Summary
本文基于创建适应协议，以使用半自动成像程序扫描，检测，分类和识别与底栖河流大型无脊椎动物相对应的数字化物体。该程序允许在大约1小时内获得大型无脊椎动物群落的个体尺寸分布和尺寸指标。
Abstract
体型是一个重要的功能性状，可用作评估自然群落扰动影响的生物指标。群落规模结构响应生物和非生物梯度，包括跨分类群和生态系统的人为扰动。然而，手动测量底栖大型无脊椎动物等小型生物（例如，>500 μm 至几厘米长）非常耗时。为了加快群落规模结构的估计，我们开发了一种协议来半自动测量受保护的河流大型无脊椎动物的个体体型，这是评估淡水生态系统生态状况最常用的生物指标之一。该协议改编自现有的方法，该方法旨在使用专为水样设计的扫描系统扫描海洋中游动物。该协议包括三个主要步骤：（1）扫描河流大型无脊椎动物的子样本（细样本和粗样本量分数）并处理数字化图像以个性化每个图像中的每个检测到的对象;（2）通过人工智能创建、评估和验证学习集，以半自动地将大型无脊椎动物的单个图像与扫描样本中的碎屑和人工制品分开;（3）描绘大型无脊椎动物群落的大小结构。除协议外，这项工作还包括校准结果，并列举了几个挑战和建议，以使该程序适应大型无脊椎动物样品并考虑进一步改进。总体而言，研究结果支持使用所提出的扫描系统对河流大型无脊椎动物进行自动体型测量，并表明其尺寸谱的描述是淡水生态系统快速生物评估的宝贵工具。
Introduction
底栖大型无脊椎动物被广泛用作确定水体生态状况的生物指标1。大多数描述大型无脊椎动物群落的指数都侧重于分类指标。然而，鼓励使用整合体型的新生物评估工具，为分类学方法提供替代或补充视角2，3。
体型被认为是与其他重要特征（如新陈代谢、生长、呼吸和运动）相关的元特征4.此外，体型可以决定营养位置和相互作用5。群落中个体体型与按大小等级标准化生物量（或丰度）之间的关系定义为尺寸谱6，并遵循随着个体大小在对数尺度上增加而归一化生物量线性减少的一般模式7。这种线性关系的斜率在理论上得到了广泛的研究，跨生态系统的实证研究将其作为群落规模结构的生态指标4。在生物多样性生态系统功能研究中成功使用的群落规模结构的另一个综合指标是群落规模多样性，它表示为大小谱或其类似物的大小类别的香农指数，该指数是根据个体大小分布8计算的。
在淡水生态系统中，不同动物群落的大小结构被用作共济失调指标，以评估生物群落对环境梯度9，10，11和人为扰动12，13，14，15，16的响应。大型无脊椎动物也不例外，它们的大小结构也对环境变化17，18和人为扰动做出反应，例如采矿19，土地利用20，或氮（N）和磷（P）富集20，21，22。然而，测量数百人以描述社区规模结构是一项繁琐且耗时的任务，由于时间不足，通常避免将其作为实验室的常规测量。因此，已经开发了几种半自动或自动成像方法来分类和测量标本23，24，25，26。然而，这些方法中的大多数都侧重于分类学分类，而不是生物体的个体大小，并且尚未准备好用于所有种类的大型无脊椎动物。在海洋浮游生物生态学中，扫描图像分析系统已被广泛用于确定浮游动物群落的大小和分类组成27，28，29，30，31。该仪器可以在世界各地的几个海洋研究所找到，它用于扫描保存的浮游动物样品以获得整个样品的高分辨率数字图像。本议定书调整了该仪器的使用，以快速自动的方式估计河流中大型无脊椎动物群落的大小范围，而无需投资创建新设备。
该协议包括扫描样品和处理整个图像，以自动获得样品中对象的单个图像（即晕影）。形状、大小和灰度特征的几种测量表征了每个对象，并允许将对象自动分类为类别，然后由专家进行验证。每个生物体的个体大小是使用椭球体生物体积（mm3）计算的，该生物体积来自以像素为单位测量的生物体面积。这允许快速获得样品的尺寸谱。据我们所知，这种扫描成像系统仅用于处理中浮游动物样品，但该设备可能允许处理淡水底栖大型无脊椎动物。
因此，本研究的总体目标是引入一种方法，通过调整以前用于海洋中游生物27，32，33的现有协议，快速获得保存的河流大型无脊椎动物的个体大小。该过程包括使用半自动方法，该方法与扫描设备一起扫描水样和三个开放式软件来处理扫描的图像。本文提出了一种经过调整的协议，用于扫描、检测和识别数字化河流大型无脊椎动物，以自动获取群落规模结构和相关规模指标。还根据从伊比利亚半岛东北部（东北）三个盆地（Ter、Segre-Ebre和Besòs）收集的42张河流大型无脊椎动物样本的扫描图像，对提高效率的程序和准则进行了评估。
这些样品是在100米长的河段收集的，遵循西班牙政府对可涉足河流中底栖河流大型无脊椎动物进行实地取样和实验室分析的协议34。在多栖息地调查后，用苏伯采样器（框架：0.3 m x 0.3 m，目数：250 μm）收集样品。在实验室中，将样品通过5毫米和500μm网清洁和筛分，以获得两个子样品：粗子样品（5毫米目）和精细子样品（500微米目），它们储存在单独的小瓶中并保存在70%乙醇中。将样品分成两个大小的分数可以更好地估计群落大小结构，因为大型生物比小型生物更稀有且更少。否则，扫描样品具有大尺寸分数的偏差表示。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：此处描述的协议基于Gorsky等人为海洋中浮游动物开发的系统27 。扫描仪（ZooSCAN）、扫描软件（VueScan 9x64 [9.5.09]）、图像处理软件（Zooprocess、ImageJ）和自动识别软件（浮游生物标识符）步骤的具体描述可以在之前的参考文献32，33中找到。为了最好地调整底栖大型无脊椎动物相对于中游动物的大小，一旦按照原始协议32，33 创建项目，请将配置文件中的最小尺寸 （minsizeesd_mm） 参数更改为 0.3 毫米，将最大尺寸 （maxsizeesd_mm） 参数更改为 100 毫米。为了帮助遵循协议，这总结在工作图表中（图1）。创建的项目存储在计算机的 C 文件夹中，并组织在以下文件夹中：PID_process、Zooscan_back、Zooscan_check、 Zooscan_config、Zooscan_meta、Zooscan_results和 Zooscan_scan。每个文件夹由多个子文件夹组成，不同的软件应用程序在协议的以下步骤中使用了这些子文件夹。
1. 大型无脊椎动物样本的数字图像采集
- 扫描和处理毛坯
注意：扫描前每天创建两个空白图像，以提取背景扫描，同时在同一天处理扫描的图像。- 打开扫描仪并打开双位置的灯，从顶部和底部投射白光。
注意：扫描中游生物样品时，使用向上的光方向，但由于大型无脊椎动物更不透明，建议将光切换到双位置。 - 清洁并用自来水冲洗扫描托盘。
- 将 110 mL 室温 （RT） 下储存的自来水倒入扫描托盘中，直到玻璃被覆盖。将大框架（24.5 cm x 15.8 cm）放在扫描托盘上的正确位置（角落位于扫描托盘的左上角），并用自来水填充，直到框架的台阶被覆盖，以避免弯月面效应，这会改变扫描的图像。合上扫描仪盖。
注意：在室温下用水以避免冷凝和气泡形成。清洁框架时没有痕迹或液滴，以避免光反射。 - 转到图像处理软件，选择工作项目，然后单击扫描 （转换）背景图像。
- 转到扫描软件，然后单击 预览。确保预览扫描的图像，检查没有线条或斑点，并等待至少30秒，然后再开始另一次扫描。单击 扫描并在第二次扫描前的说明窗口中按 确定 ，将数据从扫描软件发送到图像处理软件。
注：扫描两次以获得将构成空白的两个后台扫描。此步骤每天在开始示例处理之前执行一次，图像存储在 Zooscan_back文件夹中。 - 完成扫描后关闭扫描软件。
- 打开扫描仪并打开双位置的灯，从顶部和底部投射白光。
- 样品制备和扫描
注意：乙醇是一种易燃液体，可能会造成严重的眼睛损伤/刺激。- 填写示例元数据。转到图像处理软件，然后选择 填写示例元数据。输入示例标识，单击“ 确定”，然后填写元数据。
注意：图元文件是专门为中浮游动物样本创建的，因此它不符合底栖大型无脊椎动物采样方法，但在扫描之前需要填写文件的所有字段，否则会弹出错误标志。 - 将 110 mL 70% 乙醇倒入扫描托盘中，直到玻璃被覆盖，然后将大框架 （24.5 cm x 15.8 cm） 放在扫描托盘左上角。
注意：使用乙醇而不是水，因为大型无脊椎动物保存在乙醇中。在水中，它们在扫描托盘中漂浮和漂移，从而防止图像清晰，从而防止可靠的尺寸测量。乙醇应保存在室温下，以避免冷凝和气泡形成。 - 将大型无脊椎动物样品倒入框架边缘的扫描托盘中，如果需要，用更多的乙醇覆盖框架步骤。
注意：避免添加过多的乙醇，以避免生物体漂浮和漂移。 - 在整个框架区域中均质化样品，将最大的个体放在托盘的中心以进行适当的图像处理，并使用木针沉入漂浮的生物体。
注意：如果子样本在数值上包含超过 1，000 个个体，请将子样本分成两个或多个部分，以尽量减少扫描图像中的接触生物，并分别扫描部分。 - 使用木针将接触的生物和接触框架边缘的生物分开。
注意：此步骤需要 5-20 分钟。触摸生物体被软件视为单个物体;因此，在这些情况下，计算的个体大小与实际的单个生物体不对应，并且可能使群落规模结构的估计产生偏差。可以使用图像处理软件编辑图像以将它们分开，但此附加步骤涉及至少 1.5 小时的重新处理;因此，强烈建议手动分离。 - 要扫描样品，请合上扫描仪盖，转到图像处理软件，选择工作项目，然后单击带有 Zooscan 的 SCAN 样品（用于存档，无处理）。
- 选择示例并按照说明进行操作。
- 转到扫描软件，然后单击 预览。确保预览扫描的图像，检查没有线条或斑点，并在开始另一次扫描之前等待至少 30 秒。
- 至少 30 秒后，单击扫描软件中的 “扫描 ”按钮。
注：在扫描软件中按扫描后，在图像处理软件中按OK。请勿按计算机键盘上的任何键，并避免扫描过程中的振动。在Zooscan_scan > _raw文件夹中生成三个文件：（i） 标记的图像文件格式 （.tif） （16 位）;（ii） 名为LOG （.txt）的标准文本文件，记录有关扫描参数的信息;以及 （iii） 名为 META （.txt） 的标准文本文件，其中包含有关抽样方法的信息。 - 验证原始扫描是否正确。
注：如果扫描有浅色条纹或其他可见问题，请考虑重复扫描以避免以下步骤中出现问题。
- 填写示例元数据。转到图像处理软件，然后选择 填写示例元数据。输入示例标识，单击“ 确定”，然后填写元数据。
- 样品回收
- 取下框架并使用装有70%乙醇的挤压瓶将其冲洗在扫描托盘上方，以回收任何附着的大型无脊椎动物。
- 抬起扫描仪的上部，通过扫描检索漏斗从托盘中取出所有生物体和乙醇，放入烧杯中。在扫描仪的上部仍然抬起的情况下，用挤压瓶冲洗托盘以扫除任何剩余的生物。
- 将标本和乙醇从烧杯中穿过500μm网状物，将无脊椎动物保留在网状物中，并将它们储存在装有70%乙醇的小瓶中。
- 在小瓶中回收所有标本后，用自来水清洁托盘。
注意：在样品之间用自来水清洗托盘，以尽量减少乙醇沉淀，这会改变图像处理。用自来水冲洗框架，以避免与乙醇使用相关的潜在损坏。在一天结束时，用自来水清洁托盘并用纸轻轻擦干以避免划伤。
- 图像处理
- 转到图像处理软件，选择“批处理模式下转换和处理图像和 生物”，然后选择“转换和处理图像和粒子”（RAW文件夹中的图像）。保留默认设置，然后单击 确定。 正常结束 将出现在进程结束时。
注意：将在 Zooscan_scan > _work文件夹中创建一个PID文件和与扫描图像中所有检测到的对象相对应的小插图（在联合摄影组文件[.jpg]中）。PID文件是存储所有元数据（图元文件），与日志文件关联的技术数据以及包含图像中检测到的所有对象的36个测量变量的表格的单个文件。测量变量对应于灰度、分形维数、形状和大小的不同估计值。可用于尺寸估计的变量是面积以及与物体面积相等的椭圆的长轴和短轴（参见协议的第 3 节）。处理时间取决于图像密度和计算机特性，并且可以在样品之间启动，同时恢复和制备下一个样品。否则，建议在夜间以批处理模式开始每天扫描的样品的处理，并在第二天早上检查图像处理是否正确。 - 使用图像处理软件或通过检查位于 Zooscan_scan > _work中的遮罩图像（以msk1.gif终止）来检查处理后图像中的背景是否从样本图像中适当地减去。如果背景包含饱和区域或许多点，请考虑重复扫描以确保高质量的图像。
注：为避免背景中出现饱和区域，每次用乙醇扫描后，应用自来水冲洗扫描托盘。同样重要的是（1）减少扫描个体的数量（通过分馏样品并以不同的折叠扫描）;（2）确保将大型生物放置在扫描托盘的中心;（3）使用清洁、过滤的乙醇;（4）减少样品上的脏污;（5）确保用于扫描的乙醇量充足;（6）确保样品预览和扫描之间的延迟至少为30秒。
- 转到图像处理软件，选择“批处理模式下转换和处理图像和 生物”，然后选择“转换和处理图像和粒子”（RAW文件夹中的图像）。保留默认设置，然后单击 确定。 正常结束 将出现在进程结束时。
- 接触生物的分离
注意：当有几个带有接触生物的小插图时，有必要将接触生物的图像与其他生物和/或纤维/碎片分开，以确保正确估计群落大小结构。- 转到图像处理软件以检测具有多个对象的晕影。选择 使用晕影分离 ，然后按 确定。在配置选择窗口中，保留默认设置并单击 确定。
- 在 “与 晕影分离”窗口中，保留默认设置，另外选择 “在晕影上添加轮廓”，然后选择要编辑的样本。
- 通过用鼠标画一条线来分隔弹出的每个小插图中的触摸生物（按滚动按钮绘制）。晕影中的分离完成后，单击窗口右上角的 X 按钮，然后按“ 是” 处理下一个。按 NO 结束并保存更改。在该过程结束时，如果一切正确，将出现 正常结束 。
- 分离后，对图像进行重新处理，获取更新后的对象数据。转到图像处理软件，单击“处理（ 转换）图像（处理一）”，然后选择“ 从WORK子文件夹中处理的图像中再次处理粒子”。选择样本，然后在“ 单个图像处理 ”窗口中，保留默认设置，选中“ 使用分离蒙版（创建-修改-包含）”，然后单击“ 确定”。在该过程结束时，如果一切正确，将出现 正常结束 。
- 在 “分离控制 ”窗口中，按 “确定” 以在处理之前保存带有轮廓的图像;如果存在以前的映像，则将替换该映像。
- 在“分离控制掩码”窗口中，如果需要，请选择“编辑”以使用鼠标将分离线添加到掩码，以分离之前在使用小插图分离步骤中未出现的接触生物。完成后，结束该过程，然后在“分离掩码控制”窗口中，选择“是”以接受掩码。在该过程结束时，如果一切正确，将出现正常结束。
注意：使用分离掩模重新处理样品非常耗时（每个样品可能需要1.5小时以上）。最好在步骤 1.2.5 中指定所需的时间以避免此额外步骤。
2. 自动识别物体
注意：创建一个学习集以自动预测检测到的对象的身份，从而将生物体与样本中的碎片分开。
- 学习集创建
- 复制图像和与图像关联的 .pid 文件，这些文件将用于创建从 Zooscan_scan > _work 到 PID_process > Unsorted_vignettes_pid的学习集类别。
注意：选择具有高分类群多样性和不同采样地点和/或采样季节的样品子集，以确保样品中生物的最大代表性。 - 在 “PID_process >学习集”文件夹中，创建一个具有新学习集名称（即 yyyymmdd_raw_LS）的子文件夹，并在其中创建与学习集的每个类别（即大型无脊椎动物、碎片、其他无脊椎动物）对应的子文件夹。
注意：为了有效地获得河流大型无脊椎动物样本的群落大小结构，建议仅使用基于三个类别的学习集：大型无脊椎动物、其他无脊椎动物和碎片。该学习集基本上将对应于生物体的物体的小插图与对应于碎片（例如纤维、颗粒或丝状藻类）的小插图分开。 - 转到图像处理软件（仅限高级模式）并选择 提取小插图作为 PLANKTON 标识符（用于训练的未分类小插图）。保留默认选项并选中 添加轮廓 框。
- 转到自动识别软件，单击“学习”，PID_process > Learning_set为新学习集创建的子文件夹（步骤 2.1.2）中进行选择，然后按 OK。
- 在打开的窗口的左侧部分（未排序的拇指）中，选择 文件夹未排序vignettes_pid。选择晕影并用鼠标将它们从未排序的拇指拖动到右侧部分“排序的拇指”中相应类别的文件夹，以将每个对象分类到定义的类别中。移动的小插图将标有红色 X。
注意：通过在排序的拇指文件夹中创建子文件夹来手动定义类别，或通过单击软件中的文件夹图标来创建类别。不要同时移动超过 50 个小插图。 - 使用所选对象完成所有类别（每个类别约 300 个对象）后，单击“ 创建学习文件 ”并使用所需的名称保存它。
注意：学习集将作为 .pid 文件保存在项目的 “PID_process >学习集 ”文件夹中。建议创建和测试多个具有不同类别级别（从粗形式到精细形式）的学习集，并且每个类别中对象数量具有不同的平衡。从类别数量较少且每个类别至少 50 个对象的粗略学习集开始，然后增加每个类别中的对象数量和/或创建更精细的学习集。类别应代表其在样本集中的可变性。
- 复制图像和与图像关联的 .pid 文件，这些文件将用于创建从 Zooscan_scan > _work 到 PID_process > Unsorted_vignettes_pid的学习集类别。
- 对学习集的评估
注意：使用随机森林方法和自动识别软件执行两折和五次试验的交叉验证，以获得对象分类结果的混淆矩阵。- 转到自动分类软件，然后单击 数据分析。
- 在 “选择学习文件”中，从“学习集”中选择创建的 学习集文件PID_process >。
- 在“选择方法”中，选择“交叉验证随机林”方法。在“原始变量”中，取消选中位置变量（X、Y、XM、YM、BX、BY 和“高度”）。在自定义变量中，仅勾选 ESD。
注意：此方法使用学习集的一个随机部分来识别另一部分（两折），并重复五次以确保其在统计上是稳健的。 - 单击“ 开始分析”，然后将结果保存为 Analysis_name.txt “ PID_process >预测”文件夹中。成功完成分析后，退出数据分析。
- 转到“ PID_process >预测”文件夹，然后单击交叉验证文件。将弹出一个窗口，其中包含真实分类（行）与自动分类（列）的混淆矩阵。
注意：召回率是属于自动被充分识别的组的生物的百分比，而 1 精度是被算法分类为未识别组（组中的污染）的生物的百分比。召回率应高于70%，污染（1精度）应低于20%。 - 如果创建了多个学习集，并且需要获得每个学习集的召回率和 1 精度，请重复步骤 2.1-2.5。
注意：如果创建了多个学习集，请选择感兴趣的组（即大型无脊椎动物）的召回率最高（良好识别）和精度（低污染）的学习集，以测试下一步中一组样本的自动预测。
- 大型无脊椎动物鉴定预测
注意：使用选定的学习集，使用具有随机森林算法的自动识别软件来预测样本子集中所有对象的身份。- 转到自动识别软件，然后单击 数据分析。
- 在 “选择学习文件”中，从“学习集”中选择必须用于预测 PID_process >学习集 文件。
- 在 “选择示例文件”中，从 PID_results 文件夹中选择要预测的示例（PID 文件）。
注意：最多同时处理 20 个 .pid 文件，以避免与内存问题相关的错误。如果同时处理太多.pid文件，则该过程将显示正确的结束，但可能无法很好地处理，并且在使用图像处理软件处理时，后续步骤可能会出现错误。 - 在“选择方法”中，选择“随机森林”方法。勾选保存每个样品的详细结果。在“原始变量”中，取消选中位置变量（X、Y、XM、YM、BX、BY 和“高度”）。在自定义变量中，仅勾选 ESD。
- 单击“ 开始分析”，然后将结果另存为 Analysis_name.txt “ PID_process >预测”文件夹中。
- 手动验证
注意：专家手动验证上一步中的预测，以将错误分类的对象重新分类为正确的类别。- 将要验证 的Analysis_sample_dat1.txt 文件从 “PID_process >预测 ”文件夹复制到 “PID_process > Pid_results”文件夹。
- 转到图像处理软件，然后选择根据 预测或验证提取文件夹中的小插图。然后，选择使用 “pid_results”文件夹中的预测文件。保留默认设置，然后按 确定。
- 该软件创建一个名为 sample_yyyymmdd_hhmm_to_validate 的文件夹，其中包含 PID_process >已排序小插图文件夹中的预测对象。
- 转到“PID_process >已排序的小插图”文件夹，然后将文件夹复制到sample_yyyymmdd_ hhmm_to_validate。将文件夹名称替换为_validated_to验证。
- 要手动验证自动分类，请打开文件夹 sample_yyyymmdd_ hhmm_validated，并查看每个子文件夹（类别）中的所有穿插画，以确定是否存在错误分类的对象。当一个对象分类错误时，使用鼠标将晕影拖动到正确的文件夹（类别）。
- 转到图像处理软件，然后 从排序的小插图中选择加载标识。保留默认设置，然后选择要处理 yyyymmdd_hhmm_name_validated。
- 转到 PID_process > Pid_results > Dat1_validated，其中已创建一个名为 Id_from_sorted_vignettes_yyyymmdd_hhmm.txt 的文件，并为每个已验证的示例 （sample_tot_1_dat1.txt） 创建一个.txt文件。
注意：这些.txt文件包含一个显示预测的新列，称为pred_valid_Id_yyyymmdd_hhmm，它指定每个对象的专家分类（即，经过验证的分类）。此时，在审定期间，可以创建新的类别（例如，更精细的分类类别）。但是，请将原始类别的名称保留在新名称中（例如，macroinvertebrate_chironomidae）。这允许在计算召回率和精度时追溯原始类别，并轻松对所有大型无脊椎动物进行分组以计算群落大小结构参数（即大小谱和大小多样性）。该文本文件提供与每个对象相关的数据，包括用于获取每个生物体的椭圆体体积作为个体体型度量的短轴和长轴。此外，表的最后两列包含每个对象（行）的预测和验证类别，允许按类别计算样本子集上学习集的召回率和精度。
图 1：代表协议第 1 节和第 2 节的工作图。时间是说明性的，可能会根据计算机、要处理的小插图的丰富程度以及学习集的类别数量而变化。这种情况对应于在一组 42 个子样本（总共 47，473 个小插图）上验证三个类别的学习集。请点击此处查看此图的大图。
3. 计算个体尺寸分布、尺寸谱和尺寸指标
注意：本节中提到的计算是使用 Matlab 执行的（请参阅作为补充文件 1 的脚本）。
- 个体尺寸分布
- Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt文件的最后一列包含对象的已验证分类。仅选择分类为大型无脊椎动物的物体，以描述它们在样品中的个体大小分布。
注意：个体体型对应于大型无脊椎动物的椭球体体积。系统以像素为单位提供测量值。 - 将矢量与两次扫描的大小测量值连接起来，因为每个分数都有不同的子采样指数。在串联之前，通过复制大小向量与相应的子样本分馏的次数一样多来校正分馏。
注意：如果扫描对应于样品的一小部分（即粗或细），则需要执行此步骤。 - 从与生物体具有相同像素面积的椭圆体的大 （M） 轴和小轴 （m） 计算椭球体体积。在计算椭球体积之前，使用以下转换因子 （cf） 将长轴 （M） 和短轴 （m） 从像素转换为毫米 （mm）：
1 像素 = 2，400 dpi
1 英寸 = 25.4 毫米
cf = 25.4/2400
椭圆体体积（椭圆体积，单位为mm 3）对应于：
- 描述对数2 刻度上单个大小分布的概率密度函数。
- Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt文件的最后一列包含对象的已验证分类。仅选择分类为大型无脊椎动物的物体，以描述它们在样品中的个体大小分布。
- 尺寸多样性
- 按照Quintana等人（2008）8计算尺寸多样性（Sd），如García-Comas et al. （2016）35：
其中 p x（x） 是大小为 x 的概率密度函数，x 表示对数2（椭圆卷）。因此，该度量是香农多样性指数，适用于连续度量，例如社区中的个体规模分布。
- 按照Quintana等人（2008）8计算尺寸多样性（Sd），如García-Comas et al. （2016）35：
- 标准化生物体积尺寸谱 （NBSS）
- 定义NBSS的大小等级，将光谱的下限确定为样品中大型无脊椎动物大小分布的0.01分位数，并通过以2为基数的几何尺度创建大小等级，直到包含样品中最大的生物。
注意： 尺寸类宽度随尺寸增加，以考虑与较大尺寸相关的更大可变性。这里分析的大型无脊椎动物群落的NBSS有14个大小等级（表1）。 - 通过将每个尺寸类别的总生物体积除以尺寸类宽度来获得标准化生物体积。
- 定义NBSS的大小等级，将光谱的下限确定为样品中大型无脊椎动物大小分布的0.01分位数，并通过以2为基数的几何尺度创建大小等级，直到包含样品中最大的生物。
- 尺寸谱斜率
- 计算NBSS的线性斜率。
注意：斜率 （μ） 是根据大于模式的大小等级中的对数 2（尺寸等级中点）和对数2（归一化生物量）之间的关系计算的，忽略任何空的（在本研究中，尺寸等级从 3 到 14）。
- 计算NBSS的线性斜率。
| 尺寸等级限制（mm3） | 尺寸等级中点（mm3） |
| 0,1236 | 0,1855 |
| 0,2473 | 0,3709 |
| 0,4946 | 0,7418 |
| 0,9891 | 1,4837 |
| 1,9783 | 1,4837 |
| 3,9560 | 5,9348 |
| 7,9131 | 11,8696 |
| 15,8261 | 23,7392 |
| 31,6522 | 47,4783 |
| 63,3044 | 94,9567 |
| 126,6089 | 189,9133 |
| 253,2178 | 379,8267 |
| 506,4300 | 7597,7000 |
| 1012,9000 | 15193,0000 |
| 2025,7000 |
表1：标准化生物量尺寸谱（NBSS）的大小等级。 该表还显示了生物体的 15 个大小等级限制和大小等级中点。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
大型无脊椎动物样品的数字图像采集
扫描细微差别：扫描托盘中的乙醇沉积
在测试系统的大型无脊椎动物时，有几次扫描质量很差。背景中的黑暗饱和区域阻碍了图像的正常处理和大型无脊椎动物个体大小的测量（图2）。背景中出现饱和区域或高度像素化的图像有几个原因：（1）扫描托盘上存在太多生物;（2）样品中存在脏污;（3）样品预览与其扫描之间的延迟不足;或（4）在图像处理中使用因冷凝、脏污或水质差而质量差的背景图像33。在大型无脊椎动物群落样品中，使用乙醇代替水会导致托盘上沉淀，如果在扫描之间没有用水正确冲洗，则会形成暗影。这对于获得清晰的图像并最大限度地减少扫描托盘玻璃的任何相关腐蚀至关重要。
扫描细微差别：碎片浓度
从对47，473个小插图子集的分析中，高百分比（86.1%）对应于碎片，包括碎屑，纤维或身体部位（如腿或鳃），或扫描伪影（图3A-E）。无脊椎动物生物对应于其余13.9%的检测到的物体（图3F-L）。因此，尽管之前在实验室中对生物体与有机物进行了细致的分离，但小瓶中仍然残留着大量小碎片。
扫描细微差别：触摸物体
碎片的大量存在增强了生物体之间的接触，因此，产生了带有聚集体的小插图，其中包括多个接触生物体和附着在颗粒或纤维上的生物体（图4A-C）。这些小插图是确定单个尺寸结构形状的偏差来源。在一组五个样本（11个子样本）中，在所有大型无脊椎动物的小插图中，10%对应于接触生物或接触颗粒或纤维的生物群。这些小插图是用图像处理程序编辑的，以便将接触的生物体和附着有粒子的生物体分开。使用分离掩模重新处理样品涉及使用新分离的物体创建新的晕影，并对其进行验证以确保其正确分类。
自动识别物体
学习集结果
学习集是由专家分类为不同类别并用于监督学习模型的一组对象小插图，这也可以称为训练集27。可以使用现有学习集，使用新的插图和/或类别更新现有学习集，或者为特定项目创建新的学习集。
为了确定快速获得大型无脊椎动物大小结构的最佳学习集，通过与随机森林算法的交叉验证，创建并测试了几个学习集。生成的混淆矩阵显示真实分类（行）与自动分类（列）。召回率是属于自动良好分类的类别的生物的百分比，而 1 精度是被算法错误分类为属于某个类别（类别中的污染）的生物的百分比33。根据经验，召回率应高于 70%，污染（1 精度）应低于 20%，以将某个类别保留在学习集中。然后用样本子集进一步验证大型无脊椎动物具有最大召回率和精度的学习集，以确定其在大型无脊椎动物识别中的真实准确性。
测试了三种类型的共济失调学习集（原始、中级和精细），其类别基于对象的形态特征。原始学习集包括三类：大型无脊椎动物、其他无脊椎动物（微甲壳类动物）和碎片（纤维、颗粒和玻璃污渍等人工制品）。中级学习集包括16个类别：5个大型无脊椎动物，3个其他无脊椎动物，8个碎片。精细学习集包括另外4个类别的大型无脊椎动物，共有20个类别（表2）。
除了定义类别外，还测试了每个类别的小插图数量的影响。每个学习集分别使用每个类别中的 50 个小插图、100 个小插图和 300 个小插图进行测试（对于具有三个类别的原始学习集，则使用 500 个小插图）。除“Ostracoda”、“长圆形大型无脊椎动物”和“圆壳大型无脊椎动物”外，所有类别的数量都是平衡的，它们在100个小插图和300个小插图学习集中包括较少的个体，因为在扫描图像中没有检测到这些类别的足够生物。
考虑大型无脊椎动物（所有大型动物类别一起）和生物（大型无脊椎动物和其他无脊椎动物类别一起）的召回率和精度，以通过交叉验证选择最佳学习集（见 补充文件2中的表格）。最好的学习集是具有三个类别（大型无脊椎动物，其他无脊椎动物和碎片）的原始学习集，每个类别中有300个对象（表 2）。随后使用原始学习集来验证扫描样本子集中对象的自动分类。
| 学习集 | 类别数 | 每个类别的图片数 | 召回生物 | 召回大型无脊椎动物 | 1-精密生物 | 1-精密大型无脊椎动物 |
| 生 | 3 | 50 | 0.97 | 0.84 | 0.12 | 0.24 |
| 100 | 0.96 | 0.87 | 0.06 | 0.17 | ||
| 300 | 0.95 | 0.91 | 0.09 | 0.15 | ||
| 500 | 0.93 | 0.88 | 0.13 | 0.2 | ||
| 中等 | 16 | 50 | 0.83 | 0.77 | 0.17 | 0.24 |
| 100 | 0.84 | 0.79 | 0.15 | 0.21 | ||
| 300 | 0.87 | 0.84 | 0.14 | 0.18 | ||
| 好 | 20 | 50 | 0.89 | 0.86 | 0.14 | 0.18 |
| 100 | 0.9 | 0.87 | 0.11 | 0.14 | ||
| 300 | 0.9 | 0.86 | 0.13 | 0.14 |
表 2：创建和测试的学习集（原始、中级和精细），其中包含每个学习集中的类别以及每个类别的对象数。 召回和创建的学习集的 1 精度。原始学习集的类别：大型无脊椎动物（1），其他无脊椎动物（2），碎片（3）。中等学习集的类别：长大型无脊椎动物（1），长光滑大型无脊椎动物（2），长刺大型无脊椎动物（3），圆形大型无脊椎动物（4），圆壳大型无脊椎动物（5），分支科（6），桡足类（7），俄斯特拉科达（8），聚集体（9），纤维（10），头部（11），腿（12），污渍（13），深色污渍（14），浅灰色污渍（15），圆形污渍（16）。精细学习集的类别： 长型大型无脊椎动物 （1）， 长光滑大型无脊椎动物 （2）， 长光滑深色大型无脊椎动物 （3）， 长圆大型无脊椎动物 （4）， 长刺大型无脊椎动物 （5）， 圆形大型无脊椎动物 （6）， 圆壳大型无脊椎动物 （7）， 圆形深色大型无脊椎动物 （8）， 圆壳大型无脊椎动物 （9）， 枝形目 （10）， 桡足类 （11）， 俄斯特拉科达 （12）， 聚集体 （13）， 纤维 （14）， 头部 （15）， 腿 （16）， 污渍 （17）， 深色污渍（18），浅灰色污渍（19），圆形污渍（20）。
使用最佳学习集验证自动识别
使用随机森林算法，由 42 个精细和粗略子样本组成的子集中的对象由选定的学习集自动分类。人工验证后，所有类别的召回率都很高（平均而言，大型无脊椎动物为0.94，其他无脊椎动物为0.95，碎片为0.92），而污染（1精度）相当低，但其他无脊椎动物除外（大型无脊椎动物为0.25，其他大型无脊椎动物为0.84，碎片为0.01）（图5).其他无脊椎动物（微甲壳类动物）在样本中很少见（存在于42个子样本中的17个）;因此，这种比较并不可靠。此外，由于形状和灰度与其他物体相似，这一类别受到污染的影响很大。
自动与验证的大型无脊椎动物丰度的比较表明，这些是高度相关的（Pearson's r = 0.92， p值<0.0001，粗略子样本的n = 24;皮尔逊的r = 0.98， p值<0.0001，精细子样本的n = 18），由于碎片污染（斜率<1）（图6）的自动性能略有高估。关于平均椭球体积的比较，相关性也很高（皮尔逊r = 0.96， p值<0.0001，粗样本的n = 24;皮尔逊的r = 0.99， p值<0.0001，精细样品的n = 18），尺寸光谱斜率接近-1（图6）。细分和粗分之间的斜率差异反映了大尺寸分数中错误分类的影响更大，这与它们的低生物计数有关。
自动预测的单个尺寸分布的概率密度函数与精细子样本和粗子样本的验证预测非常吻合。然而，如前所述，与生物体数量有关的粗略子样本有一些例外，因此在这些情况下错误分类的影响更大（图7）。
接触生物对个体尺寸分布、尺寸光谱和尺寸指标的影响
对在五个选定样品的子集中分离接触生物之前和之后以及验证之前获得的大小分布进行了比较，以评估触摸物体的影响。为了比较大小分布，根据其分馏将粗子样品和细子样品组合在一起，以重建代表大型无脊椎动物群落的样品。在三个样品中，验证后的丰度增加（>500个个体）（图8A）。尽管有这种增加，但平均椭球体积与验证样本中计算的体积非常接近（图8B）。
校正样品（在接触生物分离后）的大小分布与验证的样品略有不同。因此，多个物体的存在对这些样品中的尺寸分布影响很小（图9A-E）。因此，基于校正样本计算的大小多样性与验证样本的大小多样性密切相关（皮尔逊r = 0.94，p值= 0.017，n = 5）（图9F）。
从理论上讲，具有多个营养级的群落的归一化生物体积尺寸谱（NBSS）在稳态条件下4的尺寸谱斜率在log2尺度上接近-1。自然群落中的NBSS通常具有凸起而不是线性分布，这主要归因于最小尺寸类别的采样偏差36。在本研究中，第三大小类是NBSS中最常见的。
NBSS在协议步骤之间非常相似（图10A-C），除了几个光谱中的几个尺寸等级（图10D-E）。因此，基于校正样本计算的尺寸谱斜率与基于验证样本的斜率密切相关（皮尔逊r = 0.99，p值≤0.0001，n = 5）（图10F）。
图 2：处理前后具有不同 质量的扫描图像示例。 （A，B）具有良好扫描质量的精细子样品的原始图像（左）和处理图像（右）;（中，四）扫描质量差的精细子样本的原始图像（左）和处理图像（右）（深色背景和左边缘的剪切图像）;（E，F）扫描质量差（非常像素化的深色背景）的精细子样本的原始图像（左）和处理图像（右）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：代表样品中存在的不同对象的轮廓晕影。 （A-E） 碎片（纤维、圆形污渍、大型无脊椎动物腿、污渍和有机碎片）;（F-I）大型无脊椎动物（鞘翅目，双翅目，蛇形目和三翅目）和（J-L）其他无脊椎动物（Cladocera，Copepoda和Ostracoda）。比例尺表示 1 mm gma = 1.1。请点击此处查看此图的大图。
图 4：包含多个对象的晕影示例。 （A） 附着在纤维上的大型无脊椎动物（水螅）;（B）由纤维聚集的多种生物（Caenidae）;（C）两种接触的大型无脊椎动物（Chironomidae和Caenidae）。比例尺表示 1 mm gma = 1.1。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：召回和污染的箱线图（1 精度）。所选学习集的三类大型无脊椎动物、其他无脊椎动物和碎片（每个类别 300 个小插图）的箱线图在样本子集 （n = 42） 上进行了验证。请点击此处查看此图的大图。
图 6：自动分类与验证分类中丰度和平均椭球体体积估计值之间的比较。 （A） 子样本中的丰度估计值 （n = 42） 和 （B） 子样本中的平均椭球体积估计值 （n = 42）。黑点对应于粗子样品（>0.5厘米目）;灰点对应于精细的子样品（>500μm目）。虚线表示 1：1 关系。请点击此处查看此图的大图。
图 7：概率密度函数，表示对数刻度（x 轴）中单个大小的相对贡献（y 轴），用于比较 自动估计和验证估计。 （A，B）粗略子样本的自动和验证估计（n = 18），（C，D）精细子样本（n = 24）的自动和验证估计。（A，C）自动估计之间的比较和验证估计之间的（B，D）比较。颜色代表每个子样本，以帮助识别光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：经过验证的子样本中的丰度和平均椭球体体积估计值与从选定的天然样品（细亚样和粗子样品一起）中分离接触物体后验证的子样本之间的比较。 （A） 按采样框架（n = 5）和（B）平均椭球体体积估计值（n = 5）的丰度估计值。虚线表示 1：1 关系。请点击此处查看此图的大图。
图 9：概率密度函数表示对数2 刻度（x 轴）中单个大小的相对贡献（y 轴），用于自动预测、验证预测和具有各自大小多样性值 （Sd） 的验证预测。 （A-E） 选定天然样本的概率密度函数（细亚样本和粗子样本一起）（n = 5）;红线对应自动预测，蓝线对应验证预测，绿线对应校正后的样本（接触物体分离后验证）。（F） 经验证与校正的尺寸多样性估计数的比较;虚线对应于 1：1 关系。请点击此处查看此图的大图。
图10：归一化生物体积大小谱图（NBSS）和处理之间NBSS斜率（μ）的比较。 （A-E） NBSS表示对数尺度（x轴）中每个尺寸等级的中点值与五个选定样品的每个扫描帧（y轴）的归一化生物体积之间的关系，用于自动（红叉）、验证（蓝色三角形）和校正（绿色圆圈）预测及其各自的尺寸谱 斜率 （μ） 在尺寸类中计算，从模态尺寸类开始向上（第三个尺寸类由垂直虚线表示）。（F）在验证样本上计算的斜率与校正样本（分离接触物体后）的斜率的比较。虚线对应于 1：1 关系 r2。请点击此处查看此图的大图。
补充文件 1：用于执行计算的 Matlab 脚本。请点击此处下载此文件。
补充文件 2：创建的学习集的交叉验证、召回和 1 精度。 （A） 原始学习集，包含 3 个类别，每个类别 50 个小插曲;（B）原始学习集，包含3个类别，每个类别100个小插图;（C） 原始学习集，包含 3 个类别，每个类别 300 个小插曲;（D） 原始学习集，包含 3 个类别，每个类别 500 个小插图;（E） 原始学习集，有 5 个类别，每个类别 50 个小插曲;（F） 原始学习集，包含 5 个类别，每个类别 100 个小插图;（G） 原始学习集，包含 5 个类别，每个类别 300 个小插图;（H） 中级学习集，有16个类别，每个类别50个小插曲;（一）中级学习集，有16个类别，每个类别100个小插曲;（J） 中级学习集，有16个类别，每个类别300个小插曲;（K）精细学习集，有20个类别，每个类别50个小插曲;（L）精细学习集，有20个类别，每个类别100个小插曲;和 （M） 精细学习集，包含 20 个类别，每个类别 300 个小插图。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gorsky等人2010年描述的河流大型无脊椎动物方法的调整允许在估计淡水大型无脊椎动物的群落规模结构时具有很高的分类准确性。结果表明，该方案可以将估计样品中个体大小结构的时间减少到约1小时。因此，拟议的协议旨在促进常规使用大型无脊椎动物大小光谱作为快速和综合生物指标，以评估淡水生态系统中扰动的影响。大型无脊椎动物的体型谱已经被用作评估沿海泻湖生态状况的成功指标22。随着议定书的发展，可以对无脊椎动物进行深入的调查，以便能够开展涵盖大空间和时间尺度的实地监测活动。
由于该协议的目的是以快速的方式获得采样社区的个体大小分布，而不考虑分类法，因此建议创建像这里提出的简单学习集。对更精细的学习集进行测试，类别数量较多，对整个大型无脊椎动物的回忆和精度较低（表2），并且验证步骤更耗时。
自动预测与来自不同采样地点的42个自然子样本的验证预测非常一致，表明自动模式下的方法适用于计数和测量自然样品中的大型无脊椎动物（图6）。此外，自动预测和验证预测之间的NBSS相似性以及与线性理论模型的高度拟合表明，自动模式是进行理论生态学研究的一种有前途的方法（图10）。
在适应该协议的过程中，遇到了几个问题，并以不同的方式解决或最小化了这些问题。扫描大型无脊椎动物样品时需要考虑的一个问题是深色饱和区域的出现。因此，重要的是尽快检查已处理的扫描图像以检测此问题并在必要时重复扫描。在扫描浮游生物33时也发现了这个问题，但通过使用乙醇而不是自来水会增加这个问题。不建议使用自来水，因为保存在70%乙醇中的生物会在表面上漂移。尽管该装置设计为抵抗稀释的乙醇（5%），但无脊椎动物样品仍用70%乙醇保存。也不建议使用较低浓度的乙醇进行操作，因为生物体可能会通过补水和脱水过程受到损害37。强烈建议使用的解决方案是在每次用乙醇扫描后用清水冲洗扫描托盘几次。这避免了可能改变图像背景的沉淀物的积聚，并保护扫描托盘的玻璃免受腐蚀。
另一个检测到的问题是存在具有多种生物体的小插图，由于低估了某些大小的个体，这可能会改变尺寸谱。当具有多个物体的小插图数量较少（<10%）时，如本研究所示，多个物体的存在对这些样本中的尺寸分布和NBSS的影响很小（图9 和 图10）。这表明，为了获得大型无脊椎动物群落的代表性大小结构，没有必要在协议的步骤1.5（接触生物的分离）中投入时间，图像再处理持续约1.5小时。相反，强烈建议在协议的步骤2.5（使用木针分离接触生物或聚集体）中花费时间，这要耗时少得多（最多30分钟），并确保正确估计自动模式下的大小分布30。减少接触生物体数量的一种选择是每次扫描使用更少的生物体，但应考虑在大量部分扫描一个样本所投入的时间投入以及生物体聚集的可能性。另一种解决方案是仅保留一个子样品，以便在实验室中对生物进行分类时计算具有代表性的尺寸谱，而不是像这项工作中所做的那样保存所有采样的生物体。每个样本中生物数量的减少将降低接触生物体的可能性。此外，当储存的个体较少时，样品中含有较少的碎片，这有利于分离，尤其是在可以避免纤维的情况下。
观察到的自动分类方法的局限性与所用样品中微甲壳类动物（类别：其他大型无脊椎动物）的含量低有关。缺乏微甲壳类动物的代表性会影响它们的正确分类，并限制该类别自动预测的精度。然而，作为这项工作主要目标的其他类别，即碎片和大型无脊椎动物，具有很高的回忆率和准确性。使用这种扫描仪设备的替代方案是调整一个普通的扫描仪来容纳水框，推广用于样品处理和机器学习的开源代码，就像这里提供的那样，并编写代码，用于使用相机在显微镜下测量生物体或使用一组相机通过通量。这已经在23，24，25，26，38，39，40中多次完成，但是我们提出的方法调节了扫描参数化，以获得可比较的尺寸估计值，这对于其他系统来说是难以控制的。此外，所提出的协议和扫描设备是现成的，开源的，并且已经在海洋中浮游动物群落中建立。总体而言，该协议的改编展示了使用这种自动成像方法有效地获得淡水大型无脊椎动物的大小结构并测试用于淡水生物评估的大小指标的潜力的有希望的途径。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有潜在的竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了西班牙科学、创新和大学部的支持（批准号RTI2018-095363-B-I00）。我们感谢CERM-UVic-UCC成员Èlia Bretxa，Anna Costarrosa，Laia Jiménez，María Isabel González，Marta Jutglar，Francesc Llach和Núria Sellarès在大型无脊椎动物现场采样和实验室分类方面的工作，以及David Albesa在样品扫描方面的合作。最后，我们感谢Josep Maria Gili和海洋科学研究所（ICM-CSIC）使用实验室设施和扫描仪设备。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
References
- Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe's surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
- Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
- Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
- Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
- Woodward, G., et al.
- Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
- White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
- Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography - Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
- Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
- Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
- Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
- Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
- Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l, Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
- Benejam, L. l, Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
- Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
- Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
- Townsend, C. R., Thompson, R. M. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
- Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
- García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
- Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
- Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
- Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
- Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
- Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
- Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
- Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
- Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
- Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
- Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
- Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
- García-Comas, C., Picheral, E. Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting. , Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013).
- Picheral, E. ZooSCAN: Manual to scan and process samples. Quantitative Imaging Platform of Villefranche sur Mer (PlQv). , Available from: http://www.hydroptic.com/assets/uploads/files/documentations/ae4e0-zooscan_user_manual.pdf (2020).
- Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. , Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013).
- García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
- García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
- Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
- Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
- Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
- Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).
