यहां प्रस्तुत माउस डेंटेट गाइरस से अलग एकल नाभिक को अनुक्रमित करने की एक विधि है जो प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक (एफएएन) -सॉर्टिंग के माध्यम से अधिकांश न्यूरॉन्स को शामिल नहीं करती है। यह दृष्टिकोण उच्च गुणवत्ता वाले अभिव्यक्ति प्रोफाइल उत्पन्न करता है और आला में प्रतिनिधित्व किए गए अधिकांश अन्य सेल प्रकारों के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है, जिसमें तंत्रिका स्टेम सेल जैसी दुर्लभ आबादी शामिल है।
वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस (एएचएन), जिसमें डेंटेट गाइरस (डीजी) के उप-दानेदार क्षेत्र (एसजीजेड) के भीतर प्रोलिफेरेटिव और क्वीसेंट न्यूरल स्टेम सेल (एनएससी) का आजीवन रखरखाव होता है और ग्रेन्युल सेल परत में नए पैदा हुए न्यूरॉन्स से ग्रेन्युल कोशिकाओं में उनका भेदभाव होता है, कई अध्ययनों में अच्छी तरह से मान्य है। आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों, विशेष रूप से कृन्तकों का उपयोग करना, एएचएन को विनियमित करने वाले सिग्नलिंग मार्गों की जांच करने और हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला की रचना करने वाले प्रत्येक सेल प्रकार की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। उत्तरार्द्ध को संबोधित करने के लिए, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ एकल नाभिक अलगाव के संयोजन के तरीकों का प्रत्येक कोशिका आबादी के लिए जीन हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए एएचएन के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा है। हालांकि डीजी के भीतर दुर्लभ सेल आबादी को फेनोटाइपिक रूप से प्रोफाइल करने के लिए इन तकनीकों के और शोधन की आवश्यकता है। यहां, हम एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण (एसएनआरएनए-सेक) करने के लिए, न्यून एंटीजन के लिए बिना दाग वाले नाभिक का चयन करके, ताजा विच्छेदित डीजी से अलग एकल नाभिक निलंबन से अधिकांश न्यूरोनल आबादी को बाहर करने के लिए फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड न्यूक्लियस सॉर्टिंग (एफएएनएस) का उपयोग करता है। यह विधि एएचएन के अंतरकोशिकीय विनियमन की जांच करने और प्रजातियों में नए सेलुलर मार्करों और तंत्र को उजागर करने के लिए एक संभावित कदम है।
वयस्कता में हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की निरंतर पीढ़ी, जिसे वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस (एएचएन) के रूप में भी जाना जाता है, संज्ञानात्मक कार्यों जैसे सीखने, स्मृति अधिग्रहण / निकासी और पैटर्न पृथक्करण से जुड़ा हुआ है और संज्ञानात्मक घाटे को रोकने के लिए उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में लचीलापन का एक महत्वपूर्ण तंत्र प्रतीत होता है 1,2,3 . कृंतक कई तरीकों का उपयोग करके एएचएन का अध्ययन करने के लिए पसंद का मॉडल रहे हैं, जिसमें इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) विधियां शामिल हैं। अन्य प्रजातियों के लिए इन परिणामों का अनुवाद विवादास्पद बना हुआ है। दरअसल, अधिकांश प्रजातियों में एएचएन देखा गया है, लेकिन जिस हद तक यह पूरे जीवन में बना रहता है, विशेष रूप से मनुष्यों में 4,5,6,7,8, नियमित रूप से बहस की जाती है।
आज तक, एएचएन1 को संशोधित करने के लिए विभिन्न आंतरिक और बाह्य सिग्नलिंग मार्गों की पुष्टि की गई है। हालांकि, एएचएन पर अंतरकोशिकीय संचार का प्रभाव केवल9 उभर रहा है। यह पहले आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के साथ विवो विश्लेषण में संचालन करने के लिए वर्तमान में ज्ञात सेल मार्करों की अपर्याप्त विशिष्टता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। दरअसल, कई अध्ययनों ने डबलकोर्टिन या ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) जैसे मार्करों पर भरोसा किया है जो कई सेलप्रकारों 1 में व्यक्त किए जाते हैं। दूसरा, वयस्क हिप्पोकैम्पल आला10 में जटिलता और सेल विविधता की उच्च डिग्री हर सेल प्रकार को प्रोफाइल करने के लिए तकनीकी चुनौतियां लाती है। यह विशेष रूप से विभिन्न आबादी, जैसे एनएससी या ग्लियल कोशिकाओं के लिए विश्लेषणात्मक पाइपलाइनों में उपयोग किए जाने वाले अतिव्यापी सेलुलर मार्करों के साथ जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए मामला है, जिसके परिणामस्वरूप एएचएन 7,11 का आकलन करते समय विवादास्पद निष्कर्ष निकलते हैं। तीसरा, न्यूरॉन्स की विशाल संख्या एस्ट्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स या एपेंडिमल कोशिकाओं जैसे कम प्रचुर मात्रा में सेल आबादी की जांच को कमजोर करती है, भले ही एएचएन के ठीक-ट्यूनिंग विनियमन में उनकीभूमिका प्रमुख हो रही है। साथ में, ये सीमाएं कृन्तकों से अन्य प्रजातियों में परिणामों का अनुवाद करने की क्षमता को प्रभावित करती हैं। यह विशेष रूप से एक जटिल ऊतक, जैसे हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला, और मानवऊतकों से जुड़े अध्ययनों में ऊतक प्रसंस्करण के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल की कमी के साथ-साथ उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक तक पहुंचने के लिए कई बाधाओं से बढ़ जाता है। इसलिए प्रोफाइल सेल आबादी के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करना और डेंटेट गाइरस (डीजी) के भीतर नए सेलुलर मार्करों की पहचान करना महत्वपूर्ण है जो अंततः एएचएन विनियमन के लिए प्रत्येक सेल प्रकार के विभिन्न योगदानों की बेहतर समझ पैदा करेगा।
इसे प्राप्त करने के लिए, आरएनए अनुक्रमण के साथ संयुक्त एकल कोशिका (एससी) और एकल नाभिक (एसएन) अलगाव डीजी14 जैसे जटिल ऊतकों की जांच करने के लिए सहायक बन गया है। जैसे, माउस वयस्क हिप्पोकैम्पल आला से एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए सेलुलर संवर्धन की रणनीतियों को ज्यादातर एनएससी15,16 की जांच करने के लिए किया गया है। डीजी से गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक दिलचस्प रणनीति ग्लूआर 1 / सीडी 24 डबल-नकारात्मक एकल कोशिकाओं को अनुक्रमित करके लागू की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण17 के बाद एस्ट्रोसाइट्स और एनएससी के बीच अलग-अलग समूहों के बिना 1,408 कोशिकाओं को अनुक्रमित किया गया था। यह एकल कोशिका तैयारी के लिए आवश्यक कठोर एंजाइमेटिक पाचन के कारण हो सकता है जो सेल अखंडता और आरएनए को नुकसान पहुंचाता है। इस तकनीकी मुद्दे को बायपास करने के लिए, इसके बजाय एकल नाभिक अलगाव का उपयोग करने वाले कई तरीके विकसित किए गए हैं और विशेष रूप से जटिलऊतकों के लिए अनुकूल हैं। हालांकि, डीजी के भीतर या अधिक व्यापक रूप से हिप्पोकैम्पल-एंटोरिनल सिस्टम के भीतर न्यूरॉन्स की प्रबलता इन मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर मौजूद सेल आबादी की संपूर्णता का अध्ययन करने के लिए एक नमूना पूर्वाग्रह उत्पन्न करती है। इसके अलावा, एकल सेल पुस्तकालयों की तैयारी के लिए लोड करने के लिए कोशिकाओं की सीमित संख्या अनुक्रमित एकल नाभिक की विश्लेषणात्मक पाइपलाइनों में प्रमुख सेल आबादी की उपस्थिति को बढ़ाती है। दरअसल, बड़े न्यूरोनल क्लस्टर को अक्सर एनोटेट और विश्लेषण किया जाता है जबकि अन्य सेल आबादी को कम प्रतिनिधित्व दिया जा रहा है या 5,11 से चूक गया है।
इन पूर्वाग्रहों को दूर करने और माउस डीजी में मौजूद न्यूरॉन्स के अलावा अन्य सेल प्रकारों को प्रोफाइल करने में सक्षम होने के प्रयास में, फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड न्यूक्लियस सॉर्टिंग (एफएएनएस) 18 के सिद्धांत का उपयोग करके इस अध्ययन में एक विधि तैयार की गई थी जो न्यूरोनल परमाणु एंटीजन (न्यून) के साथ दाग वाले एकल नाभिक के नकारात्मक चयन द्वारा अधिकांश न्यूरोनल आबादी को बाहर करती है। Rbfox3 के रूप में भी जाना जाता है)। एंटीजन की इस पसंद को साहित्य द्वारा निर्देशित किया गया था जिसमें न्यूएन को एक विश्वसनीय न्यूरोनल मार्कर19 के रूप में वर्णित किया गया था और इस दृष्टिकोण के लिए परमाणु प्रोटीन का उपयोग करने की आवश्यकता थी। न्यून-नकारात्मक एफएसीएस-क्रमबद्ध कोशिकाओं को तब 10x जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म पर आरएनए अनुक्रमण के लिए तैयार किया गया था। परिणाम बताते हैं कि न्यून-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का बहिष्करण ग्लियल और दुर्लभ सेल आबादी के सेल-प्रकार विशिष्ट, उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए, डीजी का विच्छेदन पहला महत्वपूर्ण कदम है, जिसके लिए इसे बिना नुकसान के रखने और आसपास के ऊतकों से संदूषण को सीमित करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है। अनुभव से, हिप्पोकैम्पस से डीजी को अलग करना एक कुशल शोधकर्ता द्वारा बहुत जल्दी हासिल किया जा सकता है, जो तब विच्छेदन की तेजी को बढ़ाने के लिए अपनी तकनीक को परिष्कृत करने पर काम कर सकता है और इसलिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करने के लिए ऊतक की ताजगी में सुधार कर सकता है। इसी तरह, एकल नाभिक की तैयारी और पुन: निलंबन एक ही प्रयोग में उपयोग की जाने वाली विभिन्न स्थितियों में स्थिरता की मांग करता है, लेकिन अत्यधिक पाइपिंग से भी बचा जा सकता है जो परमाणु झिल्ली को परिवेश आरएनए जारी करने में बाधा डाल सकता है जो अनुक्रमण परिणामों को पूर्वाग्रह ति करेगा। उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक तैयार करने के लिए पहले उल्लिखित सिफारिशों के अलावा, अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ने से पहले एकल नाभिक निलंबन की एकाग्रता पर भी विचार किया जाना है। दरअसल, निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार, 1,200 nuc / μL से अधिक एकाग्रता वाली तैयारी को पतला किया जाना चाहिए, क्योंकि नाभिक एकाग्रता के इस स्तर में डाउनस्ट्रीम जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण को प्रभावित करने वाले गुणक बनाने का उच्च जोखिम होगा। ध्यान दें, 500 nuc / μL से कम नाभिक सांद्रता वाले अनुक्रमण नमूने शामिल लागत के कारण सार्थक नहीं हो सकते हैं। यह भी अनुशंसा की जाती है कि सभी गेटिंग सेट करने के लिए एक उन्नत एफएसीएस उपयोगकर्ता की सलाह का पालन करें और नमूनों और जैविक प्रतिकृतियों में सेटिंग्स के अनुरूप रहें। इसी तरह, आरएनए अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों की तैयारी में उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ प्रशिक्षण शामिल है और अधिकांश विक्रेताओं के पास इसे कुशलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए उत्कृष्ट समर्थन है। इस पद्धति को इस अध्ययन में केवल ताजा ऊतक के साथ परीक्षण किया गया था; हालांकि, FANS को जमे हुए ऊतक25 के साथ भी प्रदर्शन किया गया है। इसलिए यह मानना उचित है कि इस प्रोटोकॉल को मामूली अनुकूलन के साथ जमे हुए ऊतक के साथ किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल को एक विशेष डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग को ध्यान में रखते हुए विकसित किया गया है, जो हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला के भीतर न्यूरॉन्स के अलावा अन्य सेल आबादी की जांच करना है। दरअसल, सबूतों की बढ़ती रेखाओं से संकेत मिलता है कि उम्र बढ़ने में एएचएन की हानि को आला 1,2,3,9 के भीतर आसपास की कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। विशेष रूप से, एस्ट्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स एएचएन के प्रमुख नियामकों के रूप में उभरते हैं; हालांकि, आरएनए-अनुक्रमण के साथ मिलकर डीजी से उनके अलगाव ने मिश्रित परिणाम उत्पन्न किए हैं, जिससे इस परिकल्पना को इस तकनीकके साथ आकलन करना चुनौतीपूर्ण हो गया है। एफएसीएस सॉर्टिंग न्यून-नकारात्मक नाभिक के इस दृष्टिकोण ने उन नमूनों की तुलना में अधिक एस्ट्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के अलगाव की अनुमति दी जो एफएसीएस-क्रमबद्ध नहीं थे, जो बेहतर जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण को सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल पूरे जीवनकाल में सभी उम्र में लागू होता है और पुराने जानवरों के ऊतकों के साथ यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा इस अवधारणा का प्रमाण प्रदान करता है कि यह विधि उम्र बढ़ने वाले हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला की जांच करने के लिए मजबूत है। इस विधि के उपयोग का विस्तार करने और विभिन्न जैविक प्रश्नों के लिए इसे अनुकूलित करने के लिए, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि अन्य न्यूरोनल परमाणु झिल्ली एंटीजन को इन मार्करों के लिए सर्वोत्तम मान्य एंटीबॉडी के गहन अनुमापन के साथ एक साथ परीक्षण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डीजी में एनएससी से न्यूरोनल भेदभाव की प्रक्रिया का अध्ययन करते समय, कुछ सेल प्रकार जैसे टाइप 2 कोशिकाएं या न्यूरोब्लास्टन्यूएन (पूरक चित्रा 3) व्यक्त करना शुरू करते हैं। इसलिए, विशेष रूप से इन सेल प्रकारों की जांच करने के लिए एक और एंटीजन की आवश्यकता होगी। इसके विपरीत, इस अध्ययन में कुछ न्यूरॉन्स की पहचान अभी भी न्यून-नकारात्मक एफएसीएस-सॉर्टिंग के बाद की गई थी, संभवतः इन आबादी में न्यूएन की कम या कोई अभिव्यक्ति नहीं होने के कारण (उदाहरण के लिए, कॉर्टिकल कैजल-रेट्ज़ियस न्यूरॉन्स19)। इसके अतिरिक्त, न्यून को ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स26 की उप-आबादी में व्यक्त किया गया है, जो पक्षपाती परिणाम दे सकता है यदि ये उप-आबादी रुचि रखती थी। इस प्रकार, एफएएनएस का उपयोग शुरू करते समय एंटीजन की पसंद को सेल आबादी के समावेश या बहिष्करण से बचने के लिए सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए जो एक विशिष्ट जैविक प्रश्न के सटीक उत्तर को रोक देगा। इसके साथ सहमति में, यह भी सिफारिश की जाती है कि प्रत्येक अनुक्रमण परिणाम को इस प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण की गई परिकल्पना को मान्य या अस्वीकार करने से पहले ऑर्थोगोनल परख (जैसे, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या आरएनए-स्कोप) द्वारा आगे मान्य किया जाता है। अंत में, FANS से जुड़े कदम को वांछित सेल आबादी को बाहर करने और / या शामिल करने के लिए अधिक विस्तृत सॉर्टिंग रणनीति के साथ एक से अधिक एंटीबॉडी को शामिल करने के लिए विकसित किया जा सकता है।
अंततः, इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रौद्योगिकियों में अन्य प्रजातियों के साथ उपयोग किए जाने पर कुछ सीमाएं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, डीजी के विशिष्ट उप-क्षेत्रों के भीतर प्रतिबंधित प्रोलिफेरेटिव और क्वीसेंट एनएससी या नए पैदा हुए न्यूरॉन्स की उपस्थिति के साथ कृन्तकों में आला को बहुत अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है, लेकिन यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि अन्य प्रजातियों में हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला को कैसे चित्रित किया जाना चाहिए। दरअसल, प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं गैर-मानव प्राइमेट्स और मनुष्यों में डीजी के निरंतर क्षेत्र के भीतर संरेखित नहीं होती हैं, बल्कि इसके चारों ओर बिखरी होती हैं और एमिग्डाला7 में भी मौजूद हो सकती हैं। इसलिए, अन्य प्रजातियों में डीजी की तुलना में व्यापक क्षेत्रों को विच्छेदित और अलग करना संभावित रूप से इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रभावित करेगा। विशेष रूप से, ऊतक की तैयारी के लिए पृथक्करण और ट्राइट्यूरेशन चरणों को ऊतक27,28 के बड़े टुकड़ों के साथ काम करते समय अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के संबंध में, जबकि इनब्रीड में रखे गए कृन्तकों में एक बहुत ही सजातीय और बहुत अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम होता है, मानव जीनोम की आनुवंशिक परिवर्तनशीलता को विभिन्न सेल आबादी (जैसे, एनएससी और एस्ट्रोसाइट्स) को स्पष्ट रूप से अलग करने के लिए सेलुलर मार्करों की अपर्याप्त संख्या के साथ संयुक्त विश्लेषण के लिए बहुत अधिक सामान्यीकरण की आवश्यकता होती है जो कोशिकाओं के एक छोटे समूह की पहचान होने पर अलग-अलग निष्कर्ष निकाल सकती है। 11. ऐसी स्थितियों में, सेल संवर्धन अभी भी एक पसंदीदा विकल्प हो सकता है या विश्लेषणात्मक शक्ति बढ़ाने के लिए अन्य रणनीतियों के साथ उपयोग किया जाना चाहिए।
बहरहाल, वर्तमान दृष्टिकोण एएचएन के विनियमन में संभावित रूप से महत्वपूर्ण सेल आबादी की भूमिका की जांच को सक्षम कर सकता है। यह विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट्स की आबादी के लिए मामला हो सकता है, जो न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की शुरुआत और प्रगति में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। इस अध्ययन से पता चला है कि एस्ट्रोसाइट्स और अन्य दुर्लभ सेल आबादी को डीजी के भीतर मौजूद न्यूरॉन्स के विशाल बहुमत को छोड़कर पहचाना और प्रोफाइल किया जा सकता है। विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करने वाले अन्य अध्ययन सेल आबादी 5,11,17 की एक ही श्रेणी से नाभिक की समान वसूली प्राप्त करने में सक्षम नहीं हैं। इसके अलावा, इस अध्ययन के परिणाम दर्शाते हैं कि इस सेल आबादीके विशिष्ट संवर्धन के बिना एनएससी क्लस्टर को अलग करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करना संभव है।
अंत में, इस पद्धति का पालन करना और सुधारना एएचएन के मॉड्यूलेशन के लिए हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला की प्रासंगिक भूमिका से संबंधित उत्कृष्ट प्रश्नों को संबोधित करने के लिए एक कदम आगे होगा। विशेष रूप से, यह एएचएन9 के विनियमन से जुड़े सेल आबादी में वृद्ध और रोगग्रस्त दिमाग में जीन अभिव्यक्ति के स्तर में नई अंतर्दृष्टि ला सकता है, एनएससी1 की संभावित विषमता की पहचान का समर्थन कर सकता है या एएचएन में वाहिका की भूमिका को संबोधित कर सकता है। अंततः, इस विधि को समान प्रश्नों और मुद्दों के साथ अन्य वयस्क स्टेम सेल niches के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक तकनीकी सहायता के लिए लाचलान हैरिस और पिएरो रिगो और पांडुलिपि पर प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए जेसन एम उस्लानर और डिट्टे लोवेट को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को एमआरसी से अनुदान समर्थन और एमएसडी, फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट के साथ एक पूर्व-प्रतिस्पर्धी अनुसंधान सहयोग द्वारा समर्थित किया गया था, जो कैंसर रिसर्च यूके (एफसी0010089), यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एफसी0010089), वेलकम ट्रस्ट (एफसी0010089) और एफजी (106187 / जेड / जेड / जेड) के लिए वेलकम ट्रस्ट इन्वेस्टिगेटर अवार्ड द्वारा अपना वित्त पोषण प्राप्त करता है। हम कई लेखकों से माफी मांगते हैं जिनके काम पर हम जगह की कमी के कारण चर्चा और हवाला नहीं दे सके।
0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
Trypan blue | Invitrogen | T10282 |