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सुरक्षा फार्माकोलॉजी की बढ़ी हुई भविष्यवाणी के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोड एरे पर कार्डियोमायोसाइट्स के लेजर-प्रेरित कार्रवाई क्षमता-जैसे माप

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64355
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, Germany,

Summary

लेजर पोरेशन और माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों (एमईए) का संयोजन खेती किए गए प्राथमिक और स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की कार्रवाई क्षमता जैसी रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। तरंग आकृति मानक रिकॉर्डिंग की तुलना में परीक्षण यौगिकों की कार्रवाई के तरीके में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। यह भविष्य में कार्डियो सुरक्षा अनुसंधान को और अनुकूलित करने के लिए पैच-क्लैंप और एमईए रीडआउट को जोड़ता है।

Abstract

जीवन-धमकाने वाली दवा-प्रेरित कार्डियक एरिथमिया अक्सर लंबे समय तक कार्डियक एक्शन पोटेंशिअल (एपी) से पहले होता है, आमतौर पर छोटे प्रोरैडमिक झिल्ली संभावित उतार-चढ़ाव के साथ। एपी के रिपोलराइजिंग अंश का आकार और समय पाठ्यक्रम अतालता की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए निर्णायक हो सकता है।

माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) बाह्य क्षेत्र क्षमता (एफपी) के माध्यम से कार्डियोटॉक्सिक यौगिक प्रभावों तक आसान पहुंच की अनुमति देता है। यद्यपि अनुसंधान और हृदय सुरक्षा फार्माकोलॉजी में एक शक्तिशाली और अच्छी तरह से स्थापित उपकरण, एफपी वेवफॉर्म बाह्य रिकॉर्डिंग सिद्धांत और परिणामस्वरूप आंतरिक प्रत्यावर्ती धारा (एसी) फ़िल्टरिंग के कारण मूल एपी आकार का अनुमान लगाने की अनुमति नहीं देता है।

यहां वर्णित एक नया उपकरण, अत्यधिक केंद्रित नैनोसेकंड लेजर बीम का उपयोग करके कई खेती के समय बिंदुओं पर एमईए इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर उगाए गए कार्डियोमायोसाइट्स की झिल्ली को बार-बार खोल सकता है। लेजर पोरेशन के परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिग्नल को एफपी से इंट्रासेल्युलर-जैसे एपी (लेजर-प्रेरित एपी, लीएपी) में बदल दिया जाता है और ट्रांससेलुलर वोल्टेज विक्षेपण की रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है। यह इंट्रासेल्युलर एक्सेस नियमित एमईए रिकॉर्डिंग की तुलना में एपी आकार और प्रोरैडमिक क्षमता के बेहतर और अधिक संवेदनशील वर्गीकरण की अनुमति देता है। यह प्रणाली मौजूदा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधियों के लिए एक क्रांतिकारी विस्तार है, जो एमईए-आधारित रिकॉर्डिंग (आसान, तीव्र और पुराने प्रयोगों, सिग्नल प्रसार विश्लेषण, आदि) के सभी फायदों के साथ कार्डियोटॉक्सिक प्रभाव के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देती है।

Introduction

दिल की धड़कन का विद्युत योगदान कई कार्डियक चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के एक जटिल और सटीक समय पर परस्पर क्रिया के साथ-साथ मायोकार्डियम1 के माध्यम से विद्युत संकेतों के सटीक प्रसार से उत्पन्न होता है। इन बारीकी से समन्वित तंत्रों (जैसे, दवाओं का उपयोग करना) के परिवर्तन से हृदय के कार्य (यानी, जीवन-धमकाने वाली अतालता) के लिए गंभीर परिणाम हो सकते हैं। अतालता को अनियमित दिल की धड़कन के रूप में परिभाषित किया जाता है जो हृदय की सामान्य लय को बदल देता है, जिसके जीवन के लिए खतरा हो सकता है। वे या तो कार्डियक उत्तेजना की एक लहर की बिगड़ा हुई शुरुआत या कार्डियक उत्तेजना4 के असामान्य प्रसार के कारण हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप हृदय के पंपिंग तंत्र की शिथिलता होती है।

कई अत्यधिक शक्तिशाली दवा उम्मीदवारों को उनके (प्रो-) लयबद्ध क्षमता 2,3 के कारण प्रारंभिक दवा विकास चरण के दौरान आगे की जांच से बाहर रखा जाना चाहिए। वे प्रमुख कार्डियक चैनलों (जैसे, मानव ईथर-ए-गो-गो-संबंधित जीन चैनल [एचईआरजी]) को संशोधित करते हैं जो सामान्य कार्डियक एक्शन संभावित गठन और समाप्ति के साथ-साथ बाद के सिग्नल प्रसारके लिए जिम्मेदार होते हैं।

दवा कंपनियां नियमित रूप से दवा उम्मीदवारों द्वारा प्रेरित संभावित कार्डियोटॉक्सिक ऑफ-टारगेट प्रभावों की जांच के लिए पैच-क्लैंप माप या माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) का उपयोग करती हैं। पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग कार्डियक आयन चैनलों पर पदार्थों के प्रभाव को समझने और उच्च स्थानिक-अस्थायी संकल्प 6,7 के साथ ट्रांससेलुलर कार्डियक एक्शन क्षमता का विश्लेषण करने की अनुमति देती है। हालांकि, इस तकनीक के नुकसान में मैन्युअल पैच-क्लैंप के साथ कम थ्रूपुट और निलंबन में कोशिकाओं पर इस विधि की निर्भरता के कारण स्वचालन की सीमित प्रयोज्यता शामिल है। इसके अलावा, विधि की आक्रामकता के कारण पुराने प्रभावों की जांच नहीं की जा सकती है। अंत में, आम तौर पर पूरे कार्डियक सिंकिटियम के बजाय केवल एकल कोशिकाओं का एक साथ अध्ययन किया जाता है, जिससे सिग्नल प्रसार के बारे में जानकारी को संबोधित करना असंभव हो जाता है।

वोल्टेज-संवेदनशील रंजक हृदय क्रिया क्षमता और दवा-प्रेरित अतालता8 की जांच के लिए मूल्यवान हैं। वे एकल-कोशिका और सिंकिटियम गतिविधि दोनों की जांच की अनुमति देते हैं। इस विधि की कमियां रोशनी के दौरान या तो रंगों या प्रतिक्रिया उत्पाद के साइटोटोक्सिक प्रभाव हैं। उनका उपयोग तीव्र प्रयोगों के लिए किया जाता है और दीर्घकालिक अध्ययन 9,10,11 के लिए मुश्किल से लागू होते हैं। विकल्प के रूप में वोल्टेज-संवेदनशील प्रोटीन ने प्रयोज्यता और संवेदनशीलता के मामले में पिछले कुछ वर्षों में महत्वपूर्ण प्रगति की है, लेकिन रुचि की कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता होती है और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकलतकनीकों की तुलना में उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन की कमी होती है।

सबसे हालिया सीआईपीए पहल13 से जानकारी में कहा गया है कि एमईए का व्यापक रूप से एक वैकल्पिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण के रूप में कार्डियक सुरक्षा स्क्रीनिंग में उपयोग किया जाता है क्योंकि वे कार्डियक फ़ंक्शन और सुरक्षा फार्माकोलॉजी की जांच के लिए एक शक्तिशाली और अच्छी तरह से स्थापित उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। कार्डियोमायोसाइट्स को चिप्स के शीर्ष पर सीधे एक सिंकिटियम के रूप में खेती की जाती है, और बाह्य क्षेत्र क्षमता (एफपी) को सब्सट्रेट-एकीकृत माइक्रोइलेक्ट्रोड के माध्यम से गैर-आक्रामक रूप से दर्ज किया जाता है। यह रिकॉर्डिंग सिद्धांत कई दिनों में बढ़ी हुई थ्रूपुट स्क्रीनिंग आयोजित करने की अनुमति देता है, जो उन्हें पुराने प्रभावों पर दवा अनुसंधान के लिए उपयुक्त बनाता है। परिणामस्वरूप एफपी तरंग इंट्रासेल्युलर एपी14 का व्युत्पन्न है। बीट दर, एफपी के प्रारंभिक भाग के आयाम और एफपी अवधि जैसे पैरामीटर आसानी से सुलभ हैं। अन्य आवश्यक मानदंड जैसे कि एफपी की लंबाई और त्रिकोणीय के बीच भेदभाव (प्रोएरिथमिया16,17 का एक महत्वपूर्ण मार्कर) तकनीक के एसी फ़िल्टरिंग प्रभाव के कारण दुर्गम हैं। इसके अलावा, अन्य छोटी प्रोरैडमिक घटनाओं का पता लगाना जैसे कि प्रारंभिक और विलंबित आफ्टरडिपोलराइजेशन (ईएडी और डीएडी, क्रमशः) अक्सर उनके छोटे आयाम के कारण आसानी से अनदेखा किया जाता है।

यहां हम कार्डियोमायोसाइट्स की झिल्ली को खोलकर इंट्रासेल्युलर झिल्ली क्षमता तक पहुंच प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इंट्रासेल डिवाइस (इसके बाद इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग डिवाइस के रूप में संदर्भित) एक विशिष्ट भौतिक घटना (सतह प्लास्मोन अनुनाद) 18 के माध्यम से अत्यधिक केंद्रित नैनोसेकंड लेजर बीम का उपयोग करके एमईए इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर उगाए गए कार्डियोमायोसाइट्स के बार-बार झिल्ली खोलने की अनुमति देता है। नतीजतन, रिकॉर्डिंग एक नियमित एफपी से इंट्रासेल्युलर जैसे एपी (लेजर-प्रेरित एपी, लीएपी) में बदल जाती है। प्रोटोकॉल दिखाता है कि यह तरंग के गतिज पहलुओं तक पहुंच प्राप्त करने की अनुमति देता है जिसे आसानी से एफपी का विश्लेषण करके कैप्चर नहीं किया जा सकता है। यह विधि पारंपरिक इंट्रासेल्युलर पैच-क्लैंप और एमईए रिकॉर्डिंग के बीच एक पुल का प्रतिनिधित्व करती है। इसलिए प्रौद्योगिकी वर्तमान हृदय सुरक्षा मूल्यांकन विधियों का एक शक्तिशाली विस्तार है।

Protocol

1. प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स तैयारी

नोट: आईसेल कार्डियोमायोसाइट्स2 (प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल [आईपीएससी]-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के रूप में संदर्भित) आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किए गए थे। प्रोटोकॉल को संक्षेप में निम्नलिखित अनुभाग में संक्षेप ति किया जाएगा।

  1. उपयोग से पहले 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटिंग और रखरखाव माध्यम को पिघलाना।
  2. 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर बाँझ पानी में बाँझ फाइब्रोनेक्टिन को घोलकर फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग तैयार करें। फ्रीज इस स्टॉक को एलिकोट में स्टोर करें (उदाहरण के लिए, 25 μL प्रति एलिकोट)। बाँझ डलबेको के संतुलित नमक समाधान (डीपीबीएस) में एलिकोट स्टॉक समाधान 1:20 को पतला करें।
  3. पहले से आटोक्लेव किए गए एमईए के इलेक्ट्रोड क्षेत्रों को लैमिनार फ्लो हुड के तहत कोट करें, 10 μL पिपेट का उपयोग करके फाइब्रोनेक्टिन के साथ बाँझ परिस्थितियों में बूंद-वार। इसके लिए, इलेक्ट्रोड क्षेत्रों पर फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान के 5 μL को छोड़ दें और इलेक्ट्रोड क्षेत्र के शीर्ष पर एक बूंद के गठन का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि संवेदनशील इलेक्ट्रोड को न छुएं।
    ध्यान दें: बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए, एमईए चिप को लैमिनार प्रवाह हुड से हटाने से पहले एक बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  4. लेपित एमईए को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. कार्डियोमायोसाइट्स युक्त क्रायोवियल को 2 मिनट के लिए लगभग 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पिघलाएं जब तक कि केवल थोड़ा बर्फ क्रिस्टल न रह जाए। सेल समाधान को धीरे से 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. खाली क्रायोवियल में 1 एमएल चढ़ाना माध्यम जोड़ें। आसमाटिक झटके को कम करने के लिए 50 एमएल ट्यूब में 90 सेकंड की समय अवधि में घोल को ड्रॉपवाइज स्थानांतरित करें। धीरे से ट्यूब में अतिरिक्त 8 एमएल चढ़ाना माध्यम जोड़ें।
  7. 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके सेल सस्पेंशन को सावधानीसे मिलाएं। स्वचालित प्रतिदीप्ति साइटोमेट्री का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें। संख्या निर्माता द्वारा प्रदान की गई डेटाशीट में संख्या के करीब होनी चाहिए।
  8. कमरे के तापमान पर 200 x g पर 3 मिनट के लिए सेल समाधान को नीचे घुमाएं। पंपिंग सिस्टम से जुड़े ग्लास पिपेट का उपयोग करके आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरने वाले को हटा दें। सेल संख्या को 6,000 और 15,000 व्यवहार्य कोशिकाओं / μL के बीच समायोजित करें।
    नोट: कोशिकाओं की संख्या आमतौर पर ऊपर दी गई सीमा में होती है लेकिन संबंधित आपूर्तिकर्ता के आधार पर भिन्न हो सकती है।
  9. सेल सीडिंग से पहले सीधे 10 μL पिपेट का उपयोग करके एमईए इलेक्ट्रोड क्षेत्र से चरण 1.3 में लागू किए गए कोटिंग समाधान को हटा दें। कोटिंग के सूखने से बचने के लिए हटाने के तुरंत बाद कोशिकाओं को बीज दें। इसके लिए, कोशिकाओं को 6-वेल एमईए और 1-वेल एमईए दोनों के लिए 4 μL पर इलेक्ट्रोड क्षेत्रों पर उसी तरह से बीज दें जैसे कोटिंग के साथ किया जाता है।
  10. कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 1 घंटे तक पालन करने की अनुमति दें, बाँझ प्लेटिंग माध्यम के साथ कुओं को भरने से पहले 6-वेल एमईए के लिए 200 μL पर लगभग 37 डिग्री सेल्सियस और लैमिनार प्रवाह हुड के तहत एकल कुएं एमईए के लिए 1 एमएल तक गर्म किया जाए।
  11. लैमिनार प्रवाह हुड के नीचे चढ़ाने के 48 घंटे बाद एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन करें। इसके लिए पंपिंग सिस्टम से जुड़े ग्लास पिपेट का उपयोग करके एस्पिरेशन द्वारा चढ़ाना माध्यम को हटा दें। फिर, कुओं में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म बाँझ रखरखाव माध्यम के 200 μL जोड़ें।
  12. हर दूसरे दिन पूर्ण मध्यम परिवर्तन करें।
  13. पिघलने के 5-8 दिनों के बाद कोशिकाओं को मापना शुरू करें। प्रयोगशुरू करने से 2 घंटे पहले एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन करें।

2. एमईए रिकॉर्डिंग

नोट: एफपी सिग्नल को लीएपी में बदलने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिवाइस में एक सीधा माइक्रोस्कोप और 1064 एनएम लेजर होता है।

  1. एमईए सिस्टम को डिवाइस के शीर्ष पर रखें जिसमें एमईए चिप धारक उद्देश्य छेद पर केंद्रित है। एमईए को स्थापित करें ताकि उद्देश्य सीधे एमईए प्रणाली के छेद के नीचे हो ताकि लेजर इलेक्ट्रोड पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति मिल सके।
  2. रिकॉर्डिंग से 15 मिनट पहले इनक्यूबेटर से खेती की गई कोशिकाओं के साथ एमईए चिप को एमईए सेटअप में स्थानांतरित करें, जिससे कोशिकाओं को यांत्रिक गड़बड़ी से उबरने की अनुमति मिलती है।
  3. शोर के स्तर को कम करने के लिए आइसोप्रोपेनॉल और कपास के स्वैब का उपयोग करके संपर्क पैड और पिन को सावधानीपूर्वक साफ करें। एमईए को सावधानीपूर्वक एमईए-सेटअप में रखें। शीर्ष बाईं ओर (6-वेल एमईए) या बाईं ओर संदर्भ इलेक्ट्रोड (सिंगल-वेल एमईए) के साथ नीचे लोगो के साथ एमईए चिप रखें।
  4. एमईए सिस्टम-एकीकृत हीटिंग को 38 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। इनक्यूबेटर स्थितियों को फिर से बनाने और वाष्पीकरण को रोकने के लिए कोशिकाओं को ह्यूमिडिफाइड कार्बोजेन (5% सीओ2 और 95% ओ2) के साथ लगातार प्रभावित करने के लिए एमईए चिप के शीर्ष पर एक छोटा कक्ष रखें।
  5. डिवाइस का ढक्कन बंद करें। एकीकृत सुरक्षा स्विच केवल लेजर को सक्रिय करने की अनुमति देता है यदि एमईए चिप पर ढक्कन बंद है। एमईए कॉन्फ़िगरेशन प्रोग्राम का उपयोग करके एमईए सिस्टम फ़िल्टर को 0.1 हर्ट्ज या उससे कम हाई-पास और 3,500 हर्ट्ज लो-पास पर सेट करें।
  6. रिकॉर्डिंग के लिए MC_Rack सॉफ्टवेयर (रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर) या किसी वैकल्पिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। अपनी आवश्यकताओं के अनुसार इनपुट रेंज समायोजित करें यह सुनिश्चित करते हुए कि सिग्नल एम्पलीफायर और नमूना दर (जैसे, 20 kHz) को संतृप्त नहीं करता है। रिकॉर्डिंग की जांच करने के लिए सॉफ़्टवेयर के दीर्घकालिक प्रदर्शन फ़ंक्शन का उपयोग करें।

3. लेजर-प्रेरित सेल पोरेशन

  1. एमईए सेटअप में एमईए चिप डालने और सॉफ्टवेयर स्थापित करने के बाद, एफबी आल्प्स सॉफ्टवेयर (प्रारंभिक सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके लेजर यांत्रिकी शुरू करें।
  2. सबसे पहले, आरंभ बटन पर क्लिक करें। आरंभ के अंत में, वर्चुअल लेजर पॉइंट क्रमशः 6-वेल एमईए के लिए अच्छी तरह से डी में होगा और सिंगल-वेल एमईए के लिए सबसे नीचे बाईं ओर होगा।
  3. इलेक्ट्रोड डी 5 के बीच में Ctrl + माउस क्लिक के साथ वर्चुअल लेजर बिंदु ले जाएं और फोकस समायोजित करें। माउस व्हील के साथ Ctrl + स्क्रॉलिंग द्वारा फ़ोकस समायोजित करें।
  4. P1 सेट करें बटन दबाएँ। वर्चुअल लेजर बिंदु स्वचालित रूप से अच्छी तरह से एफ में चला जाएगा। इलेक्ट्रोड एफ 5 के साथ प्रक्रिया को दोहराएं और सेट पी 2 का चयन करें।
  5. इस प्रक्रिया के बाद, लेजर बिंदु अच्छी तरह से बी में चला जाएगा। इलेक्ट्रोड बी 5 के साथ उसी प्रक्रिया को दोहराएं और सॉफ्टवेयर में सेट पी 3 दबाएं। प्रणाली अब संरेखित है।
  6. लेजर शक्ति को समायोजित करें और अपनी कोशिकाओं की आवश्यकताओं के अनुसार समय की प्रक्रिया करें। यहां, 40% बिजली और 25% प्रक्रिया समय का उपयोग किया गया था।
  7. लेजर को सक्षम करने के लिए, लेजर ऑफ बटन पर क्लिक करें, जो तब लेजर ऑन के रूप में दिखाई देगा। रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर पर स्विच करें, एक फ़ाइल नाम चुनें, और माप रिकॉर्ड करने के लिए विंडो के शीर्ष पर प्ले बटन के बाद लाल रिकॉर्डिंग बटन पर क्लिक करें।
  8. लेजर के साथ कोशिकाओं को खोलने से पहले 60 सेकंड की बेसलाइन रिकॉर्ड करें। आरंभ सॉफ्टवेयर पर वापस स्विच करें।
  9. Ctrl + माउस क्लिक का उपयोग करके दाईं ओर वर्चुअल मानचित्र पर लेजर द्वारा बाहर रखे जाने वाले इलेक्ट्रोड को निष्क्रिय करें। सॉफ्टवेयर विंडो के दाईं ओर सरणी प्रतिनिधित्व पर उन्हें सक्रिय करके रुचि के इलेक्ट्रोड का चयन करें।
  10. लेजर शुरू करने के लिए, Alt + माउस क्लिक का उपयोग करें और इस अच्छी तरह से केंद्र इलेक्ट्रोड का चयन करें। यह लेजर को इस कुएं के प्रत्येक इलेक्ट्रोड पर कोशिकाओं को स्वचालित रूप से खोलने के लिए शुरू करता है। प्रत्येक अच्छी तरह से दोहराएं। लेजर तब चयनित कुएं के सभी पहले सक्रिय इलेक्ट्रोड को स्वचालित रूप से खोल देगा।

4. ड्रग हैंडलिंग और आवेदन

  1. माप के दिन दवा परीक्षणों के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी पदार्थों को ताजा तैयार करें। सुनिश्चित करें कि कुओं में 1:10 कमजोर पड़ने के लिए अंतिम आवेदन एकाग्रता मध्यम में 10 गुना अधिक है।
  2. निम्फेडिपिन, ई 4031, और डोफेटिलाइड को पहले डीएमएसओ में एमएम एकाग्रता में भंग करें, और फिर वांछित एकाग्रता के माध्यम से 10 गुना तक। कुएं में 0.1% की अंतिम डीएमएसओ एकाग्रता से अधिक कभी न हों।
  3. 60 s के लिए आधारभूत गतिविधि रिकॉर्ड करें। प्रोटोकॉल के चरण 3 में वर्णित लेजर-प्रेरित पोरेशन शुरू करें, जिसके परिणामस्वरूप एफपी का लीएपी आकार में परिवर्तन होता है।
  4. सभी दवाओं को एकल-एकाग्रता-प्रति-अच्छी तरह से लागू करें। 6-वेल एमईए के लिए क्रमशः 20 μL मध्यम प्रति कुएं और सिंगल-वेल MEAs के लिए 100 μL हटा दें। दवा के स्टॉक समाधान के एमईए प्रकार के आधार पर 20 μL या 100 μL जोड़ें, जिसे कुएं में मापा जा सकता है और सावधानीपूर्वक 2-3 बार ऊपर और नीचे किया जा सकता है। सांख्यिकीय प्रासंगिकता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक दवा और एकाग्रता की कम से कम तीन प्रतिकृतियां करें।
  5. यौगिकों को 300 सेकंड तक धोने दें। इस समय के दौरान, लीएपी आकार वापस एफपी आकार में बदल सकता है। फिर, लेजर-प्रेरित पोरेशन को प्रेरित करें और अतिरिक्त 60 सेकंड के लिए लीएपी पर संभावित यौगिक-प्रेरित प्रभावों को रिकॉर्ड करें।

5. डेटा निर्यात

  1. रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर में रिकॉर्डिंग को रीप्ले करके प्रासंगिक इलेक्ट्रोड का चयन करें। MC_Rack फ़ाइलों को ASCII .txt फ़ाइलों में कनवर्ट करने के लिए MC_DataTool का उपयोग करें।
  2. फाइल > ओपन एमसीडी पर क्लिक करें > MC_Rack फाइल का चयन करें। txt बटन (नीला पाठ) पर क्लिक करें।
  3. इलेक्ट्रोड का चयन करें। चयनित इलेक्ट्रोड को दाईं ओर सूची में दिखाया जाएगा।
  4. फ़ोल्डर का चयन करने और नई .txt फ़ाइल का नाम बदलने के लिए ब्राउज़ पर क्लिक करें। सहेजें पर क्लिक करें।
  5. निर्यात किए गए इलेक्ट्रोड का चयन न करें और निर्यात करने के लिए अगले इलेक्ट्रोड का चयन करें। रुचि के सभी इलेक्ट्रोड के लिए प्रक्रिया दोहराएं।

6. डेटा हैंडलिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. आयात ने बाइनरी निशान को आर19 में बदल दिया। निम्नलिखित पैकेजों वाले कस्टम-अनुरूप स्क्रिप्ट का उपयोग करके डेटा की कल्पना / विश्लेषण करें: dplyr, tidyr, और ggplot2 20,21,22।

Representative Results

खेती किए गए कार्डियोमायोसाइट्स से विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए उपयोग की जाने वाली रिकॉर्डिंग प्रणाली में एक मानक एमईए प्रणाली शामिल थी जो एक हीटर से सुसज्जित थी और एक कंप्यूटर से जुड़े कार्बोजेन के लिए एक कक्ष था। सिस्टम को इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग डिवाइस के शीर्ष पर सेट किया गया था, जिसे बदले में एक छोटी एंटी-कंपन यूनिट (चित्रा 1 ए-बी) के शीर्ष पर रखा गया था।

आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स2 पिघलने के बाद 2-3 दिनों के भीतर अनायास धड़कना शुरू कर दिया ( दिन इन विट्रो, डीआईवी) और माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई दे रहे थे। डीआईवी 4 के बाद से, बीटिंग आवृत्ति नियमित हो गई, और एमईए चिप्स के संबंधित कुओं के भीतर अधिकांश इलेक्ट्रोड पर 1 से 5 एमवी के बीच विध्रुवण घटक के पीक-टू-पीक आयामों के साथ बाह्य क्षेत्र क्षमता (एफपी) का पता लगाया जा सकता है। जांच के तहत 95% से अधिक कुओं में विद्युत गतिविधि का पता लगाया जा सकता है। DIV 7 के बाद से, सेल डिटेचमेंट की संभावना बढ़ गई, जिससे इन कुओं का आगे उपयोग असंभव हो गया।

लेजर-प्रेरित झिल्ली खोलने को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर लेजर की शक्ति और प्रक्रिया समय दोनों को समायोजित करने की अनुमति देता है जो केवल जांच के तहत इलेक्ट्रोड पर कोशिका झिल्ली के उद्घाटन की मध्यस्थता करता है (चित्रा 1 सी), जबकि संबंधित कुएं में अन्य इलेक्ट्रोड अप्रभावित हैं। जबकि बहुत रूढ़िवादी सेटिंग्स ने एफपी के तरंग को नहीं बदला, बहुत अधिक सेटिंग्स के परिणामस्वरूप कार्डियोमायोसाइट्स की कथित चोट हुई, जो जोरदार लेकिन क्षणिक धड़कन या सिग्नल के नुकसान से संकेत मिलता है। जब कोशिकाओं द्वारा 40% शक्ति और 25% प्रक्रिया समय की सेटिंग में समायोजित किया जाता है, तो लेजर पल्स के ट्रिगर के परिणामस्वरूप रिकॉर्ड किए गए वेवफॉर्म में कई बदलाव होते हैं (एक अनुकरणीय रिकॉर्डिंग के लिए चित्रा 1 डी देखें)। इन शर्तों के तहत, इलेक्ट्रोड सामग्री का कोई परिवर्तन मैक्रोस्कोपिक रूप से नहीं देखा गया था। रिकॉर्ड किए गए सिग्नल आयाम में 4.1 ± 0.41 (एन = 20, रेंज 1.34-8.83) गुना की वृद्धि हुई, रिकॉर्डिंग के यादृच्छिक रूप से चुने गए उप-समूह से विश्लेषण किया गया, जिसके परिणामस्वरूप 7 और 22 एमवी के बीच आयाम हुए। इसके अलावा, तरंग एक मानक एफपी आकार से शुरुआत में तेजी से, द्विध्रुवीय और क्षणिक वोल्टेज विक्षेपण के साथ बदल गई, इसके बाद बेसलाइन पर एक पठार चरण और एफपी के अंत को एक ऐसे आकार में इंगित करने वाला एक छोटा विक्षेपण होता है जो इंट्रासेल्युलर रूप से रिकॉर्ड किए गए एपी के करीब था, जिसमें तेजी से वृद्धि, विस्तारित विध्रुवीकृत पठार चरण और बेसलाइन के नीचे एक अंडरशूट के साथ एक पुनर्ध्रुवण चरण था (चित्रा 1 ई)। ). हमने इन वोल्टेज विक्षेपणों को लेजर-प्रेरित एपी (लीएपी) के रूप में परिभाषित किया है। ज्यादातर मामलों में, संक्रमण क्षणिक था और कम से कम 5 मिनट के भीतर आंशिक रूप से उलटा था। कार्डियक सिंकेटियम के भीतर सिग्नल प्रसार लीएपी प्रेरण (चित्रा 2) के बाद अपरिवर्तित रहा, यह दर्शाता है कि शेष सिंकिटियम लेजर पल्स से संभावित क्षति से प्रभावित नहीं था।

इंट्रासेल्युलर रूप से रिकॉर्ड किए गए एपी की समानताएं लीएपी के मापदंडों को निकालने के लिए अनुमति दी जाती हैं जो एफपी के लिए सुलभ नहीं हैं (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 ए देखें), सबसे प्रमुख रूप से विशिष्ट समय बिंदुओं पर लीएपी की अवधि का माप (उदाहरण के लिए, 20%, 50%, और 90%) (चित्रा 3 बी), आमतौर पर एपी के विवरण के लिए उपयोग किए जाने वाले एपीडी 20/50/90 के अनुरूप।

हमने आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले कार्डियोएक्टिव फार्माकोलॉजिकल टूल यौगिकों के लिए लेजर-ओपन कार्डियोमायोसाइट्स की प्रतिक्रिया का परीक्षण किया। एक अनुकरणीय प्रोटोकॉल डिजाइन चित्रा 3 सी में पाया जा सकता है। चूंकि लीएपी का परिवर्तन हमेशा पूरे प्रयोग में जारी नहीं रहा, इसलिए यौगिक अनुप्रयोग को कुल रिकॉर्डिंग समय को कम करने के लिए संचयी तरीके के बजाय एकल-एकाग्रता-प्रति-वेल के रूप में किया गया था। फिर भी, परीक्षण यौगिक को लागू करने से पहले या तो कोशिकाओं को फिर से खोलना या एक और इलेक्ट्रोड क्षेत्र खोलना आवश्यक था।

विशिष्ट एल-टाइप सीए2 + चैनल ब्लॉकर, निफेडिपिन23,24 के अलावा, लीएपी के पठार चरण को एकाग्रता-निर्भर तरीके से कम कर दिया और इस तरह पूरे लीएपी को छोटा कर दिया (चित्रा 4 ए, बी)। यह छोटापन अनमैनिपुलेटेड इलेक्ट्रोड (चित्रा 4 सी) से कार्डियोमायोसाइट्स के एफपी से प्राप्त विश्लेषण के बराबर था, यह दर्शाता है कि शास्त्रीय एफपी रिकॉर्डिंग की तुलना में इस रिकॉर्डिंग विधि का प्रतिकूल प्रभाव नहीं था।

ई 4031 प्रासंगिक केवी 1.11 (एचईआरजी) पोटेशियम चैनल25 के पुनर्ध्रुवण को रोकता है और बढ़ी हुई सांद्रता पर कार्डियोमायोसाइट्स के लयबद्ध व्यवहार की ओर जाता है। एफपी रिकॉर्डिंग से प्राप्त विश्लेषण के समान, ई 4031 ने एकाग्रता-निर्भर तरीके से लीएपी अवधि में वृद्धि की (चित्रा 5)। इसके अतिरिक्त, 0.01 μM और उच्च की सांद्रता पर, LIAP के अंत में छोटे सकारात्मक वोल्टेज विक्षेपण दिखाई दे रहे थे। ये विक्षेपण उच्च सांद्रता के साथ अधिक प्रमुख हो गए, जो एफपी के विपरीत एक क्षणिक नए विध्रुवण का संकेत देते हैं, जहां ये विक्षेपण लगभग अदृश्य थे (चित्रा 5 बी-सी, ऊपरी (एफपी) बनाम निचले (लीएपी) निशान देखें)। इस व्यवहार को प्रारंभिक आफ्टरडिपोलराइजेशन (ईएडी) के रूप में जाना जाता है। 0.1 μM की उच्चतम सांद्रता पर, ये ईएडी समय के साथ अस्थानिक बीट्स में बढ़ गए, जो समय से पहले कार्रवाई क्षमता (चित्रा 5 सी) हैं। ईएडी और अस्थानिक बीट दोनों प्रोरैडमिक गतिविधि के प्रमुख संकेतक हैं। चित्रा 5 डी में दिखाए गए उदाहरण के अंत में, विद्युत गतिविधि के परिणामस्वरूप लयबद्ध धड़कन हुई। इसके अलावा, एफपी और लीएपी रिकॉर्डिंग के बीच प्रदर्शित एकाग्रता-प्रतिक्रिया-संबंध मेल खा रहे थे (चित्रा 5 ई)। हालांकि, परीक्षण यौगिक की उच्च सांद्रता पर एफपी के कमजोर पुनर्ध्रुवण घटक के परिणामस्वरूप एफपी डेटा में अधिक परिवर्तनशीलता है। यह आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स2 की विशिष्ट प्रकृति प्रतीत होती है जो नियंत्रण स्थितियों के तहत भी असैजिक रूप से लंबे एपी उत्पन्न करती है (एपी अवधि > 700 एमएस)। एमईए प्रणाली ने एक आंतरिक 0.1 हर्ट्ज एसी फ़िल्टरिंग लागू की, जिसके परिणामस्वरूप बदले में लीएपी का आंशिक रूप से फ़िल्टर किया गया आकार था, हालांकि अंतर्निहित एपी की शुरुआत और समाप्ति के बारे में गुणात्मक जानकारी को बाधित किए बिना।

यह पता चला कि एफपी रिकॉर्डिंग की तुलना में एलआईएपी में कम सांद्रता पर प्रोरैडमिक वोल्टेज विक्षेपण की प्रारंभिक घटना का पता लगाया जा सकता है। चित्र 6 में दिखाया गया है कि 3 μM की एकाग्रता पर डोफेटिलाइड के आवेदन के दौरान विद्युत गतिविधि की रिकॉर्डिंग है। रिकॉर्डिंग उसी कुएं में प्राप्त की गई थी। यद्यपि एफपी और लीएपी दोनों ने लगभग 2 सेकंड की अवधि प्रदर्शित की, एफपी तरंग विनीत थी, जो नियमित रूप से पुनर्ध्रुवीकरण विक्षेपण प्रस्तुत करती थी। उसी समय, liAPs के अंत में, विभिन्न परिमाणों पर ईएडी दिखाई देने लगे। प्रासंगिक सुरक्षा-औषधीय संवेदनशीलता में यह वृद्धि आगे इस खोज का समर्थन करती है कि सतह प्लास्मोन अनुनाद द्वारा प्रेरित एलआईएपी पुन: ध्रुवीकरण चरण की बेहतर योग्यता की अनुमति देता है और इस तरह जांच के तहत परीक्षण यौगिकों की कार्रवाई के तरीके के बारे में अधिक जानने में मदद करता है।

Figure 1
चित्रा 1: इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग सेटअप और अनुकरणीय रिकॉर्डिंग। (बी) ओपन एमईए रिकॉर्डिंग एम्पलीफायर के साथ रिकॉर्डिंग सिस्टम का शीर्ष दृश्य। (सी) दाईं ओर आभासी एमईए मानचित्र के साथ आरंभीकरण सॉफ्टवेयर। 1: एंटी-वाइब्रेशन टेबल, 2: इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग सिस्टम, 3: लेजर सुरक्षा ढक्कन, 4: ह्यूमिडिफाइड कार्बोजेन चैंबर, 5: एमईए हीटिंग सिस्टम, 6: एमईए इंटरफ़ेस बोर्ड, 7: 1-वेल एमईए चिप रिकॉर्डिंग एम्पलीफायर के अंदर। (डी) एलआईएपी के प्रेरण से पहले और बाद में एक इलेक्ट्रोड से उदाहरण रिकॉर्ड करना। शीर्ष: लगभग 6 मिनट की रिकॉर्डिंग। डॉटेड लाइनें नीचे दिखाए गए विस्तारित क्षेत्रों को चिह्नित करती हैं। (ई) आवर्धित एफपी (ऊपर) और लीएपी (नीचे)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: लीएपी प्रेरण के बाद सिग्नल प्रसार पैटर्न संरक्षित रहता है। सिंकिटियम के भीतर उत्तेजना तरंग के सिग्नल प्रसार का गलत रंग कोडिंग। नीला जल्दी इंगित करता है (-4 एमएस से शुरू होता है); लाल रंग पट्टी द्वारा इंगित संदर्भ इलेक्ट्रोड ई 54 पर प्राप्त संकेत से देर से समय बिंदु (+3 एमएस) को इंगित करता है। सिग्नल इलेक्ट्रोड सरणी के ऊपर दाएं से नीचे बाईं ओर यात्रा करता है। (ए) लीएपी प्रेरण से पहले, (बी) लीएपी प्रेरण के 1 मिनट बाद। (सी) लीएपी प्रेरण के 4 मिनट बाद। फ्लैश प्रतीक इलेक्ट्रोड 64 पर लेजर प्रेरण बिंदु को इंगित करता है। ध्यान दें कि समग्र प्रसार दिशा में कोई अंतर दिखाई नहीं दे रहा है। काले आयताकार अमान्य डेटा का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: FP/LIAP पैरामीटर परिभाषा और रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल. (A) पैरामीटर जिन्हें शास्त्रीय FP से निकाला जा सकता है. (B) अतिरिक्त पैरामीटर जिन्हें LIAP से प्राप्त किया जा सकता है. (सी) दवा माप की समयरेखा। बाएं से दाएं: 60 सेकंड के लिए नियंत्रण रिकॉर्डिंग, LIAP का प्रेरण, 60 s के लिए LIAP की रिकॉर्डिंग, दवा अनुप्रयोग, वॉश-इन टाइम 300 s, LIAP का पुन: प्रेरण, 60 s के लिए LIAP की रिकॉर्डिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: निफेडिपिन एकाग्रता-निर्भर तरीके से कार्डियक लीएपी को छोटा करता है। (A) शीर्ष: FP नियंत्रण (नीले) पर और 0.3 μM Nifedipine (लाल) की उपस्थिति में निशान। बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए वाई-एक्सिस ऑफसेट के साथ निशान प्रदर्शित किए जाते हैं। नीचे: लीएपी एक ही एमईए रिकॉर्डिंग से निशान लगाता है, जिसके परिणामस्वरूप बीट दर में वृद्धि के साथ संयुक्त लीएपी का छोटा होना होता है। (बी) नियंत्रण (नीला) के दौरान एकल लीएपी का सुपरपोजिशन और निफेडिपिन (लाल) की विभिन्न सांद्रता का अनुप्रयोग। a: 0.01 μM, b: 0.1 μM, और c: 0.3 μM. बढ़ती सांद्रता के साथ LIAP अवधि की कमी पर ध्यान दें। (सी) एफपी (काला) और लीएपी (लाल) रिकॉर्डिंग से प्राप्त सिग्नल चौड़ाई का एकाग्रता-प्रतिक्रिया संबंध। डेटा एन = 3 प्रयोगों से है और नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: E4031 (प्रो-) लयबद्ध व्यवहार को प्रेरित करता है। (A) FP (ऊपर) और LIAP (नीचे) नियंत्रण स्थितियों में। (बी-सी) E4031 (0.1 μM) लागू करने के बाद FPs और LIAP को अलग-अलग समय बिंदुओं पर दर्ज किया गया था। 80 के दशक के बाद, पहला ईएडी लीएपी (बी; एक लाल तीर द्वारा चिह्नित) के अंत में दिखाई देता है। परीक्षण यौगिक (सी) की उपस्थिति में ईएडी 320 सेकंड के बाद अस्थानिक बीट में परिवर्तित हो जाते हैं। (डी) 530 सेकंड के बाद, कार्डियक सिंकेटियम एक टैचीकार्डिक अवस्था में प्रवेश करता है। लीएपी रिकॉर्डिंग से चित्रित ट्रेस। (ई) एफपी (काला) और लीएपी (लाल) चौड़ाई का एकाग्रता-प्रतिक्रिया संबंध। एन = 4 प्रयोगों से डेटा, नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: एफपी की तुलना में एलआईएपी में प्रोरैडमिक घटनाओं का पता लगाना अधिक संवेदनशील है। (ए) एफपी रिकॉर्डिंग और (बी) 3 μM Dofetilide के आवेदन के दौरान एक ही कुएं के भीतर LIAP रिकॉर्डिंग। जबकि कुछ liAPs के अंत में, ईएडी का पता लगाया जा सकता है, वे एफपी रिकॉर्डिंग में अप्राप्य रहते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह अभिनव विधि कार्डियोएक्टिव फार्माकोलॉजिकल टूल यौगिकों के आवेदन के दौरान कार्डियक एक्शन क्षमता के फार्माकोलॉजिकल मॉड्यूलेशन की जांच करने का एक नया तरीका प्रदर्शित करती है।

शास्त्रीय एमईए रिकॉर्डिंग एफपी रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है, जो कार्डियक एपी14 का व्युत्पन्न है। यह अप्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग डी- और रिपोलराइजेशन के समय पाठ्यक्रम को जोड़ती है और इस तरह एपी की आवश्यक विशेषताओं को समाप्त करती है। इसके अलावा, हालांकि एपी का ट्रांससेलुलर वोल्टेज परिवर्तन आमतौर पर लगभग 100 एमवी के मूल्यों तक पहुंचता है, समग्र एफपी आयाम तुलनात्मक रूप से कम रहता है, जिसमें कई 100 μV और कम एकल-अंकीय mV मानों के बीच चरम आयाम होते हैं। रिकॉर्डिंग सिद्धांत के कारण, पुनर्ध्रुवण चरण छोटा है; कई मामलों में, यह केवल पता लगाने योग्य है और अक्सर अस्पष्ट आकार का होता है, जिससे एफपी के अंत को परिभाषित करना मुश्किल हो जाता है। कोशिका झिल्ली का उद्घाटन हमें इंट्रासेल्युलर वोल्टेज तक पहुंच प्राप्त करने की अनुमति देता है, जिससे कार्डियक एपी के समय पाठ्यक्रम को उजागर किया जा सकता है। एफपी रिकॉर्डिंग की तुलना में इस रिकॉर्डिंग विधि के कई फायदे हैं। सबसे पहले, सिग्नल आयाम अधिक प्रमुख है, जो एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करता है। दूसरे, तरंग के परिणामस्वरूप पुनर्ध्रुवण का बेहतर पता चलता है। तीसरा, पुनर्ध्रुवण चरण का आकार परीक्षण यौगिक की कार्रवाई के तरीके में अंतर्दृष्टि का योगदान देता है, जो सिग्नल विश्राम की तीव्रता द्वारा प्रदान किया जाता है। और अंत में, यह विधि महत्वपूर्ण प्रतिकूल दवा प्रभावों का पता लगाने के लिए एक बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करती है, जो लीएपी में ईएडी की घटना के लिए चित्रा 6 में प्रदर्शित रिकॉर्डिंग उदाहरण द्वारा प्रदर्शित होती है, लेकिन एफपी में नहीं।

अब तक, इंट्रासेल्युलर एपी तक पहुंच प्राप्त करने के दो तरीके हैं। पहला एकइलेक्ट्रोपोरेशन 26,27 द्वारा प्राप्त किया जाता है। यहां, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के माध्यम से लागू छोटी और मजबूत वोल्टेज दालें कोशिका झिल्ली28 को खोल सकती हैं। दूसरी संभावना लेजर पल्स के माध्यम से झिल्ली खोलना है, जो सतह प्लास्मोन अनुनाद नामक एक भौतिक घटना का उपयोग करता है, जैसा कि यहां दिखाया गया है। इलेक्ट्रोपोरेशन की तुलना में फायदों में से एक लगातार उद्घाटन की बढ़ती संभावना है। अत्यधिक केंद्रित लेजर स्पॉट (1-3 μm) के कारण यह प्रभाव बहुत स्थानीय रूप से रुचि के इलेक्ट्रोड तक सीमित है। दिलचस्प बात यह है कि लीएपी की शुरुआत ने खेती किए गए सिंकिटियम के सिग्नल प्रसार को नहीं बदला। यह इंगित करता है कि, हालांकि कोशिका अखंडता क्षतिग्रस्त है, कार्डियोमायोसाइट्स झिल्ली में छेद के माध्यम से विध्रुवण नहीं करते हैं।

इस विधि की सीमाएँ हैं। इलेक्ट्रोपोरेशन की तरह, झिल्ली खोलना, ज्यादातर मामलों में, पूरे प्रयोगात्मक पाठ्यक्रम में नहीं रहता है। विशिष्ट सेल प्रकार के ब्याज के स्थिर उद्घाटन के लिए आवश्यक लेजर पल्स की न्यूनतम शक्ति और अवधि सेटिंग्स को प्रयोगों से पहले स्वतंत्र रूप से परिभाषित करने की आवश्यकता है। हमने पाया (नहीं दिखाया गया) कि पैरामीटर विभिन्न सेल प्रकारों (हमारे मामले में, कई एचआईपीएस-व्युत्पन्न और प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स) के बीच काफी भिन्न होते हैं। यह यौगिक परीक्षण प्रयोग के दौरान कोशिकाओं पर अनावश्यक तनाव से बचाता है और इसके परिणामस्वरूप अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा होता है। कोशिकाओं और इलेक्ट्रोड पर स्पष्ट ध्यान देने के लिए जेड-अक्ष को समायोजित करना महत्वपूर्ण महत्व का है। एक अकेंद्रित कैमरा चित्र एक उप-मानक स्तर पर स्थित एक लेजर स्पॉट में पैदा होता है, जिसके परिणामस्वरूप संभवतः कोशिका झिल्ली को खोलने में असमर्थता होती है। यहां तक कि सबसे अच्छे समायोजित मापदंडों के साथ, लीएपी प्रभाव क्षणिक है, और आयाम समय के साथ कम हो जाता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर स्पेस तक पहुंच लीएपी प्रेरण के बीच भिन्न होती है, दोनों एक ही इलेक्ट्रोड पर लगातार उद्घाटन के भीतर और इलेक्ट्रोड के बीच। इसके परिणामस्वरूप लीएपी आयाम की उच्च परिवर्तनशीलता होती है। कारण अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है। संभावित स्पष्टीकरण में यांत्रिक मुद्दे शामिल हैं जैसे कि लेजर फोकस का बहाव या झिल्ली खोलने का विभिन्न उपकोशिकीय स्थानीयकरण। यह इस समय परीक्षण यौगिकों के आयाम प्रभावों के विश्लेषण को जटिल बनाता है। इसके अलावा, एमईए प्रणाली द्वारा विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए अपरिहार्य बेसलाइन बहाव की भरपाई के लिए उच्च पास फ़िल्टरिंग की आवश्यकता होती है। यद्यपि यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली में, इस फ़िल्टरिंग को 0.1 हर्ट्ज (इस प्रणाली के लिए उपलब्ध सबसे कम फ़िल्टर सेटिंग) पर सेट किया गया था, पठार चरण के दौरान फ़िल्टरिंग प्रभाव अभी भी दिखाई दे रहे थे, जिसके परिणामस्वरूप कार्डियक एपी के पठार चरण के दौरान बेसलाइन की ओर वोल्टेज विक्षेपण की धीमी प्रवृत्ति थी। यह विशेष रूप से आईपीएससी-व्युत्पन्न आईसेल कार्डियोमायोसाइट्स2 जैसे बड़े पैमाने पर लंबे अंतर्निहित एपी के साथ समस्याग्रस्त है, जो पहले से ही नियंत्रण स्थितियों के तहत एपी >700 एमएस उत्पन्न करते हैं। कम फ़िल्टरिंग वाले सिस्टम का उपयोग एपी के आकार को बेहतर ढंग से संरक्षित कर सकता है और पुनर्ध्रुवण चरण के समय पाठ्यक्रम तक बेहतर पहुंच की अनुमति दे सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक अध्ययन के दौरान इंट्रासेल सिस्टम को उधार देने के लिए फोरस बायोसिस्टम्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। वे तकनीकी सहायता के लिए हे इन चांग को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को अनुदान समझौते संख्या 964518 (टॉक्सफ्री), यूरोपीय संघ क्षितिज यूरोप यूरोपीय नवाचार परिषद कार्यक्रम, परियोजना सिमुलटॉक्स (अनुदान समझौता संख्या 101057769) और आर्थिक मामलों, श्रम और पर्यटन के लिए बाडेन-वुर्टेमबर्ग के राज्य मंत्रालय से अनुदान समझौते संख्या 964518 (टॉक्सफ्री) के तहत वित्त पोषण प्राप्त हुआ है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 well MEA chip Multi Channel Systems MCS GmbH 890301
6 well MEA chip Multi Channel Systems MCS GmbH 7600069
DMSO Merck KGaA 20-139
Sigma-Aldrich		 solvent for drugs
Dofetilide ALOMONE LABS
ISRAEL HEADQUARTERS		 D-100 Drug-Measurement
dPBS Fisher Scientific GmbH 12037539 Coating
E4031 ALOMONE LABS
ISRAEL HEADQUARTERS		 E-500 Drug-Measurement
Falcon Fisher Scientific GmbH 10788561
FB Alps version 0.5.005 Foresee Biosystems
Fibronectin Merck KGaA 11051407001 Coating
iCell cardiomyocytes FUJIFILM Cellular
Dynamics, Inc. (FCDI)		 C1016
IntraCell Foresee Biosystems
Isopropanol Carl Roth GmbH + Co. KG CN09.1 For cleaning of MEA contact pads
Maintenance Medium FUJIFILM Cellular
Dynamics, Inc. (FCDI)		 #M1003 For cell-culture
MC_Data Tool Multi Channel Systems MCS GmbH Data export
MC_Rack Multi Channel Systems MCS GmbH MEA recording
MEA 2100 - 2x60 - system Multi Channel Systems MCS GmbH 890485 For MEA-recordings
Nifedipine Merck KGaA N7634
Sigma-Aldrich		 Drug-Measurement
Plating Medium FUJIFILM Cellular
Dynamics, Inc. (FCDI)		 M1001 For cell-culture
Tergazyme VWR International, LLC 1304-1 cleaning of MEAs

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References

  1. Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. Molecular basis of arrhythmias. Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).
  2. Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk. Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).
  3. Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. Role of hERG potassium channel assays in drug development. Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).
  4. Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. Cardiac arrhythmia. Scholarpedia. 3 (7), 1665 (2008).
  5. Tisdale, J. E., et al. Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).
  6. Kramer, J., et al. MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes. Scientific Reports. 3, 2100 (2013).
  7. Rampe, D., Roy, M. -L., Dennis, A., Brown, A. M. A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG. FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).
  8. Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).
  9. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  10. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
  11. Ronzhina, M., et al. Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart. Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).
  12. Beck, C., Gong, Y. A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity. Scientific Reports. 9 (1), 15878 (2019).
  13. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  14. Kovacs, G. T. A. Electronic sensors with living cellular components. Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).
  15. Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).
  16. Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes. Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).
  17. Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).
  18. Dipalo, M., et al. Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes. Science Advances. 7 (15), (2021).
  19. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing. , Vienna Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2021).
  20. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer-Verlag. New York. (2009).
  21. Wickham, H., Girlich, M. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0. , Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2022).
  22. Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6. , Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2021).
  23. Godfraind, T. Discovery and development of calcium channel blockers. Frontiers in Pharmacology. 8, 286 (2017).
  24. Vater, W., et al. Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040). Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).
  25. Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).
  26. Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  27. Fendyur, A., Spira, M. E. Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Frontiers in Neuroengineering. 5, 21 (2012).
  28. Hayes, H. B., et al. Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology. Scientific Reports. 9 (1), 11893 (2019).

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