Summary
Här presenteras en metod för att sekvensera enstaka kärnor isolerade från musens dentatgyrus som utesluter de flesta neuroner genom fluorescensaktiverade kärnor () -sortering. Detta tillvägagångssätt genererar högkvalitativa uttrycksprofiler och underlättar studien av de flesta andra celltyper som representeras i nischen, inklusive knappa populationer som neurala stamceller.
Abstract
Vuxen hippocampal neurogenes (AHN), som består av ett livslångt underhåll av proliferativa och vilande neurala stamceller (NSC) inom den subgranulära zonen (SGZ) i dentate gyrus (DG) och deras differentiering från nyfödda neuroner till granulatceller i granulatcellskiktet, är väl validerad i många studier. Att använda genetiskt modifierade djur, särskilt gnagare, är ett värdefullt verktyg för att undersöka signalvägar som reglerar AHN och för att studera rollen för varje celltyp som utgör hippocampus neurogena nisch. För att ta itu med det senare har metoder som kombinerar isolering av enstaka kärnor med nästa generations sekvensering haft en betydande inverkan inom AHN-området för att identifiera gensignaturer för varje cellpopulation. Ytterligare förfining av dessa tekniker behövs dock för att fenotypiskt profilera sällsynta cellpopulationer inom generaldirektoratet. Här presenterar vi en metod som använder fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) för att utesluta de flesta neuronala populationer från en enda kärnsuspension isolerad från nyligen dissekerad DG, genom att välja ofärgade kärnor för NeuN-antigenet, för att utföra enstaka kärnor RNA-sekvensering (snRNA-seq). Denna metod är en potentiell språngbräda för att ytterligare undersöka intercellulär reglering av AHN och för att avslöja nya cellulära markörer och mekanismer mellan arter.
Introduction
Den kontinuerliga generationen av hippocampusneuroner i vuxen ålder, även känd som vuxen hippocampus neurogenes (AHN), är associerad med kognitiva funktioner som inlärning, minnesförvärv / clearance och mönsterseparation och verkar vara en viktig mekanism för motståndskraft i åldrande och neurodegenerativa sjukdomar för att förhindra kognitiva underskott 1,2,3 . Gnagare har varit den modell som valts för att studera AHN med flera metoder, inklusive immunocytokemi och nästa generations sekvenseringsmetoder (NGS). Översättningen av dessa resultat till andra arter är fortfarande kontroversiell. Faktum är att AHN har observerats hos de flesta arter, men i vilken utsträckning det kvarstår under hela livet, särskilt hos människor 4,5,6,7,8, diskuteras regelbundet.
Hittills har olika inneboende och yttre signalvägar bekräftats för att modulera AHN1. Effekten av intercellulär kommunikation på AHN är dock bara9. Detta kan först tillskrivas otillräcklig specificitet hos de för närvarande kända cellmarkörerna för att genomföra in vivo-analys med genetiskt modifierade djur. Faktum är att många studier har förlitat sig på markörer som dubbelkortin eller glialfibrillärt surt protein (GFAP) som uttrycks i flera celltyper1. För det andra medför komplexiteten och den höga graden av celldiversitet i den vuxna hippocampusnischen10 tekniska utmaningar för att profilera varje celltyp. Detta är särskilt fallet för bioinformatisk analys med överlappande cellulära markörer som används i analytiska pipelines för olika populationer, såsom NSC eller gliaceller, vilket resulterar i kontroversiella slutsatser vid bedömning av AHN 7,11. För det tredje undergräver det stora antalet neuroner undersökningen av mindre rikliga cellpopulationer, såsom astrocyter, oligodendrocyter eller ependymala celler, även om deras roll i finjusteringsregleringen av AHN blir framträdande9. Tillsammans påverkar dessa begränsningar förmågan att översätta resultat från gnagare till andra arter. Detta förstärks särskilt av svårigheten att rekapitulera in vitro en komplex vävnad, såsom den hippocampus neurogena nischen, och av de många hindren för att få tillgång till högkvalitativ vävnad tillsammans med bristen på standardiserade protokoll för vävnadsbehandling i studier som involverar mänskliga vävnader12,13. Det är därför viktigt att utveckla nya metoder för att profilera cellpopulationer och identifiera nya cellulära markörer inom dentate gyrus (DG) som i slutändan kommer att leda till en bättre förståelse för de olika bidragen från varje celltyp till AHN-reglering.
För att uppnå detta har isolering av encells- (sc) och enkärniga (sn) i kombination med RNA-sekvensering blivit avgörande för att undersöka komplexa vävnader som GD14. Som sådan har strategier för cellulär anrikning för att isolera enstaka celler från musens vuxna hippocampusnisch utförts mestadels för att undersöka NSC15,16. En intressant strategi för att berika icke-neuronala celler från DG tillämpades genom sekvensering av GluR1 / Cd24 dubbelnegativa enskilda celler som resulterade i att 1 408 celler sekvenserades utan distinkta kluster mellan astrocyter och NSC efter bioinformatisk analys17. Detta kan bero på den hårda enzymatiska matsmältningen som krävs för encellsberedning som skadar cellintegritet och RNA. För att kringgå detta tekniska problem har flera metoder som istället använder isolering av enstaka kärnor utvecklats och är särskilt lämpade för invecklade vävnader11,18. Övervägande av neuroner inom DG eller mer allmänt inom hippocampus-entorhinalsystemet genererar emellertid en provtagningsbias för att studera hela cellpopulationerna som finns inom dessa hjärnområden. Dessutom accentuerar det begränsade antalet celler att ladda för framställning av encellsbibliotek närvaron av den stora cellpopulationen i analytiska rörledningar av sekvenserade enskilda kärnor. Faktum är att stora neuronala kluster ofta kommenteras och analyseras medan andra cellpopulationer är underrepresenterade eller missar 5,11.
I ett försök att övervinna dessa fördomar och för att kunna profilera andra celltyper än neuroner som finns i musen DG, utarbetades en metod i denna studie med hjälp av principen om fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS)18 som utesluter de flesta neuronala populationer genom negativt urval av färgade enstaka kärnor med neuronalt kärnantigen (NeuN, även känd som Rbfox3). Detta val av antigen styrdes av litteraturen som beskriver NeuN som en pålitlig neuronmarkör19 och av nödvändigheten att använda ett kärnprotein för detta tillvägagångssätt. NeuN-negativa FACS-sorterade celler förbereddes sedan för RNA-sekvensering på en 10x Genomics-plattform. Resultaten visar att exkludering av NeuN-uttryckande celler möjliggör en celltypspecifik, högkvalitativ transkriptomisk profilering av glia- och sällsynta cellpopulationer.
Protocol
Djurvård och experimentella förfaranden utfördes i enlighet med riktlinjerna från Francis Crick Institute, liksom det brittiska inrikesministeriets riktlinjer och lagar.
Figur 1: Beredning av en enda kärnsuspension från dissekerade DG för vuxna möss för snRNA-seq av icke-neuronala populationer. Flödesschema som beskriver de viktigaste stegen i protokollet som inkluderar dissektion av mus DG, beredning av en suspension av enstaka kärnor, NeuN-immunfärgning och negativ NeuN-FANS-sortering innan du fortsätter med snRNA-seq. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Dissektion av generaldirektoratet (Tidsplan: 15 min)
- Förbered kärnisoleringsmedia 1 och 2 (NIM1 och NIM2), homogeniseringsbuffert (HB) och tvättmedia (WM) (kompletterande tabell 1). Placera alla buffertar, media, reagenser och verktyg på is tills det behövs. Lägg Dounce-homogenisatorn (se materialtabellen) på is under beredningen (minst 1 h före homogeniseringssteget).
OBS: NIM1 kan beredas och förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader. NIM2, HB och WM bör vara nyberedda.
VARNING: Manipulera DTT, proteashämmaren och Triton X-100 med försiktighet. Dessa föreningar är hud- och ögonirriterande, akut giftiga och farliga för vattenmiljön. Använd skyddshandskar, kläder, ögon- och ansiktsskydd när du använder dessa kemikalier, tvätta händerna noggrant efter hantering och undvik utsläpp i miljön. - Avliva en 22 månader gammal manlig C57Bl/6J-mus genom cervikal dislokation enligt inrikesministeriets schema 1-procedur20.
OBS: Se diskussion för motivering angående användningen av 22 månader gammal mus i denna studie. Detta protokoll kan dock utföras i alla åldrar under hela livslängden. - Dissekera hjärnan från en avlivad mus och överför den till en 10 cm petriskål fylld med iskall 1x PBS (figur 1). Lägg petriskålen på is. Ta bort cerebellum med en skalpell och skär hjärnan i hälften mellan båda halvklotet (längs sagittalaxeln).
- Fyll i en ny 10 cm petriskål med iskall PBS och lägg den på is. Överför ena halvan av hjärnan till den nya petriskålen. Använd kikare, dissekera ut GD och upprepa detta steg för att få det andra generaldirektoratet från den andra halvan av hjärnan.
OBS: Dessa steg (steg 1.2-1.4) anpassades från en tidigare beskriven procedur21. Det är viktigt att fortsätta så snabbt som möjligt i detta skede för att bevara cellernas integritet. - Överför de två generaldirektoraten till den förkylda Dounce-homogenisatorn och tillsätt 1 ml kall HB.
2. Vävnadsdissociation, isolering av enstaka kärnor och anti-NeuN-immunfärgning (Timing: 2 h)
- Homogenisera vävnaden med 10 slag av den lösa "A" -stöten, följt av 15 slag av den täta "B" -stöten.
OBS: Dounce homogenisering bör utföras med murbruk på is med mjuka slag för att minska värmen orsakad av friktion och skumning. Alla buffertar och utrustning ska förkylas och förvaras på is under proceduren. - Överför homogenatet till ett förkylt 15 ml rör; skölj Dounce-homogenisatorn med 1 ml kall HB och kombinera till samma rör. Tillsätt 3 ml HB till 15 ml röret och inkubera 5 min på is. Blanda 2x genom att invertera röret försiktigt.
- Förfukta ett 70 μm sillock med 0,5 ml HB över ett 50 ml provrör. Sila kärnans suspension från steg 2.2 genom att tippa över 15 ml röret försiktigt in i cellsilen. Tvätta cellsilen med 0,5 ml HB.
- Ta bort cellsilen och centrifugera provröret vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C med hjälp av en svängskopa. Kassera supernatanten.
OBS: Att sila homogenatet hjälper till att minska skräpet, vilket är avgörande för flödescytometrin och snRNA-seq nedströms steg. - Återsuspendera pelleten försiktigt i 4 ml HB med en P1000-pipett. Inkubera på is i 5 min. Snurra vid 500 x g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml WM.
- Förfukta ett 35 μm sillock över ett 15 ml provrör med 0,5 ml WM. Sila kärnans suspension från steg 2.5 genom cellsilen och pipettera försiktigt 0,5 ml åt gången med en P1000-pipett.
- Tvätta sillocket med 0,5 ml WM och placera röret på is. Överför filtratet till ett nytt 15 ml rör och centrifugera i 5 minuter och 4 °C vid 500 x g. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml WM.
- Snurra vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml WM med musens anti-NeuN, Alexa Fluor 488-konjugerade antikropp (anti-NeuN-AF488, 1: 32,000) och 1 μg / ml DAPI. Inkubera i 45 min på is i mörkret.
OBS: För att optimera immunfärgningen av isolerade kärnor rekommenderas att titrera antikroppen för att bestämma den optimala utspädningen för flödescytometrianalys och sortering. Kör sedan adekvata kontroller för att bekräfta att färgningsförhållandena är optimala. Till exempel, med den konjugerade anti-NeuN-AF488-antikroppen, kördes en negativ kontroll (dvs. ingen tillsats av antikroppen, kompletterande figur 1A) och en positiv kontroll (dvs. färgning med antikroppen, kompletterande figur 1B) för att bedöma segregering av ofärgade och färgade populationer. När du börjar arbeta med en AF488-konjugerad antikropp rekommenderas att köra en AF488-konjugerad isotypkontroll för att bedöma specificiteten. Om en icke-konjugerad antikropp används kan ytterligare kontroll, såsom att tillsätta en sekundär antikropp endast till ett kärnpreparat, vara nödvändig för att bedöma ospecifik bindning av den sekundära antikroppen.
3. Fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) för att utesluta neuronala populationer (Timing: 45 min)
- Överför den immunfärgade kärnsuspensionen till ett 5 ml provrör och håll det på is tills flödescytometriproceduren börjar.
OBS: Om du arbetar med större vävnadsbitar än två mus-DG kan ytterligare utspädning med WM-buffert krävas för att undvika igensättning av FACS om kärndensiteten i lösningen blir hög. - Virvla proverna i 3 s vid låg hastighet innan rören placeras i FACS-instrumentet (se materialförteckning).
OBS: (FACS-installation) Sorteringsmaskiner måste justeras i början av proceduren med kalibreringspartiklar enligt tillverkarens rekommendationer. Fallfördröjningen kalibrerades med pärlor eller mikrosfärer (se Materialförteckning) enligt FACS-modellen. Proverna sorterades vid 4 °C i renhetsläge. För att minska uppsamlingsvolymen sorterades kärnorna genom ett 70 μm munstycke vid det rekommenderade trycket för flödescytometern. Kärnor sorterades i 1,5 ml lågbindande rör (se materialtabell) innehållande 50 μL WM. Alla uppsamlingsrör belades med PBS + 5% BSA vid 4 °C över natten för att minska risken för att kärnor fastnar på rörets väggar. - För att få data från ett prov av den färgade kärnsuspensionen, ställ in grindarna i DAPI-höjd och DAPI-området för att utesluta cellskräpet och de aggregerade kärnorna (figur 2A). Separera dessutom enstaka kärnor från eventuella återstående DAPI-färgade aggregat eller cellskräp genom att ställa in grindarna i logens sidospridningsområde (SSC) och log Forward scatter (FCS)-området (figur 2B).
- Ställ in grindarna för anti-NeuN-AF488 och FSC-området för att isolera den NeuN-AF488-negativa populationen, som visas i figur 2C.
- Efter analys, med hjälp av grindstrategin som beskrivs ovan, sortera den NeuN-AF488-negativa populationen i ett 1,5 ml uppsamlingsrör fyllt med 50 μL WM.
OBS: Efter den grindstrategi som beskrivs ovan och dissektionsproceduren för att isolera generaldirektoratet från hjärnan hos en vuxen mus förväntas den NeuN-AF488-negativa populationen representera ~ 14% av de enskilda kärnorna.
Figur 2: Isolering och transkriptomisk profilering av icke-neuronala cellpopulationer från GD. (A-C) Gating-strategi för att isolera NeuN-AF488 negativa enskilda kärnor och utesluta cellskräp. (A) FLÄKTAR prickdiagram för ett representativt prov av isolerade kärnor, som visar grindinställningen för val av DAPI+-kärnor och uteslutning av cellskräp och aggregat. (B) Ytterligare urval av relevanta enskilda kärnor med användning av FSC-området och SSC-området. (C) Portarna för NeuN-AF488 för att utesluta den positiva populationen och sortera efter de negativa enskilda kärnorna. (D) Mikrograf av en bra enkärnig suspension med minimal mängd skräp och högre andel kärnor av god kvalitet (rund form, svart pil) jämfört med kärnor av dålig kvalitet (vit pil). Skalstänger = 50 μm, 10 μm (insats). (E,F) Analys av snRNA-seq-data och profilering av de distinkta cellpopulationer som isolerats från GD 22 månader gamla C57BL/6J-hanmöss. Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction (UMAP) diagram över enstaka kärnprofiler från (E) icke-FACS-sorterade celler och (F) NeuN-negativa FACS-sorterade celler, färgade efter celltyp. (G) Cirkeldiagram som jämför frekvenserna för identifierade celltyper i båda proverna. (H) Respektive mätvärden för de sekvenserade proverna: antal kärnor, medianantal gener och transkript per kärna. (I) Fioldiagram som visar fördelningen av antalet gener och transkript som detekterats för varje celltyp i båda proverna. Astr. = astrocyter, Olig. = oligodendrocyter, Vasc. = vaskulära celler, CRCs = Cajal-Retzius celler, Neur. = neuroner, Imm. = immunceller, OPCs = oligodendrocyter prekursorceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Beredning av enkärnans suspension för att utföra enkärnig RNA-sekvensering (Timing: 30 min)
- Efter sortering, tillsätt 1 ml PBS innehållande 1% BSA till uppsamlingsröret för att samla droppar på rörets vägg och snurra vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och lämna 50 μl.
OBS: Hantera de centrifugerade kärnorna med försiktighet eftersom det kan vara svårt att observera någon pellets i botten av röret. Att använda en svängskopcentrifug hjälper till att kassera supernatanten utan att störa pelleten. - Pipett försiktigt för att återsuspendera centrifugerade kärnor. Tillsätt 5 μL av kärnans suspension till 5 μL Trypan blue i ett 0,5 ml mikrorör.
VARNING: Hantera Trypan blå med försiktighet eftersom det är hälsofarligt, kan orsaka cancer och misstänks skada fertiliteten eller det ofödda barnet. Använd skyddshandskar, kläder och ögon- och ansiktsskydd. Hantera inte förrän alla säkerhetsåtgärder har lästs och förståtts. - Mät koncentrationen och bedöm livskraften hos encellssuspensionen med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare (se Materialförteckning). Utför biblioteksförberedelse och sekvensering av kärnorna enligt beskrivningen i steg 5.
OBS: Prover som ansågs vara av god kvalitet för sekvensering visade rund och regelbunden kärnform under mikroskopet utan cellskräp (figur 2D). Närvaron av en halo runt kärnmembranet eller aggregeringen av flera kärnor tillsammans är tecken på skadade kärnor och sådana cellsuspensioner bör inte övervägas för snRNA-seq (figur 2D). Den uppmätta koncentrationen av kärnor låg inom intervallet 300-700 kärnor / μl.
5. Biblioteksförberedelse och sekvensering
OBS: Beskrivningen av följande steg baseras på den interna sekvenseringsplattformen som används i denna studie (se Materialförteckning). Därför kan vissa inställningar skilja sig åt när du använder en annan plattform. Här beskrivs endast de viktigaste stegen och varje parameter bör bestämmas enligt vägledning och protokoll från den valda tillverkaren om än med optimering före första användningen. Det är viktigt att se till att förberedelse av bibliotek utförs så snabbt som möjligt efter koncentration av sorterade kärnsuspensioner för att undvika RNA-nedbrytning och säkerställa optimal kvalitet på sekvenseringen.
- Ladda mellan 7 000 och 10 000 kärnor i ett mikrofluidiks Single Cell Chip.
- Partitionsbelastade kärnor i nanoliterskaldroppar med hjälp av den medföljande styrenheten och reagenserna från den valda leverantören. Lysekärnor i varje droppe och omvänd transkribera RNA.
OBS: Inom en droppe delade alla resulterande cDNA samma cellstreckkod. - Förbered bibliotek för snRNA-seq enligt riktlinjer från den valda leverantören och säkerställa kompatibilitet med sekvenseringsplattformen. Kontrollera kvaliteten och koncentrationen hos de slutliga biblioteken med hjälp av elektrofores, fluorometri eller qPCR-baserade metoder och, om tillämpligt, slå samman dem lika mycket före sekvensering.
- Denaturering poolade 3ʹ genuttrycksbibliotek och spädde ut enligt tillverkarens rekommendation.
- Utför sekvensering av parkopplade, enkla eller dubbla indexeringssekvenser på nästa generations sekvenseringsplattform med sekvenseringsdjup på 50 000 läspar per cell.
Representative Results
Protokollet som presenteras här beskriver en metod för att förbereda en suspension av icke-neuronala enstaka kärnor isolerade från DG för att utföra snRNA-seq. Med eller utan FANS avslöjade bioinformatisk klustring väl separerade grupper av kärnor som motsvarar kända celltyper inom DG (figur 2E,F). Inom det icke-FACS-sorterade provet bestod majoriteten av de högkvalitativa kärnorna som sekvenserades av tre grupper av neuroner (84,9% av de totala kärnorna för detta prov, figur 2E, G, H). Sådana resultat förväntas, med tanke på att de mest representerade cellpopulationerna i DG är granulatneuroner, andra excitatoriska neuroner (märkta excitatoriska neuroner) och hämmande neuroner10. De icke-neuronala kluster som identifierades var mestadels gjorda av gliacellstyper (11,1%), inklusive astrocyter, oligodendrocyter och oligodendrocytprekursorceller (OPC), immunceller (3,3%) och Cajal-Retzius-celler (0,6%). När du utför FANS för att utesluta NeuN-positiva populationer (NeuN-negativt FACS-sorterat prov; Figur 2F,G,H), kluster av gliaceller blev dominerande (81,3%). Isoleringen av ett större antal glialkärnor möjliggör en bättre segmentering av olika populationer som skulle samlas utan FANS. Vid omgruppering och analys av specifika gener, antingen uttryckta i NSC eller i astrocyter, separerades fyra underkluster (kompletterande figur 2A,B). Genom att titta på mer specifika cellulära markörer och bedöma genuttrycksnivåer över celltyperna upptäcktes ett litet kluster av NSC som separerade separat från de huvudsakliga astrocytiska populationerna med högre uttryck av Hopx och Notch2 och nästan inget uttryck av Aldh1a1 eller Aqp4 (kompletterande figur 2C). På grund av överlappningen i genuttryck mellan astrocyter och NSC skulle emellertid ytterligare analys krävas för att specifikt profilera och identifiera olika undertyper av celler. Dessutom hade det NeuN-negativa FANS-provet ytterligare kluster märkta som vaskulära celler (2.3%) som omfattar endotelceller, pericyter och vaskulära leptomeningealceller när de korsrefereras för uttryck av cellspecifika markörer (data visas inte).
Efter vägledningen för det valda protokollet för att generera bibliotek för sekvensering erhölls högkvalitativa uttrycksprofiler med eller utan FANS. För prover sekvenserade vid 50 000 läsningar/kärnor detekterades i genomsnitt 2 510 gener per kärna för det icke-FACS-sorterade provet (5 578 transkript, figur 2H) och 1 665,5 gener (3 508 transkript) för NeuN-negativt FANS-prov, efter filtrering av kärnor av låg kvalitet (figur 2H,I). Dessa mätvärden bekräftar att detta protokoll genererar högkvalitativ transkriptomisk profilering av enstaka kärnor som är jämförbara med studier med olika tillvägagångssätt22,23 och att processen med FACS-sortering inte skadar kärnor för efterföljande snRNA-seq. I synnerhet beror skillnaden i antalet gener och transkript per kärnor mellan de två proverna inte på lägre datakvalitet utan på den höga andelen neuroner i det icke-FACS-sorterade provet (84,9% jämfört med 1,7% i NeuN-negativt FANS-prov), som har en högre transkriptionsaktivitet (2 660 gener / kärna och 6 170 transkript / kärna i icke-FACS-sorterat prov) än den genomsnittliga transkriptionsaktiviteten för alla icke-neuronala celltyper (1 090 gener / kärna och 1 785 transkript/kärna, figur 2I).
Tillsammans visar dessa representativa resultat att valet av NeuN-negativa kärnor med hjälp av FANS är ett kraftfullt verktyg för att isolera celltyper med låg förekomst från nyligen dissekerad hjärnvävnad och utföra högkvalitativ transkriptomisk profilering av enstaka kärnor av dessa distinkta cellpopulationer via snRNA-seq-metoder.
Kompletterande figur 1: Validering av immunfärgningen för FANS. Kärnsuspensionen inkuberades (A) utan anti-NeuN-AF 488-antikroppen som en negativ kontroll eller (B) med antikroppen och kördes genom FACS-sorteraren för att validera immunfärgningsförhållanden. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Genuttrycksanalys och omgruppering av astrocytklustret. (A) Diagram över enhetlig mångfaldig approximation och projektion för dimensionsreduktion (UMAP) som visar klustringen av 4968 kärnor baserat på genomomfattande uttrycksprofiler från figur 2F. Samtal av celltyp gjordes baserat på markörer av celltyp. (B) Astrocytkluster bestående av 2579 kärnor valda från (A) för ytterligare underinställning för att undersöka potentiella cellulära subtyper. Fyra undertyper upptäcktes genom Seurat (0-3) klustring, som visas av olika färger. (C) Genuttrycksnivåer för specifika cellulära markörer över de fyra celltyperna. Alla tomter erhölls med hjälp av Seurat R-paketet24. I korthet normaliserades RNA-seq-räkningarna för varje cell med det totala uttrycket och multiplicerades med skalfaktorn (10 000). Detta resultat loggtransformerades sedan. De transformerade värdena skalades (varians skalades till en) och centrerades (medelvärdet sattes till noll) inom varje cell innan UMAP tillämpades för att beräkna inbäddningarna, som användes som värden på x- och y-axlar. Grafer representerar utdata från en dimensionell reduktionsteknik på ett 2D-spridningsdiagram där varje punkt representerar en cell med respektive x- och y-koordinater baserat på cellinbäddningarna som bestäms av reduktionstekniken. Celler med liknande gensignaturer placeras nära varandra genom inbäddningarna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Genuttrycksanalys av NeuN i den neurogena härstamningen. (A) UMAP-diagram som visar klustring av neurogen härstamning från offentligt tillgänglig datauppsättning15. UMAPs genererades som i kompletterande figur 2. (B) Genuttrycksnivåer för specifika cellulära markörer över den neurogena härstamningen som visar astrocyt (Aquaporin 4 = Aqp4), NSC (homeodomain-only protein = Hopx), NeuN / Rbfox3 (NSC och mellanliggande stamceller [IPC]) och cykelceller (cyklinberoende kinas 6 = Cdk6). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 1: Sammansättningar av medier och buffertar som används i studien. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
För att framgångsrikt genomföra detta protokoll är dissektion av generaldirektoratet det första kritiska steget, vilket kräver viss övning för att hålla det oskadat och för att begränsa kontaminering från de omgivande vävnaderna. Av erfarenhet kunde separation av generaldirektoratet från hippocampus förvärvas mycket snabbt av en skicklig forskare som sedan kunde arbeta med att förfina sin teknik för att öka dissektionens snabbhet och därmed förbättra vävnadens färskhet för att generera högkvalitativa data. På liknande sätt kräver beredning och resuspension av enstaka kärnor konsistens över de olika förhållanden som används i ett enda experiment, men också undvikande av överdriven pipettering som kan störa kärnmembran som frigör omgivande RNA som kommer att förspänna sekvenseringsresultaten. Förutom rekommendationer som nämnts tidigare för att förbereda kärnor av hög kvalitet, ska koncentrationen av suspensionen av enstaka kärnor också beaktas innan man fortsätter med sekvensering. Enligt tillverkarens riktlinjer bör ett preparat med en koncentration som är högre än 1 200 nuc/μl spädas ut, eftersom denna nivå av kärnor kommer att ha högre risk att bilda multipletter som påverkar bioinformatiska analyser nedströms. Observera att sekvensering av prover med kärnkoncentrationer under 500 nuc / μL kanske inte är värt besväret på grund av kostnaden. Det rekommenderas också att följa råd från en avancerad FACS-användare för att ställa in all gating och för att förbli konsekvent med inställningarna för prover och biologiska replikat. På samma sätt innebär förberedelse av bibliotek för RNA-sekvensering viss utbildning för att uppnå högkvalitativa resultat och de flesta leverantörer har utmärkt stöd för att uppnå detta effektivt. Denna metod testades endast med färsk vävnad i denna studie; FANS har dock också utförts med frusen vävnad25. Det är därför rimligt att anta att detta protokoll kan utföras med frusen vävnad om än med mindre optimering.
Detta protokoll har utvecklats med en särskild nedströms applikation i åtanke, vilket är att undersöka andra cellpopulationer än neuroner inom hippocampus neurogen nisch. Allt fler bevis tyder på att försämringen av AHN i åldrandet kan tillskrivas de omgivande cellerna inom nischen 1,2,3,9. I synnerhet framträder astrocyter och oligodendrocyter som viktiga regulatorer för AHN; Deras isolering från generaldirektoratet i kombination med RNA-sekvensering har dock genererat blandade resultat, vilket gör denna hypotes utmanande att bedöma med denna teknik 1,17. Detta tillvägagångssätt för FACS-sortering av NeuN-negativa kärnor möjliggjorde isolering av fler astrocyter och oligodendrocyter jämfört med prover som inte var FACS-sorterade, vilket möjliggör bättre bioinformatisk analys. Detta protokoll är tillämpligt i alla åldrar under hela livslängden och de representativa data som presenteras här med vävnader från gamla djur ger ett bevis på konceptet att denna metod är robust för att undersöka den åldrande hippocampus neurogena nischen. För att utöka användningen av denna metod och anpassa den för olika biologiska frågor är det viktigt att överväga att andra neuronala kärnmembranantigener kan testas tillsammans med en grundlig titrering av de bästa validerade antikropparna för dessa markörer. Till exempel, när man studerar processen för neuronal differentiering från NSC i DG, börjar vissa celltyper som typ 2-celler eller neuroblaster uttrycka NeuN (kompletterande figur 3). Därför skulle ett annat antigen behövas för att specifikt undersöka dessa celltyper. Omvänt identifierades vissa neuroner fortfarande i denna studie efter NeuN-negativ FACS-sortering, möjligen på grund av lågt eller inget uttryck av NeuN i dessa populationer (t.ex. kortikala Cajal-Retzius-neuroner19). Dessutom har NeuN rapporterats uttryckas i delpopulationer av oligodendrocyter26, vilket skulle kunna ge partiska resultat om dessa delpopulationer var av intresse. Således bör valet av antigen när man börjar använda fläktar övervägas noggrant för att undvika inkludering eller uteslutning av cellpopulationer som skulle utesluta ett korrekt svar på en specifik biologisk fråga. I överensstämmelse med detta rekommenderas det också att varje sekvenseringsresultat valideras ytterligare genom ortogonala analyser (t.ex. immunohistokemi eller RNA-omfattning) innan den testade hypotesen valideras eller motbevisas med detta protokoll. Slutligen skulle steget med fläktar kunna vidareutvecklas till att omfatta mer än en antikropp med en mer genomarbetad sorteringsstrategi för att utesluta och/eller inkludera önskade cellpopulationer.
I slutändan kan tekniker som beskrivs i detta protokoll ha vissa begränsningar när de används med andra arter. Till exempel är nischen mycket väldefinierad hos gnagare med närvaron av proliferativa och vilande NSC eller nyfödda neuroner begränsade inom specifika delregioner i GD, men det är fortfarande inte klart hur hippocampus neurogena nisch ska avgränsas i andra arter. Faktum är att proliferativa celler inte är inriktade inom en kontinuerlig zon av GD hos icke-mänskliga primater och människor utan är ganska utspridda runt den och kan också vara närvarande i amygdala7. Att dissekera och isolera större områden än generaldirektoratet för andra arter skulle därför potentiellt kunna påverka användningen av detta protokoll. Särskilt dissociations- och triturationsstegen för beredning av vävnad måste optimeras när man arbetar med större bitar av vävnad27,28. När det gäller bioinformatisk analys, medan inavlade gnagare har ett mycket homogent och mycket väl kommenterat genom, kräver den genetiska variationen i det mänskliga genomet i kombination med otillräckligt antal cellulära markörer för att tydligt skilja olika cellpopulationer (t.ex. NSC och astrocyter) mycket normalisering för analys som kan leda till olika slutsatser när ett litet kluster av celler identifieras7, 11. I sådana situationer kan cellanrikning fortfarande vara ett föredraget alternativ eller bör användas tillsammans med andra strategier för att öka analyskraften.
Icke desto mindre kan det nuvarande tillvägagångssättet möjliggöra undersökning av rollen för understuderade om än potentiellt viktiga cellpopulationer i regleringen av AHN. Detta kan särskilt vara fallet för populationer av astrocyter, som spelar en central roll i uppkomsten och utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar29,30. Denna studie visade att astrocyter och andra sällsynta cellpopulationer kan identifieras och profileras helt enkelt genom att utesluta de allra flesta neuroner som finns inom GD. Andra studier med olika tillvägagångssätt har inte kunnat uppnå liknande återhämtning av kärnor från samma intervall av cellpopulationer 5,11,17. Dessutom visar resultaten från denna studie att det är möjligt att använda detta tillvägagångssätt för att isolera ett NSC-kluster utan specifik anrikning av denna cellpopulation15.
Sammanfattningsvis skulle det vara ett steg framåt att följa och förbättra denna metod för att ta itu med utestående frågor relaterade till den kontextuella rollen hos den hippocampala neurogena nischen för modulering av AHN. I synnerhet kan det ge nya insikter om genuttrycksnivåer i åldrade och sjuka hjärnor i cellpopulationer associerade med regleringen av AHN9, stödja identifieringen av en potentiell heterogenitet hos NSC1 eller ta itu med vaskulaturens roll i AHN. I slutändan kan denna metod anpassas för andra vuxna stamcellsnischer med liknande frågor och problem.
Disclosures
SG, TL och SK är anställda i Merck Sharp & Dohme LLC, ett dotterbolag till Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA känt som MSD utanför USA och Kanada. SG är aktieägare i Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Lachlan Harris och Piero Rigo för teknisk support och Jason M. Uslaner och Ditte Lovatt för att ha gett feedback på manuskriptet. Detta arbete stöddes av bidragsstöd från MRC och ett forskningssamarbete före konkurrens med MSD, Francis Crick Institute, som får sin finansiering från Cancer Research UK (FC0010089), UK Medical Research Council (FC0010089), Wellcome Trust (FC0010089) och av ett Wellcome Trust Investigator Award till FG (106187/Z/14/Z). Vi ber om ursäkt till de många författare vars arbete vi inte kunde diskutera och citera på grund av brist på utrymme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
| 10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
| 5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
| Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
| Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
| BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
| Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
| BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
| Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
| Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
| Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
| KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
| MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
| Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
| Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
| RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
| Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
| Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 |
References
- Gillotin, S. Targeting impaired adult hippocampal neurogenesis in ageing leveraging intrinsic mechanisms regulating neural stem cell activity. Ageing Research Reviews. 71, 101447 (2021).
- Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
- Hanspal, M. A., Gillotin, S. A new age in understanding adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 17 (12), 2615-2618 (2022).
- Zhang, H., et al. Single-nucleus transcriptomic landscape of primate hippocampal aging. Protein & Cell. 12 (9), 695-716 (2021).
- Franjic, D., et al. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 110 (3), 452-469 (2022).
- Moreno-Jimenez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-Garcia, M., Rabano, A., Llorens-Martin, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2541-2553 (2021).
- Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2554-2565 (2021).
- Zhou, Y., et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature. 607, 527-533 (2022).
- Bonafina, A., Paratcha, G., Ledda, F. Deciphering new players in the neurogenic adult hippocampal niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 548 (2020).
- Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Flor-Garcia, M., et al. Unraveling human adult hippocampal neurogenesis. Nature Protocols. 15 (2), 668-693 (2020).
- Moreno-Jimenez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Kalinina, A., Lagace, D. Single-cell and single-nucleus RNAseq analysis of adult neurogenesis. Cells. 11 (10), 1633 (2022).
- Harris, L., et al. Coordinated changes in cellular behavior ensure the lifelong maintenance of the hippocampal stem cell population. Cell Stem Cell. 28 (5), 863-876 (2021).
- Shin, J., et al. Single-cell RNA-seq with Waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Artegiani, B., et al. A single-cell RNA sequencing study reveals cellular and molecular dynamics of the hippocampal neurogenic niche. Cell Reports. 21 (11), 3271-3284 (2017).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nature Protocols. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Sarnat, H. B., Nochlin, D., Born, D. E. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system. Brain Development. 20 (2), 88-94 (1998).
- Guidance on the Operation of ASPA. , Available from: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_dat/file/662364/Guidance_on_the_Operation_of_ASPA.pdf (2022).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (33), e1543 (2009).
- Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer's disease and aging. Nature Neuroscience. 23 (6), 701-706 (2020).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38 (6), 737-746 (2020).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting. Journal of Visualized Experiments. (170), e62405 (2021).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Marti-Mengual, U., Varea, E., Crespo, C., Blasco-Ibanez, J. M., Nacher, J. Cells expressing markers of immature neurons in the amygdala of adult humans. European Journal of Neuroscience. 37 (1), 10-22 (2013).
- Zhang, X. M., et al. Doublecortin-expressing cells persist in the associative cerebral cortex and amygdala in aged nonhuman primates. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 17 (2009).
- Ding, Z. B., et al. Astrocytes: a double-edged sword in neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1702-1710 (2021).
- Phatnani, H., Maniatis, T.
