Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Håndtering af praktiske spørgsmål i atomkraftmikroskopibaseret mikroindrykning på humane ledbruskeksplanter

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64371
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Summary

Vi præsenterer en trinvis tilgang til at identificere og løse de mest almindelige problemer forbundet med atomkraftmikroskopimikroindrykninger. Vi eksemplificerer de nye problemer på indfødte menneskelige ledbruskeksplanter, der er kendetegnet ved forskellige grader af slidgigtdrevet degeneration.

Abstract

Uden tvivl er atomkraftmikroskopi (AFM) i øjeblikket en af de mest kraftfulde og nyttige teknikker til at vurdere mikro- og endda nano-signaler på det biologiske område. Men som med enhver anden mikroskopisk tilgang kan der opstå metodologiske udfordringer. Især kan egenskaberne ved prøven, prøveforberedelsen, instrumenttypen og indrykningssonden føre til uønskede artefakter. I denne protokol eksemplificerer vi disse nye problemer på sunde såvel som osteoartritiske ledbruskeksplanter. Til dette formål viser vi først via en trinvis tilgang, hvordan man genererer, klassificerer og visuelt klassificerer ex vivo ledbruskskiver i henhold til forskellige stadier af degeneration ved hjælp af stor 2D-mosaikfluorescensbilleddannelse af hele vævseksplanterne. Den største styrke ved ex vivo-modellen er, at den omfatter alderen, hjemmehørende, menneskelig brusk, der gør det muligt at undersøge slidgigtrelaterede ændringer fra tidlig debut til progression. Derudover præsenteres også almindelige faldgruber i vævsforberedelse samt selve AFM-proceduren sammen med den efterfølgende dataanalyse. Vi viser, hvordan grundlæggende, men afgørende trin såsom prøveforberedelse og -behandling, topografiske prøveegenskaber forårsaget af avanceret degeneration og interaktion mellem prøver og spidser kan påvirke dataindsamling. Vi undersøger også de mest almindelige problemer i AFM og beskriver, hvor det er muligt, hvordan man kan overvinde dem. Kendskab til disse begrænsninger er af største betydning for korrekt dataindsamling, fortolkning og i sidste ende indlejring af resultater i en bred videnskabelig sammenhæng.

Introduction

På grund af den stadigt mindre størrelse af elektroniske enheder og systemer har den hurtige udvikling af mikro- og nanobaseret teknologi og udstyr fået fart. En sådan enhed er atomkraftmikroskopi (AFM), som kan scanne biologiske overflader og hente topografisk eller biomekanisk information på både nano- og mikrometerskala 1,2. Blandt dets store funktioner kan dette værktøj betjenes som en mikro- såvel som en nano-indenter for at få information om de mekaniske egenskaber ved forskellige biologiske systemer 3,4,5,6. Dataene indsamles ved fysisk kontakt med overfladen gennem en mekanisk sonde, som kan være så lille som ca. 1 nm ved dens spids7. Den resulterende deformation af prøven vises derefter baseret på fordybningsdybden af udkragningsspidsen og den kraft, der påføres prøven8.

Slidgigt (OA) er en langsigtet degenerativ kronisk sygdom karakteriseret ved forringelse af ledbrusk i leddene og omgivende væv, hvilket kan føre til fuldstændig eksponering af knogleoverfladerne. OA's byrde er betydelig; I øjeblikket lider halvdelen af alle kvinder og en tredjedel af alle mænd i alderen 65 år og derover af OA9. Traumer, fedme og den deraf følgende ændrede biomekanik i leddet10 bestemmer ledbruskdegenerationen, som ses som et fælles slutresultat. Den banebrydende undersøgelse af Ganz et al. postulerede, at de tidlige trin i OA-processen kan involvere de biomekaniske egenskaber af brusk11, og siden da har forskere bekræftet denne hypotese12. Ligeledes er det generelt accepteret, at vævets biomekaniske egenskaber er funktionelt orkestreret af den ultrastrukturelle organisation såvel som celle-celle og celle-matrix krydstale. Eventuelle ændringer kan dramatisk påvirke den samlede vævsbiomekaniske funktion13. Til dato er OA-diagnosen klinisk og er baseret på almindelig filmradiografi14. Denne tilgang er tosidet: For det første gør manglen på en defineret degenerativ afskæringstærskel til formulering af diagnosen OA tilstanden vanskelig at kvantificere, og for det andet mangler billeddannelsesmetoder følsomhed og standardisering og kan ikke detektere lokaliserede bruskskader15,16,17. Til dette formål har vurderingen af bruskens mekaniske egenskaber den afgørende fordel, at den beskriver en parameter, der ændrer sig i løbet af OA uanset sygdommens ætiologi og har en direkte indflydelse på vævsfunktionaliteten på et meget tidligt stadium. Indrykningsinstrumenter måler den kraft, hvormed vævet modstår fordybningen. Det er faktisk ikke noget nyt begreb. De tidligste undersøgelser går tilbage til 1980'erne og 1990'erne. I denne periode antydede talrige undersøgelser, at indrykningsinstrumenter designet til artroskopiske målinger af ledbrusk kunne være velegnede til at detektere degenerative ændringer i brusk. Selv for 30 år siden var nogle undersøgelser i stand til at demonstrere, at indrykningsinstrumenter var i stand til at detektere in vivo-ændringer i bruskoverfladen under vævsdegeneration ved at udføre trykstivhedsmålinger under artroskopi18,19,20.

AFM-indrykning (AFM-IT) af ledbrusk giver information om vævets afgørende mekaniske egenskab, nemlig stivhed. Dette er en mekanisk parameter, der beskriver forholdet mellem en påført, ikke-destruktiv belastning og den resulterende deformation af det indrykkede vævsområde21. AFM-IT har vist sig at være i stand til at kvantificere aldersafhængige modifikationer i stivhed i makroskopisk upåvirkede kollagennetværk og således skelne mellem de patologiske ændringer forbundet med OA-debut (grad 0 på Outerbridge-skalaen i ledbrusk)22. Vi har tidligere vist, at AFM-IT'er, baseret på rumlig chondrocytorganisation som en billedbaseret biomarkør for tidlig bruskdegeneration, giver mulighed for ikke kun at kvantificere, men også faktisk identificere de tidligste degenerative mekaniske ændringer. Disse resultater er allerede blevet bekræftet af andre23,24. Derfor fungerer AFM-IT som et interessant værktøj til at diagnosticere og identificere tidlige degenerative ændringer. Disse ændringer kan allerede måles på cellulært niveau, hvilket omformer forståelsen af OA-patofysiologisk proces.

I denne protokol demonstrerer vi en komplet histologisk og biomekanisk klassificeringsprocedure for ledbruskeksplanter, fra native bruskeksplantatforberedelse til AFM-dataindsamling og -behandling. Gennem en trinvis tilgang viser vi, hvordan man genererer, klassificerer og visuelt klassificerer ledbruskvæv i henhold til forskellige stadier af degeneration ved hjælp af 2D stor mosaikbilleddannelse efterfulgt af mikro-AFM-fordybninger.

Selvom AFM-IT i øjeblikket er et af de mest følsomme værktøjer til måling af biomekaniske ændringer i brusk7, har det som enhver anden instrumentel teknik begrænsninger og praktiske særegenheder25, der kan føre til fejlagtig dataindsamling. Til dette formål undersøger vi de mest almindelige problemer, der opstår under AFM-målinger af bruskeksanlæggene, og beskriver, hvor det er muligt, hvordan man minimerer eller overvinder dem. Disse omfatter topografiske aspekter af prøverne og vanskelighederne med at stabilisere dem i et AFM-kompatibelt miljø, fysiske egenskaber ved vævets overflade og de deraf følgende vanskeligheder med at udføre AFM-målinger på sådanne overflader. Eksempler på fejlagtige kraftafstandskurver præsenteres også, hvilket understreger de forhold, der kan forårsage dem. Yderligere begrænsninger, der er forbundet med cantileverspidsens geometri og brugen af Hertz-modellen til dataanalysen, diskuteres også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Femoral kondyler indsamlet fra patienter, der gennemgik total knæ artroplastik på universitetshospitalet i Tübingen, Tyskland, blev brugt. Kun ledbruskprøver fra patienter med degenerative og posttraumatiske ledpatologier blev inkluderet i denne undersøgelse. Afdelingsmæssige, institutionelle såvel som lokale etiske udvalgs godkendelse blev opnået inden undersøgelsens påbegyndelse (projekt nr. 674/2016BO2). Der blev modtaget skriftligt informeret samtykke fra alle patienter før deltagelse.

BEMÆRK: Et rutediagram over eksperimenttrinnene i kronologisk rækkefølge er vist i figur 1.

1. Vævsbehandling og generering af bruskskiver

  1. Vævsforberedelse
    1. Efter postoperativ resektion anbringes bruskprøverne i en beholder fyldt med Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 5% (v/v) penicillin-streptomycin. Sørg for, at prøverne er helt nedsænket i mediet. Varigheden mellem kirurgisk resektion og videre behandling af brusk bør ikke overstige 24 timer. Sørg for, at prøverne under hele forarbejdningen er helt nedsænket i medier for at undgå tørring af prøver.
    2. Skær brusk væk fra knoglen ved hjælp af en skalpel.
  2. Generering af bruskskive
    1. Generer bruskskiver med en diameter på 4 mm ved hjælp af en biopsistans.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at vælge og resektere de områder af kondylen, hvor brusklagets tykkelse overstiger 1 mm. Dette kan være problematisk, især omkring bærende zoner, hvor brusklaget typisk mister sin tykkelse på grund af slidprocesser eller degeneration.
    2. De tidligere genererede 4 mm bruskskiver anbringes på en specialfremstillet skæreanordning, og bruskskiverne fastgøres og holdes stabile ved hjælp af en spatel. Når bruskskiverne placeres på skæreanordningen, skal der udvises forsigtighed. Prøverne placeres, så bruskens øverste lag (ledbruskens overfladiske zone) ikke vender mod bladet
    3. Skær bruskskiverne med et barberblad. Der genereres således skiveformede bruskprøver på 4 mm x 1 mm. For at forhindre tørring af prøver skal du udføre vævsskæring så hurtigt som muligt.
    4. Saml hver skive ved hjælp af en spatel og læg de genererede bruskskiver i 1,5 ml rør indeholdende 1 ml DMEM suppleret med 5% (v / v) penicillin-streptomycin. Anbring ca. 15 diske i et rør.
  3. Kryotomesnit af bruskskiverne (til vinkelrette skiver)
    BEMÆRK: Dette trin er valgfrit, og det kan anvendes, hvis der ønskes en sidevisningsvisualisering af den cellulære mønsterfordeling i bruskskiverne. Det kan bruges som en verifikationsmetode, da fordelingen af cellulært mønster er et 3D-træk ved ledbrusk26. Optisk sektionering og 3D-rekonstruktioner af hele bruskskiverne ved hjælp af et konfokalmikroskop kan også anvendes, hvilket fjerner behovet for at sektionere prøverne som beskrevet i protokollen.
    1. Dæk bruskskiven med vandopløseligt indlejringsmedium, og placer den på kanten på kryotomeknappen (med skivens overflade vinkelret på knappens overflade). I kryotomeindretningen fryser indlejringsmediet ved lave temperaturer.
    2. Brug et standard kryotome til at skære vævet sidelæns med en tykkelse på 60 μm, indtil midten af skiven er nået (dvs. når kryosektioner når en længde på 4 mm) og saml skiverne. Ved at skære skiveeksplantatet vinkelret kan alle zoner i brusk (overfladisk, midt og dyb) visualiseres.
    3. Sektionerne samles på et glasglas, og det vandopløselige indlejringsmedium fjernes ved at vaske tre gange med fosfatbufret saltvand (PBS).

2. Bruskskivesortering som funktion af det cellulære rumlige mønster

  1. Farvning af de skiveformede bruskprøver
    1. Der anbringes en bruskskive (punkt 1.2) i hvert hul i en plade med 96 huller, og der tilsættes 130 μL cellegennemtrængeligt fluorescensfarvestof i en fortynding på 1:1.000 til hvert hul.
    2. Undersøg visuelt hele pladen, og sørg for, at der kun er placeret en disk i hver brønd. Pladen inkuberes i 30 minutter i standardcellekulturkuvøsen ved 37 °C.
  2. Farvning af bruskskiverne på 60 μm
    1. Bruskskivesektionerne (punkt 1.3) anbringes forsigtigt på glasmikroskopglas ved hjælp af tang.
    2. Dæk brusksektionerne med monteringsmedium, der indeholder nuklear DAPI-modfarvning, og placer forsigtigt dæksedler, der er egnede til fluorescensmikroskopi.
    3. Forsegl kanterne på hver dæksel med almindelig gennemsigtig neglelak og lad den tørre i 3 min.
  3. Top-down og sidevisning brusk sortering og billeddannelse
    BEMÆRK: Hver skive skal undersøges under et fluorescerende mikroskop. Formålet med dette trin er at sortere diskene baseret på deres dominerende cellulære mønster (enkeltstrenge, dobbeltstrenge, små klynger, store klynger eller diffuse).
    1. Placer 96-brøndpladen på pladeholderen på fluorescensmikroskopet.
    2. Vælg det passende fluorescensfilter på enten Em 495 nm/Ex 515 nm (til top-down-afbildning af bruskskiverne i punkt 2.1) eller Em 358 nm/Ex 461 nm (til sidebilleddannelse af bruskafsnittene i punkt 2.2) og 10x-målet.
      BEMÆRK: Brug af 10x-målet gør det muligt at inspicere hele diskens omkreds, og prøver med inhomogen eller forkert farvning kan udelukkes. Anvendelse af kun top-down-visningen kan imidlertid resultere i opfattelsen af ændringer i cellulær organisation som følge af analyse af de dybere vævslag, der er gjort synlige for top-down-observation ved overfladisk erosion. Som et eksempel kan en stigende streng, der følger kollagenarkaderne, opfattes som en enkelt celle eller spredte celler (diffust mønster)26. Som følge heraf skal begge sider af diskene inspiceres for at sikre korrekt valg af cellulært mønster.
    3. Bestem visuelt det cellulære mønster, der vises i hver bruskskive. Det er usandsynligt, at en disk kun har en type cellulært mønster. For den del af skiven, hvor kondrocytarrangementet ikke svarer til det relevante mønster, accepteres prøverne kun, hvis det uønskede mønster befinder sig i periferien, hvor AFM-målinger ikke finder sted (dvs. op til 0,5 mm fra skivens kant), og sørg for, at dette ikke overstiger 10 % af skivens samlede overflade27. 28.
  4. Billedoptagelse af hele bruskskiverne
    1. Vælg mikroskopets 10x mål, og placer det under det forudvalgte hul, der indeholder en individuel bruskskive. Fokuser på disken for at se det cellulære mønster.
    2. Vælg navigatorfunktionen for at få et overblik over hele brønden. Brug venstre museknap og træk for at navigere til en anden sceneposition. Brug musehjulet til at zoome ind og ud.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan en forhåndsvisning af brønden med hele prøven ses ved at dobbeltklikke på hvert interesseområde sekventielt.
    3. Vælg en firkant, der omfatter det interesseområde, der skal scannes; På dette tidspunkt bliver alle enkeltfliser, der komponerer mosaikken, synlige.
    4. Juster eksponeringen / lysintensiteten, så cellerne tydeligt kan visualiseres fra baggrunden. På dette tidspunkt er billedets lysstyrke/kontrast blevet justeret for alle fliserne og kan ikke længere tilpasses individuelt for hvert felt.
      BEMÆRK: Da cellerne nær diskens kant ofte udsender et højere fluorescenssignal end cellerne i midten, skal indstillingerne for eksponering/lysintensitet tilpasses.
      1. For at vurdere, om eksponeringstiden er passende for en bestemt kanal, skal du undersøge fordelingen af signalet i histogrammet. Ved at bruge den automatiske eksponeringsmekanisme, der er inkluderet i mikroskopets billedsoftware, visualiseres alle cellerne, der findes i disken.
    5. Vælg softwarens Focus Map Point-indstilling , og vælg derefter hver enkelt flise ved at venstreklikke i midten af den.
    6. Vælg indstillingen Fokuskort. Der vises et vindue med alle de tidligere valgte fliser. Dobbeltklik på en flise på listen for at få vist den og bringe den i korrekt fokus.
    7. Klik på Angiv Z for at gemme fokusplanen og fortsætte til næste felt. Når du har justeret fokusplanen for hver enkelt flise, skal du starte billedoptagelsen ved at trykke på Start scanning.
      1. Hvis scanningen viser mørkere vandrette og/eller lodrette bjælker, kan det skyldes forkert og ujævn belysning af de enkelte billeder. Løs dette ved at bruge indstillingen Linked Shading , der er inkorporeret i softwaren før den faktiske scanning.
    8. Gem, eksporter og kommenter billederne korrekt.

3. Biomekanisk tilgang af bruskeksplanter

  1. Prøveforberedelse til AFM-målinger
    1. Hver forudvalgt bruskskive, der indeholder et cellemønster (sektion 2) i petriskåle, fastgøres ved hjælp af biokompatibel lim. Tilføj tilstrækkelig prøvelim på toppen, bunden, venstre og højre side af disken.
    2. Dæk skiverne med 2,5 ml Leibovitzs L-15-medium uden L-glutamin. Tilsæt forsigtigt Leibowitz-mediet på prøverne for at undgå, at prøven løsnes fra overfladen på grund af bølger skabt af mediet.
  2. Indlæsning af prøverne i flyvehåndbogen
    1. Placer petriskålen i AFM-enhedens prøveholder, og tænd for petrivarmeren, der er indstillet til 37 °C. Lad vævskulturskålen nå den ønskede temperatur. Dette gøres for at udelukke mulige artefakter forårsaget af temperaturvariation.
  3. AFM-udkragningskalibrering
    1. Initialiser softwareopsætningen som tidligere beskrevet af Danalache et al.29.
    2. Vælg en passende glasblokudkragningsholder til væskemålinger, og placer den forsigtigt på AFM-hovedet. En låsemekanisme fastgør glasblokken i AFM-hovedet. Sørg for, at glasblokkens reflekterende overflade er lige og parallel med AFM-holderen.
    3. Placer udkragningen forsigtigt på overfladen af glasblokkens udkragningsholder. Cantileveren selv skal hvile på det polerede optiske plan i midten af glasblokken.
    4. Placer forsigtigt et silikoneskørt (silikonemembran) på bunden af udkragningsholderen for at forhindre medium kondens i AFM-hovedet.
    5. Sænk udkragningen i trin på 100 μm ved hjælp af stepmotorfunktionen, indtil den er helt nedsænket i mediet.
    6. Kør en scannertilgang med de tilgangsparametre, der er beskrevet af Danalache et al.29. Træk udkragningen tilbage med 100 μm, når bunden af petriskålen er nået.
    7. Kalibrer udkragningen ved hjælp af de nøjagtige trin og kør parametrene beskrevet af Danalache et al.29. Ved afslutningen af kalibreringen gemmes den lodrette afbøjning og vises i newton (N) kraftenheder i stedet for volt (V) - enheden for den oprindelige registrering af fotodiodedetektoren. I forsøgene her resulterede et sætpunkt på 4,47 nN efter kalibrering.
    8. Brug stepmotorfunktionen til at trække udkragningen tilbage til 1.000 μm.
  4. Identifikation af det ønskede bruskmålested under AFM
    BEMÆRK: På grund af bruskskivernes tykkelse på 1 mm er udkragningen ikke synlig i synsfeltet, mens du navigerer over prøven.
    1. Brug mikroskopets CCD-kamera til at identificere udkragningen. AFM-udkragningen skal placeres i et prøvefrit område af petriskålen.
    2. Start en scannertilgang med udkragningen på et rent, prøvefrit område af petriskålen ved hjælp af de samme parametre beskrevet af Danalache et al.29.
    3. Træk udkragningen yderligere 1,5 mm væk fra bunden af pladen med stepmotorstyringen. Dette trin er afgørende for at undgå en direkte kollision mellem udkragningen og prøven.
    4. Skift fra brightfield til fluorescensvisning, og identificer visuelt toppen af disken.
    5. Flyt AFM-prøveholderen nøjagtigt 2 mm mod midten af skiven. Dette punkt anses for at være centrum for bruskskiven.
    6. Kør en scannertilgang, og når bruskskivens overflade er nået, trækkes udkragningen tilbage med 100 μm.
  5. Målinger af kraft-afstandskurve
    1. Fokuser på cellerne placeret på det ønskede målested. Klik på knappen Kør for at starte målingerne og genereringen af kraftafstandskurver i den målrettede position.
    2. Få fem kraftafstandskurver på hvert målested. Træk udkragningen tilbage med 500 μm og flyt udkragningen til næste målested.
      BEMÆRK: Udkragningens tilbagetrækning er et afgørende skridt, da bruskskivens overflade ikke er homogen og har uregelmæssigheder. En høj bakke på overfladen af prøven kan resultere i en dramatisk kollision, hvilket fører til uønsket udkragningsspids / prøveskade. Vi anbefaler, at du vælger mindst fem forskellige målesteder spredt over skivens overflade og opnår mindst fem kraftafstandskurver på hvert sted.
    3. Undersøg kraftafstandskurverne og gem dem.
  6. Estimering af Youngs moduli ved hjælp af Hertz fit-modellen
    1. Åbn de genererede kraftafstandskurver, der skal analyseres (.jpk-fil), i dataanalysesoftwaren ved hjælp af indstillingen Åbn en batch af spektroskopikurver .
    2. Vælg Hertz fit-modellen , og vælg derefter indstillingen Elasticitetstilpasning .
      1. Indstillingen elasticitetstilpasning udfører automatisk følgende beregninger på den valgte kraftafstandskurve: beregner basislinjen og trækker fra hele kurven for at fjerne basislinjeforskydningen (basislinjen bringes tilbage til nul på y-aksen); bestemmer kontaktpunktet ved at detektere det punkt, hvor kraftafstandskurven krydser nulkraftlinjen (kontaktpunktet er indstillet til nul på x-aksen) beregner adskillelsen af spidsprøven (højdesignalet fra piezoen, der tegner sig for bøjningen af udkragningen, trækkes fra); og tilpasser automatisk kraftafstandskurven til den valgte model. Hvis det ønskes, kan hvert af disse trin også udføres uafhængigt.
    3. Tilpas ved hjælp af følgende tilpasningsparametre: Poisson-forhold på 0,5 og den passende udkragningsspidsradius.
      BEMÆRK: Når du bruger en udkragning med en sfærisk cantileverspids, skal Hertz fit-modellen bruges. Den udkragning, der blev anvendt i denne undersøgelse, havde en sfærisk spids med en radius på 5 μm. Vi anbefaler, at du tilpasser kraftafstandskurven, indtil den maksimale påførte kraft er nået (sætpunkt).
    4. Kontroller visuelt kraftafstandskurvens pasform for at sikre korrekthed. Dette trin skal udføres for hver af de analyserede kraftafstandskurver.
  7. Bestemmelse af indrykningsdybde
    BEMÆRK: Afhængigt af det anvendte dataanalyseværktøj kan denne proces variere. Eksperimentatoren kan nemt læse indrykningsdybden ved at følge en række trin, der er inkluderet i dataanalyseprogrammet.
    1. Åbn hver af de genererede kraftafstandskurver i dataanalysesoftwaren, og vælg Hertz fit-modellen som analyseproces.
    2. Anvend indstillingen Subtraher grundlinjeforskydning til nulstilling af den lodrette nedbøjningsakse (y-akse), og vælg funktionen Forskydning + hældning .
    3. Brug funktionen Find kontaktpunkt til automatisk at identificere kontaktpunktet, som automatisk bringes til en x-koordinat på nul.
    4. Træk afstanden, der udelukkende tager højde for udkragningsafbøjning, fra den rå piezohøjde under fordybningen ved hjælp af funktionen Lodret spidsposition .
    5. Vælg indstillingen Elasticitetstilpasning for at få vist den behandlede kraftafstandskurve, og vælg grafens område, så den flugter med den mest negative værdi på den lodrette spidspositionsakse (x-aksen).
    6. Læs og dokumentér indrykningen fra feltet X Min under parameterfanen. Gem og dokumentér resultaterne.

4. Statistisk analyse

  1. Åbn statistiksoftwaren. Vælg Nyt datasæt i rullemenuen.
  2. Åbn fanen Variabelvisning , når du har valgt datasætfilen . Definer de numeriske variabler for hver cellulær mønsterkategori: enkeltstrenge = SS, dobbeltstrenge = DS, små klynger = SC, store klynger = BC, diffus og Youngs moduli.
  3. På fanen Datavisning skal du indtaste de målte Youngs modulidata for hver af de tilsvarende cellulære mønsterkategorier. Analysér datadistributionen ved at vælge Analysér på menulinjen og derefter Analyse af sonderende data.
  4. Vælg Youngs moduli som den afhængige variabel og mobilmønster som faktorlisten. Et boksplot, der bruges til resultatafsnittet, vises blandt resultaterne i outputfilen.
  5. Hvis du vil foretage en statistisk analyse, skal du vælge Afhængige prøver i afsnittet ikke-parametrisk test under fanen Analysér menulinje. Vælg Youngs moduli som testfelter og mobilmønster som grupper under fanen felter. Tryk på Kør.
    BEMÆRK: Resultaterne vises i outputfilen. Til den statistiske analyse udføres en Friedman-test.
  6. Inkorporer den ikke-parametriske tests p-værdier i boksplottet, der blev oprettet i trin 4.4. Gem resultaterne ved at klikke på Filer på menulinjen og vælge Gem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af en selvfremstillet skæreanordning var vi i stand til at eksplante og generere små (4 mm x 1 mm) bruskskiver fra friske humane kondyler indeholdende et enkelt cellulært rumligt mønster30 af enkeltstrenge (SS, figur 2A), dobbeltstrenge (DS), små klynger (SC), store klynger (BC; Figur 2A) og diffus (figur 2B). En repræsentativ bruskeksplante er afbildet i figur 3A. Udvælgelsen af diske, der kun viser én type mønster, blev udført ved hjælp af top-down fluorescensbilleddannelse (figur 2). Den topografiske variation af bruskoverfladeskiven blev yderligere illustreret ved sidebillede af 60 μm tykke sektioner genereret fra bruskskiverne (figur 2C). På overfladen af de udplantede osteoarthritiske bruskskiver var overfladisk flimmer og matrixspaltning til stede (figur 3B, C). Dette var især bemærkelsesværdigt i skiverne, der var repræsentative for avanceret OA-progression - repræsenteret ved tilstedeværelsen af BC (figur 2A). Efter postfluorescenssortering blev diskenes stivhed vurderet ved hjælp af AFM-mikroindrykninger. Til dette formål blev de genererede bruskskiver med succes fastgjort i AFM-petriskålen ved hjælp af biokompatibel lim (figur 3D) for at undgå, at prøven drev under målingerne (figur 3E). Den anvendte mængde lim skal justeres. En utilstrækkelig mængde lim vil resultere i skivestabilitet, mens tilsætning af for meget lim kan føre til uønsket spredning af limen enten under og / eller over bruskskiven. Sidstnævnte fører til måleartefakter og dårlig identifikation af disken under fluorescensmikroskopet. Utilstrækkelig limpåføring eller pludselige bevægelser af prøven under fiksering er hyppige problemer, der får vævet til at løsne sig fra petriskålen og bør undgås.

En repræsentativ gradvis stivhedsreduktion sammen med det cellulære mønsterarrangement er vist i figur 4A. Stivhedsværdierne var højere i skiverne indeholdende SS (median på 2,6 kPa) - repræsentativ for kompromisløse hedebruskområder. Med OA-debut og progression viste AFM-målingerne et stærkt trinvist fald i stivhed på 42% i DS (1,5 kPa), 77% i SC (0,6 kPa) og i sidste ende 88% i avancerede stadier repræsenteret af BC (0,3 kPa; Figur 4A). Skiverne, der indeholdt et diffust mønster, viste en forhøjet elasticitet med en vigtig variation af Youngs modul enkeltværdier. For alle bruskskiver med tildelt fremherskende cellulær mønsterorganisation viste indrykningsdybden forbundet med det anvendte sætpunkt (4,477 nN) sig at være omvendt proportional med stivhed (figur 4B). Figur 4C viser en repræsentativ genereret kraft-afstandskurve, og en Hertz-pasning samt identifikation af kontaktpunktet er vist i figur 4D.

Den korrekte tilpasning afhænger bl.a. af den korrekte bestemmelse af basislinjen. Hvis den automatiske baseline-detektion er fejlagtig (f.eks. på grund af en turbulent baseline), kan tilpasningen også bestemmes manuelt, og det giver brugeren mulighed for at vælge en mere repræsentativ baseline for målingerne. Men hvis den genererede kraftafstandskurve ikke tillader en korrekt pasform, skal den kasseres. Figur 5 viser eksempler på forkerte kraft-afstandskurver. Det kan være vanskeligt at generere passende kraftafstandskurver på osteoartritiske ledbruskeksplanter på grund af vævets uregelmæssige overflade på den ene side (eksempler er vist i figur 5A, B) og prøvens ustabilitet forårsaget af forkert prøvefiksering (eksempler vist i figur 5C, D). Artefakter kan være forårsaget af flere sondeprøvekontaktpunkter (på grund af den ujævne overflade af degenereret brusk) eller uønsket vævsbevægelse (synlig gennem ændringer i fokalplanet). Disse artefakter kan ses i de genererede kraftafstandskurver og er tegn på enten en suboptimal kontakt mellem AFM-udkragningen og bruskoverfladen eller forkert prøvefiksering til petriskålen (se figur 5A-D).

Figure 1
Figur 1: Rutediagram over forsøgsproceduren. Resumé af de eksperimentelle trin i kronologisk rækkefølge, begyndende fra intraoperativt resekterede bruskprøver til generering af 4 mm x 1 mm bruskskiver, fluorescensfarvning og sortering af skiverne på grundlag af den cellulære mønsterorganisation ved hjælp af top-down og sidebilleddannelse og i sidste ende elasticitetsvurdering ved hjælp af atomkraftmålinger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fluorescensbilleddannelse af repræsentative bruskskiver. (A) Mosaic 2D-billeder og et zoomet eksemplarisk felt af bruskskiver farvet med cellemembrangennemtrængeligt farvestof ved 100x forstørrelse. Den øverste disk viser en repræsentativ disk med enkelte strenge, mens den nederste er repræsentativ for en stor klyngedisk (nederst). (B) Mosaikbillede af en skive med diffus mønster set fra overfladen (øverst) og den samme skive afbildet fra undersiden (nederst). (C) Set fra siden af nuklear farvning af 60 μm skiver bruskskiver. Den hvide skalabjælke repræsenterer 500 μm for mosaikbillederne (større synsfelt, A [venstre panel], B, C) og 100 μm for de zoomede, fokuserede billeder (A [højre panel]). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Udplantede ledbruskskiver. (A) Repræsentativt billede af en genereret 4 mm x 1 mm bruskskive eksplant fra frisk human ledbrusk. Skalabjælken afbildet i hvidt repræsenterer 2 mm. (B) Repræsentativt billede af naturligt osteogigtbrusk, hvor vævsoverfladen præsenterer makroskopisk synlig overfladisk flimmer og spaltning. Skalabjælken afbildet i hvidt repræsenterer 1.000 mm. (C) Skematisk afbildning af bruskfladen. (D) Før AFM-målingerne var hver af bruskskiveeksplanterne korrekt fastgjort ved hjælp af biokompatibel prøvelim til overfladen af AFM-petriskålen for at undgå, at artefakter skyldes, at prøven driver under de faktiske indrykningsmålinger som vist i (E). Den hvide skalabjælke repræsenterer 4 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater af atomkraftmikroskopimålinger af ledbruskskiver sorteret på grundlag af deres fremherskende cellulære mønsterorganisation . (A) Boxplot, der viser medianen af den beregnede Youngs moduli på fem diske, en for hvert cellulært mønster, der stammer fra en patient. I alt 25 målinger blev udført på hver skive (fem målinger for fem forskellige målesteder). Den sorte linje inde i rektanglet repræsenterer medianværdien, rektanglets nedre og øvre ekstremiteter repræsenterer henholdsvis første og tredje kvartil, og fejlbjælkerne repræsenterer de laveste og højeste værdier for hver gruppe. (B) Punktplot, der viser de 125 dybdepunkter for indrykning for hvert cellulært mønster. (C) Eksemplariske kraftafstandskurver erhvervet med AFM med et beregnet Youngs modul på 0,4 kPa. D) En repræsentativ Hertz-pasning og bestemmelse af kontaktpunkt for den i punkt C viste kraftafstandskurve. X-aksen viser den lodrette spidsposition (som er den afstand, der krydses af piezoen, hvor længden, der tegner sig for udkragningsbøjningen, automatisk trækkes fra kontaktdelen af kraftafstandskurven). *p < 0,05. Til statistisk analyse blev Friedman-testen brugt. Forkortelser: SS = enkelte strenge; DS = dobbeltstrenge; SC = små klynger; BC = store klynger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Eksempler på fejlagtige kraft-afstandskurver. (A) Kraft-afstandskurven viser en massiv afvigelse efterfulgt af genopretning nær basislinjeniveauet, før der observeres en kontinuerlig fordybning af overfladen. Dette fænomen kan tilskrives en relativt stor hindring (f.eks. Store overfladekløfter, der stikker ud fra bruskens øverste lag). (B) Den udvidede kraftafstandskurve viser flere små toppe. Disse kurver menes at være forårsaget af mikroskala uregelmæssigheder på bruskoverfladen (fx fibrillering). Både (C) og (D) viser kraftafstandskurver med bifasiske forløb. Begge kraftafstandskurver er repræsentative for dårlig prøvefiksering og prøvedrift. Det er også ret almindeligt i disse tilfælde at se en pludselig ændring i brændplanet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som en progressiv og multifaktoriel sygdom udløser OA strukturelle og funktionelle ændringer i ledbrusk. I løbet af OA ledsages forringelser i mekaniske egenskaber af strukturelle og biokemiske ændringer på overfladen af ledbrusk27,31. De tidligste patologiske hændelser, der forekommer i OA, er proteoglycanudtømning kombineret med kollagennetværksforstyrrelse32,33,34. Sådanne tidlige subtile overfladeændringer er vanskelige at lokalisere og identificere med bulktest, fordi den mekaniske opførsel er gennemsnitlig over hele vævsdybden. Derudover er et stadig ubesvaret spørgsmål, om funktionelle ændringer på organ- og vævsniveau vedrører strukturelle og funktionelle ændringer i mikro- eller nanoskala. Til dette formål anses AFM for at være en af de mest følsomme metoder, der er i stand til at detektere de tidligste biomekaniske ændringer, der forekommer med OA-debut7. Det muliggør stivhedsmålinger på både mikro- og nanometerskalaer i indfødte prøver, hvilket giver information om de mekaniske egenskaber af ledbrusk35,36. I denne protokol målte vi ved hjælp af mikro-AFM-fordybninger de elastiske egenskaber hos sunde og osteoartritiske ledbruskeksplanter. Resultaterne viste, at bruskeksplanterne er meget repræsentative for tidlige lokale OA-hændelser med et bemærkelsesværdigt gradvist fald i stivhed, der forekommer i mønsterspecifikke bruskeksplanter. Desuden er resultaterne i tråd med tidligere offentliggjort forskning, der viste et bemærkelsesværdigt stivhedsfald sammen med den cellulære mønsterorganisation23,24,27,37.

Bekræftede indfødte humane modeller, der efterligner forskellige aspekter af OA-patogenese og progression, er i øjeblikket nødvendige for at løse manglerne ved translationel forskning og udfordringerne ved at oversætte in vitro-data til en klinisk indstilling. Til dato kan ingen model nøjagtigt repræsentere det komplekse indfødte humane bruskrum, endsige de aldersrelaterede ledvæv, der er tilbøjelige til OA som reaktion på sygdomsinitierende stimuli38. De mest almindeligt anvendte explant-baserede modeller hidtil var af kvæg eller kvægoprindelse og anvendte enten en stærk inflammatorisk cytokinbehandling eller mekanisk belastning 39,40,41. Denne protokol på den anden side demonstrerer, hvordan man genererer små (4 mm x 1 mm) udplantede skiveformede humane bruskprøver, som er vejledende for de enkelte stadier af specifikke OA-begivenheder. Bruskeksplanterne sorteres og tildeles trin ved hjælp af den cellulære rumlige organisation som en billedbaseret biomarkør30,42. Da tidlige ændringer i biomekaniske egenskaber allerede kan identificeres og kvantificeres, så snart dobbeltstrenge begynder at opstå23,27, på et stadium, hvor bruskoverfladen stadig fremstår makroskopisk intakt26, tillader denne eksplantbaserede model undersøgelse af et lokalt naturligt bruskrum og kan give indsigtsfuld information om tidlig OA. Desuden kan denne bruskmodel være nyttig til at undersøge cellerne og matrixresponsen på mekaniske og inflammatoriske ændringer i et 3D-naturligt lokalt habitat38,39. Da de er relativt enkle og lette at generere, kan disse bruskeksplanter også bruges til at studere OA-heterogenitet, hvilket er en begrænsende faktor i udvikling og test af sygdomsmodificerende OA-lægemidler43. Det skal også bemærkes, at skalerbarhed og afhængighed af patienter, der gennemgår ledudskiftningskirurgi, er to af modellens mangler.

Det er velkendt, at ledbrusk præsenterer en ejendommelig adfærd afhængigt af det skalaniveau, der testes. Som angivet af Loparic et al. opfører brusk sig på mikroskalaen som et ikke-struktureret og ensartet materiale35, og en sådan tilgang giver en tilnærmelse af lokaliseret samlet bruskstivhed. Med hensyn til om mikro- eller nano-fordybninger er bedre egnet, sammenlignede en undersøgelse fra 2004 af Stolz et al.44 både mikro- og nanoskala fordybninger i vurderingen af ledbruskens strukturmekaniske egenskaber. Forfatterne understregede, at for mikroskala sfærisk indrykning af ledbrusk deler nanoskala fine strukturelle komponenter (dvs. individuelle kollagenfibre og proteoglycaner) almindeligvis opgaven med belastningsbærende. I sådanne adskiller de aggregerede mekaniske egenskaber sig markant fra de enkelte nanokomponenter. De samme forfattere foreslog, at en kombination af mikro- og nanoindrykninger kunne anvendes til at vurdere ledbruskens overordnede lokale stivhedsprofiler samt stivheden i forbindelse med de fine strukturelle komponenter44.

Talrige AFM-baserede indrykningseksperimenter har brugt skarpe pyramidale udkragningsspidser (radius = 15-20 nm)22,36,44 til vurdering af bruskmekanik. Selvom nanoindrykkninger med skarpe udkragninger i øjeblikket anses for at være mere egnede til at vurdere de fineste mekaniske egenskaber, giver sfæriske udkragningsspidser resultater, der er mere konsistente og lettere at modellere og fortolke, når man tester bløde biologiske prøver44,45. Desuden viste Stolz et al., at AFM nano-indrykninger af enzymatisk (dvs. elastase) nedbrudt ledbrusk ikke er mulige, fordi vævet bliver så klæbrigt, at spidsprøvevedhæftning dominerer kraftafstandskurverne, hvilket gør dataene umulige44.

I de nuværende AFM-målinger blev der anvendt en udkragning med en sfærisk udkragningsspids på 5 μm radius. Cantilever-valget var motiveret af hensigten om at gennemsnitlige vævets mekaniske egenskaber over en temmelig stor overflade, samtidig med at den påførte skade på bruskoverfladen minimeres. Forholdet mellem den udkragningspåførte kraft og den resulterende prøvefordybning blev monteret med Hertz fit-modellen. Ved brug af sfæriske indenter anbefales Hertz fit-modellen, hvor de attraktive kræfter, der virker mellem udkragningsspidsen og prøveoverfladen, forsømmes46. Ligningerne for Hertzian-modellen er vist i Eq.1 og Eq.2.

Equation 1Eq.1

Equation 2Eq.2

Hvor F = kraft; E = Youngs modul; v = Poissons forhold; δ = indrykning; a = radius af kontaktcirkel; og Rs = kuglens radius.

Modellen beregner i sidste ende celle-/vævselasticiteten47, formelt udtrykt som Youngs modul (E). Hertz fit-modellen tager højde for flere egenskaber såsom spidsform og størrelse, fordybning og prøvedeformerbarhed. Hvis disse krav ikke ideelt set er opfyldt, kan modellen give et unøjagtigt skøn over Youngs modul46.

Hertz fit-modellen antager, at belastningen og den elastiske spænding afhænger lineært af det elastiske modul, hvilket indebærer, at fordybningen i prøven forbliver meget mindre end selve prøvetykkelsen46. Denne antagelse blev let opfyldt i denne opsætning, hvor bruskeksplanterne havde en tykkelse på 1 mm sammenlignet med fordybninger på få mikrometer.

Ledbrusk kan modelleres som et porøst viskoelastisk materiale48,49. Den viskoelastiske opførsel skyldes friktion mellem de intracellulære / cytoplasmatiske eller matrixbestanddele såsom molekyler, organeller og kollagen-proteoglycan-netværket50,51. Som navnet antyder, kombinerer viskoelastiske materialer to forskellige egenskaber: viskøs - materialet deformeres langsomt, når det udsættes for en ekstern belastning - og elastisk - materialet vender tilbage til sin oprindelige konfiguration, når den påførte belastning fjernes52,53. Den viskoelastiske opførsel manifesteres som en hysterese mellem tilgangskurverne (udvidet) og tilbagetrækningskurverne i kraftafstandskurverne 46,52, svarende til dem, der opnås i denne undersøgelse (figur 4C). Desuden er det karakteristisk for viskoelastiske materialer, at deres mekaniske egenskaber afhænger af deformationshastigheden, idet materialets stivhed øges med den hastighed, hvormed belastningen påføres (indrykningshastighed)54. Ved at vælge forskellige belastningshastigheder genereres således en familie af kraftafstandskurver, som hver repræsenterer de mekaniske egenskaber af den testede prøve ved hver belastningshastighed52. Så når man forsøger at sammenligne resultaterne af forskellige værker, er det afgørende at tage alle indrykningsparametrene i betragtning. Samlet set opfører ledbrusk sig som et ikke-struktureret og ensartet materiale, der genererer et kumulativt modul, der inkluderer både elastiske og viskøse bidrag til stivhed på grund af vævets poroviscoelastiske karakter35, når man måler på mikrometerskalaen (som i denne undersøgelse med en 5 μm sfærisk cantileverspids).

En anden antagelse af Hertzian-modellen er, at indrykningsdybden er lavere end radius af den sfæriske cantilever tip55. Indrykningsdybden repræsenterer den maksimale forskydning af udkragningsspidsen efter første kontakt med prøven. Ved maksimal belastning er den maksimale indrykningsdybde den samlede forskydning af prøven og udkragningsspidsen. Bueckles retningslinje angiver en maksimal indrykningsdybde på 10% af den samlede tykkelse af en prøve med samme struktur i hele56, ellers varierer resultaterne alt efter forholdet mellem dybde og tykkelse. For en udkragningsspidsradius på 5 μm blev bruskeksplanterne i denne undersøgelse indrykket ved 1,1 μm i gennemsnit, med nogle få toppe på 3 μm i nogle få tilfælde, især for de stærkt degenererede bruskeksplanter. I dette tilfælde blev der søgt et kompromis, da der i forsøgsindstillingen kræves relativt høje kræfter forbundet med store fordybninger for at neutralisere overfladeuregelmæssighederne i degenereret brusk. En mildere fordybning ville resultere i undersøgelse af overfladisk fibrillering og kollagenfissuring, som begge er fælles træk ved stærkt degenereret brusk57.

Afgørende for Hertz fit-modellen er også den korrekte identifikation af det punkt, hvor udkragningsspidsen kommer i direkte kontakt med prøven, generisk kaldet kontaktpunktet. Dette kan dog vise sig at være problematisk ved indrykning af for klæbrige eller for bløde prøver, da det kan resultere i flere sondeprøvekontaktpunkter58,59. Faktisk, som pænt understreget af A-Hassan et al., for blødt biologisk væv, er den nøjagtige bestemmelse af kontaktpunktet et af de mest irriterende problemer60. Denne effekt blev også observeret i de indfødte osteoarthritiske bruskeksplanter, da vævsoverfladen afhængigt af degenerationsstadiet mister sine oprindelige mekaniske egenskaber og ofte er ujævn og præsenterer overfladisk flimmer og kløft (figur 3B, C). Dette fænomen blev især bemærket i bruskeksplanterne, hvor det dominerende cellulære mønster var store klynger (figur 2C). Disse inhomogeniteter i bruskoverfladen kan føre til flere sondeprøvekontaktpunkter og dermed fejlagtige resultater. Der blev i nogle tilfælde observeret store udbøjninger, efterfulgt af en hurtig genopretning af basislinjen før den sidste strækning af kraftafstandskurven (figur 5A). Dette kan tilskrives en stor hindring i udkragningsspidsens vej (f.eks. Fremskredne fibrilleringsområder med flosset og splittende brusk). I andre tilfælde var den endelige hældning af kraftafstandskurven spredt med mindre uregelmæssigheder (figur 5B), hvilket indikerer kontakt med successivt mindre hindringer (f.eks. Mikrofibrillering af vævet). I sådanne tilfælde skal målestedet måles igen eller endda ændres for at sikre dataenes pålidelighed og reproducerbarhed. Med henblik herpå er det også vigtigt omhyggeligt at inspicere flyvehåndbogens kraft-afstandskurve-output for korrekt identifikation af kontaktpunktet. Dette er et afgørende punkt at være opmærksom på, da det har vist sig, at en forkert identifikation af kontaktpunktet med 50 nm resulterer i en forkert estimering af værdien af E med en størrelsesorden61. Flere undersøgelser er begyndt at bruge automatiserede tilgange til at bestemme kontaktpunktet for kraftafstandskurver med det formål at omgå subjektivt brugerinput ved estimering af kontaktpunktet ved visuel inspektion og forbedre nøjagtigheden. Dette bliver endnu mere afgørende, når man beskæftiger sig med et stort antal kraftforskydningskurver, såsom dem, der genereres i cellemekanikmålinger47,62. Selvom der er foreslået flere strategier til automatisering af kontaktpunktets bestemmelse 47,63,64,65, er den optimale strategi stærkt afhængig af eksperimentelle forhold og faktorer såsom den model, der bruges til at analysere dataene, sondens form, den (ikke-) klæbende mekaniske interaktion mellem udkragningsspidsen og prøven samt prøvens (ikke-) Hertzian-opførsel 63.

Prøvedrift er et andet almindeligt problem, der kan forårsage artefakter og fejlagtig bestemmelse af kontaktpunkter (figur 3E). Det betyder grundlæggende, at prøven ikke er korrekt monteret i prøveholderen (petriskål), og prøven bevæger sig under AFM-målingerne. Effekten er særlig udtalt, når AFM-udkragningen flyttes til et nyt målested. Dette aspekt kan let observeres under de faktiske målinger ved en pludselig ændring i brændplanet. De resulterende kraftafstandskurver har typisk en bifasisk forlænget hældning med en let stigning i starten, svarende til indsnævring af det tomme rum mellem bunden af skiven og petriskålen, når skiven skubbes ned af udkragningen (se figur 3E), efterfulgt af en fastere hældning i skråningens anden sektion. angiver, at skiven rykkes yderligere ind nu, hvor den er i direkte kontakt med bunden af petriskålen (figur 5C,D). For at overvinde forvrængningerne kan man forsøge at fikse prøverne bedre ved at bruge et passende prøveklæbemiddel (figur 3D), holde temperaturen konstant ved at slukke for eksterne varmekilder (lys) for at undgå termisk drift og udføre hurtige scanningsmålinger. I eksperimenterne her observerede vi en udkragningsafbøjningsdrift, der opstod inden for de første 15 minutter efter udkragningens nedsænkning i medier (på grund af pludselige temperaturændringer). Efter denne tidsforløb er driften normalt ubetydelig. Som følge heraf råder vi eksperimentatoren til omhyggeligt at undersøge baseline efter cantilever nedsænkning og begynde at måle, når den er stabiliseret. Varigheden af denne proces kan variere meget afhængigt af den anvendte udkragning.

En anden kritisk parameter for enhver AFM-måling er sætpunktet, som forenklet er et mål for den kraft, der påføres af udkragningen på prøven. For kontakttilstanden (som anvendt i denne undersøgelse) repræsenterer sætpunktet en vis afbøjning af udkragningen. Når du udfører flere scanninger eller flere gentagelser på stedet, som i protokollen her, kan udkragningsspidsen adsorbere partikler fra prøveoverfladen, hvilket gør det nogle gange nødvendigt at fjerne udkragningen, rengøre den korrekt66 og derefter kalibrere igen, før målingerne fortsættes.

Selv om AFM-mikroindrykninger giver nye og interessante dataindsamlingsmuligheder, navnlig i forbindelse med osteogigtbrusk, afhænger konsistensen og reproducerbarheden af de producerede data i høj grad af flere parametre som beskrevet ovenfor. Når man bruger denne tilgang til at vurdere de mekaniske ændringer forårsaget af bruskvævsdegeneration, skal der først udføres nogle pilotmålinger på forskellige rumlige mønstre for at opskalere resultaterne til det specifikke eksperimentelle design. AFM-pilotmålinger bør udføres med den mest standardiserede procedure, hvor der udtages tilstrækkeligt mange prøver (f.eks. fem skiver) med samme mønster til at give en indikation af omfanget af datavariabilitet. Dette er især vigtigt, når man forsøger at kvantificere og vurdere de tidligste relevante OA-stivhedsændringer (dvs. mellem enkeltstrenge og dobbeltstrenge, figur 4A). Faktisk viste vi i en tidligere undersøgelse ved hjælp af en lignende tilgang, at en prøvestørrelse på 30 humane prøver var nødvendig for at vurdere biomekaniske ændringer i matrixen som en funktion af cellernes rumlige organisering37.

Desuden er mange af de trin, der præsenteres i denne protokol, modtagelige for menneskelige fejl og er stærkt afhængige af operatørens erfaring. I betragtning af alle de faktorer, der kan påvirke de faktiske AFM-resultater, er de absolutte E-værdier, der er rapporteret i denne undersøgelse, ikke generaliserbare og er ret specifikke for denne eksperimentelle opsætning. Imidlertid er forholdet præsenteret her mellem de forskellige Youngs moduli og de cellulære mønsterbaserede bruskeksplanter (jo mere patologisk det rumlige mønster er, jo lavere er bruskens elastiske modul [EM]) upåvirket, da resultaterne er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser stivhedsændringer som en funktion af cellulær mønsterorganisation 23,37.

Samlet set demonstrerer denne trin-til-trin-protokol funktionaliteten af standardiserede 3D-native ledbruskeksplanter, som ikke kun er repræsentative for OA-drevne cellulære reorganiseringshændelser, der spænder fra debut til avanceret progression, men også er forbundet med et gradvist fald i stivhed. Explants kan afspejle en pålidelig biomimetisk model til undersøgelse af OA-debut og progression, hvilket muliggør test og udvikling af forskellige behandlingsmetoder ex vivo. Brugen af en sådan human explant-model i kombination med AFM-baseret biomekanisk vurdering kan resultere i et paradigmeskift for biomedicinsk forskning og medicinalindustrien, hvilket baner vejen for nye måder at identificere stærkt tiltrængte effektive OA-lægemidler på.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker ortopædkirurgerne fra ortopædkirurgisk afdeling på universitetshospitalet i Tuebingen for at have leveret vævsprøverne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102 (2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955 (2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247 (2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116 (2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783 (2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409 (2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467 (2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001 (2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851 (2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Tags

Retraktion udgave 188 Ledbruskeksplanter atomkraftmikroskopi elastiske moduli ex vivo-model Hertz-modelindrykning vævsforberedelse
Håndtering af praktiske spørgsmål i atomkraftmikroskopibaseret mikroindrykning på humane ledbruskeksplanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, C., Alexander, D., Umrath,… More

Daniel, C., Alexander, D., Umrath, F., Danalache, M. Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (188), e64371, doi:10.3791/64371 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter