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Developmental Biology

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Abstract

Mit außergewöhnlicher Effizienz, Genauigkeit und Leichtigkeit hat das CRISPR/Cas9-System die Genom-Editierung in Zellkultur- und Labortierversuchen deutlich verbessert. Bei der Erstellung von Tiermodellen bietet die Elektroporation von Zygoten eine höhere Effizienz, Einfachheit, Kosten und einen höheren Durchsatz als Alternative zur Goldstandardmethode der Mikroinjektion. Die Elektroporation ist auch schonender, mit höherer Lebensfähigkeit und liefert zuverlässig Cas9 / Single-Guide-RNA (sgRNA) Ribonukleoproteine (RNPs) in die Zygoten gängiger Labormausstämme (z. B. C57BL / 6J und C57BL / 6N), die eine 100%ige Liefereffizienz erreichen. Diese Technik ermöglicht Insertions-/Deletionsmutationen (Indels), Punktmutationen, die Deletion ganzer Gene oder Exons und kleine Insertionen im Bereich von 100-200 bp, um LoxP oder kurze Tags wie FLAG, HA oder V5 einzufügen. Während es ständig verbessert wird, präsentieren wir hier den aktuellen Stand von CRISPR-EZ in einem Protokoll, das die sgRNA-Produktion durch In-vitro-Transkription , Embryo-Prozessierung, RNP-Assemblierung, Elektroporation und die Genotypisierung von Präimplantationsembryonen umfasst. Ein Forscher mit minimaler Erfahrung in der Manipulation von Embryonen kann mit diesem Protokoll in weniger als 1 Woche genetisch veränderte Embryonen erhalten. Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige, effiziente und leistungsfähige Methode an, die mit Mausembryonen verwendet werden könnte.

Introduction

Die Genom-Editierung bei lebenden Mäusen wurde erheblich vereinfacht und ist seit dem Aufkommen der CRISPR-Editierungzugänglicher und erschwinglicher geworden 1,2,3. Erste Versuche zur Bearbeitung von Tieren verwendeten Mikroinjektionen, um CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium zu liefern 4,5,6. Während die Mikroinjektion sehr effektiv ist, ist die Menge an Übung, die erforderlich ist, um sie vollständig zu beherrschen, möglicherweise nicht für Auszubildende und Studenten geeignet und erfordert auch teure Geräte, die sich ein bescheiden finanziertes Labor nicht leisten kann. Die Mikroinjektion wird in der Regel von erfahrenen Technikern in transgenen Anlagen mit Zeitplänen und Servicepreisen durchgeführt, die für viele Forscher preisbegrenzend sind. Ein zugänglicherer Ansatz ist die Elektroporation, die sich als sehr effektiv für die Verabreichung von CRISPR-Cas9-mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium erwiesen hat7. Weitere Verbesserungen bei der Genom-Editierung und den Verabreichungsstrategien von CRISPR deuten darauf hin, dass vorkonfektionierte RNPs, die bereits mit sgRNAs verbunden sind, ein wirksames Mittel zur Verringerung des Mosaizismus sein könnten8.

Der Grund für die Entwicklung und Verwendung dieses Protokolls bestand darin, viele der Einschränkungen und Hindernisse zu umgehen, die mit der Mikroinjektion verbunden sind. Wie der Name schon sagt, wäre eine einfache, hauseigene und kostengünstige Methode, mit der schnell festgestellt werden kann, ob sich ungetestete sgRNA-Designs während eines Mikroinjektionsexperiments lohnen, ein sehr praktischer Schritt zur Qualitätskontrolle im ersten Durchgang (Abbildung 1). Während diese Methode die Mikroinjektion für komplexere Strategien, wie die Einführung langer Spender-DNA-Sequenzen für rekombinationsbasierte Ergebnisse, nicht ersetzen kann, ist sie ideal für weniger komplexe Strategien wie kleine Deletionen oder Insertionen und die Markierung von Genen. Diese Methode eignet sich für Forscher mit grundlegenden Fähigkeiten in der Manipulation von Embryonen, die einfache Bearbeitungsbedürfnisse haben, ihre Hypothese innerhalb des Zeitrahmens der Präimplantationsentwicklung testen möchten oder es vorziehen, sgRNAs in Embryonen zu testen, bevor sie einen Termin mit einem Mikroinjektionsspezialisten vereinbaren. Hier werden Editierreagenzien vorübergehend als Cas9 / sgRNA-RNPs über Elektroporation (eine Reihe elektrischer Impulse) in Embryonen im pronuklearen Stadium eingebracht, um die Effizienz zu maximieren und gleichzeitig den Mosaikismus zu verringern8. Unter Verwendung einer Embryonen-Genotypisierungsmethode liegen die Bearbeitungsergebnisse in ca. 1 Woche9 vor, wodurch der Bedarf an verschiedenen Mikroinjektionsanwendungen zu deutlich reduzierten Kosten reduziert wird.

Die Wirksamkeit dieser Methode erreicht ihren Höhepunkt im pronukleären Embryostadium, wenn der Embryo noch nicht mit den mütterlichen und väterlichen Vorkernen verschmolzen ist oder in die S-Phase eingetreten ist (Abbildung 2). Superovulation wird verwendet, um die Anzahl der Zygoten zu maximieren, produziert aber sowohl pronukleäre Zygoten als auch unbefruchtete Eier. Gesunde Zygoten können auch vor der Elektroporation vorselektiert werden, um die Gesamteffizienz zu erhöhen. Da andere Elektroporationsprotokolle Zygoten effizient editiert haben, ohne dass ein ähnlicher Schritt 7,10,11,12,13,14,15 erforderlich ist, ist ein optionaler Schritt dieses Protokolls die leichte Erosion der Zona pellucida (ZP). Das ZP ist eine Glykoproteinschicht, die die Bindung von Spermatozoen, die Akrosomenreaktion und die Befruchtung von Embryonen im Pronuklearstadium unterstützt. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass eine sanfte säurebasierte Erosion des ZP eine zuverlässige Cas9-RNP-Elektroporation mit nur marginalen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit bietet.

Wir haben RNP-Lieferraten von bis zu 100% Effizienz durch Elektroporation in Mausstämmen beobachtet, die häufig in der Forschung verwendet werden, wie C57BL / 6J und C57BL / 6N 9,16. Unabhängige Gruppen haben auch auf Elektroporation basierende Verfahren entwickelt, deren Wirkungsgrade größer oder gleich denen der Mikroinjektion 11, 12, 13, 14, 15, 17 sind, wobei die Elektroporationsprotokolle bei Ratten18, 19, Schweinen 20,21, 22 und Kühen 23 gut funktionieren Daher empfehlen wir den Lesern, die Protokolle zu vergleichen, um die Bedingungen zu finden, die ihren Experimentier- und Ausrüstungsanforderungen am besten entsprechen. Das hier beschriebene System verwendet gängige Materialien und Geräte, die nur grundlegende Fähigkeiten zur Manipulation von Embryonen erfordern. Diese Technik ist für eine Reihe von Bearbeitungsstrategien wirksam und macht diese Methode für die Forschungsgemeinschaft allgemein zugänglich.

Das Design idealer Small-Guide-RNAs (sgRNAs) ist für eine effiziente Bearbeitung unerlässlich. Wir empfehlen, zwei bis drei sgRNA-Strategien pro Zielort direkt in Mausembryonen zu screenen, insbesondere wenn die Generierung von Mauslinien gewünscht wird. Einmal entwickelt, werden klonenfreie Methoden wie die In-vitro-Transkription (IVT) zur Herstellung hochwertiger sgRNAs empfohlen3. Die RNPs und sgRNAs werden mit 30-50 prozessierten Embryonen im Pronuklearstadium gemischt und einer Reihe von elektrischen Impulsen ausgesetzt, um zuerst vorübergehend die ZP und die Zellmembran zu permeabilisieren, mit nachfolgenden Impulsen, um die Poren offen zu halten und die RNPs durch die Zygote24 zu elektrophorisieren. Nach der Optimierung fanden wir heraus, dass sechs 3-ms-Impulse bei 30 V für Massenembryonen (~ 50) optimal für die Editiereffektivität und Lebensfähigkeit waren und eine hocheffiziente Cas9 / sgRNA-RNP-Lieferung 9,16,25 ermöglichten. Editierereignisse in einzelnen Mausmorula können mit einer Vielzahl von Validierungsstrategien bestätigt werden, die für die CRISPR-Bearbeitung üblich sind, wie z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), T7-Endonuklease-Verdauung und Sanger-Sequenzierung der interessierenden Region26.

Die aktuelle Methode eignet sich am besten für einfache Bearbeitungsschemata (Abbildung 3), wie z. B. Einfügungen/Löschungen (Indels), Exon-große Löschungen in der Größenordnung von 500-2000 bp und die Bereitstellung von Punktmutationen und kleinen Insertionen wie C- oder N-Terminal-Tags (z. B. FLAG, HA oder V5)9,16,27. Das Potenzial für komplexe Genom-Editierung, wie große Insertionen von Fluoreszenz-Tags oder bedingten Allelen, bleibt ungewiss und steht derzeit im Fokus bevorstehender Verbesserungen.

Diese Methode ist leicht zu beherrschen und kann verwendet werden, um sgRNAs in kultivierten Mausembryonen in 1 Woche9 schnell zu testen (Abbildung 1). In dieser Arbeit wird ein sechsstufiges Protokoll vorgestellt, das 1) sgRNA-Design; 2) sgRNA-Synthese; 3) Superovulation und Paarung; 4) Embryonenkultur, -entnahme und -verarbeitung; 5) RNP-Montage und Elektroporation; 6) Embryokultur und Genotypisierung. Informationen über alle verwendeten Materialien werden zur Verfügung gestellt (Materialtabelle). Als Positivkontrolle wurden Reagenzien zur Bearbeitung des Tyrosinase (Tyr)-Locus 9,16 in die Ergänzungstabelle 1 aufgenommen.

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Protocol

Die gesamte Tierpflege und -verwendung während dieses Protokolls entsprach den Richtlinien des Tierschutzgesetzes, dem ILAR-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien der AVMA für Euthanasie und den Richtlinien und Richtlinien und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pennsylvania. Das Tierpflege- und Verwendungsprotokoll wurde von der University of Pennsylvania IACUC für dieses Projekt überprüft und genehmigt. Bitte holen Sie aus Gründen der Einhaltung und Vorsicht alle erforderlichen Genehmigungen ein, bevor Sie dieses Protokoll ausprobieren.

1. sgRNA und optionales Donor-Oligo-Design

  1. sgRNA-Design
    1. Wählen Sie sgRNA-Kandidaten aus allen weit verbreiteten Online-Algorithmen, wie z. B. Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 oder CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Da jede Plattform einzigartig ist, lesen Sie bitte sorgfältig die Gebrauchsanweisungen, um ideale sgRNAs zu entwerfen. Wählen Sie für In/Del-Experimente zwei bis drei zu testende sgRNAs aus. Für Deletionen werden sgRNAs vorgeschlagen, die die Zielregion flankieren, z. B. zwei sgRNAs stromaufwärts des Ziels und zwei sgRNAs stromabwärts des Ziels.
      HINWEIS: Während verschiedene Online-sgRNA-Algorithmen Off-Targets berücksichtigen, um fehlerhafte sgRNA-Designs zu vermeiden, ist das BLAST-Tool von NCBI hilfreich, um die Qualität der ausgewählten sgRNA-Sequenzen zu bestätigen.
    2. 19-20 Nukleotide (nt), die aus dem vorherigen Schritt (1.1.1) bestimmt wurden, werden in die variable Region des sgRNA-Oligos (Ergänzungstabelle 1) eingefügt und synthetisierte sgRNA als kundenspezifische DNA-Oligos gekauft.
      HINWEIS: Eine Seitenbereinigung ist nicht erforderlich.
  2. (Optional) Donor-Oligo-Design für Homologie-gerichtete Reparatur (HDR)-vermitteltes Knock-in.
    1. Entwerfen Sie das geeignete einzelsträngige Oligodeoxynukleotid (ssODN) auf der Grundlage des gewünschten experimentellen Ergebnisses (präzise Punktmutation, loxP-Insertion, Insertion kleiner Tags usw.), wobei die Gesamtlänge auf 100-200 nt mit Homologiearmen von 50 nt oder mehr gehalten wird, die den zentralen Bereich flankieren.
    2. Um eine höhere Knock-in-Effizienz zu gewährleisten, entwerfen Sie die sgRNA so, dass sie komplementär zum ssODN30 ist, und ersetzen Sie die PAM-Sequenz (Protospacer adjacent motif) durch eine stille Mutation, um ein wiederholtes Schneiden durch das Cas9-Enzym zu verhindern.
    3. Bestellen Sie ssODN mit der benutzerdefinierten Oligo-Option.

2. sgRNA-Synthese

  1. Template-Generierung für die In-vitro-Transkription (IVT)
    1. Um die DNA-Vorlage für sgRNA IVT durch PCR zu generieren, bereiten Sie eine IVT-Reaktion in einem PCR-Streifenröhrchen vor, das RNAse-frei ist. (siehe Ergänzungstabelle 2).
    2. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen für den Thermocycler:
      95 °C für 2 min; 30 Zyklen von 95 °C für 2 min, 57 °C für 10 s und 72 °C für 10 s; dann 72 °C für 2 min
    3. Um den Erfolg der sgRNA-DNA-Template-PCR-Reaktion zu überprüfen, wurden 5 μL des Produkts mit 1 μL 6x Beladungsfarbstoff auf einem 2% (Gew./Vol) Agarose-Gel kombiniert.
      HINWEIS: Die erwartete Produktgröße beträgt 127 bp. Die verbleibende PCR-Reaktion kann bis zu 5 Monate bei −20 °C gelagert werden.
  2. In-vitro-Transkription (IVT) von sgRNA
    1. Um die sgRNA zu erzeugen, bereiten Sie das Reaktionsgemisch (T7 IVT gemäß Herstelleranweisung) in einem PCR-Röhrchen vor und mischen Sie die Reagenzien.
      HINWEIS: Siehe Ergänzungstabelle 3 für das Beispiel des Reaktionsaufbaus. Die IVT-Reaktion ist RNase-Kontaminationssensitivität; Bemühen Sie sich daher nach Kräften, eine RNase-freie Umgebung bereitzustellen.
    2. Damit die Reaktion eingeleitet und fortgesetzt werden kann, wird das IVT-Reaktionsgemisch für >18 h bei 37 °C entweder in einem Thermocycler oder einem Wärmeblock inkubiert.
    3. Um die ursprüngliche DNA-Vorlage abzubauen (Schritt 2.1.3), wird 1 μL DNase I (2 Einheiten pro Reaktion) eingeführt und die Reaktion für 20 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
    4. Um die RNA-Bindung an die magnetischen Reinigungskügelchen zu fördern, kombinieren Sie 129 μL 100% Ethanol in der Reaktion, was jetzt 150 μL ist.
    5. Um die Reinigungskügelchen, die dazu neigen, sich während der Lagerung abzusetzen, zu resuspendieren, wirbeln Sie das Aliquot für mindestens 10 s.
    6. Um die sgRNAs zu reinigen, fügen Sie 100 μL der resuspendierten Kügelchen (Schritt 2.2.5) zur IVT-Reaktion (Schritt 2.2.4) hinzu und mischen Sie vorsichtig durch 10-faches Pipettieren auf und ab.
    7. Um eine Bindung zu ermöglichen, lassen Sie die Mischung 5 min bei RT ruhen.
    8. Um die sgRNA aus den nicht inkorporierten Reaktionsprodukten zu isolieren, legen Sie die Reaktion für 5 min bei RT auf die magnetischen Ständer und warten Sie, bis sich ein kleines Pellet bildet.
    9. Um die sgRNAs zu waschen, entsorgen Sie zuerst vorsichtig den Überstand und fügen Sie dann 200 μL 80% Ethanol vom Pellet weg.
      HINWEIS: Während des 80%igen (vol/vol) Ethanol-Waschschritts ist es wichtig, das Pellet nicht durch Pipettieren zu stören, da dies die sgRNA-Konzentrationen erheblich reduziert. Stattdessen pipettieren Sie das 80% ige Ethanol vorsichtig, so dass das Pellet eingetaucht ist, und entfernen Sie das Volumen vorsichtig mit einer Pipette.
    10. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt (Schritt 2.2.9) und trocknen Sie das Pellet nicht länger als 5-6 Minuten an der Luft, da die sgRNA sonst dauerhaft mit den Kügelchen verbunden ist.
    11. Eluieren Sie die sgRNA mit 20 μL nukleasefreiem Wasser, indem Sie das Pellet 10x pipettieren, 2 min bei (RT) inkubieren und dann wieder auf den Magnetständer legen, um die Kügelchen von der jetzt gereinigten sgRNA zu trennen.
    12. Um die Qualität und Quantität der sgRNA zu bewerten, verwenden Sie ein Instrument wie ein Spektralphotometer oder einen Bioanalysator. Alternativ können Sie auf einem 2%igen Agarose-Gel 2 μL sgRNAs laufen lassen, ähnlich wie in Schritt 2.1.3.
      HINWEIS: Die Qualität wird durch ein einzelnes durchsichtiges Band bestätigt. Der Rest der sgRNA kann entweder sofort verwendet oder bei -80 °C gelagert werden.

3. Superovulation

  1. Um genügend Embryonen zur Verfügung zu stellen, um jedes sgRNA-Design zu testen, superovulieren Sie zwei bis drei C57BL / 6J-Weibchen, die zwischen 3 und 5 Wochen alt sind, wie zuvor beschrieben9. Es wird empfohlen, 20-30 Embryonen pro sgRNA zu elektroporieren, um genügend Ergebnisse zu erzielen, um die Wirksamkeit zu bestätigen.
    HINWEIS: Wenn die Befruchtung erfolgreich ist, erwarten Sie 10-20 Embryonen pro Paarung.
  2. Um den Eisprung zu induzieren, befolgen Sie diesen Hormoninjektionsplan:
    1. Tag 1: Verabreichung von 5 I.E. Serumgonadotropin (PMSG) (100 μl) durch eine intraperitoneale (IP) Injektion mit einer 26 G-Spritze an 3-5 Wochen alte weibliche Mäuse.
    2. Tag 3: Nach 46-48 h PMSG-Injektion injizieren Sie 5 IE humanes Choriongonadotropin (hCG) (100 μL) durch eine IP-Injektion, um den Eisprung zu induzieren.
    3. Um die Zucht einzurichten, paaren Sie die Weibchen 1:1 mit einem Männchen aus zuverlässiger Zucht direkt nach der hCG-Injektion.
      HINWEIS: Um zu verhindern, dass sich die Hormone abbauen und ihre Aktivität verlieren, führen Sie Injektionen unter 30 Minuten Auftauen durch.

4. Entnahme und Verarbeitung von Embryonen

  1. Entnahme von Embryonen
    1. Um Weibchen einzuschläfern und das notwendige Material zu entnehmen, wie zuvorbeschrieben 31, stellen Sie sicher, dass Sie zuerst die geeignete Methode in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien bestätigen. Verwenden Sie beispielsweise CO2 -Erstickung, Gebärmutterhalsluxation und / oder andere zugelassene Methoden.
      HINWEIS: Normalerweise zeigen >75% der hormonstimulierten Weibchen Kopulationspfropfen, was auf eine erfolgreiche Paarung hinweist.
    2. Um zu verhindern, dass Haare die Gewebeentnahme erschweren, legen Sie die eingeschläferten Weibchen auf den Rücken und sprühen Sie 70% (vol / vol) Ethanol auf die Bauchregion, die chirurgisch geöffnet werden soll.
      HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt wird empfohlen, die chirurgischen Schritte in einer belüfteten Haube durchzuführen, um eine aseptische Umgebung aufrechtzuerhalten und das Kontaminationspotenzial zu reduzieren.
    3. Um die Bauchhöhle zu öffnen und die Eileiter zu entfernen, schneiden Sie die Haut- / Haarschicht (subkutan) mit einer chirurgischen Schere und lokalisieren Sie die Eierstöcke (Abbildung 4), die sich in der Nähe der Niere befinden und einen Teil eines Fettpolsters teilen. Die Eileiter befinden sich proximal zu den Eierstöcken (Abbildung 4). Beide Eileiter werden operativ aus dem Weibchen entfernt und in einzelne 50 μl Tröpfchen M2+BSA (4 mg/ml BSA) gegeben (Abbildung 5A).
      ANMERKUNG: Detaillierte Anweisungen für diesen Abschnitt des Verfahrens können visuell31 angezeigt oder schrittweise9 unter Verwendung zuvor veröffentlichter Protokolle befolgt werden.
    4. Um die Cumulus-Eizell-Komplexe (CoCs), die Eizellen enthalten, freizusetzen (Abbildung 4), verwenden Sie eine Dissektionszange, um die Ampulle des Eileiters zu schneiden, während Sie durch ein Stereomikroskop schauen.
    5. Um die Menge an Ablagerungen (Blut, Fett, Gewebe) zu reduzieren, übertragen und kombinieren Sie jedes CoC mit einer Handpipette von 20-30 μL auf ein einzelnes 50 μL M2 + BSA-Medium, um die Verschleppung von Ablagerungen zu vermeiden.
  2. Entfernung von Kumuluszellen
    1. Um mit der Entfernung von Kumuluszellen aus den Zygoten zu beginnen (Abbildung 4), übertragen Sie CoCs mit so wenig zusätzlichem Medium wie möglich in ein Tröpfchen von 100 μL M2+Hyaluronidase (Abbildung 5B) und mischen Sie die CoCs vorsichtig durch Pipettieren, bis die Embryonen sichtbar von den viel kleineren Cumuluszellen getrennt sind. Achten Sie darauf, die Exposition der Embryonen gegenüber M2 + Hyaluronidase auf ein Minimum zu beschränken, da dies die Lebensfähigkeit beeinträchtigen kann.
      HINWEIS: Man kann entweder vorheizen (37 °C) oder zusätzliche 50 μL M2+Hyaluronidase hinzufügen, wenn sich die Embryonen nicht innerhalb von 2 Minuten von den Kumuluszellen trennen.
    2. Um Hyaluronidase zu verdünnen und lose Kumuluszellen von den Zygoten zu entfernen, verwenden Sie eine mundbetriebene Pipette, um die Zygoten zu einem frischen 50 μL M2 + BSA-Tröpfchen zu bewegen.
      HINWEIS: Die meisten Schritte, die über diesen Punkt hinausgehen, erfordern die Verwendung einer mundbetriebenen Pipette, sofern nicht anders angegeben. Während das Risiko einer Kontamination durch den Benutzer gering ist, wird die Verwendung eines Inline-Luftfilters empfohlen, um eine aseptische Umgebung aufrechtzuerhalten. Bitte beachten Sie die zuvor beschriebenen Methoden zur Herstellung und Verwendung dieses Gerätes 9,31.
    3. Führen Sie die Embryonen mit einer Mundpipette durch mindestens vier bis fünf weitere 50 μL M2+BSA-Tröpfchen, um die Anzahl der Kumuluszellen zu reduzieren.
  3. (OPTIONAL) Ausdünnung der Zona pellucida mit saurer Tyrode (AT)-Lösung.
    1. Um die Zona pellucida des Embryos zu erodieren und zusätzliche physische Hindernisse für die Reagenzienabgabe zu verringern, werden die Embryonen in einen vorgewärmten (37 °C) 100 μL Tropfen AT-Lösung auf einer 60 mm dicken Platte übertragen (Abbildung 5C). Beobachten Sie die Zygoten kontinuierlich mit einem Stereomikroskop, bis etwa 30% der Zona pellucida erodiert sind9. Die AT-Gesamtexposition muss 60-90 s betragen. Eine längere Exposition gegenüber AT kann die Zona pellucida vollständig auflösen und die Lebensfähigkeit des Embryos gefährden.
      ANMERKUNG: Detaillierte Anweisungen und Abbildungen zu diesem Abschnitt des Verfahrens finden Sie in den zuvor veröffentlichten Methoden 9,16.
    2. Um den AT zu verdünnen, verwenden Sie eine Mundpipette, um die Embryonen durch mindestens vier 50 μL Tröpfchen M2 + BSA zu führen.
    3. Um festzustellen, ob eine angemessene Anzahl von Embryonen verarbeitet wurde, verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Embryonen zu zählen. Abhängig von der Anzahl der verwendeten weiblichen Mäuse kann man mit etwa 10-20 lebensfähigen Zygoten pro Weibchen rechnen.
      HINWEIS: In diesem Stadium sollten die Embryonen relativ frei von Ablagerungen sein, die die Beurteilung von Quantität und Qualität verhindern würden. Wenn zum Beispiel fünf Weibchen verwendet werden, liegt die erwartete Zygotenzahl wahrscheinlich zwischen 50 und 100, und ein mechanischer Zellzähler wäre angemessen, um die Embryonen zu verfolgen. Es ist üblich, etwa 10%-20% der Embryonen zu verlieren, weil sie nicht befruchtet werden oder Eizellen von geringer Qualität ovulieren. Im nächsten Schritt werden die Embryonen in 50 μL M2+BSA für nicht mehr als 30 min in einem Inkubator kurzzeitig gelagert.

5. RNP-Montage und Elektroporation

  1. RNP-Baugruppe
    1. Um den RNP-Komplex zusammenzubauen, verwenden Sie die beigefügten Beispieltabellen, um die geeigneten Reaktionsgemische basierend auf der gewünschten Bearbeitungsstrategie im RNP-Puffer zu kombinieren (100 mM HEPES pH 7,5, 750 mM KCl, 5 mMMgCl2, 50% Glycerin und 100 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid [TCEP] in nukleasefreiem Wasser)
      HINWEIS: TCEP ist ein geeignetes Reduktionsmittel, hat aber eine kurze Halbwertszeit in wässrigen Lösungen. Fügen Sie daher TCEP kurz vor der komplexen RNP-Baugruppe hinzu.
      1. Für nicht-homologe End Join (NHEJ)-vermittelte Indels siehe Ergänzungstabelle 4.
      2. Informationen zur HDR-vermittelten Bearbeitung (Homology directed repair) finden Sie in der Zusatztabelle 5.
      3. Informationen zu technischen Deletionen mit gepaarten sgRNAs finden Sie in der Ergänzungstabelle 6.
        1. Unabhängig von der Strategie kombinieren Sie die gewünschten Reagenzien bei RT in einem PCR-Röhrchen.
        2. Um die Bildung des RNP-Komplexes zu ermöglichen, wird das Gemisch 10 min bei 37 °C inkubiert.
          HINWEIS: Der RNP-Komplex kann bei RT bis zu 1 Stunde gelagert werden.
  2. Elektroporation
    1. Um die BSA vor der Elektroporation zu verdünnen, passieren Sie die Embryonen durch mindestens zwei Tröpfchen von 50 μL reduziertem Serummedium.
      HINWEIS: BSA erhöht den Widerstand während der Elektroporation und kann die Zygoten schädigen.
    2. Um die Zygoten (Schritt 4.3.2) mit dem RNP-Komplex (Schritt 5.1.1.2) für die Elektroporation vorzubereiten und zu mischen, pipettieren Sie 25-30 Embryonen in einen 10-μl-Tropfen reduzierter Serummedien und fügen Sie dann mit einer Handpipette 10 μl des RNP-Komplexes hinzu (Schritt 5.1.1.2).
    3. Um das viskose Glycerin aus dem RNP-Komplex zu verdünnen und die Probe zu homogenisieren, mischen Sie durch Pipettieren 10x oder bis die Mischung keine Anzeichen von Viskosität (Wirbelmuster) mehr mit einem Stereomikroskop aufweist.
    4. Um die Probe für das Einführen in den Elektroporator vorzubereiten, pipettieren Sie diese 20 μL Embryo + RNP-Mischung in eine 0,1 cm große Elektroporationsküvette, wobei Blasen vermieden werden.
    5. Um die Editierreagenzien in die Zygote zu bringen, elektroporieren Sie die Embryonen mit einem Rechteckwellenprotokoll unter folgenden Bedingungen: 30 V, 4-6 Impulse, 3 ms Pulslänge und 100 Pulsintervalle.
    6. Um Zygoten aus der Küvette zu entnehmen, verwenden Sie eine Handpipette, um 50 μL KSOM + BSA (1 mg / ml BSA) in die Oberseite der Küvette zu geben, um die Embryonen zu spülen, die sich möglicherweise auf dem Boden abgesetzt haben. Pipettieren Sie diese Mischung vorsichtig heraus und auf eine 60-mm-Platte.
    7. Wiederholen Sie Schritt 5.2.6 mindestens 2x-3x und kombinieren Sie jede Spülung auf einer 60-mm-Platte, bis die meisten Embryonen geborgen sind.
      HINWEIS: Eine typische Genesung beträgt >90% der ursprünglich geladenen Embryonen. Um das Überleben des Embryos zu gewährleisten, testen Sie den Inkubator und überprüfen Sie das Verfallsdatum aller Reagenzien. Embryonen sind anfällig für nicht ideale Kulturbedingungen wie Temperatur, CO2 -Gehalt, Feuchtigkeit und pH-Wert.

6. Embryonenkultur und Genotypisierung

  1. Embryonenkultur
    1. Um Zygoten bis zu einem gewünschten Stadium zu kultivieren, verwenden Sie eine Mundpipette, um 20-30 Zygoten in einen Tropfen KSOM+BSA in einer voräquilibrierten Kulturplatte zu überführen und die Embryonen zum Tröpfchen zu bewegen (Abbildung 5D). Inkubieren Sie die Platte über Nacht in 5%CO2, bei 37 °C, bei 95% Luftfeuchtigkeit.
      ANMERKUNG: Vor dem Gleichgewicht, indem eine vorbereitete 35-mm-Kulturplatte entweder am Tag vor oder mindestens 4 h vor der Inkubation in einen Inkubator gelegt wird (Abbildung 5D).
    2. Um ideale Wachstumsbedingungen zu fördern, werden nur zweizellige Embryonen am nächsten Tag mit einem Stereomikroskop auf einen frischen Tropfen KSOM+BSA-Mischung übertragen und in den Inkubator zurückgebracht. Achten Sie darauf, die toten oder unbefruchteten Embryonen zu belassen oder zu entsorgen.
      HINWEIS: Embryonen im Pronuklearstadium wachsen typischerweise nach 72 Stunden Kultur zu Morulae und nach 84 Stunden zu Blastozysten heran.
  2. Genotypisierung
    1. Um die Bestandteile des Mediums zu verdünnen, die eine PCR-Reaktion stören könnten, waschen Sie die Morula-/Blastozysten-Embryonen mit einer Mundpipette, indem Sie zwei Tropfen DPBS passieren.
    2. Um einzelne Embryonen für die Lyse zu laden, werden einzelne Embryonen in eine Vertiefung eines 8-Well-PCR-Streifens übertragen, indem eine Pipette auf 1 μL eingestellt wird, und dann 10 μL Lysepuffer hinzugefügt (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8,5, 2,5 mM MgCl 2, 0,1 mg/ml Gelatine, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20,0,2 mg/ml Proteinase K in nukleasefreiemH2O).
      HINWEIS: Fügen Sie die Proteinase K kurz vor der Herstellung des Lysepuffers hinzu.
    3. Um die Embryonen zu lysieren, programmieren Sie einen Thermocycler für 4 h auf 55 °C und inaktivieren Sie dann die Proteinase K mit einer 10-minütigen Inkubation bei 95 °C.
      HINWEIS: Versuchen Sie insbesondere für Erstbenutzer ein Bearbeitungsexperiment an den Tyr-Loci . Dieser Arbeitsablauf wurde optimiert und kann als Positivkontrolle dienen. Falls erforderlich, lagern Sie die Embryolysate bei 4 °C für 2-3 Tage oder bis zu 2 Wochen vor der PCR-Analyse im Gefrierschrank. Verhindern Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
    4. Um die Chancen auf eine erfolgreiche Genotypisierungsanalyse zu erhöhen, führen Sie eine verschachtelte PCR-Strategie durch, indem Sie etwas längere DNA-Fragmente, die die Zielstelle flankieren, sowie Regionen, die zur Amplifikation eines präziseren DNA-Fragments verwendet werden, amplifizieren. Befolgen Sie die Bedingungen in der Zusatztabelle 7.
    5. Befolgen Sie die unten genannten Bedingungen des Thermocyclers:
      95 °C für 2 min
      30+ Zyklen: 95 °C für 2 Minuten, 60 °C für 10 s und 72 °C für 10 s
      72 °C für 2 min
    6. Um die zweite Stufe einer verschachtelten PCR-Strategie vorzubereiten, führen Sie eine 1:10-Verdünnung des ersten PCR-Produkts durch (Schritt 6.2.5) und laden Sie 2 μL davon in die nächste PCR-Reaktion (mit Primern, die sich innerhalb des vorherigen Amplikons befinden).
      HINWEIS: Die erste PCR-Reaktion muss verdünnt werden, um die Verschleppung von flankierenden Primern in der zweiten PCR-Reaktion zu reduzieren. Bereiten Sie die verschachtelte PCR vor, indem Sie die Schritte in der Ergänzungstabelle 8 ausführen.
    7. Platzieren Sie die PCR-Reaktion in einem Thermocycler unter den folgenden Zyklusbedingungen:
      95 °C für 2 min
      30 Zyklen: 95 °C für 2 min, 60 °C für 10 s und 72 °C für 10 s
      72 °C für 2 min
      HINWEIS: Normalerweise sind >90% der PCR-Reaktionen erfolgreich, wenn die Amplikongröße 500 bp oder weniger beträgt.
    8. (Optionale Steuerung) Bei NHEJ-vermittelten in/del-Mutationen mit Tyr als Positivkontrolle werden 10 μL der verschachtelten PCR-Produkte aus Schritt 6.2.7 durch Inkubation bei 37 °C für 4 h mit 10 U HinfI in einer 20 μL-Reaktion verdaut (siehe Zusatztabelle 9). Führen Sie auf einem 2% Agarose-Gel das verdaute Produkt aus, um die Bearbeitung zu bewerten, und verwenden Sie ein nicht verdautes PCR-Produkt als Belastungskontrolle. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 135 V laufen.
      HINWEIS: Die Verwendung von HinfI als geeignetes Restriktionsenzym wurde aufgrund einer günstig gelegenen HinfI-Stelle innerhalb der sgRNA-Zielregion ausgewählt, von der erwartet wird, dass sie nach einer erfolgreichen NHEJ-Editierung abgetragen wird. Ein detailliertes Verfahren und die Ergebnisse wurden bereits 9,16 beschrieben.
    9. (Optionale Steuerung) Bei HDR-vermittelten Mutationen mit Tyr als Positivkontrolle werden 10 μL der verschachtelten PCR-Produkte aus Schritt 6.2.7 durch Inkubation bei 37 °C für 4 h mit 10 E EcoRI in einer 20 μL-Reaktion verdaut (siehe Zusatztabelle 10). Führen Sie auf einem 2% Agarose-Gel das verdaute Produkt aus, um die Bearbeitung zu bewerten, und verwenden Sie ein nicht verdautes PCR-Produkt als Belastungskontrolle. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 135 V laufen.
      HINWEIS: Die Wahl von EcoRI als diagnostisches Restriktionsenzym nutzt die ursprüngliche Sequenz in der sgRNA-Zielregion, wo nach erfolgreichem HDR die natürlich vorkommende HinfI-Stelle durch eine EcoRI-Stelle ersetzt wird und eine Frameshift-Mutation erzwungen wird, die das Tyr-Gen stört. Führen Sie für die HDR-Analyse sowohl NHEJ- (Schritt 6.2.8) als auch HDR-Analysen (Schritt 6.2.9) für jede Probe durch, da beide Ergebnisse auftreten können und bei der Bestimmung des Mosaiks helfen können. Ein detailliertes Verfahren und die Ergebnisse wurden bereits 9,16 beschrieben.

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Representative Results

Diese Methode erzeugt mehr als 100 μg sgRNA (20 μL bei >6.000 ng/L Konzentration) für eine effiziente Cas9/sgRNA-RNP-Assemblierung. Die hier beschriebene routinemäßige Superovulationsmethode produziert typischerweise 10-20 lebensfähige Embryonen pro verstopftem Weibchen. Aufgrund von Handhabungsfehlern und typischen Verlusten, die mit der Manipulation von Embryonen verbunden sind, sind voraussichtlich 80% der Embryonen befruchtet, lebensfähig und in ausgezeichnetem Zustand nach der Elektroporation. Um den Forschern bei der Durchführung eines erfolgreichen Experiments zu helfen, haben wir eine Beispielstrategie zur Verfügung gestellt, um den Tyr-Locus der Maus als Positivkontrolle (Abbildung 6) anzugreifen, einschließlich Oligo-Designs (Abbildung 6A, Ergänzungstabelle 1) und Genotypisierungsstrategien für NHEJ- und HDR-Ereignisse (Abbildung 6B) (Schritt 6.2). Detaillierte Beispiele für experimentelle Erfolge und Ergebnisse sindverfügbar 9,16.

In einem früheren Versuch, dieses Protokoll mit der Mikroinjektion zu vergleichen, waren insgesamt über 30 verschiedene Bearbeitungsversuche mit sieben verschiedenen Labors zur Generierung von Mausmodellen erfolgreich 9,16. Darüber hinaus wurde diese Methode verwendet, um das erste essentielle Retrotransposon in der Säugetierentwicklung zu untersuchen und darüberzu berichten 27. Bei einer einfachen Strategie wie der Verabreichung einer einzelnen sgRNA betrug die Abgabe von RNPs bis zu 100% in den C57BL/6J- und C57BL/6N-Mausstämmen, wobei die In/Del-Bildung bei 50-100% und der kleine oligobasierte Ersatz zwischen 14% und 63% lag9,16 (Tabelle 1). Bei der Entwicklung genomischer Deletionen kann die Editiereffektivität zwischen 3% und 100% variieren, wobei Faktoren wie die genomische Lokalisation, das sgRNA-Design und die Größe der Deletion eine Rolle spielen (Tabelle 2). Zum Beispiel sind Löschungen, die kleiner als 1.000 bp sind, erfolgreicher als solche, die größer als 1.000 bp 9,16 sind.

Bei der Verwendung von 60 Embryonen für die Elektroporation übertrifft dieses Protokoll die Mikroinjektion in Bezug auf die Bearbeitungseffektivität, was zu 3-4 Gründertieren im Vergleich zu einem Gründertier aus der Mikroinjektion9 führt. Bei Gen-Knockout-Experimenten im C57BL/6N-Mäusestamm mit identischer sgRNA übertraf diese Methode die Mikroinjektion und ergab durchschnittlich vier Gründertiere9 (Tabelle 2). Für kleine Einfügungen, wie z. B. V5- oder HA-Tagging, wurden ssODNs bis zu 162 nt erfolgreich getestet, und derzeit wird eine Skalierung auf 1000-2000 nt angestrebt. Der Erfolg dieser Experimente hängt weitgehend von der Wirksamkeit der sgRNA ab, die für HDR-Ergebnisse verwendet wird, um robust zu sein. Fast alle HDR-Ergebnisse sind Mosaike, aber zwischen 31% und 64% der Embryonen zeigen Anzeichen von Insertionen 9,16.

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über CRISPR-EZ. Eine grafische Übersicht über den Workflow. Sobald eine Strategie und ein Design erstellt wurden, können bearbeitete Embryonen in ca. 1 Woche generiert und getestet werden. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. und Chen et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Ideales Timing für die Durchführung des Eingriffs. Das Diagramm zeigt relevante Merkmale und Zeitpunkte während der ersten Zellteilung nach der Befruchtung. Um diesen Ansatz durchzuführen, erhalten die Forscher einige sichtbare Hinweise, wie morphologische Veränderungen, Zellzykluszeitschätzungen und chemische Marker, die häufig vor der ersten Spaltung beobachtet werden. Da der genaue Zeitpunkt der Insemination und Befruchtung unbekannt ist, wäre es eine sinnvolle Empfehlung, Stunde 0 als Mitternacht zu betrachten. Bevor die Zygote in die S-Phase eintritt, ist der ideale Zeitpunkt, um Bearbeitungsmaschinen für NHEJ oder HDR zu liefern, was bedeutet, dass dieses Protokoll zwischen 7 und 11 Uhr morgens ausgeführt wird. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Erfolg der Bearbeitungsstrategien. Einfache Strategien, wie z.B. eine einzelne sgRNA, führen zu einer in/del via NHEJ-Reparatur oder zu einer Präzisionsmutation, wenn sie mit einer ssODN-Vorlage durch HDR kombiniert werden. Die NHEJ-Reparatur kann auch für Deletionen mit mehreren sgRNAs verwendet werden. Generell gilt: Je einfacher die Strategie, desto effektiver ist CRISPR-EZ ohne weitere Optimierung. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Lokalisierung des Eileiters und der Ampulle. Nach der chirurgischen Isolierung des Fortpflanzungsgewebes sollte man die Region sichern, indem man mit einer Pinzette sanften Druck auf das Fettpolster ausübt. Das Fettpolster ist eine relativ sichere Region, die manipuliert werden kann, um die Eierstöcke / den Eileiter nicht zu schädigen. Der Bereich im gestrichelten Quadrat sollte entfernt und zur weiteren Sektion in einen Tropfen M2 gelegt werden. Ein Cartoon-Diagramm zeigt den interessierenden Bereich mit den relevanten anatomischen Strukturen. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Vorgeschlagene Verarbeitung und Einrichtung der Kulturplatte. Schematische Darstellungen verschiedener Plattenaufbauten, um den Forschern bei der Durchführung von Embryonenverarbeitung und -kultur zu helfen. (A) Typische M2+BSA-Waschplatte. (B) M2+Hyaluronidase-Platte zur Kumuluszellentfernung. (C) Optionale AT-Lösungsplatte für die Zona-Ausdünnung. (D) KSOM+BSA-Platte für die Embryokultur mit Mineralölüberzug, die zur Aufrechterhaltung von pH-Wert, Feuchtigkeit und Temperatur erforderlich ist. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Genotypisierungsbeispiel für NHEJ- und HDR-Ergebnisse. (A) Ein Cartoon-Diagramm der Region, die das Tyr-Gen im Mausgenom umgibt. Im Folgenden finden Sie Details der unbearbeiteten (WT) Sequenz, in der eine natürlich vorkommende HinfI-Restriktionsstelle gefunden wird, die sich innerhalb der Zielerkennungsstelle der sgRNA befindet (roter Text). Darunter ist eines von vielen möglichen Ergebnissen nach erfolgreichem CRISPR/Cas9-Targeting, bei dem ein "in/del" gebildet wird. Die genaue Art dieser Bearbeitung ist schwer vorherzusagen, wird aber mit ziemlicher Sicherheit die HinfI-Seite stören. Weiter unten befindet sich die Spender-Oligo-Sequenz, die zwei Basenpaare verändert, um die HinfI-Stelle in eine EcoRI-Erkennungsstelle zu verwandeln. (B) Repräsentative Ergebnisse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) nach der Bearbeitung. Es werden Beispiele für die Bearbeitung von NHEJ (oben) und HDR (unten) gezeigt. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Phänotyp und Lebensfähigkeit von Tyr-editierten Zygoten und Mäusen. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung von Modzelewski et al.9 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Ergebnisse von CRISPR-EZ- und Mikroinjektions-Deletionsexperimenten. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung von Modzelewski et al.9 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 1: Liste der Oligos und Spender-ssODN. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung von Modzelewski et al.9 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 2: DNA-Template für den sgRNA-Reaktionsaufbau. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung von Modzelewski et al.9 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 3: In-vitro-Transkriptionsaufbau. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 4: RNP-Komplexaufbau für die NHEJ-Bildung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 5: RNP-Komplexaufbau für die HDR-Formation. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung von Modzelewski et al.9 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 6: RNP-Komplexaufbau zum Löschen. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 7: Genotypisierungs-PCR-Setup. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 8: Nested Genotyping PCR Setup. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Modzelewski et al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 9: HinfI-Restriktions-Digest-Setup. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle 10: EcoRi-Restriktions-Digest-Setup. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Hier wird eine einfache und hocheffiziente Maus-Genom-Editing-Technologie vorgestellt. Die Elektroporation kann verwendet werden, um modifizierte Embryonen in 1-2 Wochen zu erzeugen (Abbildung 1) und kann innerhalb von 6 Wochen editierte Mäuse produzieren9. Im Vergleich zu zeitgleich entwickelten elektroporationsbasierten Protokollen, die RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32 liefern, ist die hier beschriebene Methode konzeptionell ähnlich und bietet Wirkungsgrade im gleichen Bereich, mit nur geringen Unterschieden in der Reagenzienentwicklung und den Parametern. Daher empfehlen wir den Lesern, basierend auf den Bedürfnissen und dem Zugang zu Geräten zu vergleichen und zu kontrastieren. Wie der Name schon sagt, wurde dieses Protokoll mit Blick auf "das durchschnittliche Mauslabor" entwickelt, mit nur gängigen Methoden (IVT, PCR, Gelelektrophorese), Reagenzien (Standard-Embryonen- und Gewebekultur-Verbrauchsmaterial) oder Geräten (Elektroporator und Küvetten, die üblicherweise für die bakterielle Transfektion verwendet werden), die wahrscheinlich für die meisten Labore zugänglich sind, die daran interessiert und in der Lage sind, Embryonen zu sammeln (oder indem sie freundlich benachbarte Labore fragen). Forscher auf Doktorandenebene mit grundlegenden Fähigkeiten im Umgang mit Embryonen können sgRNAs auf Effizienz testen oder datenproduzierende Experimente mehrmals innerhalb des Zeitrahmens der Präimplantationsentwicklung durchführen, ohne dass sie mit einer Kerneinrichtung planen müssen. Wenn das gewünschte Ziel jedoch darin besteht, Tiermodelle zu erzeugen, ohne dass eine Mikroinjektion oder Embryonenmanipulation erforderlich ist, stehen weniger intrusive Methoden zur Verfügung10,32.

Viele Faktoren, die sich auf die Effizienz von Cas9 auswirken, werden aktiv erforscht, wie z.B. die Spezifität eines genomischen Ziels, sgRNA-Sequenzparameter, Genomzugänglichkeit und -topologie und insbesondere der Zelltyp. Daher ist das Design und Testen von sgRNAs entscheidend für den Erfolg. Dieses Protokoll und andere unabhängig entwickelte Elektroporationsmethoden wurden optimiert, um Cas9-Protein/sgRNA-RNPs schnell und vorübergehend in Embryonen im Zygotenstadium zu liefern, wodurch die Effizienz gesteigert und gleichzeitig der Mosaikismus aufgrund der Abgabe in einem frühen Entwicklungsstadium und der kurzen Halbwertszeit des RNP 7,9,10,11,12,13,14,15 minimiert wird. 16,33,34.

Für die gebräuchlichsten Genom-Editing-Strategien und verschiedene Stämme von Mäusen kann diese Methode Mikroinjektionen in Bezug auf Kosten, Effizienz, kleine Insertionen, In/Del-Mutationen, Exon-Deletionen, Insertionen und Punktmutationen übertreffen9. Mit dem aktuellen Protokoll ist diese Methode ideal für die Erzeugung von In/Del-Mutationen und -Deletionen bis zu 2,6 kb, was viel länger ist als die typische Länge eines proteinkodierenden Exons von 170 bp35. Lange Löschungen sind weniger effizient. Diese Einschränkung gilt jedoch nicht nur für dieses Protokoll. Da die Cas9-vermittelte Bearbeitung verbessert wird und neue Cas-Proteinvarianten entwickelt werden, ermöglicht der modulare Charakter dieser Methode, dass diese Verbesserungen die Fähigkeiten unseres Protokolls direkt erweitern.

Während diese Methode eine Vielzahl einfacher Bearbeitungen durchführen kann, wird ihr Potenzial für größere und komplexere Strategien, wie das Einfügen bedingter Allele oder fluoreszierender Tags, derzeit in unserem Labor getestet. Längere ssODNs könnten einen praktikablen Ansatz für eine komplizierte Genom-Editierung bieten und haben sich als erfolgreich bei der Mikroinjektion der Embryo-Editierung erwiesen36; Längere ssODNs sind jedoch teuer in der Synthese und müssen noch ausgiebig mit Elektroporationgetestet werden 37. Die Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAV) zur Einführung von bis zu 3,3 kb Spendersequenzen hat sich ebenfalls als erfolgreich erwiesen, ist aber für die meisten Labore möglicherweise nicht zugänglich25. Vorläufig empfehlen wir die Standard-Genom-Editierung und Mikroinjektion von embryonalen Stammzellen für das komplexe Genom-Engineering von Mäusen.

Die Besorgnis über Cas9-Off-Target-Effekte bleibt 8,38,39. Manipulierte Cas9-Variationen könnten die Zielspezifität erhöhen, obwohl dies in RNP-Studien zur Elektroporation von Embryonen nicht vollständig untersucht wurde. CRISPR-EZ könnte eine nützliche Methode sein, um Verbindungsmutationsmodelle zu erstellen, um komplexe Genetik zu erforschen. Während Mikroinjektionen das gleichzeitige Editieren mehrerer Loci ermöglicht haben40, machen Elektroporationsmethoden wie die hier beschriebene dies bequemer und effektiver.

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Disclosures

Es gibt keine relevanten Finanzerklärungen der Autoren.

Acknowledgments

A.J.M. entwickelte das ursprüngliche Konzept, das zur Entwicklung von CRISPR-EZ führte, und produzierte die Zahlen. C.K.D. hat die internen und veröffentlichten Protokolle für dieses aktuelle Manuskript zusammengestellt und angepasst. A.J.M. wird von NIH (R00HD096108) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

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Developmental Biology Heft 190
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