ここでは、マウス歯状回から単離された単一の核を配列決定する方法を紹介し、蛍光活性化核(FAN)ソーティングによってほとんどのニューロンを除外します。このアプローチは、高品質の発現プロファイルを生成し、神経幹細胞などの希少な集団を含む、ニッチに代表される他のほとんどの細胞タイプの研究を容易にします。
成体海馬神経新生(AHN)は、歯状回(DG)の顆粒下ゾーン(SGZ)内の増殖性および静止性神経幹細胞(NSC)の生涯にわたる維持と、新しく生まれたニューロンから顆粒細胞層の顆粒細胞への分化で構成されており、多くの研究で十分に検証されています。遺伝子組み換え動物、特にげっ歯類を使用することは、AHNを調節するシグナル伝達経路を調査し、海馬の神経原性ニッチを構成する各細胞型の役割を研究するための貴重なツールです。後者に対処するために、単一核単離と次世代シーケンシングを組み合わせた方法は、各細胞集団の遺伝子シグネチャを特定するためにAHNの分野で大きな影響を及ぼしました。しかし、DG内のより希少な細胞集団を表現型的にプロファイリングするには、これらの技術のさらなる改良が必要です。ここでは、蛍光活性化核ソーティング(FANS)を利用して、NeuN抗原の非染色核を選択することにより、解剖したばかりのDGから分離された単一核懸濁液からほとんどのニューロン集団を除外し、単一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)を実行する方法を紹介します。この方法は、AHNの細胞間制御をさらに調査し、種を超えた新しい細胞マーカーとメカニズムを明らかにするための潜在的な足がかりです。
成人期の海馬ニューロンの継続的な生成は、成人海馬神経新生(AHN)とも呼ばれ、学習、記憶獲得/クリアランス、パターン分離などの認知機能に関連しており、認知障害を予防するための老化および神経変性疾患における回復力の重要なメカニズムであるように思われます1,2,3 .げっ歯類は、免疫細胞化学や次世代シーケンシング(NGS)法など、いくつかの方法を使用してAHNを研究するための選択モデルです。これらの結果の他の種への翻訳は議論の余地があります。実際、AHNはほとんどの種で観察されていますが、生涯を通じて持続する程度、特にヒト4,5,6,7,8では定期的に議論されています。
現在までに、様々な内因性および外因性のシグナル伝達経路がAHN1を調節することが確認されている。しかし、細胞間コミュニケーションがAHNに与える影響は、まだ明らかになったばかりです9。これはまず、遺伝子改変動物を用いてin vivo解析を行うには、現在知られている細胞マーカーの特異性が不十分であることに起因する可能性がある。実際、多くの研究は、複数の細胞型で発現するダブルコルチンやグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)などのマーカーに依存しています1。第二に、成体の海馬ニッチ10の複雑さと高度な細胞多様性は、すべての細胞タイプのプロファイリングに技術的な課題をもたらします。これは特に、NSCやグリア細胞などの異なる集団の分析パイプラインで使用される重複する細胞マーカーを使用したバイオインフォマティクス分析の場合に当てはまり、AHN 7,11を評価する際に物議を醸す結論をもたらします。第三に、膨大な数のニューロンは、AHNの微調整制御におけるそれらの役割が顕著になりつつあるにもかかわらず、星状細胞、希突起膠細胞または上衣細胞などのそれほど豊富でない細胞集団の研究を弱体化させる9。一緒に、これらの制限はげっ歯類から他の種に結果を翻訳する能力に影響を与えます。これは、海馬神経原性ニッチなどの複雑な組織をin vitroで再現することの難しさ、およびヒト組織を含む研究における組織処理のための標準化されたプロトコルの欠如とともに高品質の組織にアクセスするための多くのハードルによって特に増幅されます12,13。したがって、細胞集団をプロファイリングし、歯状回(DG)内の新しい細胞マーカーを特定するための新しいアプローチを開発し、最終的にはAHN制御に対する各細胞タイプのさまざまな寄与をよりよく理解することが重要です。
これを達成するために、RNAシーケンシングと組み合わせた単一細胞(sc)および単一核(sn)単放散は、DG14などの複雑な組織の調査に不可欠になっています。そのため、マウス成体海馬ニッチから単一細胞を単離するための細胞濃縮の戦略は、主にNSCを調べるために行われてきました15、16。DGから非神経細胞を濃縮するための興味深い戦略は、GluR1/Cd24ダブルネガティブシングルセルのシーケンシングによって適用され、バイオインフォマティクス解析後にアストロサイトとNSCの間に明確なクラスターなしで1,408個の細胞がシーケンスされました17。これは、細胞の完全性とRNAを損なう単一細胞の調製に必要な過酷な酵素消化が原因である可能性があります。この技術的問題を回避するために、代わりに単一核単離を使用するいくつかの方法が開発されており、複雑な組織に特に適している11,18。しかし、DG内またはより広義には海馬-嗅内系内のニューロンの優位性は、これらの脳領域内に存在する細胞集団全体を研究するためのサンプリングバイアスを生成する。さらに、シングルセルライブラリの調製のためにロードする細胞数が限られているため、配列決定された単一核の分析パイプラインにおける主要な細胞集団の存在が強調されます。実際、大きなニューロンクラスターはしばしば注釈を付けて分析されますが、他の細胞集団は過小評価されているか、見逃されています5,11。
これらのバイアスを克服し、マウスDGに存在するニューロン以外の細胞型をプロファイリングできるようにするために、本研究では、蛍光活性化核ソーティング(FANS)18 の原理を用いて、ニューロン核抗原(NeuN、 Rbfox3とも呼ばれます)。この抗原の選択は、NeuNを信頼できるニューロンマーカーとして記述している文献19 と、このアプローチに核タンパク質を使用する必要性によって導かれました。次に、NeuN陰性FACSソーティング細胞を、10x GenomicsプラットフォームでRNAシーケンシング用に調製しました。この結果は、NeuN発現細胞を排除することで、グリア細胞集団および希少細胞集団の細胞型特異的で高品質のトランスクリプトームプロファイリングが可能になることを示しています。
このプロトコルを正常に実行するには、DGの解剖が最初の重要なステップであり、損傷を受けないようにし、周囲の組織からの汚染を制限するための練習が必要です。経験から、海馬からのDGの分離は、解剖の速さを高め、組織の鮮度を改善して高品質のデータを生成するための技術の改良に取り組む熟練した研究者によって非常に迅速に取得できました。同様に、単一核の調製と再懸濁には、単一の実験で使用されるさまざまな条件にわたる一貫性が必要ですが、シーケンシング結果にバイアスをかける周囲RNAを放出する核膜を破壊する可能性のある過度のピペッティングの回避も必要です。高品質の核を調製するための前述の推奨事項に加えて、シーケンシングを進める前に、単一核懸濁液の濃度も考慮する必要があります。実際、メーカーのガイドラインによると、1,200 nuc/μLを超える濃度の調製物は、このレベルの核濃度が下流のバイオインフォマティクス分析に影響を与えるマルチプレットを形成するリスクが高いため、希釈する必要があります。注目すべきは、核濃度が500 nuc/μL未満のサンプルのシーケンシングは、コストがかかるため価値がない可能性があります。また、上級FACSユーザーのアドバイスに従って、すべてのゲーティングを設定し、サンプルと生物学的複製全体の設定との一貫性を保つことをお勧めします。同様に、RNAシーケンシング用のライブラリの準備には、高品質の結果を達成するためのトレーニングが必要であり、ほとんどのベンダーはこれを効率的に達成するための優れたサポートを提供しています。この方法は、この研究では新鮮な組織でのみテストされました。しかしながら、FANSは凍結組織25を用いても行われている。したがって、このプロトコルは、わずかな最適化ではありますが、凍結組織で実行できると仮定するのが合理的です。
このプロトコルは、海馬の神経原性ニッチ内のニューロン以外の細胞集団を調査するという特定のダウンストリームアプリケーションを念頭に置いて開発されました。実際、加齢におけるAHNの障害は、ニッチ1,2,3,9内の周囲の細胞に起因する可能性があることを示す証拠が増えています。特に、星状細胞と希突起膠細胞はAHNの重要な調節因子として出現します。しかし、RNAシーケンシングと組み合わせたDGからの単離は、さまざまな結果を生み出しており、この仮説をこの手法で評価することは困難です1,17。FACSソーティングのNeuN陰性核のこのアプローチにより、FACSソーティングされていないサンプルと比較して、より多くのアストロサイトと希突起膠細胞の分離が可能になり、より良いバイオインフォマティクス分析が可能になります。このプロトコルは、生涯にわたってすべての年齢に適用可能であり、ここに提示された老齢動物の組織に関する代表的なデータは、この方法が老化した海馬の神経原性ニッチを調査するために堅牢であるという概念実証を提供します。この方法の使用を拡大し、さまざまな生物学的問題に適応させるには、これらのマーカーに対して最もよく検証された抗体の徹底的な滴定とともに、他のニューロン核膜抗原をテストできることを考慮することが重要です。例えば、DGのNSCからの神経分化過程を研究する場合、2型細胞や神経芽細胞などの一部の細胞型はNeuNを発現し始めます(補足図3)。したがって、これらの細胞型を特異的に調査するには、別の抗原が必要になります。逆に、NeuN陰性FACSソーティング後も、おそらくこれらの集団におけるNeuNの発現が低いかまったくないため、一部のニューロンが同定されました(例:.、皮質カハール-レツィウスニューロン19)。さらに、NeuNは希突起膠細胞の亜集団で発現することが報告されており26、これらの亜集団が関心事である場合、偏った結果をもたらす可能性があります。したがって、FANSの使用を開始する際の抗原の選択は、特定の生物学的質問に対する正確な答えを妨げる細胞集団の包含または除外を避けるために慎重に検討する必要があります。これに同意して、このプロトコルでテストされた仮説を検証または反論する前に、各シーケンシング結果を直交アッセイ(免疫組織化学やRNAスコープなど)によってさらに検証することも推奨されます。最後に、FANSを含むステップをさらに開発して、所望の細胞集団を除外および/または含めるためのより精巧な選別戦略を備えた複数の抗体を含めることができます。
最終的に、このプロトコルに記載されている技術は、他の種と一緒に使用するといくつかの制限がある可能性があります。たとえば、ニッチは、増殖性および静止性のNSCまたはDGの特定のサブ領域内で制限された新生児ニューロンが存在するげっ歯類で非常によく定義されていますが、海馬の神経原性ニッチが他の種でどのように描写されるべきかはまだ明らかではありません。実際、増殖細胞は、非ヒト霊長類およびヒトではDGの連続ゾーン内に整列しているのではなく、DGの周りに散在しており、扁桃体にも存在する可能性があります7。したがって、他の種のDGよりも広い領域を解剖して分離することは、このプロトコルの使用に影響を与える可能性があります。特に、組織調製のための解離および粉砕ステップは、より大きな組織片を扱う際に最適化される必要があるであろう27、28。バイオインフォマティクス解析に関しては、近交系の飼育されたげっ歯類は非常に均質で非常によく注釈されたゲノムを持っていますが、ヒトゲノムの遺伝的多様性と、異なる細胞集団(NSCや星状細胞など)を明確に区別するための不十分な数の細胞マーカーを組み合わせると、分析のために多くの正規化が必要であり、細胞の小さなクラスターが特定された場合に異なる結論につながる可能性があります7。11.このような状況では、細胞濃縮が依然として好ましい選択肢であるか、分析能力を高めるために他の戦略と一緒に使用する必要があります。
それにもかかわらず、現在のアプローチは、AHNの調節における潜在的に重要な細胞集団ではあるが、十分に研究されていない細胞集団の役割の調査を可能にすることができる。これは特に、神経変性疾患の発症と進行に中心的な役割を果たす星状細胞の集団に当てはまる可能性があります29,30。この研究は、アストロサイトやその他の希少細胞集団が、DG内に存在するニューロンの大部分を除外するだけで識別およびプロファイリングできることを示しました。異なるアプローチを用いた他の研究では、同じ範囲の細胞集団から核の同様の回収を達成することができなかった5、11、17。さらに、この研究の結果は、このアプローチを使用して、この細胞集団の特異的濃縮なしにNSCクラスターを単離することが可能であることを実証しています15。
結論として、この方法に従い、改善することは、AHNの調節に対する海馬神経原性ニッチの文脈的役割に関連する未解決の問題に対処するための一歩前進となるでしょう。特に、AHN9の調節に関連する細胞集団における高齢および罹患した脳における遺伝子発現レベルに関する新しい洞察をもたらし、NSCの 潜在的な不均一性1の特定をサポートし、またはAHNにおける血管系の役割に対処する可能性があります。最終的に、この方法は、同様の質問や問題を持つ他の成体幹細胞ニッチに適用することができます。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、技術サポートを提供してくれたLachlan HarrisとPiero Rigo、原稿に関するフィードバックを提供してくれたJason M. UslanerとDitte Lovattに感謝したいと思います。この研究は、MRCからの助成金支援と、Cancer Research UK(FC0010089)、UK Medical Research Council(FC0010089)、Wellcome Trust(FC0010089)、およびWellcome Trust Investigator Award(106187/Z/14/Z)から資金提供を受けているMSD、Francis Crick Instituteとの競争前の研究協力によって支援されました。スペース不足のために議論や引用ができなかった多くの著者にお詫び申し上げます。
0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
Trypan blue | Invitrogen | T10282 |