Summary
De combinatie van laserporosatie en micro-elektrode arrays (MEA) maakt actiepotentiaalachtige opnames van gecultiveerde primaire en stamcel-afgeleide cardiomyocyten mogelijk. De golfvorm biedt superieur inzicht in het werkingsmechanisme van teststoffen dan standaardopnamen. Het koppelt patch-clamp en MEA-uitlezing om cardioveiligheidsonderzoek in de toekomst verder te optimaliseren.
Abstract
Levensbedreigende geneesmiddel-geïnduceerde hartritmestoornissen worden vaak voorafgegaan door langdurige cardiale actiepotentialen (AP), vaak vergezeld van kleine pro-aritmische membraanpotentiaalfluctuaties. De vorm en het tijdsverloop van de repolariserende fractie van het AP kan cruciaal zijn voor de aan- of afwezigheid van aritmie.
Micro-elektrode arrays (MEA) bieden gemakkelijke toegang tot cardiotoxische samengestelde effecten via extracellulaire veldpotentialen (FP). Hoewel het een krachtig en beproefd hulpmiddel is in onderzoek en farmacologie voor cardiale veiligheid, laat de FP-golfvorm het niet toe om de oorspronkelijke AP-vorm af te leiden vanwege het extracellulaire opnameprincipe en de resulterende intrinsieke wisselstroom (AC) -filtering.
Een nieuw apparaat, hier beschreven, kan herhaaldelijk het membraan van cardiomyocyten openen dat bovenop de MEA-elektroden op meerdere teelttijdpunten is gekweekt, met behulp van een zeer gerichte nanoseconde laserstraal. De laserporatie resulteert in het transformeren van het elektrofysiologische signaal van FP naar intracellulair-achtige AP's (laser-geïnduceerde AP, liAP) en maakt de registratie van transcellulaire spanningsafbuigingen mogelijk. Deze intracellulaire toegang maakt een betere beschrijving van de AP-vorm en een betere en gevoeligere classificatie van pro-aritmische potentialen mogelijk dan reguliere MEA-opnames. Dit systeem is een revolutionaire uitbreiding van de bestaande elektrofysiologische methoden, waardoor een nauwkeurige evaluatie van het cardiotoxische effect mogelijk is met alle voordelen van op MEA gebaseerde opnames (eenvoudige, acute en chronische experimenten, signaalvoortplantingsanalyse, enz.).
Introduction
De elektrische bijdrage van een hartslag is het resultaat van een complex en nauwkeurig getimed samenspel van vele hartkanalen en transporters, evenals de nauwkeurig afgestemde voortplanting van elektrische signalen door het myocardium1. Verandering van deze nauw gecoördineerde mechanismen (bijv. het gebruik van geneesmiddelen) kan leiden tot ernstige gevolgen voor de functie van het hart (d.w.z. levensbedreigende aritmie)2,3. Aritmieën worden gedefinieerd als onregelmatige hartslagen die het normale ritme van het hart veranderen, wat levensbedreigende gevolgen kan hebben. Ze kunnen worden veroorzaakt door een verminderde initiatie van een golf van cardiale excitatie of door abnormale voortplanting van cardiale excitatie4, wat op zijn beurt resulteert in een disfunctie van het pompmechanisme van het hart.
Veel zeer krachtige kandidaat-geneesmiddelen moeten worden uitgesloten van verder onderzoek tijdens de vroege ontwikkelingsfase van geneesmiddelen vanwege hun (pro-) aritmische potentieel 2,3. Ze moduleren belangrijke hartkanalen (bijvoorbeeld het menselijke ether-a-go-go-gerelateerde genkanaal [hERG]) die verantwoordelijk zijn voor de vorming en beëindiging van normale cardiale actiepotentialen en de daaropvolgende signaalvoortplanting5.
Farmaceutische bedrijven gebruiken routinematig patch-clamp-metingen of micro-elektrode-arrays (MEA) om potentiële cardiotoxische off-target effecten geïnduceerd door kandidaat-geneesmiddelen te onderzoeken. Patch-clamp opnames maken het mogelijk om de impact van stoffen op cardiale ionkanalen te ontcijferen en om het transcellulaire cardiale actiepotentiaal te analyseren met een hoge spatio-temporele resolutie 6,7. Nadelen van deze techniek zijn echter een lage doorvoer met handmatige patchklem en beperkte toepasbaarheid van automatisering vanwege de afhankelijkheid van deze methode van cellen in suspensie. Bovendien kunnen chronische effecten niet worden onderzocht vanwege de invasiviteit van de methode. Ten slotte worden meestal alleen afzonderlijke cellen tegelijkertijd bestudeerd in plaats van het hele cardiale syncytium, waardoor het onmogelijk is om informatie over signaalvoortplanting aan te pakken.
Spanningsgevoelige kleurstoffen zijn waardevol voor het niet-invasief onderzoeken van cardiale actiepotentialen en door geneesmiddelen geïnduceerde aritmieën8. Ze maken het onderzoek van zowel eencellige als syncytiumactiviteit mogelijk. Nadelen van deze methode zijn cytotoxische effecten van de kleurstoffen op zich of van het reactieproduct tijdens de verlichting. Ze worden gebruikt voor acute experimenten en zijn nauwelijks toepasbaar voor langetermijnstudies 9,10,11. Spanningsgevoelige eiwitten als alternatieven hebben de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt in termen van bruikbaarheid en gevoeligheid, maar vereisen genetische modificatie van de cellen van belang en missen een hoge temporele resolutie in vergelijking met elektrofysiologische technieken12.
Informatie van het meest recente CiPA-initiatief13 stelt dat MEA's op grote schaal worden gebruikt in cardiale veiligheidsscreenings als een alternatieve elektrofysiologische benadering, omdat ze een krachtig en beproefd hulpmiddel vormen om de hartfunctie en veiligheidsfarmacologie te onderzoeken. Cardiomyocyten worden gekweekt als een syncytium direct bovenop de chips, en extracellulaire veldpotentialen (FP's) worden niet-invasief geregistreerd via substraatgeïntegreerde micro-elektroden. Dit registratieprincipe maakt het mogelijk om gedurende meerdere dagen screenings met verhoogde doorvoer uit te voeren, waardoor ze geschikt zijn voor farmaceutisch onderzoek naar chronische effecten. De resulterende FP-golfvorm is een afgeleide van de intracellulaire AP14. Parameters zoals beat rate, de amplitude van het eerste deel van de FP en FP-duur zijn gemakkelijk toegankelijk15. Andere essentiële criteria zoals het onderscheid tussen verlenging en triangulatie van de FP (een belangrijke marker van pro-aritmie16,17) zijn ontoegankelijk vanwege het AC-filtereffect van de techniek. Bovendien wordt het detecteren van andere kleine pro-aritmische gebeurtenissen zoals vroege en vertraagde afterdepolarisaties (respectievelijk EAD en DAD) vaak gemakkelijk over het hoofd gezien vanwege hun kleine amplitude.
Hier beschrijven we een methode om toegang te krijgen tot het intracellulaire membraanpotentiaal door het membraan van cardiomyocyten te openen. Het IntraCell-apparaat (hierna intracellulair opnameapparaat genoemd) maakt herhaalde membraanopeningen van cardiomyocyten mogelijk die bovenop de MEA-elektroden worden gekweekt met behulp van een zeer gerichte nanosecondelaserstraal via een specifiek fysisch fenomeen (oppervlakteplasmonresonantie)18. Als gevolg hiervan gaat de opname over van een gewone FP naar een intracellulair-achtige AP (laser-geïnduceerde AP, liAP). Het protocol laat zien hoe dit het mogelijk maakt om toegang te krijgen tot kinetische aspecten van de golfvorm die niet gemakkelijk kunnen worden vastgelegd door FP's te analyseren. Deze methode vormt een brug tussen traditionele intracellulaire patch-clamp en MEA-opnames. De technologie is daarom een krachtige uitbreiding van de huidige beoordelingsmethoden voor cardiale veiligheid.
Protocol
1. Geïnduceerde pluripotente preparaat van stamcellen afgeleide cardiomyocyten
OPMERKING: iCell cardiomyocyten2 (aangeduid als geïnduceerde pluripotente stamcel [iPSC's]-afgeleide cardiomyocyten) werden bereid volgens het protocol dat door de leverancier werd verstrekt. Het protocol wordt kort samengevat in de volgende sectie.
- Ontdooiings- en onderhoudsmedium bij 4 °C gedurende 24 uur voorafgaand aan gebruik.
- Bereid fibronectine coating door steriele fibronectine op te lossen in steriel water in een concentratie van 1 mg / ml. Bewaar deze voorraad in aliquots (bijv. 25 μL per aliquot). Verdun de gealiquoteerde stamoplossing 1:20 in de gebalanceerde zoutoplossing (dPBS) van Dulbecco.
- Bedek de elektrodevelden van de eerder geautoclaveerde MEA's onder de laminaire stromingskap, druppelgewijs onder steriele omstandigheden met fibronectine met behulp van een pipet van 10 μL. Laat hiervoor 5 μL van de fibronectinecoatingoplossing op de elektrodevelden vallen en observeer de vorming van een druppel bovenop het elektrodegebied. Zorg ervoor dat u de gevoelige elektroden niet aanraakt.
OPMERKING: Om steriele omstandigheden te behouden, brengt u de MEA-chip over in een steriele petrischaal voordat u deze uit de laminaire stromingskap verwijdert. - Incubeer de gecoate MEA's gedurende 1 uur bij 37 °C in een incubator bij voorkeur.
- Ontdooi het cryoviaal met de cardiomyocyten in een waterbad bij ongeveer 37 °C gedurende 2 minuten totdat er slechts een klein ijskristal overblijft. Breng de celoplossing voorzichtig over in een buis van 50 ml.
- Voeg 1 ml platingmedium toe aan het lege cryoviaal. Breng de oplossing druppelsgewijs over een periode van 90 s over in de buis van 50 ml om de osmotische schok te verminderen. Voeg voorzichtig 8 ml platingmedium toe aan de buis.
- Meng de celsuspensie voorzichtig met een pipet van 10 ml. Bereken het totale aantal levensvatbare cellen met behulp van geautomatiseerde fluorescentiecytometrie. Het nummer moet dicht bij het nummer in het gegevensblad liggen dat door de fabrikant is verstrekt.
- Draai de celoplossing gedurende 3 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant door afzuiging met behulp van een glazen pipet die aan een pompsysteem is bevestigd. Pas het celnummer aan tussen 6.000 en 15.000 levensvatbare cellen/μL.
OPMERKING: Het aantal cellen ligt meestal in het bovenstaande bereik, maar kan variëren afhankelijk van de respectieve leverancier. - Verwijder de coatingoplossing die in stap 1.3 is aangebracht uit het MEA-elektrodegebied met een pipet van 10 μL direct voor het zaaien van de cel. Zaai de cellen onmiddellijk na de verwijdering om uitdroging van de coating te voorkomen. Zaai hiervoor de cellen druppelsgewijs op 4 μL voor zowel 6-well MEAs als 1-well MEAs op de elektrodevelden op dezelfde manier als gedaan met de coating.
- Laat de cellen gedurende 1 uur in de incubator hechten bij 37 °C en 5% CO2 voordat u de putten vult met het steriele platingmedium dat wordt verwarmd tot ongeveer 37 °C bij 200 μL voor 6-well MEA en 1 ml voor mea met één put onder de laminaire stromingskap.
- Voer een volledige mediumwissel uit 48 uur na het beplateren onder de laminaire stromingskap. Verwijder hiervoor het beplatingsmedium door aspiratie met behulp van een glazen pipet die aan een pompsysteem is bevestigd. Voeg vervolgens 200 μL steriel onderhoudsmedium verwarmd tot 37 °C toe aan de putten.
- Voer om de dag volledige mediumveranderingen uit.
- Begin met het meten van de cellen 5-8 dagen na het ontdooien. Voer een volledige mediumverandering uit 2 uur voordat u met de experimenten begint.
2. MEA opnames
OPMERKING: Het apparaat dat wordt gebruikt om het FP-signaal om te zetten in liAP bestaat uit een rechtopstaande microscoop en een 1064 nm-laser.
- Plaats het MEA-systeem bovenop het apparaat met de MEA-chiphouder gecentreerd boven het doelgat. Plaats de MEA-opstelling zo dat het doel zich direct onder het gat van het MEA-systeem bevindt, zodat de laser zich op de elektroden kan concentreren.
- Breng de MEA-chip met de gekweekte cellen 15 minuten voor de opname over van de incubator naar de MEA-opstelling, zodat de cellen kunnen herstellen van de mechanische verstoring.
- Reinig de contactpads en pinnen zorgvuldig met isopropanol en een wattenstaafje om het geluidsniveau te verlagen. Plaats de MEA voorzichtig in de MEA-opstelling. Plaats de MEA-chip met het logo linksboven (6-well MEA) of met de referentie-elektrode links (single-well MEA).
- Stel de in het MEA-systeem geïntegreerde verwarming in op 38 °C. Plaats een kleine kamer bovenop de MEA-chip om de cellen constant te doordringen van bevochtigde carbogen (5% CO2 en 95% O2) om de incubatoromstandigheden na te bootsen en verdamping te voorkomen.
- Sluit de klep van het apparaat. Met de geïntegreerde veiligheidsschakelaar kan de laser alleen worden geactiveerd als het deksel over de MEA-chip is gesloten. Stel het MEA-systeemfilter met behulp van het MEA-configuratieprogramma in op 0,1 Hz of minder high-pass en 3.500 Hz low-pass.
- Gebruik de MC_Rack software (opnamesoftware) of alternatieve software voor opname. Pas het ingangsbereik aan uw behoeften aan en zorg ervoor dat het signaal de versterker en de bemonsteringsfrequentie (bijv. 20 kHz) niet verzadigt. Gebruik de langetermijnweergavefunctie van de software om de opname te controleren.
3. Laser-geïnduceerde celporatie
- Na het plaatsen van de MEA-chip in de MEA-installatie en het instellen van de software, initialiseert u de lasermechanica met behulp van de FB Alps-software (initialisatiesoftware).
- Klik eerst op de knop Initialisatie . Aan het einde van de initialisatie bevindt het virtuele laserpunt zich in put D voor een 6-well MEA en linksonder voor een single-well MEA, respectievelijk.
- Verplaats het virtuele laserpunt met Ctrl + muisklik naar het midden van elektrode D5 en pas de focus aan. Pas de focus aan door Ctrl + scrollen met het muiswiel.
- Druk op de knop Set P1. Het virtuele laserpunt gaat automatisch naar put F. Herhaal het proces met de elektrode F5 en selecteer P2 instellen.
- Na deze procedure gaat het laserpunt naar put B. Herhaal hetzelfde proces met elektrode B5 en druk op Set P3 in de software. Het systeem is nu uitgelijnd.
- Pas het laservermogen en de verwerkingstijd aan de behoeften van uw cellen aan. Hier werd 40% vermogen en 25% procestijd gebruikt.
- Om de laser in te schakelen, klikt u op de knop Laser uit , die dan als laser aan verschijnt. Schakel over naar de opnamesoftware, kies een bestandsnaam en klik op de rode opnameknop gevolgd door de knop Afspelen bovenaan het venster om de meting op te nemen.
- Noteer een basislijn van 60 s voordat u de cellen met de laser opent. Schakel terug naar de initialisatiesoftware.
- Deactiveer elektroden die moeten worden uitgesloten door de laser op de virtuele kaart aan de rechterkant met Ctrl + muisklik. Selecteer de interessante elektroden door ze te activeren op de arrayweergave aan de rechterkant van het softwarevenster.
- Om de laser te starten, gebruikt u Alt + muisklik en selecteert u de middelste elektrode van dit putje. Dit initieert de laser om automatisch de cellen op elke elektrode van deze put te openen. Herhaal dit voor elke put. De laser opent dan automatisch alle eerder geactiveerde elektroden van de geselecteerde put.
4. Behandeling en toepassing van drugs
- Bereid alle stoffen voor die op de dag van de metingen vers voor drugstests moeten worden gebruikt. Zorg ervoor dat de uiteindelijke toepassingsconcentratie 10 keer hoger is in het medium om een verdunning van 1:10 in de putten te maken.
- Los Nifedipine, E4031 en Dofetilide eerst op in DMSO in mM-concentratie en vervolgens verder in medium tot 10x van de gewenste concentratie. Overschrijd nooit een uiteindelijke DMSO-concentratie van 0,1% in de put.
- Noteer de basislijnactiviteit gedurende 60 s. Start de laser-geïnduceerde poratie zoals beschreven in stap 3 van het protocol, wat resulteert in een transformatie van de FP in liAP-vorm.
- Breng alle medicijnen aan als single-concentration-per-well. Verwijder 20 μL medium per putje voor respectievelijk 6-well MEAs en 100 μL voor single-well MEAs. Voeg 20 μL of 100 μL, afhankelijk van het MEA-type, van de te meten stamoplossing van het te meten geneesmiddel toe aan de put en pipet voorzichtig 2-3 keer op en neer. Voer ten minste drie replicaties van elk geneesmiddel en elke concentratie uit om statistische relevantie te bereiken.
- Laat de compounds 300 s inspoelen. Gedurende deze tijd kan de liAP-vorm weer transformeren in een FP-vorm. Nogmaals, induceer laser-geïnduceerde poratie en registreer mogelijke samengestelde effecten op de liAP voor nog eens 60 s.
5. Gegevensexport
- Selecteer relevante elektroden door de opname opnieuw af te spelen in de opnamesoftware. Gebruik MC_DataTool om MC_Rack bestanden te converteren naar ASCII .txt bestanden.
- Klik op Bestand > MCD openen > Selecteer een MC_Rack bestand. Klik op de txt-knop (blauwe tekst).
- Selecteer een elektrode. De geselecteerde elektrode wordt weergegeven in de lijst aan de rechterkant.
- Klik op Bladeren om de map te selecteren en de naam van het nieuwe .txt bestand te wijzigen. Klik op Opslaan.
- Hef de selectie van de geëxporteerde elektrode op en selecteer de volgende elektrode die u wilt exporteren. Herhaal de procedure voor alle elektroden van belang.
6. Gegevensverwerking en statistische analyse
- Importeer geconverteerde binaire sporen in R19. Visualiseer/analyseer de gegevens met behulp van op maat gemaakte scripts met de volgende pakketten: dplyr, tidyr en ggplot2 20,21,22.
Representative Results
Het registratiesysteem dat werd gebruikt om elektrische activiteit van gekweekte cardiomyocyten te registreren, bestond uit een standaard MEA-systeem uitgerust met een verwarming en een kamer voor carbogen die aan een computer was bevestigd. Het systeem werd bovenop het intracellulaire opnameapparaat geplaatst, dat op zijn beurt bovenop een kleine antitrillingseenheid was gemonteerd (figuur 1A-B).
iPSC-afgeleide cardiomyocyten2 begonnen spontaan te kloppen binnen 2-3 dagen na het ontdooien (dagen in vitro, DIV) en waren zichtbaar onder een microscoop. Vanaf DIV 4 werd de slagfrequentie regelmatig en konden extracellulaire veldpotentialen (FP) met piek-tot-piekamplitudes van de depolariserende component tussen 1 en 5 mV worden gedetecteerd op de meeste elektroden in de respectieve putten van de MEA-chips. De elektrische activiteit kon worden gedetecteerd in meer dan 95% van de onderzochte putten. Vanaf DIV 7 nam de kans op celloslating toe, waardoor verder gebruik van deze putten onmogelijk werd.
De software om de lasergeïnduceerde membraanopening te regelen, maakt het mogelijk om zowel het vermogen als de procestijd van de laser aan te passen die de opening van het celmembraan alleen op de onderzochte elektrode bemiddelt (figuur 1C), terwijl andere elektroden in de betreffende put niet worden beïnvloed. Hoewel te conservatieve instellingen de golfvorm van de FP niet veranderden, resulteerden te hoge instellingen in de vermeende verwonding van de cardiomyocyten, aangegeven door krachtig maar voorbijgaand kloppen of verlies van het signaal. Bij aanpassing aan een instelling van 40% vermogen en 25% procestijd die goed wordt verdragen door de cellen, resulteerde het activeren van de laserpuls in meerdere veranderingen in de opgenomen golfvorm (zie figuur 1D voor een voorbeeldige opname). Onder deze omstandigheden werd macroscopisch geen verandering van het elektrodemateriaal waargenomen. De opgenomen signaalamplitude nam enorm toe met 4,1 ± 0,41 (n = 20, bereik 1,34-8,83) keer, geanalyseerd uit een willekeurig gekozen subset van opnames, resulterend in amplitudes tussen 7 en 22 mV. Bovendien transformeerde de golfvorm van een standaard FP-vorm met snelle, bifasische en transiënte spanningsafbuiging aan het begin, gevolgd door een plateaufase terug bij de basislijn en een kleine afbuiging die het einde van de FP aangeeft naar een vorm die dichter bij een intracellulair geregistreerd AP lag met een snelle stijging, uitgebreide gedepolariseerde plateaufase en een repolarisatiefase met een onderschrijding onder de basislijn (figuur 1E ). We hebben deze spanningsafbuigingen gedefinieerd als laser-geïnduceerde AP (liAP). In de meeste gevallen was de overgang van voorbijgaande aard en ten minste gedeeltelijk omgekeerd binnen 5 minuten. Signaalvoortplanting in het cardiale syncytium bleef ongewijzigd na liAP-inductie (figuur 2), wat aangeeft dat het resterende syncytium niet werd beïnvloed door potentiële schade door de laserpuls.
Overeenkomsten met intracellulair geregistreerde AP's maakten het mogelijk om parameters van de liAP te extraheren die niet toegankelijk zijn voor FP's (zie voor voorbeeldparameters bijvoorbeeld figuur 3A), met name de meting van de duur van de liAP op specifieke tijdstippen (bijvoorbeeld bij 20%, 50% en 90%) (figuur 3B), analoog aan APD20/50/90 die gewoonlijk wordt gebruikt voor de beschrijving van AP's.
Vervolgens testten we de respons van de laser-geopende cardiomyocyten op veelgebruikte cardioactieve farmacologische hulpmiddelen. Een voorbeeldig protocolontwerp is te vinden in figuur 3C. Omdat de transformatie van de liAP niet altijd gedurende het hele experiment aanhield, werd de toepassing van de verbinding uitgevoerd als een enkele concentratie per put in plaats van op een cumulatieve manier om de totale opnametijd te verkorten. Niettemin was het noodzakelijk om de cellen te heropenen of een ander elektrodegebied te openen voordat de teststof werd aangebracht.
De toevoeging van de specifieke L-type Ca2+ kanaalblokker, Nifedipine23,24, verminderde de plateaufase van de liAP op een concentratieafhankelijke manier en verkortte daarmee de gehele liAP (figuur 4A,B). Deze verkorting was vergelijkbaar met de analyse verkregen uit FP's van cardiomyocyten uit ongemanipuleerde elektroden (figuur 4C), wat aangeeft dat deze opnamemethode geen nadelige effecten had in vergelijking met klassieke FP-opnames.
E4031 remt de repolarisatie van relevant Kv1.11 (hERG) kaliumkanaal25 en leidt tot aritmisch gedrag van cardiomyocyten bij verhoogde concentraties. Vergelijkbaar met de analyse verkregen uit FP-opnames, verhoogde E4031 de liAP-duur op een concentratieafhankelijke manier (figuur 5). Bovendien waren bij concentraties van 0,01 μM en hoger kleine positieve spanningsafbuigingen aan het einde van de liAP zichtbaar. Deze afbuigingen werden prominenter met hogere concentraties, wat wijst op een voorbijgaande nieuwe depolarisatie, in tegenstelling tot de FP's, waar deze verbuigingen vrijwel onzichtbaar waren (zie figuur 5B-C, bovenste (FP) versus onderste (liAP) sporen). Dit gedrag staat bekend als vroege afterdepolarisatie (EAD). Bij de hoogste concentratie van 0,1 μM escaleerden deze EAD's in de loop van de tijd tot ectopische slagen, die voortijdige actiepotentialen zijn (figuur 5C). Zowel EAD als ectopische beats zijn belangrijke indicatoren van pro-aritmische activiteit. Aan het einde van het voorbeeld in figuur 5D resulteerde de elektrische activiteit in aritmisch kloppen. Ook de concentratie-respons-relaties tussen FP- en liAP-opnames kwamen overeen (figuur 5E). Er is echter een grotere variabiliteit in de KP-gegevens als gevolg van de zwakke repolarisatiecomponent van de FP's bij hogere concentraties van de teststof. Het lijkt de karakteristieke aard van iPSC-afgeleide cardiomyocyten2 te zijn om ook onder controleomstandigheden onfysiologisch lange AP's te genereren (AP-duur > 700 ms). Het MEA-systeem paste een intrinsieke 0,1 Hz AC-filtering toe, wat op zijn beurt resulteerde in een gedeeltelijk gefilterde vorm van de liAP, hoewel zonder de kwalitatieve informatie over het begin en de beëindiging van het onderliggende AP uit te sluiten.
Het bleek dat het aanvankelijk optreden van pro-aritmische spanningsafbuigingen kon worden gedetecteerd bij lagere concentraties in liAP's in vergelijking met FP-opnames. In figuur 6 is de registratie van elektrische activiteit tijdens de toepassing van dofetilide in een concentratie van 3 μM. De opname werd in dezelfde put verkregen. Hoewel zowel FP als liAP een duur van ongeveer 2 s vertoonden, was de FP-golfvorm onopvallend en vertoonde regelmatig repolariserende afbuigingen. Tegelijkertijd werden aan het einde van liAP's EAD's van verschillende groottes zichtbaar. Deze toename van de relevante veiligheidsfarmacologische gevoeligheid ondersteunt verder de bevinding dat liAP's geïnduceerd door oppervlakteplasmonresonantie een betere kwalificatie van de repolarisatiefase mogelijk maken en daardoor helpen meer te weten te komen over het werkingsmechanisme van de onderzochte teststoffen.
Figuur 1: De intracellulaire opname-instelling en voorbeeldopnamen. (A) Overzicht van de installatie. (B) Bovenaanzicht van het opnamesysteem met open MEA-opnameversterker. (C) Initialisatiesoftware met de virtuele MEA-kaart aan de rechterkant. 1: antitrillingstabel, 2: intracellulair opnamesysteem, 3: laserbeschermingsdeksel, 4: bevochtigde carbogenkamer, 5: MEA-verwarmingssysteem, 6: MEA-interfacekaart, 7: 1-well MEA-chip in de opnameversterker. (D) Het opnemen van voorbeelden van één elektrode voor en na inductie van liAP's. Boven: opname van ongeveer 6 min. Stippellijnen markeren de uitgevouwen gebieden die onderaan worden weergegeven. (E) Vergrote FP (boven) en liAP (onder). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Signaalvoortplantingspatroon blijft behouden na liAP-inductie. Valse kleurcodering van de signaalvoortplanting van de excitatiegolf binnen het syncytium. Blauw geeft vroeg aan (beginnend bij -4 ms); rood geeft late tijdspunten (+3 ms) aan van het signaal dat is verkregen bij referentie-elektrode E54, zoals aangegeven door de kleurenbalk. Het signaal reist van rechtsboven naar linksonder van de elektrode-array. (A) Vóór liAP-inductie, (B) 1 min na liAP-inductie. (C) 4 min na liAP-inductie. Het flitssymbool geeft het laserinductiepunt aan op elektrode 64. Merk op dat er geen verschil in de algehele voortplantingsrichting zichtbaar is. Zwarte rechthoeken duiden op ongeldige gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Definitie en registratieprotocol van de FP/liAP-parameter. (A) Parameters die kunnen worden geëxtraheerd uit de klassieke FP. (B) Aanvullende parameters die kunnen worden verkregen uit liAP's. (C) Tijdlijn van de meting van geneesmiddelen. Van links naar rechts: controle opname voor 60 s, inductie van liAP, opname van liAP voor 60 s, medicijntoepassing, wash-in tijd 300 s, herinductie van liAP, opname van liAP voor 60 s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Nifedipine verkort de cardiale liAP op een concentratieafhankelijke manier. (A) Top: FP-sporen bij controle (blauw) en in aanwezigheid van 0,3 μM Nifedipine (rood). Sporen worden weergegeven met een verschuiving van de y-as voor een betere visualisatie. Onder: liAP-sporen van dezelfde MEA-opname, wat resulteert in een verkorting van de liAP in combinatie met een toename van de beat rate. (B) Superpositie van enkelvoudige liAP's tijdens de controle (blauw) en toepassing van verschillende concentraties nifedipine (rood). a: 0,01 μM, b: 0,1 μM en c: 0,3 μM. Let op de verkorting van de liAP-duur bij toenemende concentraties. (C) De concentratie-responsrelatie van signaalbreedte verkregen uit FP (zwart) en liAP (rood) opnames. Gegevens zijn van n = 3 experimenten en genormaliseerd om te controleren. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: E4031 induceert (pro-) aritmisch gedrag. (A) FP (boven) en liAP (onder) bij controleomstandigheden. (B-C) FP's en liAP's werden op verschillende tijdstippen geregistreerd na toepassing van E4031 (0,1 μM). Na 80 s zijn de eerste EAD's zichtbaar aan het einde van de liAP (B; gemarkeerd met een rode pijl). EAD's worden na 320 s omgezet in ectopische slagen in aanwezigheid van het testmiddel (C). (D) Na 530 s komt het cardiale syncytium in een tachycardische toestand. Spoor afgebeeld van liAP-opname. (E) Concentratie-responsrelatie van FP (zwart) en liAP (rood) breedte. Gegevens van n = 4 experimenten, genormaliseerd om te controleren. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Detectie van pro-aritmische gebeurtenissen is gevoeliger in liAP's dan FP's. (A) FP-opname en (B) liAP-opname binnen dezelfde put tijdens toepassing van 3 μM dofetilide. Hoewel aan het einde van sommige liAP's EAD's detecteerbaar zijn, blijven ze onvindbaar in FP-opnames. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Deze innovatieve methode demonstreert een nieuwe manier om in vitro de farmacologische modulatie van het cardiale actiepotentieel te onderzoeken tijdens de toepassing van cardioactieve farmacologische hulpmiddelverbindingen.
Klassieke MEA-opnames maken FP-opnames mogelijk, die de afgeleide zijn van de cardiale AP14. Deze indirecte registratie verkort het tijdsverloop van de de- en repolarisatie en elimineert daardoor essentiële kenmerken van het AP. Bovendien, hoewel de transcellulaire spanningsverandering van een AP doorgaans waarden van ongeveer 100 mV bereikt, blijft de totale FP-amplitude vergelijkbaar laag, met piekamplitudes tussen verschillende 100 μV en lage enkelcijferige mV-waarden. Door het opnameprincipe is de repolarisatiefase klein; in veel gevallen is het slechts detecteerbaar en vaak onduidelijk van vorm, waardoor het moeilijk is om het einde van het KP te definiëren. De opening van het celmembraan stelt ons in staat om toegang te krijgen tot de intracellulaire spanning, waardoor het tijdsverloop van het cardiale AP wordt blootgelegd. Er zijn meerdere voordelen van deze opnamemethode in vergelijking met FP-opnames. Ten eerste is de signaalamplitude prominenter aanwezig, wat zorgt voor een superieure signaal-ruisverhouding. Ten tweede resulteert de golfvorm in een betere detectie van de repolarisatie. Ten derde draagt de vorm van de repolarisatiefase bij tot inzicht in het werkingsmechanisme van de teststof, die wordt geleverd door de steilheid van de signaalontspanning. En ten slotte biedt deze methode een verbeterde gevoeligheid om kritieke bijwerkingen van geneesmiddelen te detecteren, aangetoond door het opnamevoorbeeld in figuur 6 voor het optreden van EAD's in de LIAP, maar niet in de KP.
Tot nu toe zijn er twee manieren om toegang te krijgen tot het intracellulaire AP. De eerste wordt bereikt door elektroporatie26,27. Hier kunnen korte en sterke spanningspulsen die via de opname-elektroden worden toegepast, het celmembraan openen28. De tweede mogelijkheid is de membraanopening via een laserpuls, waarbij gebruik wordt gemaakt van een fysisch fenomeen genaamd oppervlakteplasmonresonantie, zoals hier gedemonstreerd. Een van de voordelen ten opzichte van elektroporatie is de verhoogde kans op opeenvolgende openingen. Door de sterk gefocuste laserspot (1-3 μm) is dit effect zeer lokaal beperkt tot de elektrode van belang. Interessant is dat de initiatie van de liAP de signaalvoortplanting van het gecultiveerde syncytium niet veranderde. Dit geeft aan dat, hoewel de celintegriteit is beschadigd, de cardiomyocyten niet lijken te depolariseren via het gat in het membraan.
Er zijn beperkingen aan deze methode. Net als bij elektroporatie duurt de membraanopening in de meeste gevallen niet de hele experimentele loop. De minimale vermogens- en duurinstellingen van de laserpuls die nodig zijn voor een stabiele opening van het specifieke celtype van belang moeten onafhankelijk worden gedefinieerd voorafgaand aan de experimenten. We ontdekten (niet aangetoond) dat de parameters drastisch variëren tussen verschillende celtypen (in ons geval verschillende hiPS-afgeleide en primaire cardiomyocyten). Dit voorkomt onnodige stress op de cellen tijdens het samengestelde testexperiment en resulteert in betrouwbaardere en reproduceerbare gegevens. Het is van cruciaal belang om de z-as aan te passen om een duidelijke focus op de cellen en de elektroden te bieden. Een onscherp camerabeeld levert op in een laserspot op een suboptimaal niveau, wat mogelijk resulteert in het onvermogen om het celmembraan te openen. Zelfs met de best aangepaste parameters is het liAP-effect van voorbijgaande aard en neemt de amplitude in de loop van de tijd af. Bovendien varieert de toegang tot de intracellulaire ruimte van de cellen tussen liAP-inducties, zowel binnen opeenvolgende openingen bij dezelfde elektrode als tussen elektroden. Dit resulteert in een hoge variabiliteit van de liAP-amplitude. De reden is nog niet volledig begrepen. Mogelijke verklaringen zijn mechanische problemen zoals een drift van de laserfocus of een andere subcellulaire lokalisatie van de membraanopening. Dit maakt de analyse van amplitude-effecten van teststoffen op dit moment ingewikkeld. Ook vereist het registreren van elektrische activiteit door een MEA-systeem high pass filtering om te compenseren voor onvermijdelijke basislijndrift. Hoewel in het hier gebruikte systeem deze filtering was ingesteld op 0,1 Hz (de laagste filterinstelling die beschikbaar is voor dit systeem), waren filtereffecten tijdens de plateaufase nog steeds zichtbaar, wat resulteerde in een langzame trend van de spanningsafbuiging naar de basislijn tijdens de plateaufase van het cardiale AP. Dit is vooral problematisch bij uitgebreid lange onderliggende AP's zoals de iPSC-afgeleide iCell-cardiomyocyten2 die hier worden gebruikt, die al AP > 700 ms genereren onder controleomstandigheden. Het gebruik van systemen met lagere filtering kan de vorm van het AP beter behouden en een nog betere toegang tot het tijdsverloop van de repolarisatiefase mogelijk maken.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Foresee Biosystems bedanken voor het uitlenen van het IntraCell-systeem tijdens de studies. Ze willen ook Hae In Chang bedanken voor de technische assistentie. Dit werk heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-programma van de Europese Unie op het gebied van onderzoek en innovatie onder de subsidieovereenkomst nr. 964518 (ToxFree), van het EU Horizon Europe European Innovation Council Programme, project SiMulTox (subsidieovereenkomst nr. 101057769) en van het ministerie van Baden-Württemberg voor Economische Zaken, Arbeid en Toerisme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890301 | |
| 6 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 7600069 | |
| DMSO | Merck KGaA | 20-139 Sigma-Aldrich |
solvent for drugs |
| Dofetilide | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
D-100 | Drug-Measurement |
| dPBS | Fisher Scientific GmbH | 12037539 | Coating |
| E4031 | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
E-500 | Drug-Measurement |
| Falcon | Fisher Scientific GmbH | 10788561 | |
| FB Alps version 0.5.005 | Foresee Biosystems | ||
| Fibronectin | Merck KGaA | 11051407001 | Coating |
| iCell cardiomyocytes | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
C1016 | |
| IntraCell | Foresee Biosystems | ||
| Isopropanol | Carl Roth GmbH + Co. KG | CN09.1 | For cleaning of MEA contact pads |
| Maintenance Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
#M1003 | For cell-culture |
| MC_Data Tool | Multi Channel Systems MCS GmbH | Data export | |
| MC_Rack | Multi Channel Systems MCS GmbH | MEA recording | |
| MEA 2100 - 2x60 - system | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890485 | For MEA-recordings |
| Nifedipine | Merck KGaA | N7634 Sigma-Aldrich |
Drug-Measurement |
| Plating Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
M1001 | For cell-culture |
| Tergazyme | VWR International, LLC | 1304-1 | cleaning of MEAs |
References
- Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. Molecular basis of arrhythmias. Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).
- Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk. Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).
- Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. Role of hERG potassium channel assays in drug development. Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).
- Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. Cardiac arrhythmia. Scholarpedia. 3 (7), 1665 (2008).
- Tisdale, J. E., et al. Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).
- Kramer, J., et al. MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes. Scientific Reports. 3, 2100 (2013).
- Rampe, D., Roy, M. -L., Dennis, A., Brown, A. M. A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG. FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).
- Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
- Ronzhina, M., et al. Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart. Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).
- Beck, C., Gong, Y. A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity. Scientific Reports. 9 (1), 15878 (2019).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Kovacs, G. T. A. Electronic sensors with living cellular components. Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).
- Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).
- Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes. Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).
- Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).
- Dipalo, M., et al. Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes. Science Advances. 7 (15), (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing. , Vienna Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2021).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer-Verlag. New York. (2009).
- Wickham, H., Girlich, M. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0. , Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2022).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6. , Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2021).
- Godfraind, T. Discovery and development of calcium channel blockers. Frontiers in Pharmacology. 8, 286 (2017).
- Vater, W., et al. Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040). Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).
- Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Fendyur, A., Spira, M. E. Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Frontiers in Neuroengineering. 5, 21 (2012).
- Hayes, H. B., et al. Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology. Scientific Reports. 9 (1), 11893 (2019).
