaats 19-20 nucleotiden (nt) bepaald uit de vorige stap (1.1.1) in het variabele gebied van het sgRNA-oligo (aanvullende tabel 1) en koop gesynthetiseerd sgRNA als aangepaste DNA-oligo's.
      OPMERKING: PAGINA-zuivering is niet vereist.
  2. (Optioneel) Donor oligo ontwerp voor homologie gerichte reparatie (HDR)-gemedieerde knock-in.
    1. Ontwerp het juiste enkelstrengs oligodeoxynucleotide (ssODN) op basis van het gewenste experimentele resultaat (precieze puntmutatie, loxP-insertie, kleine tag-insertie, enz.), waarbij de totale lengte op 100-200 nt wordt gehouden met homologiearmen van 50 nt of meer die het centrale gebied flankeren.
    2. Om een hogere knock-in efficiëntie te garanderen, ontwerpt u het sgRNA als complementair aan de ssODN30 en vervangt u de protospacer adjacent motif (PAM) -sequentie door een stille mutatie om terugkerende snede door het Cas9-enzym te voorkomen.
    3. Bestel ssODN met behulp van de aangepaste oligo-optie.

2. sgRNA-synthese

  1. Sjabloongeneratie voor in vitro transcriptie (IVT)
    1. Om het DNA-sjabloon voor sgRNA IVT via PCR te genereren, bereidt u een IVT-reactie voor in een PCR-stripbuis die RNAse-vrij is. (zie aanvullende tabel 2).
    2. Gebruik de volgende thermische cycler condities:
      95 °C gedurende 2 min; 30 cycli van 95 °C gedurende 2 min, 57 °C gedurende 10 s en 72 °C gedurende 10 s; dan 72 °C gedurende 2 min
    3. Om het succes van de pcr-reactie van de sgRNA-DNA-sjabloon te verifiëren, elektroforese 5 μL van het product gecombineerd met 1 μL 6x ladende kleurstof op een 2% (wt / vol) agarose-gel.
      OPMERKING: De verwachte productgrootte is 127 bp. Elke resterende PCR-reactie kan maximaal 5 maanden bij −20 °C worden bewaard.
  2. In vitro transcriptie (IVT) van sgRNA
    1. Om het sgRNA te genereren, bereidt u het reactiemengsel (T7 IVT volgens de instructies van de fabrikant) in een PCR-buis en veegt u om de reagentia te mengen.
      OPMERKING: Zie aanvullende tabel 3 voor het voorbeeld van de reactie-instelling. De IVT-reactie is RNase-besmettingsgevoelig; doe daarom alles in het werk om een RNase-vrije omgeving te bieden.
    2. Om de reactie op gang te brengen en te laten verlopen, incubeert u het ivt-reactiemengsel gedurende >18 uur bij 37 °C in een thermische cycler of een warmteblok.
    3. Om het oorspronkelijke DNA-sjabloon af te breken (stap 2.1.3), introduceert u 1 μL DNase I (2 eenheden per reactie) en incubeert u de reactie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    4. Om de RNA-binding aan de magnetische zuiveringsparels te bevorderen, combineert u 129 μL 100% ethanol in de reactie, wat nu 150 μL zal zijn.
    5. Om de zuiveringsparels, die de neiging hebben om tijdens de opslag te bezinken, te resuspenderen, vortex de aliquot gedurende ten minste 10 s.
    6. Om de sgRNA's te zuiveren, voegt u 100 μL van de geresuspendeerde kralen (stap 2.2.5) toe aan de IVT-reactie (stap 2.2.4) en mengt u voorzichtig door 10x op en neer te pipetteren.
    7. Om het binden mogelijk te maken, laat u het mengsel 5 minuten op RT rusten.
    8. Om het sgRNA te isoleren van de niet-geïncorporeerde reactieproducten, plaatst u de reactie gedurende 5 minuten op de magnetische standaards bij RT en wacht u tot een kleine pellet zich vormt.
    9. Om de sgRNA's te wassen, gooit u eerst het supernatant voorzichtig weg en voegt u vervolgens 200 μL 80% ethanol toe aan de pellet.
      OPMERKING: Tijdens de 80% (vol /vol) ethanol wasstap is het van cruciaal belang om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord door pipetteren, omdat dit de sgRNA-concentraties aanzienlijk zal verlagen. Pipetteer in plaats daarvan voorzichtig de 80% ethanol zodat de pellet wordt ondergedompeld en verwijder het volume voorzichtig met een pipet.
    10. Herhaal de vorige stap (stap 2.2.9) en droog de pellet aan de lucht gedurende niet langer dan 5-6 minuten, anders wordt het sgRNA permanent geassocieerd met de kralen.
    11. Eluteer het sgRNA met 20 μL nucleasevrij water door de pellet 10x te pipetteren, gedurende 2 minuten te broeden op (RT) en vervolgens terug te plaatsen op de magnetische standaard om de kralen te scheiden van het nu gezuiverde sgRNA.
    12. Om de kwaliteit en kwantiteit van het sgRNA te evalueren, gebruikt u een instrument zoals een spectrofotometer of bioanalyzer. Als alternatief, op een 2% agarose gel, voer 2 μL sgRNA's uit, vergelijkbaar met stap 2.1.3.
      OPMERKING: Kwaliteit wordt bevestigd door een enkele clear band. De rest van het sgRNA kan onmiddellijk worden gebruikt of worden opgeslagen in -80 °C-omstandigheden.

3. Superovulatie

  1. Om voldoende embryo's te bieden om elk sgRNA-ontwerp te testen, superovuleren twee tot drie C57BL / 6J-vrouwtjes die tussen 3-5 weken oud zijn, zoals eerder beschreven9. Elektroporating van 20-30 embryo's per sgRNA wordt aanbevolen om voldoende resultaten te genereren om de effectiviteit te bevestigen.
    OPMERKING: Als de bevruchting succesvol is, verwacht dan 10-20 embryo's per paring.
  2. Om de ovulatie te induceren, volgt u dit hormooninjectieschema:
    1. Dag 1: Dien 5 IE serumgonadotrofine (PMSG) (100 μL) van drachtige merrie toe via een intraperitoneale (IP) injectie met een spuit van 26 G in vrouwelijke muizen van 3-5 weken oud.
    2. Dag 3: Injecteer na 46-48 uur PMSG-injectie 5 IE humaan choriongonadotrofine (hCG) (100 μL) via een IP-injectie om de ovulatie te induceren.
    3. Om de fokkerij op te zetten, koppelt u vrouwtjes 1:1 met een mannetje van betrouwbare fokkerij direct na hCG-injectie.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat hormonen afbreken en activiteit verliezen, voert u injecties uit onder 30 minuten ontdooien.

4. Embryoverzameling en -verwerking

  1. Embryo-verzameling
    1. Om vrouwen te euthanaseren en het benodigde materiaal op te halen, zoals eerder beschreven31, moet u eerst de juiste methode bevestigen in overeenstemming met het institutionele beleid. Gebruik bijvoorbeeld CO 2-verstikking, cervicale dislocatie en / of andere goedgekeurde methoden.
      OPMERKING: Normaal gesproken vertonen >75% van de hormoonstimulerende vrouwtjes copulatory pluggen, wat wijst op een succesvolle paring.
    2. Om te voorkomen dat haren het verzamelen van weefsel moeilijk maken, plaatst u de geëuthanaseerde vrouwtjes op hun rug en spuit u 70% (vol / vol) ethanol op het buikgebied dat operatief moet worden geopend.
      OPMERKING: Vanaf dit punt wordt geadviseerd om de chirurgische stappen uit te voeren in een geventileerde kap om een aseptische omgeving te behouden en het risico op besmetting te verminderen.
    3. Om de buikholte te openen en de eileiders te verwijderen, knipt u de huid / het haar (subcutane) laag met een chirurgische schaar en lokaliseert u de eierstokken (figuur 4), die zich in de buurt van de nier bevinden en een deel van een vetkussen delen. De eileiders bevinden zich proximaal aan de eierstokken (figuur 4). Verwijder beide eileiders operatief van het vrouwtje en plaats ze in individuele 50 μL druppeltjes M2+BSA (4 mg/ml BSA) medium (figuur 5A).
      OPMERKING: Gedetailleerde instructies voor dit gedeelte van de procedure kunnen visueel worden bekeken31 of stapsgewijsworden gevolgd 9 met behulp van eerder gepubliceerde protocollen.
    4. Om de cumulus-eicelcomplexen (CoC's) die eicellen bevatten vrij te maken (figuur 4), gebruikt u een dissectietang om het ampulla van de eileider te breken terwijl u door een stereomicroscoop kijkt.
    5. Om de hoeveelheid puin (bloed, vet, weefsel) te verminderen, breng en combineer elke CoC tot een enkele 50 μL druppel M2 + BSA-media met een handpipet ingesteld op 20-30 μL om de overdracht van puin te voorkomen.
  2. Verwijdering van cumuluscellen
    1. Om te beginnen met het verwijderen van cumuluscellen uit de zygoten (figuur 4), breng coc's met zo min mogelijk extra media over naar een druppel van 100 μL M2 + hyaluronidase (figuur 5B) en meng voorzichtig door de CoC's te pipetteren totdat de embryo's zichtbaar zijn gescheiden van de veel kleinere cumuluscellen. Zorg ervoor dat u de blootstelling van M2 + hyaluronidase aan de embryo's tot een minimum beperkt, omdat dit de levensvatbaarheid kan beïnvloeden.
      OPMERKING: Men kan ofwel voorverwarmen (37 °C) of een extra 50 μL M2 + hyaluronidase toevoegen als de embryo's niet binnen 2 minuten van de cumuluscellen scheiden.
    2. Om hyaluronidase te verdunnen en losse cumuluscellen uit de zygoten te verwijderen, gebruikt u een mondbediende pipet om de zygoten naar een verse 50 μL M2 + BSA-druppel te verplaatsen.
      OPMERKING: De meeste stappen voorbij dit punt vereisen het gebruik van een mondbediende pipet, tenzij anders vermeld. Hoewel het risico op besmetting door de gebruiker laag is, wordt het gebruik van een inline luchtfilter aanbevolen om een aseptische omgeving te behouden. Raadpleeg de eerder beschreven methoden om dit instrument te bereiden en te gebruiken 9,31.
    3. Gebruik een mondpipet om de embryo's door ten minste vier tot vijf andere 50 μL M2 + BSA-druppels te leiden om het aantal cumuluscellen te verminderen.
  3. (OPTIONEEL) Verdunning van de zona pellucida met zure tyrode (AT) oplossing.
    1. Om de zona pellucida van het embryo te eroderen en extra fysieke obstakels voor de toediening van reagens te verminderen, brengt u de embryo's over naar een voorgewarmde (37 °C) 100 μL druppel AT-oplossing op een plaat van 60 mm (figuur 5C). Observeer de zygoten continu met behulp van een stereomicroscoop totdat ongeveer 30% van de zona pellucida is geërodeerd9. De totale AT-blootstelling moet 60-90 s zijn. Langdurige blootstelling aan AT kan de zona pellucida volledig oplossen en de levensvatbaarheid van het embryo in gevaar brengen.
      OPMERKING: Voor gedetailleerde instructies en afbeeldingen van dit gedeelte van de procedure verwijzen wij u naar eerder gepubliceerde methoden 9,16.
    2. Om de AT te verdunnen, gebruikt u een mondpipet om de embryo's door ten minste vier druppeltjes M2 + BSA van 50 μL te laten gaan.
    3. Om te bepalen of een geschikt aantal embryo's is verwerkt, gebruikt u een stereomicroscoop om de embryo's te tellen. Afhankelijk van het aantal gebruikte vrouwelijke muizen, kan men ongeveer 10-20 levensvatbare zygoten per vrouw verwachten.
      OPMERKING: In dit stadium moeten embryo's relatief vrij zijn van puin dat de evaluatie van kwantiteit en kwaliteit zou verhinderen. Als u bijvoorbeeld vijf vrouwtjes gebruikt, zouden de verwachte zygote-aantallen waarschijnlijk tussen 50-100 liggen en zou een mechanische celteller geschikt zijn om embryo's bij te houden. Het is gebruikelijk om ongeveer 10% -20% van de embryo's te verliezen als gevolg van het niet bevruchten of oöcyten van lage kwaliteit die worden geovuleerd. Bewaar de embryo's tijdens de volgende stap kort in 50 μL M2+BSA gedurende niet meer dan 30 minuten in een couveuse.

5. RNP-assemblage en elektroporatie

  1. RNP-assemblage
    1. Om het RNP-complex samen te stellen, gebruikt u de bijgevoegde voorbeeldtabellen om de juiste reactiemengsels te combineren op basis van de gewenste bewerkingsstrategie in RNP-buffer (100 mM HEPES pH 7,5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl2, 50% glycerol en 100 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrochloride [TCEP] in nucleasevrij water)
      OPMERKING: TCEP is een handig reductiemiddel, maar heeft een korte halfwaardetijd in waterige oplossingen; voeg daarom TCEP toe vlak voor RNP-complexe assemblage.
      1. Voor niet-homologe end joining (NHEJ)-gemedieerde indels, zie aanvullende tabel 4.
      2. Voor homology directed repair (HDR)-gemedieerde bewerking raadpleegt u Aanvullende tabel 5.
      3. Voor technische deleties met behulp van gepaarde sgRNA's raadpleegt u Aanvullende tabel 6.
        1. Ongeacht de strategie, combineer de gewenste reagentia bij RT in een PCR-buis.
        2. Om RNP-complexvorming mogelijk te maken, incubeert u het mengsel gedurende 10 minuten bij 37 °C.
          OPMERKING: RNP-complex kan maximaal 1 uur bij RT worden opgeslagen.
  2. Elektroporatie
    1. Om de BSA vóór elektroporatie te verdunnen, laat u de embryo's door ten minste twee druppeltjes van 50 μL gereduceerde serummedia lopen.
      OPMERKING: BSA verhoogt de weerstand tijdens elektroporatie en kan de zygoten beschadigen.
    2. Om de zygoten (stap 4.3.2) te bereiden en te mengen met het RNP-complex (stap 5.1.1.2) voor elektroporatie, pipetteer je 25-30 embryo's in een druppel van 10 μL gereduceerd serummedium en gebruik je vervolgens een handpipet om 10 μL van het RNP-complex toe te voegen (stap 5.1.1.2).
    3. Om de viskeuze glycerol uit het RNP-complex te verdunnen en het monster te homogeniseren, mengt u door 10x te pipetteren of totdat het mengsel geen tekenen van viscositeit (wervelpatroon) meer vertoont met behulp van een stereomicroscoop.
    4. Om het monster voor te bereiden op het inbrengen in de elektroporator, pipetteert u dit 20 μL embryo + RNP-mengsel in een elektroporatiecuvet van 0,1 cm terwijl u bellen vermijdt.
    5. Om de bewerkingsreagentia in de zygote af te leveren, elektropomeert u de embryo's met behulp van een blokgolfprotocol met deze voorwaarden: 30 V, 4-6 pulsen, 3 ms pulslengte en 100 pulsintervallen.
    6. Om zygoten uit de cuvette te halen, gebruikt u een handpipet om 50 μL KSOM + BSA (1 mg / ml BSA) in de bovenkant van het cuvet af te leveren om de embryo's die zich mogelijk naar de bodem hebben gevestigd, door te spoelen. Pipetteer dit mengsel voorzichtig uit en op een plaat van 60 mm.
    7. Herhaal stap 5.2.6 ten minste 2x-3x en combineer elke spoeling op een plaat van 60 mm totdat de meeste embryo's zijn hersteld.
      OPMERKING: Een typisch herstel is >90% van de oorspronkelijk geladen embryo's. Om de overleving van het embryo te garanderen, test u de couveuse en controleert u de vervaldatums voor alle reagentia. Embryo's zijn gevoelig voor niet-ideale kweekomstandigheden zoals temperatuur, CO2-niveau , vochtigheid en pH.

6. Embryocultuur en genotypering

  1. Embryocultuur
    1. Om zygoten tot een gewenst stadium te kweken, gebruikt u een mondpipet om 20-30 zygoten over te brengen in een druppel KSOM + BSA in een vooraf uitgebalanceerde kweekplaat en de embryo's naar de druppel te verplaatsen (figuur 5D). Incubeer de plaat een nacht in 5% CO2, bij 37 °C, met een luchtvochtigheid van 95%.
      OPMERKING: Pre-equilibrate door een voorbereide 35mm kweekplaat in een incubator te plaatsen, hetzij de dag ervoor of ten minste 4 uur vóór de incubatie (figuur 5D).
    2. Om ideale groeiomstandigheden te bevorderen, brengt u de volgende dag alleen tweecellige embryo's over naar een verse druppel KSOM + BSA-mengsel met behulp van een stereomicroscoop en keert u terug naar de incubator. Zorg ervoor dat u de dode of onbevruchte embryo's achterlaat of weggooit.
      OPMERKING: Pronucleaire stadium embryo's groeien meestal uit tot morulae na 72 uur cultuur en blastocysten na 84 uur.
  2. Genotypering
    1. Om de componenten van het medium die een PCR-reactie kunnen verstoren te verdunnen, wast u de morula/ blastocyst-embryo's met een mondpipet door twee druppels DPBS te laten gaan.
    2. Om enkele embryo's voor lysis te laden, brengt u individuele embryo's over naar één putje van een 8-well PCR-strip door een pipet in te stellen op 1 μL en voegt u vervolgens 10 μL lysisbuffer toe (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8,5, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mg / ml gelatine, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20, 0,2 mg / ml proteïnase K in nucleasevrije H2O).
      OPMERKING: Voeg proteïnase K toe vlak voordat u de lysisbuffer bereidt.
    3. Om de embryo's te lyseren, programmeert u een thermische cycler tot 55 °C gedurende 4 uur en inactiveert u vervolgens het proteïnase K met een incubatie van 10 minuten bij 95 °C.
      OPMERKING: Vooral voor nieuwe gebruikers, probeer een bewerkingsexperiment op de Tyr loci. Deze workflow is geoptimaliseerd en kan dienen als een positieve controle. Bewaar de embryolysaten indien nodig bij 4 °C gedurende 2-3 dagen of in de vriezer gedurende maximaal 2 weken vóór de PCR-analyse. Voorkom herhaalde vries-dooicycli.
    4. Om de kans op succesvolle genotyperingsanalyse te vergroten, voert u een geneste PCR-strategie uit door iets langere DNA-fragmenten te versterken die de beoogde locatie flankeren, evenals regio's die zullen worden gebruikt om een nauwkeuriger DNA-fragment te versterken. Volg de voorwaarden in aanvullende tabel 7.
    5. Volg de onderstaande thermische cycler condities:
      95 °C gedurende 2 min
      30+ cycli: 95 °C gedurende 2 min, 60 °C gedurende 10 s en 72 °C gedurende 10 s
      72 °C gedurende 2 min
    6. Om de tweede fase van een geneste PCR-strategie voor te bereiden, maakt u een 1:10-verdunning van het eerste PCR-product (stap 6.2.5) en laadt u 2 μL hiervan in de volgende PCR-reactie (met primers die zijn ontworpen om zich in het vorige amplicon te bevinden).
      OPMERKING: De eerste PCR-reactie moet worden verdund om de overdracht van flankerende primers in de tweede PCR-reactie te verminderen. Bereid de geneste PCR voor door de stappen in aanvullende tabel 8 te volgen.
    7. Plaats de PCR-reactie in een thermische cycler met behulp van de volgende fietsomstandigheden:
      95 °C gedurende 2 min
      30 cycli: 95 °C gedurende 2 min, 60 °C gedurende 10 s en 72 °C gedurende 10 s
      72 °C gedurende 2 min
      OPMERKING: Normaal gesproken is >90% van de PCR-reacties succesvol wanneer de amplicongrootte 500 bp of minder is.
    8. (Optionele bediening) Voor NHEJ-gemedieerde in/del mutaties die Tyr als positieve controle gebruiken, verteerbaart u 10 μL van de geneste PCR-producten uit stap 6.2.7 door gedurende 4 uur bij 37 °C te broeden met 10 U HinfI in een reactie van 20 μL (zie aanvullende tabel 9). Voer op een 2% agarose-gel het verteerde product uit om de bewerking te evalueren en gebruik een niet-verteerd PCR-product als belastingscontrole. Laat de gel 30 min op 135 V draaien.
      OPMERKING: Het gebruik van HinfI als een geschikt restrictie-enzym werd geselecteerd vanwege een gunstig gelegen HinfI-site in het sgRNA-doelgebied waarvan wordt voorspeld dat deze zal worden geableerd na een succesvolle NHEJ-bewerking. Een gedetailleerde methode en resultaten zijn eerder beschreven 9,16.
    9. (Optionele bediening) Voor HDR-gemedieerde mutaties die Tyr als positieve controle gebruiken, vertwijft u 10 μL van de geneste PCR-producten uit stap 6.2.7 door gedurende 4 uur bij 37 °C te broeden met 10 U EcoRI in een reactie van 20 μL (zie aanvullende tabel 10). Voer op een 2% agarose-gel het verteerde product uit om de bewerking te evalueren en gebruik een niet-verteerd PCR-product als belastingscontrole. Laat de gel 30 min op 135 V draaien.
      OPMERKING: De keuze van EcoRI als diagnostisch restrictie-enzym maakt gebruik van de oorspronkelijke sequentie in het sgRNA-doelgebied, waar, na succesvolle HDR, de natuurlijk voorkomende HinfI-site wordt vervangen door een EcoRI-site en een frameshift-mutatie wordt gedwongen die interfereert met het Tyr-gen. Voer voor HDR-analyse zowel NHEJ-analyses (stap 6.2.8) als HDR-analyses (stap 6.2.9) uit op elk monster, omdat beide uitkomsten kunnen optreden en kunnen helpen bij het bepalen van mozaïcisme. Een gedetailleerde methode en resultaten zijn eerder beschreven 9,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze methode genereert meer dan 100 μgg sgRNA (20 μL bij >6.000 ng/L concentratie) voor een efficiënte Cas9/sgRNA RNP assemblage. De hier beschreven routinematige superovulatiemethode produceert meestal 10-20 levensvatbare embryo's per geplugd vrouwtje. Als gevolg van hanteringsfouten en typische verliezen in verband met embryomanipulatie, is naar verwachting 80% van de embryo's bevrucht, levensvatbaar en in uitstekende staat na elektroporatie. Om onderzoekers te helpen bij het uitvoeren van een succesvol experiment, hebben we een voorbeeldstrategie gegeven om de Tyr-locus van de muis als een positieve controle te richten (figuur 6), inclusief oligo-ontwerpen (figuur 6A, aanvullende tabel 1) en genotyperingsstrategieën voor zowel NHEJ- als HDR-gebeurtenissen (figuur 6B) (stap 6.2). Gedetailleerde voorbeelden van experimenteel succes en resultaten zijn beschikbaar 9,16.

In een eerdere poging om dit protocol te vergelijken met micro-injectie, waren gezamenlijk meer dan 30 verschillende bewerkingspogingen waarbij zeven verschillende laboratoria betrokken waren om muismodellen te genereren allemaal succesvol 9,16. Bovendien werd deze methode gebruikt om de eerste essentiële retrotransposon in de ontwikkeling van zoogdieren te onderzoeken en erover te rapporteren27. Bij het gebruik van een eenvoudige strategie, zoals het leveren van een enkel sgRNA, was de levering van RRP's tot en met 100% in de C57BL/6J- en C57BL/6N-muizenstammen, waarbij in/del-vorming optrad bij 50-100% en kleine oligo-gebaseerde vervangingen variërend van 14%-63%9,16 (tabel 1). Bij het ontwerpen van genomische deleties kan de bewerkingseffectiviteit variëren van 3% tot 100%, waarbij bijdragende factoren genomische locatie, sgRNA-ontwerp en de grootte van de deletie omvatten (tabel 2). Deleties kleiner dan 1.000 bp zijn bijvoorbeeld succesvoller dan die groter dan 1.000 bp 9,16.

Bij gebruik van 60 embryo's voor elektroporatie overtreft dit protocol micro-injectie in termen van bewerkingseffectiviteit, wat resulteert in 3-4 oprichtersdieren in vergelijking met één oprichter van micro-injectie9. Voor gen knock-out experimenten in de C57BL/6N muizenstam met identiek sgRNA presteerde deze methode beter dan micro-injectie, wat gemiddeld vier oprichters opleverde9 (tabel 2). Voor kleine inserties, zoals V5- of HA-tagging, zijn ssODN's tot 162 nt met succes getest en zijn de inspanningen momenteel gericht op het opschalen naar 1000-2000 nt. Het succes van deze experimenten hangt grotendeels af van de effectiviteit van het sgRNA dat wordt gebruikt om HDR-uitkomsten robuust te maken. Bijna alle HDR-uitkomsten zijn mozaïek, maar tussen 31% -64% van de embryo's vertoont enig bewijs van inserties 9,16.

Figure 1
Figuur 1: Overzicht van CRISPR-EZ. Een grafisch overzicht van de workflow. Zodra een strategie en ontwerp zijn gemaakt, kunnen bewerkte embryo's in ongeveer 1 week worden gegenereerd en getest. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. en Chen et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Ideale timing om de procedure uit te voeren. Het diagram toont relevante kenmerken en tijdspunten tijdens de eerste cellulaire deling na de bevruchting. Om deze aanpak uit te voeren, krijgen onderzoekers enkele zichtbare aanwijzingen, zoals morfologische veranderingen, schattingen van de celcyclustijd en chemische markers die vaak worden waargenomen vóór de eerste splitsing. Aangezien de exacte timing van inseminatie en bevruchting onbekend is, zou een verstandige aanbeveling zijn om uur 0 als middernacht te beschouwen. Voordat de zygote de S-fase ingaat, is het ideale moment om bewerkingsmachines voor NHEJ of HDR te leveren, wat zich vertaalt in het uitvoeren van dit protocol tussen 7 uur 's ochtends en 11 uur 's ochtends. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Het succes van bewerkingsstrategieën. Eenvoudige strategieën zoals een enkel sgRNA resulteren in een in/del via NHEJ reparatie of een precisiemutatie in combinatie met een ssODN template via HDR. NHEJ-reparatie kan ook worden gebruikt voor verwijderingen met behulp van meerdere sgRNA's. Over het algemeen geldt dat hoe eenvoudiger de strategie, hoe effectiever CRISPR-EZ is zonder verdere optimalisatie. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Lokaliseren van de eileider en ampulla. Na het chirurgisch isoleren van de voortplantingsweefsels, moet men het gebied beveiligen door zachte druk uit te oefenen op het vetkussen met een tang. Het vetkussen is een relatief veilig gebied om te manipuleren om de eierstokken / eileider niet te beschadigen. Het gebied in het onderbroken vierkant moet worden verwijderd en in een druppel M2 worden geplaatst voor verdere dissectie. Een cartoondiagram toont het interessegebied met de relevante anatomische structuren gelabeld. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Voorgestelde opstelling van de verwerkings- en kweekplaat. Schema's met verschillende plaatopstellingen om onderzoekers te helpen bij het uitvoeren van zowel embryoverwerking als cultuur. (A) Typische M2+BSA wasplaat. (B) M2+hyaluronidaseplaat voor het verwijderen van cumuluscellen. (C) Optionele AT-oplossingsplaat voor zona-verdunning. (D) KSOM+BSA-plaat voor embryocultuur, met minerale olie-overlay die nodig is voor het handhaven van pH, vochtigheid en temperatuur. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Genotyperingsvoorbeeld voor NHEJ- en HDR-uitkomsten. (A) Een cartoondiagram van het gebied rond het Tyr-gen in het muizengenoom. Hieronder vindt u details van de onbewerkte (WT) sequentie waar een natuurlijk voorkomende HinfI-beperkingssite wordt gevonden, die zich binnen de doelherkenningsplaats van het sgRNA (rode tekst) bevindt. Daaronder zit een van de vele mogelijke uitkomsten na succesvolle CRISPR/Cas9-targeting waarbij een "in/del" wordt gevormd. De exacte aard van deze bewerking is moeilijk te voorspellen, maar zal vrijwel zeker de HinfI-site verstoren. Verderop is de donor oligosequentie die twee basenparen verandert om de HinfI-site in een EcoRI-herkenningslocatie te veranderen. (B) Representatieve restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) resultaten na bewerking. Nhej (boven) en HDR (onder) bewerkingsvoorbeelden worden weergegeven. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Fenotype en levensvatbaarheid van Tyr-bewerkte zygoten en muizen. Deze tabel is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Resultaten van CRISPR-EZ en micro-injectie deletie experimenten. Deze tabel is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Lijst van oligo's en donor-ssODN. Deze tabel is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: DNA-sjabloon voor de sgRNA-reactieopstelling. Deze tabel is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 3: In vitro transcriptie setup. Deze tabel is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 4: RNP-complexopstelling voor NHEJ-formatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 5: RNP-complexe opstelling voor HDR-formatie. Deze tabel is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 6: RNP complexe setup voor verwijdering. Deze tabel is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 7: Genotypering PCR setup. Deze tabel is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 8: Geneste genotypering PCR setup. Deze tabel is aangepast met toestemming van Modzelewski et al.9. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 9: HinfI-restrictiesamenvatting instellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 10: EcoRi restrictie digest setup. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier wordt een eenvoudige en zeer efficiënte technologie voor het bewerken van het muizengenoom gepresenteerd. Elektroporatie kan worden gebruikt om gemodificeerde embryo's te genereren in 1-2 weken (figuur 1) en kan binnen 6 weken bewerkte muizen produceren9. Vergeleken met gelijktijdig ontwikkelde op elektroporatie gebaseerde protocollen die RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32 leveren, is de methode zoals hier beschreven conceptueel vergelijkbaar en biedt efficiënties in hetzelfde bereik, met slechts kleine verschillen in reagensontwikkeling en parameters. Daarom raden we lezers aan om te vergelijken en te contrasteren op basis van behoeften en toegang tot apparatuur. Zoals de naam al aangeeft, is dit protocol ontwikkeld met "het gemiddelde muizenlaboratorium" in gedachten, met alleen gangbare methoden (IVT, PCR, gel-elektroforese), reagentia (standaard embryo- en weefselkweekverbruiksmiddel) of apparatuur (elektroporator en cuvetten die vaak worden gebruikt voor bacteriële transfectie), die waarschijnlijk toegankelijk zijn voor de meeste laboratoria die geïnteresseerd zijn en in staat zijn om embryo's te verzamelen (of door het vriendelijk te vragen aan naburige laboratoria). Afgestudeerde onderzoekers op studentniveau met basisvaardigheden voor het hanteren van embryo's kunnen sgRNA's testen op efficiëntie of meerdere keren gegevensproducerende experimenten uitvoeren binnen het tijdsbestek van de pre-implantatieontwikkeling zonder dat ze hoeven te plannen met een kernfaciliteit. Als het gewenste doel echter is om diermodellen te genereren zonder de noodzaak van micro-injectie of embryomanipulatie, zijn er minder intrusieve methoden beschikbaar10,32.

Veel factoren die van invloed zijn op de efficiëntie van Cas9 worden actief onderzocht, zoals de specificiteit van een genomisch doelwit, sgRNA-sequentieparameters, genoomtoegankelijkheid en topologie, en vooral het celtype. Daarom is het ontwerpen en testen van sgRNA's cruciaal voor succes. Dit protocol en andere onafhankelijk ontwikkelde elektroporatiemethoden zijn geoptimaliseerd om Cas9-eiwit / sgRNA-RNP's snel en tijdelijk in embryo's in het zygote-stadium af te leveren, waardoor de efficiëntie wordt verbeterd en mozaïcisme wordt geminimaliseerd als gevolg van levering in een vroeg ontwikkelingsstadium en de korte halfwaardetijd van de RNP 7,9,10,11,12,13,14,15, 16,33,34.

Voor de meest voorkomende genoombewerkingsstrategieën en verschillende muizenstammen kan deze methode beter presteren dan micro-injecties in termen van kosten, efficiëntie, kleine inserties, in / del-mutaties, exon-deleties, inserties en puntmutaties9. Met het huidige protocol is deze methode ideaal voor het creëren van in/del mutaties en deleties tot 2,6 kb, wat veel langer is dan de typische lengte van een eiwitcoderend exon van 170 bp35. Lange deleties zijn minder efficiënt; deze beperking is echter niet uniek voor dit protocol. Daarom, naarmate Cas9-gemedieerde bewerking wordt verbeterd en nieuwe Cas-eiwitvarianten worden ontwikkeld, maakt het modulaire karakter van deze methode het mogelijk dat deze verbeteringen de mogelijkheden van ons protocol direct vergroten.

Hoewel deze methode een verscheidenheid aan eenvoudige bewerkingen kan uitvoeren, wordt het potentieel ervan voor grotere en complexere strategieën, zoals het invoegen van voorwaardelijke allelen of fluorescerende tags, momenteel getest in ons laboratorium. Langere ssODN's zouden een haalbare aanpak kunnen bieden voor gecompliceerde genoombewerking en hebben succes getoond bij het bewerken van embryo's op basis vanmicro-injecties 36; langere ssODN's zijn echter duur om te synthetiseren en moeten nog uitgebreid worden getest met elektroporatie37. Het gebruik van adeno-geassocieerde virussen (AAV) om donorsequenties tot 3,3 kb te introduceren, heeft ook succes getoond, maar is mogelijk niet toegankelijk voor de meeste laboratoria25. Voorlopig raden we standaard embryonale stamcelgenoombewerking en micro-injectie aan voor complexe muisgenoomtechnologie.

Zorgen over Cas9 off-target effecten blijven 8,38,39. Gemanipuleerde Cas9-variaties kunnen de doelspecificiteit verhogen, hoewel dit niet volledig is onderzocht in RNP-embryo-elektroporatiestudies. CRISPR-EZ zou een nuttige methode kunnen zijn voor het maken van samengestelde mutatiemodellen om complexe genetica te onderzoeken. Terwijl micro-injecties gelijktijdig bewerken van meerdere loci mogelijk hebben gemaakt40, maken elektroporatiemethoden zoals die hier beschreven dit handiger en effectiever.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er zijn geen relevante financiële verklaringen van de auteurs.

Acknowledgments

A.J.M. creëerde het oorspronkelijke concept dat leidde tot de ontwikkeling van CRISPR-EZ en produceerde de figuren. C.K.D. stelde de interne en gepubliceerde protocollen voor dit huidige manuscript samen en bewerkte deze. A.J.M. wordt ondersteund door NIH (R00HD096108).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Tags

Ontwikkelingsbiologie Nummer 190
Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J.… More

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J. Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes. J. Vis. Exp. (190), e64302, doi:10.3791/64302 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter