Summary
המאמר מבוסס על יצירת פרוטוקול מותאם לסריקה, זיהוי, מיון וזיהוי אובייקטים דיגיטליים המתאימים למקרו-חסרי חוליות של נהרות בנטיים באמצעות הליך הדמיה חצי אוטומטי. הליך זה מאפשר רכישה של התפלגויות הגודל האינדיבידואליות ומדדי הגודל של קהילת מקרו-חסרי חוליות תוך כשעה.
Abstract
גודל הגוף הוא תכונה פונקציונלית חשובה שיכולה לשמש כביו-אינדיקטור להערכת ההשפעות של הפרעות בקהילות טבעיות. מבנה גודל הקהילה מגיב לשיפועים ביוטיים וא-ביוטיים, כולל הפרעות אנתרופוגניות בין טקסונים ומערכות אקולוגיות. עם זאת, המדידה הידנית של אורגניזמים בעלי גוף קטן כגון מקרו-חסרי חוליות בנטיים (למשל, >500 מיקרומטר עד כמה סנטימטרים אורך) גוזלת זמן רב. כדי לזרז את ההערכה של מבנה גודל הקהילה, כאן, פיתחנו פרוטוקול למדידה אוטומטית למחצה של גודל הגוף האינדיבידואלי של מקרו-חסרי חוליות בנהרות שהשתמרו, שהם אחד הביו-אינדיקטורים הנפוצים ביותר להערכת המצב האקולוגי של מערכות אקולוגיות של מים מתוקים. פרוטוקול זה מותאם ממתודולוגיה קיימת שפותחה לסריקת מזוזואופלנקטון ימי באמצעות מערכת סריקה המיועדת לדגימות מים. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים: (1) סריקת תת-דגימות (שברים בגודל דגימה עדין וגס) של מקרו-חוליות בנהר ועיבוד התמונות הדיגיטליות כדי להתאים אישית כל אובייקט שזוהה בכל תמונה; (2) יצירה, הערכה ואימות של מערך למידה באמצעות בינה מלאכותית כדי להפריד באופן אוטומטי למחצה את התמונות הבודדות של מקרו-חוליות מדטריטוס וממצאים בדגימות הסרוקות; ו-(3) תיאור מבנה הגודל של קהילות המקרו-חסרי חוליות. בנוסף לפרוטוקול, עבודה זו כוללת את תוצאות הכיול ומפרטת מספר אתגרים והמלצות להתאמת ההליך לדגימות מקרו-חסרי חוליות ולשקול שיפורים נוספים. בסך הכל, התוצאות תומכות בשימוש במערכת הסריקה המוצגת למדידת גודל הגוף האוטומטית של מקרו-חסרי חוליות בנהרות ומציעות כי תיאור ספקטרום הגודל שלהם הוא כלי רב ערך להערכה ביולוגית מהירה של מערכות אקולוגיות של מים מתוקים.
Introduction
מקרו-חסרי חוליות בנטיים נמצאים בשימוש נרחב כביו-אינדיקטורים כדי לקבוע את המצב האקולוגי של גופי מים1. רוב המדדים לתיאור קהילות מקרו-חסרי חוליות מתמקדים במדדים טקסונומיים. עם זאת, כלי הערכה ביולוגית חדשים המשלבים את גודל הגוף מעודדים לספק נקודת מבט חלופית או משלימה לגישות טקסונומיות 2,3.
גודל הגוף נחשב למטא-טראיט הקשור לתכונות חיוניות אחרות כגון חילוף חומרים, גדילה, נשימה ותנועה4. יתר על כן, גודל הגוף יכול לקבוע מיקום טרופי ואינטראקציות5. הקשר בין גודל הגוף האינדיבידואלי לבין הביומסה המנורמלת (או השפע) לפי גודל בקהילה מוגדר כספקטרום הגודל6 ועוקב אחר התבנית הכללית של ירידה ליניארית בביומסה המנורמלת ככל שגודל הפרט גדל בסולם לוגריתמי7. השיפוע של מערכת יחסים ליניארית זו נחקר בהרחבה באופן תיאורטי, ומחקרים אמפיריים על פני מערכות אקולוגיות השתמשו בו כאינדיקטור אקולוגי למבנה גודל הקהילה4. אינדיקטור סינתטי נוסף למבנה גודל הקהילה ששימש בהצלחה במחקרי תפקוד של מגוון ביולוגי-מערכות אקולוגיות הוא מגוון גודל הקהילה, המיוצג כמדד שאנון של מחלקות הגודל של ספקטרום הגודל או האנלוגי שלו, המחושב על סמך התפלגויות הגודל האינדיבידואליות8.
במערכות אקולוגיות של מים מתוקים, מבנה הגודל של קבוצות חיות שונות משמש כאינדיקטור אטקסי להערכת התגובה של קהילות ביוטיות לשיפועים סביבתיים 9,10,11 ולהפרעות אנתרופוגניות 12,13,14,15,16. מקרו-חסרי חוליות אינם יוצאי דופן, ומבנה גודלם מגיב גם לשינויים סביבתיים17,18 ולהפרעות אנתרופוגניות, כגון כרייה 19, שימוש בקרקע 20, או העשרת חנקן (N) וזרחן (P)20,21,22. עם זאת, מדידת מאות אנשים כדי לתאר את מבנה גודל הקהילה היא משימה מייגעת וגוזלת זמן, שלעתים קרובות נמנעת ממנה כמדידה שגרתית במעבדות בשל חוסר זמן. לפיכך, מספר שיטות הדמיה חצי אוטומטיות או אוטומטיות לסיווג ומדידת דגימות פותחו23,24,25,26. עם זאת, רוב השיטות הללו מתמקדות בסיווג טקסונומי יותר מאשר בגודל הפרט של האורגניזמים ואינן מוכנות לשימוש עבור כל מיני מקרו-חסרי חוליות. באקולוגיה של פלנקטון ימי, נעשה שימוש נרחב במערכת ניתוח תמונות סורקת כדי לקבוע את הגודל וההרכב הטקסונומי של קהילות זואופלנקטון 27,28,29,30,31. ניתן למצוא מכשיר זה במספר מכונים ימיים ברחבי העולם, והוא משמש לסריקת דגימות זואופלנקטון שהשתמרו כדי לקבל תמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה של הדגימה כולה. הפרוטוקול הנוכחי מתאים את השימוש במכשיר זה כדי להעריך את ספקטרום גודל קהילת המקרו-חסרי חוליות בנהרות באופן אוטומטי מהיר מבלי להשקיע ביצירת מכשיר חדש.
הפרוטוקול מורכב מסריקת דגימה ועיבוד התמונה כולה כדי לקבל באופן אוטומטי תמונות בודדות (כלומר, vignettes) של האובייקטים בדגימה. מספר מדדים של צורה, גודל ותכונות ברמת האפור מאפיינים כל אובייקט ומאפשרים סיווג אוטומטי של האובייקטים לקטגוריות, אשר מאומתות לאחר מכן על ידי מומחה. הגודל האינדיבידואלי של כל אורגניזם מחושב באמצעות הביו-נפח האליפסואידי (מ"מ3), הנגזר משטח האורגניזם הנמדד בפיקסלים. זה מאפשר לקבל את ספקטרום הגודל של המדגם בצורה מהירה. למיטב ידיעתנו, מערכת הדמיית סריקה זו שימשה רק לעיבוד דגימות מזוזואופלנקטון, אך המכשיר עשוי לאפשר עבודה עם מקרו-חסרי חוליות בנטיים במים מתוקים.
המטרה הכוללת של מחקר זה היא, אם כן, להציג שיטה להשגת הגודל האינדיבידואלי של מקרו-חסרי חוליות בנהר שהשתמרו על ידי התאמת פרוטוקול קיים ששימש בעבר עם מזוזואופלנקטון ימי 27,32,33. ההליך מורכב משימוש בגישה חצי אוטומטית הפועלת עם מכשיר סריקה לסריקת דגימות מים ושלוש תוכנות פתוחות לעיבוד התמונות הסרוקות. פרוטוקול מותאם לסריקה, זיהוי וזיהוי של מקרו-חסרי חוליות בנהרות שעברו דיגיטציה כדי לרכוש באופן אוטומטי את מבנה גודל הקהילה ומדדי גודל קשורים מוצג כאן. הערכת הנוהל וההנחיות לשיפור היעילות מוצגות גם על סמך 42 תמונות סרוקות של דגימות מקרו-חוליות בנהרות שנאספו משלושה אגנים בחצי האי האיברי הצפון-מזרחי (NE) (Ter, Segre-Ebre ו-Besòs).
הדגימות נאספו בקטעי נהרות בגובה 100 מטרים בעקבות פרוטוקול לדיגום שדה וניתוח מעבדה של מקרו-חולייתנים של נהרות בנטיים בנהרות יבשתיים מממשלת ספרד34. הדגימות נאספו באמצעות סמפלר סורבר (מסגרת: 0.3 מ' x 0.3 מ', רשת: 250 מיקרומטר) בעקבות סקר רב-בתי גידול. במעבדה, הדגימות נוקו וסוננו באמצעות רשת של 5 מ"מ ו-500 מיקרומטר כדי לקבל שתי תת-דגימות: תת-דגימה גסה (רשת 5 מ"מ) ותת-דגימה עדינה (רשת של 500 מיקרומטר), שאוחסנו בבקבוקונים נפרדים ונשמרו ב-70% אתנול. הפרדת הדגימה לשני שברים בגודל מאפשרת הערכה טובה יותר של מבנה גודל הקהילה, שכן אורגניזמים גדולים הם נדירים יותר ופחות מהאורגניזמים הקטנים. אחרת, למדגם הסרוק יש ייצוג מוטה של שבר הגודל הגדול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על המערכת שפותחה על ידי Gorsky et al.27 עבור מזוזואופלנקטון ימי. תיאור ספציפי של הסורק (ZooSCAN), תוכנת הסריקה (VueScan 9x64 [9.5.09]), תוכנת עיבוד התמונה (Zooprocess, ImageJ) ושלבי תוכנת הזיהוי האוטומטי (מזהה פלנקטון) ניתן למצוא בהפניות קודמות32,33. כדי להתאים בצורה הטובה ביותר את הגדלים של המקרו-חסרי חוליות הבנטיים ביחס למזוזואופלנקטון, לאחר שהפרויקט נוצר בעקבות הפרוטוקול המקורי32,33, שנה את הפרמטר של גודל מינימלי (minsizeesd_mm) ל- 0.3 מ"מ ואת הפרמטר בגודל מרבי (maxsizeesd_mm) ל- 100 מ"מ בקובץ התצורה. כדי לעזור לעקוב אחר הפרוטוקול, זה מסוכם בתרשים עבודה (איור 1). הפרוייקט שנוצר מאוחסן בתיקיית C של המחשב ומאורגן בתיקיות הבאות: PID_process, Zooscan_back, Zooscan_check, Zooscan_config, Zooscan_meta, Zooscan_results ו- Zooscan_scan. כל תיקיה מורכבת ממספר תיקיות משנה שבהן משתמשים יישומי התוכנה השונים בשלבים הבאים של הפרוטוקול.
1. רכישת תמונות דיגיטליות לדגימות מקרו-חסרי חוליות
- סריקה ועיבוד של הריק
הערה: צור שתי תמונות ריקות מדי יום לפני הסריקה כדי לחלץ את סריקות הרקע בעת עיבוד התמונות הסרוקות באותו יום.- הפעל את הסורק והדליק את האור במיקום הכפול כדי להקרין אור לבן מלמעלה ומלמטה.
הערה: בעת סריקת דגימות מזוזואופלנקטון, נעשה שימוש בכיוון האור כלפי מעלה, אך מכיוון שמקרו-חסרי חוליות אטומים יותר, מומלץ להעביר את האור למצב כפול. - נקו ושטפו את מגש הסריקה במי ברז.
- מוזגים 110 מ"ל של מי ברז המאוחסנים בטמפרטורת החדר (RT) למגש הסריקה עד לכיסוי הכוס. הנח את המסגרת הגדולה (24.5 ס"מ x 15.8 ס"מ) על מגש הסריקה במיקום הנכון (עם הפינה בחלק השמאלי העליון של מגש הסריקה), ומלא אותה במי ברז עד לכיסוי שלב המסגרת כדי למנוע אפקט מניסקוס, שישנה את התמונה הסרוקה. סגור את מכסה הסורק.
הערה: יש להשתמש במים ב-RT כדי למנוע עיבוי והיווצרות בועות. נקו את המסגרת ללא סימנים או טיפות כדי למנוע השתקפות אור. - עבור אל תוכנת עיבוד התמונה, בחר את פרויקט העבודה ולחץ על סרוק (המר) תמונת רקע.
- עבור אל תוכנת הסריקה ולחץ על תצוגה מקדימה. הקפד להציג תצוגה מקדימה של התמונה הסרוקה, לבדוק שאין קווים או כתמים ולהמתין לפחות 30 שניות לפני תחילת סריקה נוספת. לחץ על סריקה ולחץ על אישור בחלון ההוראות לפני הסריקה השנייה כדי לשלוח את הנתונים מתוכנת הסריקה לתוכנת עיבוד התמונה.
הערה: סרוק פעמיים כדי לקבל את שתי סריקות הרקע שירכיבו את הריק. שלב זה נעשה פעם ביום לפני תחילת עיבוד הדגימה, והתמונות מאוחסנות בתיקיית Zooscan_back. - סגור את תוכנת הסריקה לאחר סיום הסריקה.
- הפעל את הסורק והדליק את האור במיקום הכפול כדי להקרין אור לבן מלמעלה ומלמטה.
- הכנה וסריקה של דוגמאות
אזהרה: אתנול הוא נוזל דליק שעלול לגרום לנזק/גירוי חמור בעיניים.- מלא את המטה-נתונים לדוגמה. עבור אל תוכנת עיבוד התמונה ובחר מלא מטה-נתונים לדוגמה. הזן את הזהות לדוגמה, לחץ על אישור ומלא את המטא נתונים.
הערה: קובץ המטא-קובץ נוצר במיוחד עבור דגימות מזוזואופלנקטון, כך שהוא אינו מתאים למתודולוגיית דגימת המקרו-חסרי חוליות הבנטית, אך יש למלא את כל שדות הקובץ לפני הסריקה, אחרת יופיע דגל שגיאה. - מוזגים 110 מ"ל של 70% אתנול למגש הסריקה עד לכיסוי הכוס ומניחים את המסגרת הגדולה (24.5 ס"מ על 15.8 ס"מ) עם הפינה בחלק השמאלי העליון של מגש הסריקה.
הערה: עבודה עם אתנול במקום מים, שכן המקרו-חסרי חוליות נשמרים באתנול. במים, הם צפים ונסחפים במגש הסריקה, ומונעים תמונה חדה, ובכך, מדידות גודל אמינות. אתנול צריך להישמר ב- RT כדי למנוע עיבוי והיווצרות בועות. - שפכו את דגימת המקרו-חסרי חוליות למגש הסריקה שבקצהו המסגרת, וכסו את שלב המסגרת באתנול נוסף במידת הצורך.
הערה: הימנעו מהוספת כמות גדולה מדי של אתנול כדי למנוע מהאורגניזמים לצוף ולהיסחף. - הומוגניזציה של הדגימה בכל אזור המסגרת, הצבת הפרטים הגדולים ביותר במרכז המגש לעיבוד תמונה תקין, והטבעת האורגניזמים הצפים באמצעות מחט עץ.
הערה: אם תת-דגימה מכילה באופן מספרי יותר מ-1,000 פרטים, חלק את תת-הדגימה לשני שברים או יותר כדי למזער את המגע באורגניזמים בתמונה הסרוקה, וסרוק את השברים בנפרד. - הפרד את האורגניזמים הנוגעים במגע ואת האורגניזמים הנוגעים בקצוות המסגרת באמצעות מחט העץ.
הערה: שלב זה דורש 5-20 דקות. אורגניזמים נוגעים נחשבים לאובייקט יחיד על ידי התוכנה; לפיכך, במקרים אלה, הגדלים האישיים המחושבים אינם תואמים אורגניזמים בודדים בפועל ויכולים להטות את הערכת מבנה גודל הקהילה. קיימת אפשרות לערוך את התמונה עם תוכנת עיבוד התמונה כדי להפריד ביניהם, אך שלב נוסף זה כרוך לפחות 1.5 שעות של עיבוד מחדש; לכן, הפרדה ידנית מומלצת מאוד. - כדי לסרוק את המדגם, סגור את מכסה הסורק, עבור אל תוכנת עיבוד התמונה, בחר את פרויקט העבודה ולחץ על SCAN Sample with Zooscan (עבור ארכיון, ללא תהליך).
- בחר את הדוגמה ובצע את ההוראות.
- עבור אל תוכנת הסריקה ולחץ על תצוגה מקדימה. הקפד להציג תצוגה מקדימה של התמונה הסרוקה, לבדוק שאין קווים או כתמים ולהמתין לפחות 30 שניות לפני תחילת סריקה נוספת.
- לאחר 30 שניות לפחות, לחץ על כפתור הסריקה בתוכנת הסריקה.
הערה: לחץ על OK בתוכנת עיבוד התמונה לאחר לחיצה על Scan בתוכנת הסריקה. אל תלחץ על מקש כלשהו במקלדת המחשב והימנע מרעידות של הסריקה במהלך הסריקה. שלושה קבצים נוצרים בתיקייה Zooscan_scan > _raw : (i) תבנית קובץ תמונה מתויגת (.tif) (16 סיביות); (ii) מסמך טקסט סטנדרטי בשם LOG (.txt) המתעד מידע בפרמטרים של הסריקה; ו-(iii) מסמך טקסט סטנדרטי בשם META (.txt) עם מידע על שיטות הדגימה. - ודא שהסריקה הגולמית נכונה.
הערה: אם הסריקה כוללת פסים בהירים או בעיות גלויות אחרות, שקול לחזור על הסריקה כדי למנוע בעיות בשלבים הבאים.
- מלא את המטה-נתונים לדוגמה. עבור אל תוכנת עיבוד התמונה ובחר מלא מטה-נתונים לדוגמה. הזן את הזהות לדוגמה, לחץ על אישור ומלא את המטא נתונים.
- שחזור לדוגמה
- הסר את המסגרת ושטוף אותה מעל מגש הסריקה באמצעות בקבוק לחיץ מלא ב-70% אתנול כדי לשחזר את כל המקרו-חסרי חוליות המצורפים.
- הרם את החלק העליון של הסורק כדי לאחזר את כל האורגניזמים והאתנול מהמגש דרך משפך אחזור הסריקה לתוך. כאשר החלק העליון של הסורק עדיין מורם, שטפו את המגש עם בקבוק הלחיצה כדי לטאטא לאורך כל האורגניזמים שנותרו.
- מעבירים את הדגימות והאתנול מהכוס דרך רשת של 500 מיקרומטר כדי לשמור על חסרי החוליות ברשת, ומאחסנים אותם בחזרה בבקבוקון עם 70% אתנול.
- לאחר שכל הדגימות משוחזרות בבקבוקון, נקו את המגש עם מי ברז.
הערה: שטפו את המגש במי ברז בין דגימות כדי למזער את משקעי האתנול, מה שמשנה את עיבוד התמונה. יש לשטוף את המסגרת במי ברז כדי למנוע נזקים אפשריים הקשורים לשימוש באתנול. בסוף היום, נקו את המגש באמצעות מי ברז ויבשו אותו בעדינות עם נייר כדי למנוע שריטות.
- עיבוד תמונה
- עבור אל תוכנת עיבוד התמונה ובחר המר ועבד תמונות ואורגניזמים במצב אצווה ולאחר מכן המר ועבד תמונה וחלקיקים (תמונה בתיקיית RAW). שמור על הגדרות ברירת המחדל ולחץ על אישור. NORMAL END יופיע בסוף התהליך.
הערה: קובץ PID וה-vignettes המתאימים לכל האובייקטים שזוהו בתמונה הסרוקה (בקובץ קבוצת צילום משותפת [.jpg]) ייווצרו בתיקיית Zooscan_scan > _work. קובץ PID הוא קובץ יחיד המאחסן את כל המטא-נתונים (מטא-קובץ), את הנתונים הטכניים המשויכים לקובץ יומן הרישום וטבלה עם 36 משתנים נמדדים של כל העצמים שזוהו בתמונה. המשתנים הנמדדים תואמים לאומדנים שונים של רמת האפור, ממד הפרקטלים, הצורה והגודל. המשתנים שניתן להשתמש בהם להערכת גודל הם השטח והצירים הראשיים והמשניים של אליפסה עם שטח שווה לאובייקט (ראה סעיף 3 של הפרוטוקול). זמן העיבוד תלוי בצפיפות התמונה ובמאפייני המחשב, וניתן לשגר אותו בין דגימות תוך כדי שחזור והכנת הדגימה הבאה. אחרת, מומלץ להפעיל את עיבוד הדגימות שנסרקו מדי יום במצב אצווה במהלך הלילה ולבדוק עיבוד תמונה תקין למחרת בבוקר. - בדוק אם הרקע בתמונה המעובדת מופחת כראוי מהתמונה לדוגמה באמצעות תוכנת עיבוד התמונה או על-ידי בדיקת תמונות המסיכה (שהסתיימו ב- msk1.gif) הממוקמות ב- Zooscan_scan > _work. אם הרקע כולל אזורים רוויים או נקודות רבות, שקול לחזור על הסריקה כדי להבטיח תמונות באיכות גבוהה.
הערה: כדי להימנע מאזורים רוויים ברקע, יש לשטוף את מגש הסריקה במי ברז לאחר כל סריקה עם אתנול. חשוב גם (1) להפחית את מספר האנשים הסרוקים (על ידי פיצול הדגימה וסריקה בקיפולים שונים); (2) לוודא שאורגניזמים גדולים ממוקמים במרכז מגש הסריקה; (3) להשתמש באתנול נקי ומסונן; (4) להפחית את הלכלוך על הדגימות; (5) לוודא שנפח האתנול לסריקה מספיק; וכן (6) לוודא שההשהיה בין התצוגה המקדימה של הדגימה לבין הסריקה היא לפחות 30 שניות.
- עבור אל תוכנת עיבוד התמונה ובחר המר ועבד תמונות ואורגניזמים במצב אצווה ולאחר מכן המר ועבד תמונה וחלקיקים (תמונה בתיקיית RAW). שמור על הגדרות ברירת המחדל ולחץ על אישור. NORMAL END יופיע בסוף התהליך.
- הפרדת אורגניזמים נוגעים
הערה: כאשר ישנם מספר ציורים עם אורגניזמים נוגעים, יש צורך להפריד את התמונות של האורגניזמים הנוגעים ללב מאורגניזמים אחרים ו/או מסיבים /פסולת כדי להבטיח הערכה נכונה של מבנה גודל הקהילה.- עבור אל תוכנת עיבוד התמונה כדי לזהות את vignettes עם אובייקטים מרובים. בחר הפרדת צבע באמצעות Vignettes ולחץ על אישור. בחלון בחירת התצורה, שמור על הגדרות ברירת המחדל ולחץ על אישור.
- בחלון הפרדת צבע מ- VIGNETTES , שמור על הגדרות ברירת המחדל, בחר בנוסף הוסף קווי מתאר ב- Vignettes ולאחר מכן בחר את הדוגמה לעריכה.
- הפרד את האורגניזמים הנוגעים ללב בכל ציור שצץ על-ידי ציור קו עם העכבר (לחץ על לחצן הגליל כדי לצייר). לאחר השלמת ההפרדה ב- vignette, לחץ על לחצן X בפינה השמאלית העליונה של החלון ולחץ על כן כדי לעבד את הלחצן הבא. לחץ על NO כדי לסיים ולשמור את השינויים. בסוף התהליך, NORMAL END יופיע אם הכל נכון.
- לאחר הפרדת הצבע, עבדו מחדש את התמונה כדי לקבל את נתוני האובייקט המעודכנים. עבור אל תוכנת עיבוד התמונה, לחץ על תהליך ( מומר) תמונה (תהליך אחד), ובחר עבד שוב חלקיקים מתמונות מעובדות בתיקיות המשנה של WORK. בחר את הדוגמה, ובחלון תהליך תמונה בודדת , שמור על הגדרות ברירת המחדל, סמן את עבודה עם מסיכת הפרדה (CREATE-CHANGE-INCLUDE) ולאחר מכן לחץ על אישור. בסוף התהליך, NORMAL END יופיע אם הכל נכון.
- בחלון ' בקרת הפרדות צבע ', לחצו על הלחצן 'אשר' לשמירת התמונה עם קווי המתאר שלפני העיבוד; אם קיימת תמונה קודמת, היא תוחלף.
- בחלון ' מסיכת בקרת הפרדות ', במידת הצורך, בחרו 'עריכה ' להוספת קווי הפרדה למסיכה באמצעות העכבר להפרדת אורגניזמים נוגעים שלא הופיעו קודם לכן בשלב ההפרדה באמצעות vignettes. בסיום, סיימו את התהליך, ובחלון ' בקרת מסיכת הפרדה ', בחרו ' כן' כדי לקבל את המסיכה. בסוף התהליך, NORMAL END יופיע אם הכל נכון.
הערה: עיבוד מחדש של דגימה באמצעות מסיכת הפרדה גוזל זמן רב (פעולה זו עשויה להימשך יותר משעה וחצי לכל דגימה). עדיף להקדיש את הזמן הנדרש בשלב 1.2.5 כדי למנוע צעד נוסף זה.
2. זיהוי אוטומטי של האובייקטים
הערה: צור ערכת למידה כדי לחזות באופן אוטומטי את זהות האובייקטים שזוהו, ובכך להפריד את האורגניזמים מהפסולת בדגימה.
- יצירת ערכות למידה
- העתק את התמונות ואת קבצי ה- .pid המשויכים לתמונות שישמשו ליצירת הקטגוריות של ערכת הלמידה מ- Zooscan_scan > _work ל- PID_process > Unsorted_vignettes_pid.
הערה: בחר תת-קבוצה של דגימות עם מגוון טקסונים גבוה ואתרי דגימה שונים ו/או עונות דגימה שונות כדי להבטיח ייצוג מרבי של אורגניזמים בדגימות. - בתיקייה PID_process > Learning set, צור תיקיית משנה עם שם ערכת הלמידה החדשה (כלומר, yyyymmdd_raw_LS), ובתוכה, צור את תיקיות המשנה שיתאימו לכל קטגוריה של ערכת הלמידה (כלומר, מקרו-חסרי חוליות, פסולת, חסרי חוליות אחרים).
הערה: כדי להשיג ביעילות את מבנה גודל הקהילה של דגימות מקרו-חסרי חוליות בנהר, מומלץ להשתמש בערכת למידה המבוססת על שלוש קטגוריות בלבד: מקרו-חסרי חוליות, חסרי חוליות אחרים ופסולת. מערך למידה זה בעצם מפריד בין האובייקטים המתאימים לאורגניזמים לבין אלה המתאימים לפסולת (למשל, סיבים, חלקיקים או אצות נימה). - עבור אל תוכנת עיבוד התמונה (מצב מתקדם בלבד) ובחר EXTRACT Vignettes עבור PLANKTON IDENTIFIER (ציורים לא ממוינים לאימון). השאר את אפשרויות ברירת המחדל וסמן את התיבה הוסף קווי מתאר .
- עבור אל תוכנת הזיהוי האוטומטית, לחץ על למידה, בחר מתוך PID_process > Learning_set תיקיית המשנה שנוצרה עבור ערכת הלמידה החדשה (שלב 2.1.2) ולחץ על אישור.
- בחלק השמאלי (אגודלים לא ממוינים) של החלון הפתוח, בחר את התיקיה לא ממוינת vignettes_pid. בחר את vignettes וגרור אותם עם העכבר מן האגודלים הלא ממוינים לתיקייה של הקטגוריה המתאימה שלהם בחלק הימני, אגודלים ממוינים, כדי לסווג כל אובייקט לקטגוריות המוגדרות. הציורים שהועברו יסומנו ב-X אדום.
הערה: הגדר את הקטגוריות באופן ידני על ידי יצירת תיקיות משנה בתיקיית האגודלים הממוינת או צור אותן על ידי לחיצה על סמל התיקיות בתוכנה. אין להזיז יותר מ-50 ציורים בו-זמנית. - לאחר השלמת כל הקטגוריות עם האובייקטים שנבחרו (כ -300 אובייקטים לקטגוריה), לחץ על צור קובץ למידה ושמור אותו עם השם הרצוי.
הערה: ערכת הלמידה תישמר כקובץ .pid בתיקיה PID_process > ערכת למידה של הפרוייקט. מומלץ ליצור ולבדוק מספר קבוצות למידה עם רמות שונות של קטגוריות (מצורות גסות ועד עדינות) ועם איזון שונה של מספר האובייקטים בתוך כל קטגוריה. התחל עם ערכת למידה גסה עם מספר נמוך של קטגוריות ולפחות 50 אובייקטים לכל קטגוריה, ולאחר מכן הגדל את מספר האובייקטים בכל קטגוריה ו/או צור ערכות למידה עדינות יותר. קטגוריה צריכה לייצג את השתנותה בקבוצת הדגימות.
- העתק את התמונות ואת קבצי ה- .pid המשויכים לתמונות שישמשו ליצירת הקטגוריות של ערכת הלמידה מ- Zooscan_scan > _work ל- PID_process > Unsorted_vignettes_pid.
- הערכת מערך הלמידה
הערה: בצע אימות צולב עם שני קיפולים וחמישה ניסויים באמצעות שיטת Random Forest עם תוכנת הזיהוי האוטומטית כדי להשיג מטריצת בלבול של הסיווג המתקבל של האובייקטים.- עבור אל תוכנת הסיווג האוטומטית ולחץ על ניתוח נתונים.
- תחת בחר קובץ למידה, בחר את קובץ ערכת הלמידה שנוצר מתוך ערכת הלמידה PID_process >.
- בתיבה בחר שיטה, בחר בשיטה 'יער אקראי של אימות צולב' . במשתנים מקוריים, בטל את הסימון של משתני המיקום (X, Y, XM, YM, BX, BY וגובה). במשתנים מותאמים אישית, סמן רק ESD.
הערה: שיטה זו משתמשת בחלק אקראי אחד של ערכת הלמידה כדי לזהות את החלק השני (שני קיפולים), וזה חוזר על עצמו חמש פעמים כדי להבטיח שהוא עמיד סטטיסטית. - לחץ על התחל ניתוח ושמור את התוצאות כ- Analysis_name.txt בתיקיית החיזוי PID_process >. לאחר שהניתוח הושלם בהצלחה, צא מניתוח הנתונים.
- עבור אל תיקיית החיזוי PID_process > ולחץ על קובץ האימות הצולב. חלון יופיע עם מטריצת הבלבול של הסיווג האמיתי (שורות) לעומת הסיווג האוטומטי (עמודות).
הערה: ההיזכרות היא אחוז האורגניזמים השייכים לקבוצה שזוהתה היטב באופן אוטומטי, ואילו 1-דיוק הוא אחוז האורגניזמים המסווגים על ידי האלגוריתם כקבוצה שאינה מוכרת (זיהום בקבוצה). ההחזרה צריכה להיות מעל 70%, והזיהום (דיוק 1) צריך להיות נמוך מ -20%. - חזור על שלבים 2.1-2.5 אם נוצרו מספר ערכות למידה ויש להשיג את ההיזכרות והדיוק 1 של כל אחת מהן.
הערה: אם נוצרו מספר ערכות למידה, בחר את זו עם ההיזכרות הגדולה ביותר (זיהוי טוב) והדיוק (זיהום נמוך) של קבוצת העניין (כלומר, מקרו-חסרי חוליות) כדי לבדוק את החיזוי האוטומטי של קבוצת דגימות בשלב הבא.
- חיזוי זיהוי של מקרו-חסרי חוליות
הערה: השתמש בערכת הלמידה שנבחרה כדי לחזות את הזהות של כל האובייקטים בקבוצת משנה של דגימות באמצעות תוכנת הזיהוי האוטומטית עם אלגוריתם יער אקראי.- עבור אל תוכנת הזיהוי האוטומטית ולחץ על ניתוח נתונים.
- בקובץ 'בחר למידה', בחר את קובץ ערכת הלמידה מתוך ערכת הלמידה PID_process > שיש להשתמש בו לחיזוי.
- תחת בחר קבצים לדוגמה, בחר מהתיקיה PID_results את הדוגמאות (קבצי PID) שיחזו.
הערה: עבד עד 20 קבצי .pid בו-זמנית כדי למנוע שגיאות הקשורות לבעיות זיכרון. אם יותר מדי קבצי .pid מעובדים בו-זמנית, התהליך יציג סוף נכון אך ייתכן שלא יעובד היטב, ושגיאה עלולה להתרחש בשלבים הבאים בעת עיבוד באמצעות תוכנת עיבוד התמונה. - בתיבה בחר שיטה, בחר את שיטת היער האקראי . סמן שמור תוצאות מפורטות עבור כל מדגם. במשתנים מקוריים, בטל את הסימון של משתני המיקום (X, Y, XM, YM, BX, BY וגובה). במשתנים מותאמים אישית, סמן רק ESD.
- לחץ על התחל ניתוח ושמור את התוצאות כ- Analysis_name.txt בתיקיית החיזוי PID_process >.
- אימות ידני
הערה: מומחה מאמת באופן ידני את החיזוי מהשלב הקודם כדי לסווג מחדש אובייקטים שסווגו באופן שגוי לקטגוריה הנכונה.- העתק את קבצי Analysis_sample_dat1.txt לאימות מהתיקיה PID_process > חיזוי לתיקיית PID_process > Pid_results.
- עבור אל תוכנת עיבוד התמונה ובחר חלץ Vignettes בתיקיות על פי חיזוי או אימות. לאחר מכן, בחר השתמש בקבצים חזויים מתיקיית "pid_results". שמור את הגדרות ברירת המחדל ולחץ על OK.
- התוכנה יוצרת תיקייה בשם sample_yyyymmdd_hhmm_to_validate עם האובייקטים החזויים בתיקייה vignettes ממוינים PID_process >.
- עבור אל התיקיה PID_process > vignettes ממוינים והעתק את התיקיה sample_yyyymmdd_ hhmm_to_validate. החלף את שם התיקיה _to לאמת ב - _validated.
- כדי לאמת באופן ידני את הסיווג האוטומטי, פתח את sample_yyyymmdd_ hhmm_validated התיקיה וסקור את כל הציורים מכל תיקיית משנה (קטגוריה) כדי לזהות אם קיימים אובייקטים המסווגים באופן שגוי. כאשר אובייקט אחד מסווג באופן שגוי, גרור את הפריט באמצעות העכבר לתיקיה הנכונה (קטגוריה).
- עבור אל תוכנת עיבוד התמונה ובחר זיהויי עומס מתוך Vignettes ממוינים. שמור את הגדרות ברירת המחדל ובחר yyyymmdd_hhmm_name_validated לעיבוד.
- עבור אל PID_process > Pid_results > Dat1_validated, שבו נוצר קובץ בשם Id_from_sorted_vignettes_yyyymmdd_hhmm.txt וקובץ .txt אחד עבור כל אחת מהדוגמאות המאומתות (sample_tot_1_dat1.txt).
הערה: קובצי .txt אלה מכילים עמודה חדשה המציגה את החיזוי, הנקרא pred_valid_Id_yyyymmdd_hhmm, המציין את סיווג המומחה של כל אובייקט (כלומר, הסיווג המאומת). ניתן ליצור קטגוריות חדשות (למשל, קטגוריות טקסונומיות עדינות יותר) בשלב זה, במהלך האימות. עם זאת, שמור את שם הקטגוריה המקורית בשם החדש (לדוגמה, macroinvertebrate_chironomidae). זה מאפשר להתחקות אחר הקטגוריה המקורית בעת חישוב ההיזכרות והדיוק ולקבץ בקלות את כל המקרו-חסרי חוליות כדי לחשב את הפרמטרים של מבנה גודל הקהילה (כלומר, ספקטרום הגודל ומגוון הגודלים). קובץ הטקסט מספק את הנתונים המשויכים לכל אובייקט, כולל הצירים הקטנים והעיקריים המשמשים לקבלת הנפח האליפסואידי של כל אורגניזם כמדד לגודל גוף אינדיבידואלי. יתר על כן, שתי העמודות האחרונות של הטבלה מכילות את הקטגוריות החזויות והמאומתות של כל אובייקט (שורה), המאפשרות לחשב, לפי קטגוריה, את ההיזכרות והדיוק של קבוצת הלמידה על תת-קבוצה של דגימות.
איור 1: תרשים עבודה המייצג את סעיף 1 וסעיף 2 של הפרוטוקול. הזמנים הם להמחשה ויכולים להשתנות בהתאם למחשב, לשפע הווינטות לעיבוד ולמספר הקטגוריות של מערך הלמידה. מקרה זה מתאים לאימות של קבוצת למידה של שלוש קטגוריות על קבוצה של 42 תת-דגימות (בסך הכל, 47,473 vignettes). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
3. חישוב התפלגות הגודל הבודדת, ספקטרום הגודל ומדדי הגודל
הערה: החישובים המוזכרים בסעיף זה בוצעו באמצעות Matlab (ראה סקריפט כקובץ משלים 1).
- התפלגות גודל אישי
- העמודה האחרונה של קובץ Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt מכילה את הסיווג המאומת של האובייקטים. בחרו רק בעצמים המסווגים כמקרו-חסרי חוליות כדי לתאר את התפלגות הגודל האינדיבידואלי שלהם בדגימה.
הערה: גודל הגוף האינדיבידואלי מתאים לנפח האליפסואידי של האורגניזמים המקרו-חסרי חוליות. המערכת מספקת מדידות בפיקסלים. - שרשררו את הווקטורים עם מדידות הגודל משתי הסריקות, מכיוון שלכל שבר יש מעריך תת-דגימה שונה. לפני שרשור, תקן את הפיצול על ידי שכפול וקטורי הגודל כמה פעמים שתת-הדגימה המתאימה הופצלה.
הערה: שלב זה נחוץ אם סריקה מתאימה לשבריר של דגימה (כלומר, גסה או עדינה). - חשב את הנפח האליפסואידי מהציר הראשי (M) והמינורי (m) של אליפסואידים פרולטים עם אותם אזורי פיקסלים כמו האורגניזמים. לפני חישוב הנפח האליפסואידי, המר את הצירים הראשי (M) והמשני (m) מפיקסלים למילימטרים (מ"מ) באמצעות מקדם ההמרה הבא (cf):
1 פיקסל = 2,400 dpi
1 אינץ' = 25.4 מ"מ
cf = 25.4/2400
הנפח האליפסואידי (אליפוול עם יחידות במ"מ3) מתאים ל:
- תאר את פונקציית צפיפות ההסתברות של התפלגות הגודל הבודד בסולם לוג2 .
- העמודה האחרונה של קובץ Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt מכילה את הסיווג המאומת של האובייקטים. בחרו רק בעצמים המסווגים כמקרו-חסרי חוליות כדי לתאר את התפלגות הגודל האינדיבידואלי שלהם בדגימה.
- גיוון בגדלים
- חשב את מגוון הגודל (Sd) בעקבות Quintana et al. (2008)8, כמו ב- García-Comas et al. (2016)35:
כאשר p x(x) היא פונקציית צפיפות ההסתברות של גודל x, ו-x מייצג את log2 (אליפסה). מדד זה הוא, אם כן, מדד הגיוון של שאנון המותאם למדד רציף, כגון התפלגות הגודל האינדיבידואלי בקהילה.
- חשב את מגוון הגודל (Sd) בעקבות Quintana et al. (2008)8, כמו ב- García-Comas et al. (2016)35:
- ספקטרום גודל ביו-נפח מנורמל (NBSS)
- הגדר את מחלקות הגודל של ה- NBSS, קבע את הגבול התחתון של הספקטרום כקוונטיל 0.01 של התפלגות גודל המקרו-חסרי חוליות בדגימות ויצירת מחלקות גודל על ידי קנה מידה גיאומטרי של בסיס 2 עד להכללת האורגניזם הגדול ביותר בדגימות.
הערה: רוחב מחלקת הגודל גדל עם הגודל כדי לקחת בחשבון את השונות הגדולה יותר המשויכת לגדלים גדולים יותר. ב-NBSS של קהילות המקרו-חסרי חוליות שנותחו כאן היו 14 כיתות גודל (טבלה 1). - השג את ה- biovolume המנורמל על ידי חלוקת ה- biovolume הכולל בכל מחלקת גודל ברוחב מחלקת הגודל.
- הגדר את מחלקות הגודל של ה- NBSS, קבע את הגבול התחתון של הספקטרום כקוונטיל 0.01 של התפלגות גודל המקרו-חסרי חוליות בדגימות ויצירת מחלקות גודל על ידי קנה מידה גיאומטרי של בסיס 2 עד להכללת האורגניזם הגדול ביותר בדגימות.
- שיפוע ספקטרום הגודל
- חישוב השיפוע הליניארי של NBSS.
הערה: השיפוע (μ) מחושב על סמך הקשר בין היומן 2 (נקודת אמצע של מחלקת גודל) לבין היומן2 (ביומסה מנורמלת) במחלקות הגודל הגדולות מהמצב, תוך התעלמות מכל אלה הריקות (במחקר זה, מחלקות הגודל מ-3 עד 14).
- חישוב השיפוע הליניארי של NBSS.
| מגבלות גודל מחלקה (מ"מ3) | גודל מעמד נקודת אמצע (מ"מ3) |
| 0,1236 | 0,1855 |
| 0,2473 | 0,3709 |
| 0,4946 | 0,7418 |
| 0,9891 | 1,4837 |
| 1,9783 | 1,4837 |
| 3,9560 | 5,9348 |
| 7,9131 | 11,8696 |
| 15,8261 | 23,7392 |
| 31,6522 | 47,4783 |
| 63,3044 | 94,9567 |
| 126,6089 | 189,9133 |
| 253,2178 | 379,8267 |
| 506,4300 | 7597,7000 |
| 1012,9000 | 15193,0000 |
| 2025,7000 |
טבלה 1: מחלקות גודל של ספקטרום גודל הביומסה המנורמל (NBSS). הטבלה מציגה גם את מגבלות מחלקת הגודל 15 ואת נקודות האמצע של מחלקת הגודל של האורגניזמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רכישת תמונות דיגיטליות של דגימות מקרו-חסרי חוליות
ניואנסים בסריקה: תצהיר אתנול במגש הסריקה
בעת בדיקת המערכת עבור מקרו-חסרי חוליות, מספר סריקות היו באיכות ירודה. אזור רווי כהה ברקע מנע עיבוד תקין של התמונה ומדידת הגדלים האינדיבידואליים של המקרו-חסרי חוליות (איור 2). מספר סיבות ניתנו להופעת אזורים רוויים ברקע או תמונות מפוקסלות מאוד: (1) נוכחות של אורגניזמים רבים מדי על מגש הסריקה; (2) נוכחות לכלוך בדגימות; (3) השהיה לא מספקת בין התצוגה המקדימה של הדגימה לבין הסריקה שלה; או (4) שימוש בעיבוד תמונה בתמונת רקע באיכות ירודה עקב עיבוי, לכלוך או איכות מים ירודה33. בדגימות של קהילת מקרו-חסרי חוליות, השימוש באתנול במקום במים גורם למשקעים על המגש, מה שיוצר צל כהה אם הוא לא נשטף כראוי במים בין הסריקות. זה חיוני כדי לקבל תמונות חדות כדי למזער כל קורוזיה הקשורה של זכוכית מגש הסריקה.
סריקת ניואנסים: ריכוז פסולת
מניתוח של תת-קבוצה של 47,473 וינטות, אחוז גבוה (86.1%) התאים לפסולת, כולל דטריטוס, סיבים או חלקי גוף (כגון רגליים או זימים), או לממצאי סריקה (איור 3A-E). אורגניזמים חסרי חוליות התאימו ל-13.9% הנותרים של העצמים שזוהו (איור 3F-L). לכן, למרות ההפרדה המוקפדת הקודמת של אורגניזמים מחומר אורגני במעבדה, הרבה פסולת קטנה עדיין נשארה בבקבוקון.
סריקת ניואנסים: נגיעה באובייקטים
הנוכחות המשמעותית של פסולת משפרת את הנגיעה בין אורגניזמים, ולכן יוצרת יצורים עם אגרגטים שכוללים אורגניזמים נוגעים מרובים ואורגניזמים המחוברים לחלקיקים או לסיבים (איור 4A-C). ציורים אלה הם מקור להטיה בקביעת הצורה של מבנה הגודל האינדיבידואלי. בקבוצה של חמש דגימות (11 תת-דגימות), מתוך כל הדגימות עם מקרו-חולייתנים כלשהם, 10% התאימו לקבוצות עם אורגניזמים נוגעים או אורגניזמים שנוגעים בחלקיקים או בסיבים. ציורים אלה נערכו עם תוכנית עיבוד התמונה על מנת להפריד בין האורגניזמים הנוגעים ללב לבין האורגניזמים עם חלקיקים מחוברים. עיבוד מחדש של הדגימות עם מסכת ההפרדה היה כרוך ביצירת ציורים חדשים עם האובייקטים החדשים שהופרדו, אשר אומתו כדי להבטיח את סיווגם הנכון.
זיהוי אוטומטי של האובייקטים
תוצאות ערכת למידה
ערכת למידה היא קבוצה של ציורים של אובייקטים המסווגים לקטגוריות שונות על ידי מומחה ומשמשים במודל למידה מפוקח, וזה יכול להיקרא גם ערכת אימון27. ניתן לעבוד עם ערכת למידה קיימת, לעדכן את מערך הלמידה הקיים בערכים ו/או קטגוריות חדשות, או ליצור ערכת למידה חדשה לפרויקט ספציפי.
כדי לקבוע את ערכת הלמידה הטובה ביותר כדי להשיג במהירות את מבנה גודל המקרו-חסרי חוליות, מספר קבוצות למידה נוצרו ונבדקו באמצעות אימות צולב עם אלגוריתם היער האקראי. מטריצת הבלבול המתקבלת מציגה את הסיווג האמיתי (שורות) לעומת הסיווג האוטומטי (עמודות). ההיזכרות היא אחוז האורגניזמים השייכים לקטגוריה שסווגה באופן אוטומטי היטב, ואילו הדיוק 1 הוא אחוז האורגניזמים שסווגו בטעות על ידי האלגוריתם כשייכים לקטגוריה (זיהום בקטגוריה)33. ככלל אצבע, ההיזכרות צריכה להיות מעל 70%, והזיהום (דיוק 1) צריך להיות נמוך מ-20% כדי לשמור על קטגוריה במערך הלמידה. קבוצת הלמידה עם ההיזכרות והדיוק הגדולים ביותר עבור מקרו-חסרי חוליות מאומתת לאחר מכן עם תת-קבוצה של דגימות כדי לקבוע את הדיוק האמיתי שלה בזיהוי מקרו-חסרי חוליות.
שלושה סוגים של קבוצות למידה אטקסיות (גולמיות, בינוניות ומשובחות) עם קטגוריות המבוססות על התכונות המורפולוגיות של האובייקטים נבדקו. מערך הלמידה הגולמי כלל שלוש קטגוריות: מקרו-חסרי חוליות, חסרי חוליות אחרים (מיקרו-סרטנים) ופסולת (סיבים, חלקיקים וממצאים כמו כתמי זכוכית). מערך הלמידה הבינונית כלל 16 קטגוריות: 5 עבור מקרו-חסרי חוליות, 3 עבור חסרי חוליות אחרים ו-8 עבור פסולת. מערך הלמידה המשובח כלל 4 קטגוריות נוספות של מקרו-חסרי חוליות, ובסך הכל 20 קטגוריות (לוח 2).
בנוסף להגדרת הקטגוריות, נבדקה גם ההשפעה של מספר הווינטות לכל קטגוריה. כל ערכת למידה נבדקה בנפרד באמצעות 50 vignettes, 100 vignettes ו-300 vignettes בכל קטגוריה (ו-500 vignettes עבור ערכת הלמידה הגולמית עם שלוש קטגוריות). כל הקטגוריות היו מאוזנות במספרן, למעט "אוסטרקודה", "מקרו-חסרי חוליות ארוכים-עגולים" ו"מקרו-חסרי חוליות עגולים", שכללו פחות פרטים ב-100 ערכות הלמידה של vignette ו-300 vignette, משום שלא זוהו מספיק אורגניזמים מקטגוריות אלה בתמונות הסרוקות.
ההיזכרות והדיוק של מקרו-חסרי חוליות (כל הקטגוריות המקרו-אינוורברטיות יחד) ואורגניזמים (המקרו-חסרי חוליות וקטגוריות אחרות של חסרי חוליות יחד) נחשבו לבחירה של קבוצת הלמידה הטובה ביותר על-ידי אימות צולב (ראו טבלאות בקובץ משלים 2). ערכת הלמידה הטובה ביותר הייתה ערכת הלמידה הגולמית עם שלוש קטגוריות (מקרו-חסרי חוליות, חסרי חוליות אחרים ופסולת), עם 300 אובייקטים בכל קטגוריה (טבלה 2). ערכת הלמידה הגולמית שימשה לאחר מכן לאימות הסיווג האוטומטי של האובייקטים בתת-קבוצה של דגימות סרוקות.
| ערכת למידה | מספר קטגוריות | תמונות לכל קטגוריה | נזכיר אורגניזמים | נזכיר מאקרו-חסרי חוליות | אורגניזמים בעלי דיוק אחד | מקרו-חסרי חוליות ברמת דיוק אחת |
| גולמי | 3 | 50 | 0.97 | 0.84 | 0.12 | 0.24 |
| 100 | 0.96 | 0.87 | 0.06 | 0.17 | ||
| 300 | 0.95 | 0.91 | 0.09 | 0.15 | ||
| 500 | 0.93 | 0.88 | 0.13 | 0.2 | ||
| בינוני | 16 | 50 | 0.83 | 0.77 | 0.17 | 0.24 |
| 100 | 0.84 | 0.79 | 0.15 | 0.21 | ||
| 300 | 0.87 | 0.84 | 0.14 | 0.18 | ||
| קנס | 20 | 50 | 0.89 | 0.86 | 0.14 | 0.18 |
| 100 | 0.9 | 0.87 | 0.11 | 0.14 | ||
| 300 | 0.9 | 0.86 | 0.13 | 0.14 |
טבלה 2: ערכות למידה שנוצרו ונבדקו (גולמיות, בינוניות ומשובחות) עם הקטגוריות בתוך כל אחת מהן ומספר האובייקטים לכל קטגוריה. היזכרות ודיוק 1 של ערכות הלמידה שנוצרו. קטגוריות של קבוצת הלמידה הגולמית: מקרו-חסרי חוליות (1), חסרי חוליות אחרים (2), פסולת (3). קטגוריות של קבוצת הלמידה הבינונית: מקרו-חסרי חוליות ארוכים (1), מקרו-חסרי חוליות ארוכים וחלקים (2), מקרו-חסרי חוליות ארוכים (3), מקרו-חסרי חוליות עגולים (4), מקרו-חסרי חוליות עגולים (5), קלדוקרה (6), קופפודה (7), אוסטרקודה (8), אגרגטים (9), סיבים (10), ראשים (11), רגליים (12), כתמים (13), כתמים כהים (14), כתמים אפורים בהירים (15), כתמים עגולים (16). קטגוריות של קבוצת הלמידה העדינה: מקרו-חסרי חוליות ארוכים (1), מקרו-חסרי חוליות ארוכים וחלקים (2), מקרו-חסרי חוליות כהים חלקים וארוכים (3), מקרו-חסרי חוליות ארוכים (4), מקרו-חסרי חוליות ארוכים (5), מקרו-חסרי חוליות עגולים (6), מקרו-חסרי חוליות עגולים (7), מקרו-חסרי חוליות כהים עגולים (8), מקרו-חסרי חוליות עגולים (9), קלדוקרה (10), קופפודה (11), אוסטרקודה (12), אגרגטים (13), סיבים (14), ראשים (15), רגליים (16), כתמים (17), כתמים כהים (18), כתמים אפורים בהירים (19), כתמים עגולים (20).
אימות של זיהוי אוטומטי עם ערכת הלמידה הטובה ביותר
האובייקטים בתת-קבוצה של 42 תת-דגימות עדינות וגסות סווגו באופן אוטומטי על ידי ערכת הלמידה שנבחרה עם אלגוריתם היער האקראי. לאחר אימות ידני, ההיזכרות עבור כל הקטגוריות הייתה גבוהה (בממוצע, 0.94 עבור מקרו-חסרי חוליות, 0.95 עבור חסרי חוליות אחרים ו-0.92 עבור פסולת), בעוד שהזיהום (דיוק 1) היה נמוך למדי, למעט חסרי חוליות אחרים (0.25 עבור מקרו-חסרי חוליות, 0.84 עבור מקרו-חסרי חוליות אחרים ו-0.01 עבור פסולת) (איור 5 ). חסרי חוליות אחרים (מיקרו-סרטנים) היו נדירים בדגימות (נוכחים ב-17 מתוך 42 תת-דגימות); לפיכך, ההשוואה לא הייתה חזקה. יתר על כן, קטגוריה זו הושפעה מאוד מהזיהום בגלל הדמיון בצורה וברמות האפור לאובייקטים אחרים.
ההשוואה של שפע מקרו-חסרי חוליות אוטומטי לעומת מאומת הראתה כי אלה היו מתואמים מאוד (r של פירסון = 0.92, ערך p < 0.0001, n = 24 עבור תת-דגימות גסות; r של פירסון = 0.98, ערך p < 0.0001, n = 18 עבור תת-דגימות עדינות), עם הערכת יתר קלה על ידי הביצועים האוטומטיים עקב זיהום מפסולת (שיפועים < 1) (איור 6). לגבי ההשוואה של הנפח האליפסואידי הממוצע, גם המתאם היה גבוה (r של פירסון = 0.96, ערך p < 0.0001, n = 24 עבור דגימות גסות; r של פירסון = 0.99, ערך p < 0.0001, n = 18 עבור דגימות עדינות), ושיפוע ספקטרום הגודל היה קרוב ל- −1 (איור 6). ההבדל במדרונות בין השברים העדינים והגסים משקף את ההשפעה הגדולה יותר של סיווג שגוי בשברים בגודל גדול, הקשורה לספירת האורגניזמים הנמוכה שלהם.
פונקציות צפיפות ההסתברות של התפלגויות הגודל האינדיבידואליות של החיזוי האוטומטי הסכימו מאוד עם התחזיות המאומתות עבור תת-הדגימות העדינות, כמו גם עבור תת-הדגימות הגסות. עם זאת, היו כמה יוצאים מן הכלל עבור תת-הדגימות הגסות הקשורות למספר האורגניזמים, ולכן, השפעה גדולה יותר של סיווג שגוי במקרים אלה, כפי שהודגש קודם לכן (איור 7).
השפעת נגיעה באורגניזמים על התפלגויות הגודל הבודדות, ספקטרום הגודל ומדדי הגודל
בוצעה השוואה של התפלגויות הגודל שהתקבלו לפני ואחרי הפרדת האורגניזמים הנוגעים ולפני האימות בתת-קבוצה של חמש דגימות נבחרות כדי להעריך את ההשפעה של נגיעה בעצמים. כדי להשוות את התפלגויות הגודל, שולבו תת-הדגימות הגסות והעדינות, על פי הפיצול שלהן, כדי לשחזר מדגם המייצג את קהילת המקרו-חסרי חוליות. בשלוש דגימות, השפע לאחר האימות גדל (>500 פרטים) (איור 8A). למרות העלייה הזו, הנפח האליפסואידי הממוצע מתאים מאוד לזה שחושב בדגימות המאומתות (איור 8B).
התפלגויות הגודל של הדגימות המתוקנות (לאחר הפרדת האורגניזמים הנוגעים) היו שונות במקצת מאלו המאומתות. לפיכך, לנוכחותם של עצמים מרובים הייתה השפעה קטנה על התפלגויות הגודל בדגימות אלה (איור 9A-E). בהתאם לכך, מגוון הגודל המחושב על סמך הדגימות המתוקנות נמצא בקורלציה חזקה עם מגוון הגודל של הדגימות המאומתות (r של פירסון = 0.94, ערך p = 0.017, n = 5) (איור 9F).
באופן תיאורטי, לספקטרום גודל הביו-נפח המנורמל (NBSS) של קהילה עם מספר רמות טרופיות יש שיפוע ספקטרום גודל בסולם לוג2 המתקרב ל -1 בתנאי מצב יציב4. ל- NBSS בקהילות טבעיות יש לעתים קרובות בליטה ולא התפלגות ליניארית, וזה מיוחס בעיקר להטיית הדגימה של מחלקות הגודל הקטנות ביותר36. במחקר הנוכחי, הכיתה בגודל השלישי הייתה הנפוצה ביותר ב- NBSS.
ה-NBSS היו די דומים בין שלבי הפרוטוקול (איור 10A-C), למעט כמה מחלקות גודל בכמה ספקטרום (איור 10D-E). בהתאם לכך, שיפוע ספקטרום הגודל מחושב על סמך הדגימות המתוקנות נמצא בקורלציה חזקה עם השיפוע המבוסס על הדגימות המאומתות (r של פירסון = 0.99, ערך p ≤ 0.0001, n = 5) (איור 10F).
איור 2: דוגמאות לתמונות סרוקות בעלות איכויות שונות לפני ואחרי העיבוד. (A,B) תמונה גולמית (משמאל) ותמונה מעובדת (מימין) של תת-דגימה עדינה באיכות סריקה טובה; (ג,ד) תמונה גולמית (משמאל) ותמונה מעובדת (מימין) של תת-דגימה עדינה עם איכות סריקה גרועה (רקע כהה ותמונה חתוכה בקצה השמאלי); (E,F) תמונה גולמית (משמאל) ותמונה מעובדת (מימין) של דגימת משנה עדינה עם איכות סריקה גרועה (רקע כהה מפוקסל מאוד). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: קווי מתאר המייצגים עצמים שונים הנמצאים בדגימות. (A-E) פסולת (סיבים, כתם עגול, רגל מקרו-חסרי חוליות, כתמים ופסולת אורגנית); (F-I) מקרו-חולייתנים (קולאופטרה, דיפטרה, פלקופטרה וטריכופטרה) וחסרי חוליות אחרים (קלדוקרה, קופפודה ואוסטרקודה). פסי קנה מידה מציינים 1 מ"מ gma = 1.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: דוגמאות לפריטים המכילים אובייקטים מרובים. (A) מקרו-חוליות (הידראקרינה) המחובר לסיב; (B) אורגניזמים מרובים (Caenidae) המצטברים על ידי סיב; ו-(C) שני מקרו-חולייתנים נוגעים ללב (Chironomidae ו-Caenidae). פסי קנה מידה מציינים 1 מ"מ gma = 1.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תיבות של היזכרות וזיהום (דיוק 1). התיבות עבור שלוש הקטגוריות של מקרו-חסרי חוליות, חסרי חוליות אחרים ופסולת (300 vignettes לכל קטגוריה) של קבוצת הלמידה שנבחרה אומתו על תת-קבוצה של דגימות (n = 42). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: השוואה בין אומדני השפע והנפח האליפסואידי הממוצע בסיווג אוטומטי לעומת מאומת. (A) אומדני שפע בתת-הדגימות (n = 42) ו- (B) אומדני נפח אליפסואידיים ממוצעים בתת-הדגימות (n = 42). הנקודות הכהות תואמות את תת-הדגימות הגסות (רשת >0.5 ס"מ); הנקודות האפורות תואמות את תת-הדגימות העדינות (רשת >500 מיקרומטר). הקו המקווקו מייצג את קשר הגומלין 1:1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: פונקציות צפיפות הסתברות המייצגות את התרומה היחסית (ציר y) של הגודל הבודד בסולם היומן (ציר x) לצורך השוואה בין אומדנים אוטומטיים ובין אומדנים מאומתים. (A,B) אומדנים אוטומטיים ומאומתים עבור תת-דגימות גסות (n = 18), (C,D) אומדנים אוטומטיים ומאומתים עבור תת-דגימות עדינות (n = 24). (א,ג) השוואה בין אומדנים אוטומטיים והשוואה (B,D) בין אומדנים מאומתים. צבעים מייצגים כל תת-דגימה כדי לסייע בהבחנה בספקטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: השוואה בין אומדני הנפח האליפסואידי הממוצע בתת-דגימות מאומתות לעומת תת-דגימות שאומתו לאחר הפרדת עצמים נוגעים מדגימות טבעיות נבחרות (תת-דגימות עדינות וגסות יחד ). (A) הערכות שפע לפי מסגרת דגימה (n = 5) ו- (B) אומדני נפח אליפסואידיים ממוצעים (n = 5). הקו המקווקו מייצג את קשר הגומלין 1:1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: פונקציות צפיפות הסתברות המייצגות את התרומה היחסית (ציר y) של הגודל האינדיבידואלי ביומן בקנה מידה2 (ציר x) עבור החיזוי האוטומטי, חיזוי מאומת וחיזוי מאומת עם ערכי מגוון הגודל שלהם (Sd). (A-E) פונקציות צפיפות הסתברות עבור דגימות טבעיות נבחרות (תת-דגימות עדינות וגסות יחד) (n = 5); הקו האדום מתאים לחיזוי האוטומטי, הקו הכחול מתאים לחיזוי המאומת, והקו הירוק מתאים לדגימות המתוקנות (מאומתות לאחר הפרדת האובייקטים הנוגעים). (ו) השוואה בין אומדני גיוון גודל מאומתים לעומת מתוקנים; הקו המקווקו מתאים למערכת היחסים של 1:1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 10: ספקטרום גודל ביו-נפח מנורמל (NBSS) והשוואה של מדרונות NBSS (μ) בין טיפולים. (A-E) NBSS המייצג את הקשר בין ערך נקודת האמצע של כל מחלקת גודל בסולם היומן (ציר x) לעומת הביו-נפח המנורמל לכל מסגרת סריקה (ציר y) של חמש הדגימות שנבחרו עבור התחזיות האוטומטיות (צלבים אדומים), מאומתות (משולשים כחולים) ומתוקנות (עיגולים ירוקים) עם ספקטרום הגודל המתאים שיפועים (μ) המחושבים במחלקות הגודל ממחלקת הגודל המודאלית ומעלה (מחלקת הגודל השלישית מסומנת על ידי הקו המקווקו האנכי). (ו) השוואת השיפועים המחושבים על הדגימות המאומתות לעומת אלה המתוקנות (לאחר הפרדת העצמים הנוגעים). הקו המקווקו מתאים למערכת היחסים 1:1, r2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
קובץ משלים 1: סקריפט Matlab לביצוע החישובים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: אימות צולב, אחזור ודיוק 1 של ערכות הלמידה שנוצרו. (א) ערכת למידה גולמית עם 3 קטגוריות ו-50 ציורים לכל קטגוריה; (B) ערכת למידה גולמית עם 3 קטגוריות ו-100 vignettes לכל קטגוריה; (ג) ערכת למידה גולמית עם 3 קטגוריות ו-300 ציורים לכל קטגוריה; (D) ערכת למידה גולמית עם 3 קטגוריות ו-500 vignettes לכל קטגוריה; (E) ערכת למידה גולמית עם 5 קטגוריות ו-50 vignettes לכל קטגוריה; (ו) ערכת למידה גולמית עם 5 קטגוריות ו-100 ציורים לכל קטגוריה; (G) ערכת למידה גולמית עם 5 קטגוריות ו-300 ציורים לכל קטגוריה; (H) מערך למידה ביניים עם 16 קטגוריות ו-50 vignettes לכל קטגוריה; (I) מערך למידה ביניים עם 16 קטגוריות ו-100 vignettes לכל קטגוריה; (J) מערך למידה ביניים עם 16 קטגוריות ו-300 vignettes לכל קטגוריה; (K) ערכת למידה משובחת עם 20 קטגוריות ו-50 ציורים לכל קטגוריה; (L) ערכת למידה משובחת עם 20 קטגוריות ו-100 ציורים לכל קטגוריה; ו-(M) ערכת למידה משובחת עם 20 קטגוריות ו-300 ציורים לכל קטגוריה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההתאמה של המתודולוגיה שתוארה על ידי Gorsky et al. 2010 עבור מקרו-חסרי חוליות של נהרות מאפשרת דיוק סיווג גבוה בהערכת מבנה גודל הקהילה במקרו-חסרי חוליות של מים מתוקים. התוצאות מצביעות על כך שהפרוטוקול יכול לקצר את הזמן להערכת מבנה הגודל הבודד במדגם לכשעה. לפיכך, הפרוטוקול המוצע נועד לקדם את השימוש השגרתי בספקטרום בגודל מקרו-חסרי חוליות כביו-אינדיקטור מהיר ואינטגרטיבי להערכת ההשפעה של הפרעות במערכות אקולוגיות של מים מתוקים. ספקטרום הגודל של המקרו-חסרי חוליות כבר שימש כמדד מוצלח להערכת המצב האקולוגי של לגונות החוף22. עם פיתוח הפרוטוקול, ניתן לבצע סקרים אינטנסיביים על חסרי חוליות כדי לאפשר מסעות ניטור בשטח המכסים קני מידה מרחביים וזמניים גדולים.
מכיוון שמטרת פרוטוקול זה היא להשיג את התפלגות הגודל האינדיבידואלי של הקהילה שנדגמה בצורה מהירה, תוך התעלמות מטקסונומיה, מומלץ ליצור מערך למידה פשוט כמו זה המוצע כאן. מבחנים של קבוצות למידה עדינות יותר, עם מספר גבוה יותר של קטגוריות, מעניקים זיכרון ודיוק נמוכים יותר עבור מקרו-חסרי חוליות בכללותם (טבלה 2), ושלב האימות גוזל זמן רב יותר.
החיזוי האוטומטי תואם מאוד את החיזוי המאומת של 42 תת-דגימות טבעיות מאתרי דגימה שונים, מה שמרמז על כך שהשיטה במצב אוטומטי מתאימה לספירה ולמדידה של המקרו-חסרי חוליות בדגימות טבעיות (איור 6). יתר על כן, הדמיון ב-NBSSs בין התחזיות האוטומטיות והמאומתות לבין ההתאמה הגבוהה למודל התיאורטי הליניארי מצביע על כך שהמצב האוטומטי הוא שיטה מבטיחה למחקרים אקולוגיים תיאורטיים (איור 10).
במהלך ההתאמה של פרוטוקול זה, נתקלו במספר בעיות, והן נפתרו או צומצמו בדרכים שונות. בעיה שיש לקחת בחשבון בעת סריקת דגימות מקרו-חסרי חוליות היא המראה של אזורים רוויים כהים. לכן, חשוב לבדוק את התמונות המעובדות, הסרוקות בהקדם האפשרי כדי לזהות בעיה זו ולחזור על הסריקה במידת הצורך. בעיה זו נמצאה גם בעת סריקת פלנקטון33, אך היא מוגברת על ידי שימוש באתנול במקום במי ברז. לא מומלץ להשתמש במי ברז, שכן האורגניזמים שהשתמרו ב-70% אתנול ייסחפו על פני השטח. למרות שהמכשיר מתוכנן להתנגד לאתנול מדולל (5%), דגימות חסרי החוליות נשמרות עם 70% אתנול. גם פעולה עם ריכוזים נמוכים יותר של אתנול אינה מומלצת, שכן האורגניזמים עלולים להיפגע באמצעות תהליכי התייבשות והתייבשות37. הפתרון המוצע, המומלץ ביותר, הוא לשטוף את מגש הסריקה במים מתוקים מספר פעמים לאחר כל סריקה המבוצעת עם אתנול. זה מונע הצטברות של משקעים שעלולים לשנות את רקע התמונה ומגן על הזכוכית של מגש הסריקה מפני קורוזיה.
בעיה נוספת שזוהתה היא נוכחות של vignettes עם אורגניזמים מרובים, אשר יכול לשנות את ספקטרום הגודל בגלל הערכת חסר של אנשים בגדלים מסוימים. כאשר מספר האובייקטים עם אובייקטים מרובים נמוך (<10%), כמו במחקר זה, לנוכחותם של אובייקטים מרובים יש השפעה קטנה על התפלגויות הגודל וה-NBSS בדגימות אלה (איור 9 ואיור 10). זה מצביע על כך, כדי לקבל מבנה גודל מייצג של הקהילה macroinvertebrate, אין צורך להשקיע זמן בשלב 1.5 של הפרוטוקול (הפרדת אורגניזמים נוגעים), אשר עיבוד מחדש של התמונה נמשך כ 1.5 שעות. במקום זאת, מומלץ מאוד לקחת זמן בשלב 2.5 של הפרוטוקול (הפרדת אורגניזמים נוגעים או אגרגטים באמצעות מחט עץ), אשר הרבה פחות זמן רב (מקסימום 30 דקות) ומבטיח הערכה נכונה של התפלגויות גודל במצבאוטומטי 30. אפשרות להפחית את מספר האורגניזמים הנוגעים היא לעבוד עם פחות אורגניזמים בכל סריקה, אך יש לקחת בחשבון את הזמן המושקע בסריקת דגימה אחת במספר גבוה של שברים ואת האפשרות לצבירה של אורגניזמים. פתרון אחר יהיה לשמר רק תת-דגימה שתאפשר חישוב ספקטרום גודל מייצג בעת מיון האורגניזמים במעבדה במקום לשמר את כל האורגניזמים שנדגמו, כפי שנעשה בעבודה זו. הירידה במספר האורגניזמים לכל דגימה תפחית את ההסתברות לגעת באורגניזמים. יתר על כן, כאשר פחות אנשים מאוחסנים, המדגם מכיל פחות פסולת, אשר מקל על ההפרדה, במיוחד אם סיבים ניתן להימנע.
המגבלה הנצפית של שיטת הסיווג האוטומטית קשורה לנוכחות נמוכה של מיקרו-סרטנים (קטגוריה: מקרו-חולייתנים אחרים) בדגימות המשומשות. חוסר הייצוג של מיקרו-סרטנים יכול להשפיע על הסיווג הנכון שלהם ולהגביל את הדיוק של החיזוי האוטומטי עבור קטגוריה זו. עם זאת, הקטגוריות האחרות, פסולת ומקרו-חסרי חוליות, שהם המטרה העיקרית של עבודה זו, מציגים היזכרות ודיוק גבוהים. חלופות לשימוש במכשיר סורק זה יהיו להתאים סורק משותף שיחזיק מסגרות מים, לקדם קודים בקוד פתוח לעיבוד דגימות ולמידת מכונה כמו זה המסופק כאן, ולכתוב קודים למדידת אורגניזמים תחת מיקרוסקופ עם מצלמה או באמצעות שטף עם סט של מצלמות. זה נעשה במספר הזדמנויות 23,24,25,26,38,39,40, אך השיטה שאנו מציעים מסדירה את פרמטריזציה הסריקה על מנת לקבל אומדני גודל דומים, שקשה לשלוט בהם עם המערכות האחרות. יתר על כן, הפרוטוקול המוצע ומכשיר הסריקה מוכנים לשימוש, קוד פתוח, וכבר הוקמו בקהילת מזוזופלנקטון הימית. בסך הכל, ההתאמה של פרוטוקול זה מדגימה אפיק מבטיח לשימוש בשיטת הדמיה אוטומטית זו כדי להשיג את מבנה הגודל של מקרו-חסרי חוליות במים מתוקים ביעילות ולבחון את הפוטנציאל של מדדי גודל להערכה ביולוגית של מים מתוקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים פוטנציאליים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי (מענק מספר RTI2018-095363-B-I00). אנו מודים לחברי CERM-UVic-UCC אליה ברטקסה, אנה קוסטרוסה, לאיה חימנס, מריה איזבל גונזלס, מרתה יוטגלר, פרנצ'סק לאך ונוריה סלארס על עבודתם בדגימת שדה מקרו-חסרי חוליות ומיון מעבדה ולדוד אלבסה על שיתוף הפעולה בסריקת הדגימות. לבסוף אנו מודים לג'וזפ מריה גילי ולמכון Ciències del Mar (ICM-CSIC) על השימוש במתקני המעבדה ובמכשיר הסורק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
References
- Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe's surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
- Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
- Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
- Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
- Woodward, G., et al.
- Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
- White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
- Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography - Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
- Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
- Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
- Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
- Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
- Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l, Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
- Benejam, L. l, Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
- Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
- Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
- Townsend, C. R., Thompson, R. M. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
- Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
- García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
- Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
- Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
- Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
- Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
- Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
- Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
- Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
- Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
- Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
- Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
- Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
- García-Comas, C., Picheral, E. Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting. , Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013).
- Picheral, E. ZooSCAN: Manual to scan and process samples. Quantitative Imaging Platform of Villefranche sur Mer (PlQv). , Available from: http://www.hydroptic.com/assets/uploads/files/documentations/ae4e0-zooscan_user_manual.pdf (2020).
- Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. , Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013).
- García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
- García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
- Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
- Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
- Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
- Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).
