Här presenteras en metod för att sekvensera enstaka kärnor isolerade från musens dentatgyrus som utesluter de flesta neuroner genom fluorescensaktiverade kärnor () -sortering. Detta tillvägagångssätt genererar högkvalitativa uttrycksprofiler och underlättar studien av de flesta andra celltyper som representeras i nischen, inklusive knappa populationer som neurala stamceller.
Vuxen hippocampal neurogenes (AHN), som består av ett livslångt underhåll av proliferativa och vilande neurala stamceller (NSC) inom den subgranulära zonen (SGZ) i dentate gyrus (DG) och deras differentiering från nyfödda neuroner till granulatceller i granulatcellskiktet, är väl validerad i många studier. Att använda genetiskt modifierade djur, särskilt gnagare, är ett värdefullt verktyg för att undersöka signalvägar som reglerar AHN och för att studera rollen för varje celltyp som utgör hippocampus neurogena nisch. För att ta itu med det senare har metoder som kombinerar isolering av enstaka kärnor med nästa generations sekvensering haft en betydande inverkan inom AHN-området för att identifiera gensignaturer för varje cellpopulation. Ytterligare förfining av dessa tekniker behövs dock för att fenotypiskt profilera sällsynta cellpopulationer inom generaldirektoratet. Här presenterar vi en metod som använder fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) för att utesluta de flesta neuronala populationer från en enda kärnsuspension isolerad från nyligen dissekerad DG, genom att välja ofärgade kärnor för NeuN-antigenet, för att utföra enstaka kärnor RNA-sekvensering (snRNA-seq). Denna metod är en potentiell språngbräda för att ytterligare undersöka intercellulär reglering av AHN och för att avslöja nya cellulära markörer och mekanismer mellan arter.
Den kontinuerliga generationen av hippocampusneuroner i vuxen ålder, även känd som vuxen hippocampus neurogenes (AHN), är associerad med kognitiva funktioner som inlärning, minnesförvärv / clearance och mönsterseparation och verkar vara en viktig mekanism för motståndskraft i åldrande och neurodegenerativa sjukdomar för att förhindra kognitiva underskott 1,2,3 . Gnagare har varit den modell som valts för att studera AHN med flera metoder, inklusive immunocytokemi och nästa generations sekvenseringsmetoder (NGS). Översättningen av dessa resultat till andra arter är fortfarande kontroversiell. Faktum är att AHN har observerats hos de flesta arter, men i vilken utsträckning det kvarstår under hela livet, särskilt hos människor 4,5,6,7,8, diskuteras regelbundet.
Hittills har olika inneboende och yttre signalvägar bekräftats för att modulera AHN1. Effekten av intercellulär kommunikation på AHN är dock bara9. Detta kan först tillskrivas otillräcklig specificitet hos de för närvarande kända cellmarkörerna för att genomföra in vivo-analys med genetiskt modifierade djur. Faktum är att många studier har förlitat sig på markörer som dubbelkortin eller glialfibrillärt surt protein (GFAP) som uttrycks i flera celltyper1. För det andra medför komplexiteten och den höga graden av celldiversitet i den vuxna hippocampusnischen10 tekniska utmaningar för att profilera varje celltyp. Detta är särskilt fallet för bioinformatisk analys med överlappande cellulära markörer som används i analytiska pipelines för olika populationer, såsom NSC eller gliaceller, vilket resulterar i kontroversiella slutsatser vid bedömning av AHN 7,11. För det tredje undergräver det stora antalet neuroner undersökningen av mindre rikliga cellpopulationer, såsom astrocyter, oligodendrocyter eller ependymala celler, även om deras roll i finjusteringsregleringen av AHN blir framträdande9. Tillsammans påverkar dessa begränsningar förmågan att översätta resultat från gnagare till andra arter. Detta förstärks särskilt av svårigheten att rekapitulera in vitro en komplex vävnad, såsom den hippocampus neurogena nischen, och av de många hindren för att få tillgång till högkvalitativ vävnad tillsammans med bristen på standardiserade protokoll för vävnadsbehandling i studier som involverar mänskliga vävnader12,13. Det är därför viktigt att utveckla nya metoder för att profilera cellpopulationer och identifiera nya cellulära markörer inom dentate gyrus (DG) som i slutändan kommer att leda till en bättre förståelse för de olika bidragen från varje celltyp till AHN-reglering.
För att uppnå detta har isolering av encells- (sc) och enkärniga (sn) i kombination med RNA-sekvensering blivit avgörande för att undersöka komplexa vävnader som GD14. Som sådan har strategier för cellulär anrikning för att isolera enstaka celler från musens vuxna hippocampusnisch utförts mestadels för att undersöka NSC15,16. En intressant strategi för att berika icke-neuronala celler från DG tillämpades genom sekvensering av GluR1 / Cd24 dubbelnegativa enskilda celler som resulterade i att 1 408 celler sekvenserades utan distinkta kluster mellan astrocyter och NSC efter bioinformatisk analys17. Detta kan bero på den hårda enzymatiska matsmältningen som krävs för encellsberedning som skadar cellintegritet och RNA. För att kringgå detta tekniska problem har flera metoder som istället använder isolering av enstaka kärnor utvecklats och är särskilt lämpade för invecklade vävnader11,18. Övervägande av neuroner inom DG eller mer allmänt inom hippocampus-entorhinalsystemet genererar emellertid en provtagningsbias för att studera hela cellpopulationerna som finns inom dessa hjärnområden. Dessutom accentuerar det begränsade antalet celler att ladda för framställning av encellsbibliotek närvaron av den stora cellpopulationen i analytiska rörledningar av sekvenserade enskilda kärnor. Faktum är att stora neuronala kluster ofta kommenteras och analyseras medan andra cellpopulationer är underrepresenterade eller missar 5,11.
I ett försök att övervinna dessa fördomar och för att kunna profilera andra celltyper än neuroner som finns i musen DG, utarbetades en metod i denna studie med hjälp av principen om fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS)18 som utesluter de flesta neuronala populationer genom negativt urval av färgade enstaka kärnor med neuronalt kärnantigen (NeuN, även känd som Rbfox3). Detta val av antigen styrdes av litteraturen som beskriver NeuN som en pålitlig neuronmarkör19 och av nödvändigheten att använda ett kärnprotein för detta tillvägagångssätt. NeuN-negativa FACS-sorterade celler förbereddes sedan för RNA-sekvensering på en 10x Genomics-plattform. Resultaten visar att exkludering av NeuN-uttryckande celler möjliggör en celltypspecifik, högkvalitativ transkriptomisk profilering av glia- och sällsynta cellpopulationer.
För att framgångsrikt genomföra detta protokoll är dissektion av generaldirektoratet det första kritiska steget, vilket kräver viss övning för att hålla det oskadat och för att begränsa kontaminering från de omgivande vävnaderna. Av erfarenhet kunde separation av generaldirektoratet från hippocampus förvärvas mycket snabbt av en skicklig forskare som sedan kunde arbeta med att förfina sin teknik för att öka dissektionens snabbhet och därmed förbättra vävnadens färskhet för att generera högkvalitativa data. På liknande sätt kräver beredning och resuspension av enstaka kärnor konsistens över de olika förhållanden som används i ett enda experiment, men också undvikande av överdriven pipettering som kan störa kärnmembran som frigör omgivande RNA som kommer att förspänna sekvenseringsresultaten. Förutom rekommendationer som nämnts tidigare för att förbereda kärnor av hög kvalitet, ska koncentrationen av suspensionen av enstaka kärnor också beaktas innan man fortsätter med sekvensering. Enligt tillverkarens riktlinjer bör ett preparat med en koncentration som är högre än 1 200 nuc/μl spädas ut, eftersom denna nivå av kärnor kommer att ha högre risk att bilda multipletter som påverkar bioinformatiska analyser nedströms. Observera att sekvensering av prover med kärnkoncentrationer under 500 nuc / μL kanske inte är värt besväret på grund av kostnaden. Det rekommenderas också att följa råd från en avancerad FACS-användare för att ställa in all gating och för att förbli konsekvent med inställningarna för prover och biologiska replikat. På samma sätt innebär förberedelse av bibliotek för RNA-sekvensering viss utbildning för att uppnå högkvalitativa resultat och de flesta leverantörer har utmärkt stöd för att uppnå detta effektivt. Denna metod testades endast med färsk vävnad i denna studie; FANS har dock också utförts med frusen vävnad25. Det är därför rimligt att anta att detta protokoll kan utföras med frusen vävnad om än med mindre optimering.
Detta protokoll har utvecklats med en särskild nedströms applikation i åtanke, vilket är att undersöka andra cellpopulationer än neuroner inom hippocampus neurogen nisch. Allt fler bevis tyder på att försämringen av AHN i åldrandet kan tillskrivas de omgivande cellerna inom nischen 1,2,3,9. I synnerhet framträder astrocyter och oligodendrocyter som viktiga regulatorer för AHN; Deras isolering från generaldirektoratet i kombination med RNA-sekvensering har dock genererat blandade resultat, vilket gör denna hypotes utmanande att bedöma med denna teknik 1,17. Detta tillvägagångssätt för FACS-sortering av NeuN-negativa kärnor möjliggjorde isolering av fler astrocyter och oligodendrocyter jämfört med prover som inte var FACS-sorterade, vilket möjliggör bättre bioinformatisk analys. Detta protokoll är tillämpligt i alla åldrar under hela livslängden och de representativa data som presenteras här med vävnader från gamla djur ger ett bevis på konceptet att denna metod är robust för att undersöka den åldrande hippocampus neurogena nischen. För att utöka användningen av denna metod och anpassa den för olika biologiska frågor är det viktigt att överväga att andra neuronala kärnmembranantigener kan testas tillsammans med en grundlig titrering av de bästa validerade antikropparna för dessa markörer. Till exempel, när man studerar processen för neuronal differentiering från NSC i DG, börjar vissa celltyper som typ 2-celler eller neuroblaster uttrycka NeuN (kompletterande figur 3). Därför skulle ett annat antigen behövas för att specifikt undersöka dessa celltyper. Omvänt identifierades vissa neuroner fortfarande i denna studie efter NeuN-negativ FACS-sortering, möjligen på grund av lågt eller inget uttryck av NeuN i dessa populationer (t.ex. kortikala Cajal-Retzius-neuroner19). Dessutom har NeuN rapporterats uttryckas i delpopulationer av oligodendrocyter26, vilket skulle kunna ge partiska resultat om dessa delpopulationer var av intresse. Således bör valet av antigen när man börjar använda fläktar övervägas noggrant för att undvika inkludering eller uteslutning av cellpopulationer som skulle utesluta ett korrekt svar på en specifik biologisk fråga. I överensstämmelse med detta rekommenderas det också att varje sekvenseringsresultat valideras ytterligare genom ortogonala analyser (t.ex. immunohistokemi eller RNA-omfattning) innan den testade hypotesen valideras eller motbevisas med detta protokoll. Slutligen skulle steget med fläktar kunna vidareutvecklas till att omfatta mer än en antikropp med en mer genomarbetad sorteringsstrategi för att utesluta och/eller inkludera önskade cellpopulationer.
I slutändan kan tekniker som beskrivs i detta protokoll ha vissa begränsningar när de används med andra arter. Till exempel är nischen mycket väldefinierad hos gnagare med närvaron av proliferativa och vilande NSC eller nyfödda neuroner begränsade inom specifika delregioner i GD, men det är fortfarande inte klart hur hippocampus neurogena nisch ska avgränsas i andra arter. Faktum är att proliferativa celler inte är inriktade inom en kontinuerlig zon av GD hos icke-mänskliga primater och människor utan är ganska utspridda runt den och kan också vara närvarande i amygdala7. Att dissekera och isolera större områden än generaldirektoratet för andra arter skulle därför potentiellt kunna påverka användningen av detta protokoll. Särskilt dissociations- och triturationsstegen för beredning av vävnad måste optimeras när man arbetar med större bitar av vävnad27,28. När det gäller bioinformatisk analys, medan inavlade gnagare har ett mycket homogent och mycket väl kommenterat genom, kräver den genetiska variationen i det mänskliga genomet i kombination med otillräckligt antal cellulära markörer för att tydligt skilja olika cellpopulationer (t.ex. NSC och astrocyter) mycket normalisering för analys som kan leda till olika slutsatser när ett litet kluster av celler identifieras7, 11. I sådana situationer kan cellanrikning fortfarande vara ett föredraget alternativ eller bör användas tillsammans med andra strategier för att öka analyskraften.
Icke desto mindre kan det nuvarande tillvägagångssättet möjliggöra undersökning av rollen för understuderade om än potentiellt viktiga cellpopulationer i regleringen av AHN. Detta kan särskilt vara fallet för populationer av astrocyter, som spelar en central roll i uppkomsten och utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar29,30. Denna studie visade att astrocyter och andra sällsynta cellpopulationer kan identifieras och profileras helt enkelt genom att utesluta de allra flesta neuroner som finns inom GD. Andra studier med olika tillvägagångssätt har inte kunnat uppnå liknande återhämtning av kärnor från samma intervall av cellpopulationer 5,11,17. Dessutom visar resultaten från denna studie att det är möjligt att använda detta tillvägagångssätt för att isolera ett NSC-kluster utan specifik anrikning av denna cellpopulation15.
Sammanfattningsvis skulle det vara ett steg framåt att följa och förbättra denna metod för att ta itu med utestående frågor relaterade till den kontextuella rollen hos den hippocampala neurogena nischen för modulering av AHN. I synnerhet kan det ge nya insikter om genuttrycksnivåer i åldrade och sjuka hjärnor i cellpopulationer associerade med regleringen av AHN9, stödja identifieringen av en potentiell heterogenitet hos NSC1 eller ta itu med vaskulaturens roll i AHN. I slutändan kan denna metod anpassas för andra vuxna stamcellsnischer med liknande frågor och problem.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Lachlan Harris och Piero Rigo för teknisk support och Jason M. Uslaner och Ditte Lovatt för att ha gett feedback på manuskriptet. Detta arbete stöddes av bidragsstöd från MRC och ett forskningssamarbete före konkurrens med MSD, Francis Crick Institute, som får sin finansiering från Cancer Research UK (FC0010089), UK Medical Research Council (FC0010089), Wellcome Trust (FC0010089) och av ett Wellcome Trust Investigator Award till FG (106187/Z/14/Z). Vi ber om ursäkt till de många författare vars arbete vi inte kunde diskutera och citera på grund av brist på utrymme.
0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
Trypan blue | Invitrogen | T10282 |