Et nødvendigt skridt i udvikling af anticancer aptamer er at teste dets binding til målet. Vi demonstrerer et flowcytometrisk baseret assay for at studere denne binding og understreger vigtigheden af at inkludere en negativ kontrolaptamer og kræftceller, der er positive eller negative for det pågældende protein.
En vigtig udfordring ved udvikling af en anticancer aptamer er effektivt at bestemme selektiviteten og specificiteten af den udviklede aptamer til målproteinet. På grund af sine mange fordele i forhold til monoklonale antistoffer har aptamerudvikling vundet enorm popularitet blandt kræftforskere. Systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) er den mest almindelige metode til udvikling af aptamere, der er specifikke for proteiner af interesse. Efter SELEX fremskynder et hurtigt og effektivt bindende assay identifikationsprocessen, hvilket bekræfter aptamerens selektivitet og specificitet.
Dette papir forklarer et trin-for-trin flow cytometrisk baseret bindingsassay af en aptamer, der er specifik for epitelcellulært adhæsionsmolekyle (EpCAM). Transmembranglykoproteinet EpCAM er overudtrykt i de fleste karcinomer og spiller roller i kræftinitiering, progression og metastase. Derfor er det en værdifuld kandidat til målrettet lægemiddellevering til tumorer. For at evaluere selektiviteten og specificiteten af aptameren til det membranbundne EpCAM kræves EpCAM-positive og -negative celler. Derudover kræves en ikke-bindende EpCAM-aptamer med en lignende længde og 2-dimensionel (2D) struktur som EpCAM-bindende aptamer. Bindingsanalysen omfatter forskellige buffere (blokeringsbuffer, vaskebuffer, inkubationsbuffer og FACS-buffer) og inkubationstrin.
Aptameren inkuberes med cellelinjerne. Efter inkubations- og vasketrinnene evalueres cellerne ved hjælp af et følsomt flowcytometriassay. Analyse af resultaterne viser bindingen af den EpCAM-specifikke aptamer til EpCAM-positive celler og ikke de EpCAM-negative celler. I EpCAM-positive celler er dette afbildet som et båndskift i bindingen af EpCAM-aptameren til højre sammenlignet med den ikke-bindende aptamerkontrol. I EpCAM-negative celler overlapper de tilsvarende bånd af EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamerer. Dette viser selektiviteten og specificiteten af EpCAM-aptameren. Mens denne protokol er fokuseret på EpCAM-aptameren, gælder protokollen for andre offentliggjorte aptamere.
Kræft er stadig en af de hyppigste årsager til dødelighedpå verdensplan 1. På trods af den betydelige forbedring i kræftbehandling i de seneste årtier er udvikling af kræftmedicin stadig et meget debatteret emne. Dette skyldes, at kemoterapi, som grundpillen i kræftbehandling, ledsages af alvorlige bivirkninger, der begrænser patientens overholdelse af behandlingen. Desuden har kemoterapi-induceret kræftresistens over for behandling begrænset dets anvendelse som det eneste valg af medicinsk intervention. Anvendelsen af monoklonale antistoffer (mAbs) introducerede et forbedret respons påkræftbehandlinger 2. Begrundelsen for at bruge mAbs var at forbedre effekten af kemoterapeutika og minimere deres bivirkninger. Administrationen af mAbs blev dog også en udfordring. Dette skyldtes ikke kun de mAb-inducerede immunologiske reaktioner, men også de dyreafhængige og dyre produktionsomkostninger og vanskelige opbevaringsforhold3. Introduktion af aptamere i 1990’erne4 skabte nye forhåbninger inden for kræftbehandling, da anvendelsen af aptamere kunne løse de udfordringer, der er forbundet med mAbs.
Aptamerer er korte nukleinsyresekvenser, der specifikt produceres til et bestemt mål. Systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) er en almindelig metode i aptamerproduktion. I SELEX inkuberes proteinet af interesse med et bibliotek af tilfældige nukleotidsekvenser, og gennem en række iterative cyklusser renses aptameren, der er specifik for dette protein. Aptamere har lignende målselektivitet og specificitet som mAbs, og derfor viser lægemiddeludvikling på dette område lovende fremtidige anvendelser. Aptamers specifikke for kræft biomarkører kunne anvendes som enkeltmedicin og kræftdiagnostiske værktøjer 5,6,7. På grund af deres nano-størrelse struktur, disse aptamers kunne også fungere som lægemiddelbærere til at levere cytotoksiske midler specifikt til tumoren8. Dette ville øge effekten af målrettet lægemiddellevering og mindske kemoterapi-associerede, off-target bivirkninger. Desuden har disse nanolægemidler en høj vævsindtrængning, hvilket gør dem til en ønskelig kandidat til levering og behandling af dyb tumormedicin. Aptamere kan også designes til at målrette mod transportørerne udtrykt på blod-hjerne-barrieren (BBB) for at forbedre lægemiddelafgivelsen til hjernetumorer9. Et godt eksempel på en sådan aptamer er bifunktionelle aptamere, der er målrettet mod transferrinreceptoren (TfR)10 for at forbedre lægemiddelafgivelsen på tværs af BBB og levere en cytotoksisk lægemiddelnyttelast til tumorceller11.
På trods af alle fordelene ved aptamerer har lægemiddeludvikling på dette område endnu ikke givet et markedsført, vellykket kræftlægemiddel. En af grundene til dette kunne være manglen på standard og reproducerbare metoder, der kunne følges globalt af forskere på området. I dette papir demonstreres en trin-for-trin protokol for en aptamerbinding til et naturligt protein udtrykt på celleoverfladen. Denne protokol er et forudsætningstrin i den prækliniske vurdering af anticancer-aptammere. Analysen udføres for at vise selektiviteten og specificiteten af den oprensede aptamer indsamlet fra SELEX eller en offentliggjort aptamersekvens til bekræftelse af selektivitet og specificitet. Dette flowcytometriske assay er et hurtigt, pålideligt, følsomt assay, der nøjagtigt viser aptamerens selektivitet og specificitet, hvor aptameren testes mod proteiner på celleoverfladen12,13,14. Denne metode demonstreres ved hjælp af bindingen af en aptamer, der er specifik for EpCAM, vist i dette papir15. EpCAM, som et transmembranglykoprotein, spiller roller i tumorcellesignalering, progression, migration og metastase16,17. For at vise selektiviteten og specificiteten af denne aptamer blev EpCAM-positive og -negative kræftceller anvendt. Den tidligere udviklede EpCAM-specifikke aptamer, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) og en negativ kontrolaptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), blev brugt som henholdsvis EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamere10. 3′-enden af både TEPP og TENN blev mærket med en TYE665 fluorophore.
TEPP er en bifunktionel aptamer, der er målrettet mod EpCAM fra den ene ende og TfR i den anden. Dette har gjort TEPP til en passende kandidat til lægemiddellevering til EpCAM+ hjernetumorer. Ved hjælp af sin TfR-specifikke ende krydser TEPP blod-hjerne-barrieren og ved hjælp af den EpCAM-specifikke ende finder tumoren og leverer sin last (f.eks. Cytotoksiske lægemidler) til tumoren. TENN har en lignende længde og 2D-struktur som TEPP, men den har ikke affinitet for EpCAM eller TfR og er derfor en passende negativ kontrolaptamer. Ved hjælp af TEPP og TENN er test af bindingen af en aptamer til målproteinet ved hjælp af flowcytometri vist i dette papir. Denne protokol gælder for udviklingen af cellespecifikke aptamerer. Det gælder også for yderligere supplerende og bekræftende analyser af de aptamersekvenser, der er tilgængelige i litteraturen. Protokollen kan også bruges af dem, der er nye inden for aptamerfeltet, der ser på at bruge en tidligere offentliggjort aptamer til deres forsknings- og udviklingsformål (F &U). I dette papir studeres to aptamersekvenser, der er tilgængelige i litteraturen.
Den største udfordring med at udvikle nye aptamers er manglen på standardretningslinjer, der gælder for forskellige trin i denne proces. McKeague et al. har for nylig demonstreret nogle af de tilknyttede udfordringer, som fører til uklare præsentationer af data i publikationer og manglende replikering af forskningen. De foreslog grundlæggende retningslinjer, der var nødvendige for overvejelse ved karakterisering af aptamers19. Et aptamer bindende assay er et kritisk skridt i screening og / …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT) SEED-finansiering, “Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship” -programmet ved Deakin University og “Australian Government Research Training Program Scholarship”.
1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |