Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Решение практических вопросов микроиндентирования на основе атомно-силовой микроскопии на эксплантах суставного хряща человека

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64371
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Summary

Представлен пошаговый подход к выявлению и решению наиболее распространенных проблем, связанных с микровдавливаниями в атомно-силовой микроскопии. В качестве примера мы приводим возникающие проблемы на экплантах суставного хряща человека, характеризующихся различными степенями дегенерации, вызванной остеоартритом.

Abstract

Без сомнения, атомно-силовая микроскопия (АСМ) в настоящее время является одним из самых мощных и полезных методов для оценки микро- и даже наносигналов в биологической области. Однако, как и в случае с любым другим микроскопическим подходом, могут возникнуть методологические проблемы. В частности, характеристики образца, пробоподготовки, тип прибора и датчик для индентирования могут привести к появлению нежелательных артефактов. В этом протоколе мы иллюстрируем эти возникающие проблемы на здоровых, а также на костно-артритных эксплантатах суставного хряща. С этой целью мы сначала покажем с помощью пошагового подхода, как генерировать, классифицировать и визуально классифицировать диски суставного хряща ex vivo в соответствии с различными стадиями дегенерации с помощью большой 2D-мозаичной флуоресцентной визуализации всей ткани. Основное преимущество модели ex vivo заключается в том, что она включает в себя старые, естественные хрящи человека, что позволяет исследовать изменения, связанные с остеоартритом, от раннего начала до прогрессирования. Кроме того, представлены общие подводные камни при подготовке тканей, а также сама процедура АСМ вместе с последующим анализом данных. Мы показываем, как основные, но важные этапы, такие как подготовка и обработка образцов, характеристики топографических образцов, вызванные прогрессирующей дегенерацией, и взаимодействие образца с наконечником образца, могут повлиять на сбор данных. Мы также тщательно изучаем наиболее распространенные проблемы в АСМ и описываем, где это возможно, способы их преодоления. Знание этих ограничений имеет первостепенное значение для правильного сбора данных, интерпретации и, в конечном счете, включения полученных результатов в широкий научный контекст.

Introduction

В связи с постоянно уменьшающимися размерами электронных устройств и систем набирает обороты стремительное развитие микро- и нанотехнологий и оборудования. Одним из таких устройств является атомно-силовая микроскопия (АСМ), которая может сканировать биологические поверхности и извлекать топографическую или биомеханическую информацию как в нано-, так и в микрометровом масштабе 1,2. Среди его обширных возможностей можно отметить, что этот прибор может работать как в микро-, так и в нано-инденторе для получения информации о механических свойствах различных биологических систем 3,4,5,6. Данные собираются путем физического контакта с поверхностью с помощью механического зонда, который может иметь размер около 1 нм на конце7. Результирующая деформация образца затем отображается в зависимости от глубины вдавливания консольного наконечника и силы, приложенной к образцу8.

Остеоартроз (ОА) – это длительное дегенеративное хроническое заболевание, характеризующееся ухудшением состояния суставного хряща в суставах и окружающих тканей, что может привести к полному обнажению костных поверхностей. Бремя ОД является существенным; В настоящее время половина всех женщин и одна треть всех мужчин в возрасте 65 лет и старше страдают от ОА9. Травмы, ожирение и, как следствие, изменение биомеханики сустава10 определяют дегенерацию суставного хряща, которая рассматривается как общий конечный результат. Новаторское исследование Ganz et al. постулировало, что ранние стадии процесса ОА могут быть связаны с биомеханическими свойствами хряща11, и с тех пор исследователи подтвердили эту гипотезу12. Кроме того, принято считать, что биомеханические свойства ткани функционально управляются ультраструктурной организацией, а также перекрестными помехами между клетками и клетками-матриксами. Любые изменения могут существенно повлиять на общее биомеханическое функционирование тканей13. На сегодняшний день диагноз ОА носит клинический характер и основывается на рентгенографии на обычной пленке14. Этот подход является двусторонним: во-первых, отсутствие определенного дегенеративного порога отсечения для постановки диагноза ОА затрудняет количественную оценку этого состояния, и, во-вторых, методы визуализации не обладают достаточной чувствительностью и стандартизацией и не могут обнаружить локализованное повреждение хряща15,16,17. С этой целью оценка механических свойств хряща имеет решающее преимущество в том, что она описывает параметр, который изменяется в течение ОА независимо от этиологии заболевания и оказывает непосредственное влияние на функциональность тканей на самой ранней стадии. Инструменты для индентирования измеряют силу, с которой ткань сопротивляется вдавливанию. Это, на самом деле, не новая концепция; Самые ранние исследования датируются 1980-ми и 1990-ми годами. В этот период многочисленные исследования показали, что инструменты для индентирования, предназначенные для артроскопических измерений суставного хряща, могут быть хорошо приспособлены для обнаружения дегенеративных изменений в хряще. Еще 30 лет назад некоторые исследования смогли продемонстрировать, что инструменты для индентирования способны обнаруживать in vivo изменения поверхности хряща при дегенерации тканей путем проведения измерений компрессионной жесткости во время артроскопии18,19,20.

АСМ индентирование (АСМ-ИТ) суставного хряща дает информацию об основных механических свойствах ткани, а именно о жесткости. Это механический параметр, описывающий связь между приложенной неразрушающей нагрузкой и результирующей деформацией вдавленной областиткани 21. Было показано, что AFM-IT способна количественно оценивать возрастные изменения жесткости в макроскопически непораженных коллагеновых сетях, таким образом, дифференцировать патологические изменения, связанные с началом ОА (степень 0 по шкале Outerbridge в суставном хряще)22. Ранее мы показали, что АСМ-ИТ на основе пространственной организации хондроцитов в качестве биомаркера ранней дегенерации хряща на основе изображений позволяют не только количественно оценить, но и фактически точно определить самые ранние дегенеративные механические изменения. Эти выводы уже подтверждены другими23,24. Таким образом, AFM-IT выступает в качестве интересного инструмента для диагностики и выявления ранних дегенеративных изменений. Эти изменения уже могут быть измерены на клеточном уровне, что меняет понимание патофизиологического процесса ОА.

В этом протоколе мы демонстрируем полную процедуру гистологической и биомеханической классификации эксплантов суставного хряща, начиная с подготовки экплантов из нативного хряща и заканчивая сбором и обработкой данных АСМ. С помощью пошагового подхода мы показываем, как генерировать, классифицировать и визуально классифицировать суставную хрящевую ткань в соответствии с различными стадиями дегенерации с помощью 2D-визуализации большой мозаики с последующей микро-АСМ индентацией.

Несмотря на то, что в настоящее время АСМ-ИТ является одним из наиболее чувствительных инструментов для измерения биомеханических изменений в хряще7, как и любой другой инструментальный метод, он имеет ограничения и практические особенности25, которые могут привести к ошибочному получению данных. С этой целью мы тщательно рассмотрим наиболее распространенные проблемы, возникающие при АСМ измерениях хрящевых эксплантов, и опишем, где это возможно, способы их минимизации или преодоления. К ним относятся топографические аспекты образцов и трудности их стабилизации в АСМ-совместимой среде, физические особенности поверхности ткани и, как следствие, трудности при проведении АСМ измерений на таких поверхностях. Также приведены примеры ошибочных кривых зависимости силы от расстояния с акцентом на условия, которые могут их вызвать. Также обсуждаются дополнительные ограничения, присущие геометрии консольного наконечника и использованию модели Герца для анализа данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использовались мыщелки бедренной кости, собранные у пациентов, перенесших тотальное эндопротезирование коленного сустава в университетской клинике Тюбингена, Германия. В исследование были включены только образцы суставного хряща пациентов с дегенеративными и посттравматическими патологиями суставов. До начала исследования было получено одобрение ведомственного, институционального, а также местного этического комитета (Проект No 674/2016BO2). Перед участием было получено письменное информированное согласие от всех пациентов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема этапов эксперимента в хронологическом порядке приведена на рисунке 1.

1. Обработка тканей и формирование хрящевых дисков

  1. Подготовка тканей
    1. После послеоперационной резекции поместите образцы хряща в контейнер, наполненный модифицированной средой Игла (DMEM) компании Dulbecco с добавлением 5% (v/v) пенициллина-стрептомицина. Убедитесь, что образцы полностью погружены в среду. Продолжительность между хирургической резекцией и дальнейшей обработкой хряща не должна превышать 24 ч. Убедитесь, что на протяжении всей обработки образцы полностью погружены в среду, чтобы избежать высыхания образца.
    2. Отрежьте хрящ от кости с помощью скальпеля.
  2. Генерация хрящевых дисков
    1. Создайте хрящевые диски диаметром 4 мм с помощью биопсийного пуансона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выделить и резектировать участки мыщелка, где толщина хрящевого слоя превышает 1 мм. Это может быть проблематично, особенно в зонах нагрузки, где хрящевой слой обычно теряет свою толщину из-за процессов износа или дегенерации.
    2. Поместите ранее сгенерированные хрящевые диски диаметром 4 мм на изготовленное по индивидуальному заказу режущее устройство, а затем закрепите и удерживайте хрящевые диски в стабильном положении с помощью шпателя. При размещении хрящевых дисков на режущем устройстве необходимо соблюдать осторожность. Расположите образцы так, чтобы самый верхний слой хряща (поверхностная зона суставного хряща) не был обращен к лезвию
    3. Разрежьте хрящевые диски лезвием бритвы. Таким образом, образуются образцы хряща в форме диска размером 4 мм x 1 мм. Чтобы предотвратить высыхание образца, выполняйте резку ткани как можно быстрее.
    4. Соберите каждый диск с помощью шпателя и поместите сформированные хрящевые диски в пробирки по 1,5 мл, содержащие 1 мл ДМЕМ с добавлением 5% (v/v) пенициллина-стрептомицина. Поместите примерно 15 дисков в одну пробирку.
  3. Криотомного секционирования хрящевых дисков (для перпендикулярных срезов)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным, и его можно использовать, если требуется визуализация распределения клеточного рисунка в хрящевых дисках сбоку. Он может быть использован в качестве метода верификации, так как распределение клеточного рисунка является 3D-особенностью суставного хряща26. Также можно использовать оптическое сечение и 3D-реконструкцию всего хрящевого диска с помощью конфокального микроскопа, устраняя, таким образом, необходимость секционирования образцов, как описано в протоколе.
    1. Накройте хрящевой диск водорастворимой средой для заделки и поместите его на его край на ручку криотома (поверхность диска перпендикулярна поверхности ручки). В криотомном устройстве закладная среда замерзает при низких температурах.
    2. Используя стандартный криотом, разрезают ткань сбоку на толщину 60 мкм до середины диска (т.е. когда криосекции достигают длины 4 мм) и собирают срезы. При перпендикулярном рассечении эксплантата диска можно визуализировать все зоны хряща (поверхностные, средние и глубокие).
    3. Соберите срезы на предметном стекле и удалите водорастворимую среду для заделки, трижды промыв фосфатно-солевым буфером (PBS).

2. Сортировка хрящевых дисков в зависимости от пространственной структуры клеток

  1. Окрашивание образцов хряща в форме диска
    1. Поместите по одному хрящевой диску (раздел 1.2) в каждую лунку 96-луночной пластины и добавьте 130 мкл проницаемого для клеток флуоресцентного красителя в разведении 1:1000 в каждую лунку.
    2. Визуально осмотрите всю пластину и убедитесь, что в каждую лунку помещен только один диск. Инкубируйте планшет в течение 30 мин в стандартном инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C.
  2. Окрашивание хрящевых срезов размером 60 мкм
    1. Аккуратно поместите срезы хрящевого диска (раздел 1.3) на предметные стекла микроскопа с помощью щипцов.
    2. Покройте хрящевые участки монтажной средой, содержащей ядерное противоокрашивание DAPI, и аккуратно поместите покровные стекла, подходящие для флуоресцентной микроскопии.
    3. Запечатайте края каждого покровного стекла обычным прозрачным лаком для ногтей и дайте высохнуть в течение 3 минут.
  3. Сортировка и визуализация хряща сверху вниз и сбоку
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый диск должен быть исследован под флуоресцентным микроскопом. Целью этого шага является сортировка дисков на основе их преобладающего клеточного рисунка (одинарные струны, двойные струны, маленькие кластеры, большие кластеры или диффузные).
    1. Поместите 96-луночный планшет на держатель планшета флуоресцентного микроскопа.
    2. Выберите подходящий флуоресцентный фильтр Em 495 нм/Ex 515 нм (для нисходящей визуализации хрящевых дисков, подготовленных в разделе 2.1.) или Em 358 нм/Ex 461 нм (для изображения сбоку хрящевых участков, подготовленных в разделе 2.2) и 10-кратный объектив.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование объектива 10x позволяет исследовать всю окружность диска, а образцы с неоднородным или неправильным окрашиванием могут быть исключены. Тем не менее, использование только нисходящего вида может привести к восприятию изменений в клеточной организации в результате анализа более глубоких слоев тканей, видимых для наблюдения сверху вниз при поверхностной эрозии. Например, восходящая струна, следующая за коллагеновыми аркадами, может восприниматься как одна клетка или рассеянные клетки (диффузный паттерн)26. В результате, обе стороны дисков должны быть осмотрены, чтобы обеспечить правильный выбор клеточного рисунка.
    3. Определите визуально клеточный рисунок, отображаемый в каждом хрящевом диске. Маловероятно, что диск будет иметь только один тип клеточного рисунка. Для той части диска, где расположение хондроцитов не соответствует интересующему образцу, образцы принимают только в том случае, если нежелательный рисунок находится на самой периферии, где не проводятся измерения АСМ (т.е. на расстоянии до 0,5 мм от границы диска), и следите, чтобы он не превышал 10% от общей поверхности диска27, 28. См.
  4. Получение изображений всего хрящевого диска
    1. Выберите 10-кратный объектив микроскопа и поместите его под предварительно выбранную лунку, содержащую отдельный хрящевой диск. Сосредоточьтесь на диске, чтобы увидеть клеточный рисунок.
    2. Выберите функцию навигатора, чтобы получить обзор всей скважины. Используйте левую кнопку мыши и перетащите, чтобы перейти в другую рабочую область. С помощью колесика мыши увеличивайте и уменьшайте масштаб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе предварительный просмотр лунки со всем образцом можно увидеть, последовательно дважды щелкнув по каждой интересующей области.
    3. Выберите квадрат, охватывающий область интереса для сканирования; В этот момент все отдельные плитки, составляющие мозаику, станут видимыми.
    4. Отрегулируйте экспозицию/интенсивность света так, чтобы ячейки можно было четко визуализировать с фона. На этом этапе яркость/контрастность изображения была отрегулирована для всех плиток и больше не может быть настроена индивидуально для каждой плитки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку клетки у края диска часто излучают более высокий флуоресцентный сигнал, чем клетки в центре, необходимо адаптировать настройки экспозиции/интенсивности света.
      1. Чтобы оценить, подходит ли время экспозиции для конкретного канала, изучите распределение сигнала на гистограмме. Используя механизм автоматической экспозиции, входящий в программное обеспечение микроскопа, визуализируйте все клетки, находящиеся внутри диска.
    5. Выберите параметр программного обеспечения Focus Map Point, а затем выберите каждую отдельную плитку, щелкнув левой кнопкой мыши в ее центре.
    6. Выберите опцию Карта фокусировки. Отобразится окно со всеми ранее выбранными плитками. Дважды щелкните плитку в списке, чтобы отобразить ее и поместить в нужный фокус.
    7. Нажмите кнопку Set Z, чтобы сохранить фокальный план, и перейдите к следующей плитке. Настроив фокальный план для каждой отдельной плитки, начните получение изображения, нажав кнопку Начать сканирование.
      1. Если скан отображает более темные горизонтальные и/или вертикальные полосы, это может быть связано с неправильным и неравномерным освещением отдельных кадров. Устраните эту проблему с помощью параметра Связанное затенение , встроенного в программное обеспечение перед фактическим сканированием.
    8. Сохраняйте, экспортируйте и корректно комментируйте изображения.

3. Биомеханический подход к эксплантам хряща

  1. Подготовка образцов для АСМ измерений
    1. Зафиксируйте каждый предварительно выбранный хрящевой диск, содержащий ячеистый рисунок (раздел 2), в чашках Петри с помощью биосовместимого клея. Добавьте достаточное количество образца клея на верхнюю, нижнюю, левую и правую стороны диска.
    2. Залейте диски 2,5 мл среды L-15 Лейбовица без L-глютамина. Осторожно добавьте среду Лейбовица на образцы, чтобы избежать отрыва образца от поверхности из-за волн, создаваемых средой.
  2. Загрузка образцов в АСМ
    1. Поместите чашку Петри в держатель образца прибора АСМ и включите нагреватель чашки Петри на 37 °C. Дайте чашке для культуры тканей нагреться до желаемой температуры. Это сделано для исключения возможных артефактов, вызванных колебаниями температуры.
  3. Калибровка кантилевера АСМ
    1. Инициализируйте установку программного обеспечения, как описано ранее Danalache et al.29.
    2. Выберите подходящий консольный держатель стеклянного блока для измерения жидкости и аккуратно поместите его на головку АСМ. Механизм блокировки фиксирует стеклоблок в головке AFM. Убедитесь, что отражающая поверхность стеклоблока прямая и параллельна держателю AFM.
    3. Осторожно поместите консоль на поверхность держателя консоли из стеклянного блока. Сам кантилевер должен опираться на полированную оптическую плоскость, в центре стеклоблока.
    4. Осторожно поместите силиконовую юбку (силиконовую мембрану) на основание консольного держателя, чтобы предотвратить образование конденсата в головке AFM.
    5. Опустите консоль с шагом 100 мкм с помощью функции шагового двигателя до полного погружения в среду.
    6. Используйте сканер с параметрами приближения, описанными Danalache et al.29. Втяните кантилевер на 100 мкм, как только вы достигнете дна чашки Петри.
    7. Откалибруйте консоль, выполнив точные действия, и выполните параметры, описанные Danalache et al.29. В конце калибровки вертикальное отклонение сохраняется и отображается в ньютонах (Н) единицах силы, а не в вольтах (В) - единицах измерения исходной регистрации фотодиодным детектором. В приведенных здесь экспериментах после калибровки было получено заданное значение 4,47 нН.
    8. Используя функцию шагового двигателя, втяните консоль на 1 000 мкм.
  4. Определение желаемого места измерения хряща с помощью АСМ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за толщины хрящевых дисков толщиной 1 мм консоль не видна в поле зрения при навигации по образцу.
    1. Используйте ПЗС-камеру микроскопа для идентификации консоли. Кантилевер АСМ должен располагаться в свободной от образцов области чашки Петри.
    2. Начните сканирование с кантилевера на чистом, свободном от образцов участке чашки Петри, используя те же параметры, что и Danalache et al.29.
    3. Далее отодвиньте консоль на 1,5 мм от нижней части пластины с помощью шагового двигателя. Этот шаг имеет решающее значение для того, чтобы избежать прямого столкновения между кантилевером и образцом.
    4. Переключитесь с яркого поля на флуоресцентный вид и визуально определите верхнюю часть диска.
    5. Сдвиньте держатель образца АСМ ровно на 2 мм к середине диска. Эта точка считается центром хрящевого диска.
    6. Запустите сканер и, как только поверхность хрящевого диска будет достигнута, втяните кантилевер на 100 мкм.
  5. Измерения кривой «сила-расстояние»
    1. Сосредоточьтесь на ячейках, расположенных в нужном месте измерения. Нажмите кнопку Run (Выполнить), чтобы начать измерения и построение кривых зависимости силы от расстояния в заданном положении.
    2. Получите пять кривых «сила-расстояние» на каждом участке измерения. Отодвиньте кантилевер на 500 мкм и переместите кантилевер к следующей точке измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ретракция кантилевера является важным шагом, так как поверхность хрящевого диска неоднородна и имеет неровности. Высокий бугорок на поверхности образца может привести к резкому столкновению, что приведет к нежелательному повреждению кончика кантилевера/образца. Мы рекомендуем выбрать не менее пяти различных точек измерения, разбросанных по поверхности диска, и получить не менее пяти кривых зависимости силы от расстояния в каждом месте.
    3. Проверьте кривые зависимости силы от расстояния и сохраните их.
  6. Оценка модулей Юнга с помощью модели аппроксимации Герца
    1. Откройте сгенерированные кривые зависимости силы от расстояния для анализа (файл .jpk) в программном обеспечении для анализа данных с помощью опции Open a Batch of Spectroscopy Curves .
    2. Выберите модель подгонки по Герцу, а затем выберите параметр Эластичная подгонка.
      1. Опция «Подгонка упругости» автоматически выполняет следующие вычисления для выбранной кривой «сила-расстояние»: вычисляет базовую линию и вычитает из нее всю кривую, чтобы удалить смещение базовой линии (базовая линия возвращается к нулю по оси Y); определяет точку контакта, определяя точку, в которой кривая «сила-расстояние» пересекает нулевую силовую линию (точка контакта устанавливается равной нулю по оси X); рассчитывает разделение зонда и образца (вычитается сигнал высоты пьезоприемника, учитывающий изгиб кантилевера); и автоматически подгоняет кривую сила-расстояние к выбранной модели. При желании каждый из этих этапов также можно выполнить самостоятельно.
    3. Адаптируйте, используя следующие параметры посадки: коэффициент Пуассона 0,5 и соответствующий радиус консольного наконечника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании консоли со сферическим консольным наконечником следует использовать модель Hertz fit. Консоль, использованная в этом исследовании, имела сферический наконечник радиусом 5 мкм. Мы рекомендуем подгонять кривую «сила-расстояние» до тех пор, пока не будет достигнуто максимальное приложенное усилие (заданное значение).
    4. Визуально проверьте подгонку кривой «сила-расстояние», чтобы убедиться в правильности. Этот шаг должен быть выполнен для каждой из анализируемых кривых сила-расстояние.
  7. Определение глубины вдавливания
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемого инструмента анализа данных этот процесс может отличаться. Экспериментатор может легко прочитать глубину отступа, выполнив ряд шагов, которые включены в программу анализа данных.
    1. Откройте каждую из сгенерированных кривых «сила-расстояние» в программном обеспечении для анализа данных и выберите модель соответствия Герца в качестве процесса анализа.
    2. Примените параметр « Смещение базовой линии » для обнуления оси вертикального отклонения (оси Y) и выберите функцию «Смещение + наклон ».
    3. Используйте функцию Find Contact Point (Найти точку контакта) для автоматического определения точки контакта, которая автоматически приводится к x-координате, равной нулю.
    4. Вычтите расстояние, учитывающее исключительно отклонение кантилевера, из исходной высоты пьезокопа во время вдавливания с помощью функции Vertical Tip Position .
    5. Выберите параметр «Эластичная подгонка », чтобы отобразить обработанную кривую зависимости силы от расстояния, и выберите область графика таким образом, чтобы она совпадала с наименьшим отрицательным значением на оси вертикального положения зонда (ось x).
    6. Прочтите и задокументируйте отступ из поля X Min на вкладке параметров. Сохраните и задокументируйте результаты.

4. Статистический анализ

  1. Откройте статистическую программу. Выберите Новый набор данных в раскрывающемся меню.
  2. Откройте вкладку Variable View после выбора файла DataSet . Определите числовые переменные для каждой категории клеточных паттернов: одиночные строки = SS, двойные строки = DS, малые кластеры = SC, большие кластеры = BC, диффузные и модули Юнга.
  3. На вкладке представления данных введите измеренные данные модулей Юнга для каждой из соответствующих категорий клеточных шаблонов. Проанализируйте распределение данных, выбрав Анализ в строке меню, а затем Исследовательский анализ данных.
  4. Выберите Модули Юнга в качестве зависимой переменной и Клеточный паттерн в качестве списка факторов. Ящичковая диаграмма, используемая для раздела результатов, отображается среди результатов в выходном файле.
  5. Чтобы выполнить статистический анализ, выберите «Зависимые выборки » в разделе «Непараметрический тест» на вкладке «Анализ» в строке меню. Выберите модули Юнга в качестве тестовых полей и клеточный паттерн в качестве групп на вкладке полей. Нажмите кнопку Выполнить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты отображаются в выходном файле. Для статистического анализа проводится критерий Фридмана.
  6. Включите p-значения непараметрического теста в ящичковую диаграмму, созданную на шаге 4.4. Сохраните результаты, щелкнув Файл в строке меню и выбрав Сохранить.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя самодельное режущее устройство, мы смогли эксплантировать и получить небольшие (4 мм х 1 мм) хрящевые диски из свежих мыщелков человека, содержащих единый ячеистый пространственный паттерн30 одиночных нитей (SS, рис. 2A), двойных нитей (DS), малых кластеров (SC), больших кластеров (BC; рис. 2А) и диффузные (рис. 2Б). Типичный эксплант хряща изображен на рисунке 3А. Выбор дисков, демонстрирующих только один тип рисунка, был выполнен с помощью нисходящей флуоресцентной визуализации (рис. 2). Топографическая изменчивость диска хрящевой поверхности была дополнительно проиллюстрирована визуализацией сбоку срезов толщиной 60 мкм, полученных из хрящевых дисков (рис. 2C). На поверхности эксплантированных остеоартритных хрящевых дисков наблюдалась поверхностная фибрилляция и расщепление матрикса (рис. 3Б,В). Это было особенно заметно в дисках, характерных для прогрессирующей прогрессии ОА, представленной присутствием РМЖ (рис. 2А). После постфлуоресцентной сортировки жесткость дисков оценивали с помощью микровдавливаний АСМ. С этой целью сгенерированные хрящевые диски были успешно зафиксированы в чашке Петри АСМ с помощью биосовместимого клея (рис. 3D), чтобы избежать смещения образца во время измерений (рис. 3E). Количество используемого клея должно быть скорректировано. Недостаточное количество клея приведет к нестабильности диска, в то время как добавление слишком большого количества клея может привести к нежелательному растеканию клея под и/или над хрящевым диском. Последнее приводит к артефактам измерений и плохой идентификации диска под флуоресцентным микроскопом. Неправильное нанесение клея или резкие движения образца во время фиксации являются частыми проблемами, которые приводят к отделению ткани от чашки Петри, и их следует избегать.

На рисунке 4А показано репрезентативное постепенное снижение жесткости вдоль расположения ячеистых структур. Значения жесткости были выше в дисках, содержащих SS (медиана 2,6 кПа), что является репрезентативным для бескомпромиссных участков здорового хряща. При возникновении и прогрессировании ОА измерения АСМ показали сильное ступенчатое снижение жесткости на 42% при ДС (1,5 кПа), 77% при СК (0,6 кПа) и, в конечном счете, на 88% в поздних стадиях, представленных БК (0,3 кПа; Рисунок 4А). Диски, содержащие диффузный рисунок, демонстрировали повышенную упругость с существенным изменением единичных значений модуля Юнга. Было обнаружено, что для всех хрящевых дисков с преобладающей организацией клеточного рисунка глубина вдавливания, связанная с используемой заданной точкой (4,477 нН), обратно пропорциональна жесткости (рис. 4B). На рисунке 4C показана репрезентативная кривая зависимости силы от расстояния, а на рисунке 4D показана аппроксимация в герцах, а также идентификация точки контакта.

Правильная посадка зависит, среди прочего, от правильного определения исходного уровня. Если автоматическое определение базовой линии ошибочно (например, из-за турбулентной базовой линии), подгонка также может быть определена вручную, что позволяет пользователю выбрать более репрезентативную базовую линию для измерений. Однако, если сгенерированная кривая сила-расстояние не позволяет выполнить надлежащую посадку, ее следует отбросить. На рисунке 5 показаны примеры некорректных кривых зависимости силы от расстояния. Создание подходящих кривых «сила-расстояние» на эксплантатах суставного хряща при остеоартрите может быть затруднено, с одной стороны, из-за неровной поверхности ткани (примеры показаны на рисунке 5A, B) и нестабильности образца, вызванной неправильной фиксацией образца (примеры показаны на рисунке 5C, D). Артефакты могут быть вызваны множественными точками контакта зонда с образцом (из-за неровной поверхности дегенеративного хряща) или нежелательным движением тканей (видимым через изменения в фокальной плоскости). Эти артефакты можно увидеть на сгенерированных кривых зависимости силы от расстояния и свидетельствуют либо о неоптимальном контакте кантилевера АСМ с поверхностью хряща, либо о неправильной фиксации образца в чашке Петри (см. рис. 5A-D).

Figure 1
Рисунок 1: Блок-схема экспериментальной процедуры. Краткое изложение этапов эксперимента в хронологическом порядке, начиная от интраоперационно резецированных образцов хряща и заканчивая получением хрящевых дисков размером 4 мм х 1 мм, флуоресцентным окрашиванием и сортировкой дисков на основе организации клеточного рисунка с помощью визуализации сверху вниз и сбоку, и, наконец, оценкой эластичности с помощью атомно-силовых измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Флуоресцентная визуализация репрезентативных хрящевых дисков. (A) Мозаичные 2D-изображения и увеличенное поле хрящевых дисков, окрашенных красителем, проницаемым для клеточной мембраны, при 100-кратном увеличении. На верхнем диске изображен репрезентативный однострунный диск, а на нижнем - большой кластерный диск (внизу). (B) Мозаичное изображение диска с диффузным рисунком, видимого с поверхности (вверху), и того же диска, изображенного с нижней стороны (внизу). (C) Вид сбоку на ядерное окрашивание 60 мкм срезов хрящевых дисков. Белая масштабная линейка представляет собой 500 мкм для мозаичных изображений (большее поле зрения, A [левая панель], B, C) и 100 мкм для увеличенных сфокусированных изображений (A [правая панель]). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Эксплантированные суставные хрящевые диски. (A) Репрезентативное изображение сгенерированного эксплантата хрящевого диска размером 4 мм x 1 мм из свежего суставного хряща человека. Масштабная линейка, изображенная белым цветом, обозначает 2 мм. (B) Репрезентативное изображение нативного остеоартритного хряща, на поверхности которого макроскопически видна поверхностная фибрилляция и расщепление. Масштабная линейка, изображенная белым цветом, представляет собой 1 000 мм. (C) Схематическое изображение фибрилляционной поверхности хряща. (D) Перед измерениями АСМ каждый из эксплантов хрящевого диска был надлежащим образом закреплен с помощью биосовместимого клея для образцов на поверхности чашки Петри АСМ, чтобы избежать артефактов из-за дрейфа образца во время фактических измерений вдавливания, как показано на рисунке (E). Белая масштабная линейка соответствует 4 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты измерений суставных хрящевых дисков с помощью атомно-силовой микроскопии, отсортированные на основе их преобладающей клеточной структуры . (A) Ящичковая диаграмма, показывающая медиану вычисленных модулей Юнга, состоящих из пяти дисков, по одному для каждого клеточного паттерна, происходящего от одного пациента. Всего было выполнено 25 измерений на каждом диске (пять измерений для пяти различных точек измерения). Черная линия внутри прямоугольника представляет медианное значение, нижние и верхние края прямоугольника представляют первый и третий квартили соответственно, а столбцы ошибок представляют наименьшее и самое высокое значения для каждой группы. (B) Точечная диаграмма, показывающая 125 точек глубины вдавливания для каждого ячеистого узора. (C) Примерные кривые зависимости силы от расстояния, полученные с помощью АСМ с вычисленным модулем Юнга, равным 0,4 кПа. (D) Репрезентативная аппроксимация в герцах и определение точки контакта для кривой «сила-расстояние», показанной на рисунке (C). Ось X отображает вертикальное положение наконечника (которое представляет собой расстояние, пройденное пьезо, при этом длина, учитывающая изгиб кантилевера, автоматически вычитается из контактной части кривой сила-расстояние). *p < 0,05. Для статистического анализа использовался критерий Фридмана. Аббревиатуры: SS = одиночные строки; DS = двойные строки; SC = небольшие кластеры; BC = большие скопления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Примеры ошибочных кривых зависимости силы от расстояния. (A) Кривая зависимости силы от расстояния показывает значительное отклонение, за которым следует восстановление вблизи базового уровня, прежде чем будет наблюдаться непрерывное вдавливание поверхности. Это явление может быть связано с относительно большим препятствием (например, большими поверхностными расщелинами, выступающими из самого верхнего слоя хряща). (B) Расширенная кривая зависимости силы от расстояния показывает множество небольших пиков. Считается, что эти кривые вызваны микромасштабными неровностями на поверхности хряща (например, фибрилляцией). И (C), и (D) отображают кривые зависимости силы от расстояния с двухфазными курсами. Обе кривые зависимости силы от расстояния характеризуют плохую фиксацию образца и дрейф образца. Также довольно часто в этих случаях наблюдается внезапное изменение фокальной плоскости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Являясь прогрессирующим и многофакторным заболеванием, ОА вызывает структурные и функциональные изменения в суставном хряще. На протяжении всего течения ОА нарушения механических свойств сопровождаются структурными и биохимическими изменениями на поверхности суставного хряща27,31. Самыми ранними патологическими явлениями, возникающими при ОА, являются истощение протеогликанов в сочетании с нарушением коллагеновой сети32,33,34. Такие ранние тонкие изменения поверхности трудно точно определить и идентифицировать с помощью объемного тестирования, потому что механическое поведение усредняется по всей глубине ткани. Кроме того, до сих пор остается нерешенным вопрос о том, связаны ли функциональные изменения на уровне органов и тканей со структурными и функциональными изменениями на микро- или наноуровне. В связи с этим АСМ считается одним из наиболее чувствительных методов, способных выявлять самые ранние биомеханические изменения, происходящие с началом ОА7. Он позволяет измерять жесткость как в микро-, так и в нанометровом масштабе в нативных образцах, предоставляя информацию о механических свойствах суставного хряща35,36. В этом протоколе с помощью микро-АСМ индентирований мы измеряли эластические свойства здоровых и остеоартритных суставных хрящей эксплантатов человека. Результаты показали, что хрящевые эксплантаты очень репрезентативны для ранних локальных событий ОА с заметным постепенным снижением жесткости, происходящим в хрящевых эксплантах, специфичных для рисунка. Кроме того, результаты согласуются с предыдущими опубликованными исследованиями, которые показали заметное снижение жесткости наряду с организацией клеточного паттерна23,24,27,37.

В настоящее время для устранения недостатков трансляционных исследований и проблем переноса данных in vitro в клинические условия необходимы подтвержденные нативные модели человека, которые имитируют различные аспекты патогенеза и прогрессирования ОА. На сегодняшний день ни одна модель не может точно представить сложный хрящевой компартмент человека, не говоря уже о возрастных суставных тканях, которые склонны к ОА в ответ на раздражители, инициирующиезаболевание. Наиболее часто используемые до сих пор модели на основе эксплантов были бычьего или крупного рогатого скота и применяли либо лечение сильными воспалительными цитокинами, либо механическую нагрузку 39,40,41. Этот протокол, с другой стороны, демонстрирует, как получить небольшие (4 мм x 1 мм) эксплантированные образцы хряща человека в форме диска, которые указывают на отдельные стадии конкретных событий ОА. Хрящевые экспланты сортируют и назначают стадию с использованием пространственной организации клеток в качестве биомаркера на основе изображений30,42. Поскольку ранние изменения биомеханических свойств могут быть идентифицированы и количественно оценены, как только начинают возникать двойные нити23,27, на стадии, когда поверхность хряща все еще выглядит макроскопически неповрежденной26, эта модель на основе эксплантата позволяет исследовать локальный нативный хрящевой компартмент и может предоставить проницательную информацию о раннем ОА. Кроме того, эта модель хряща может быть полезна для исследования реакции клеток и матрикса на механические и воспалительные изменения в 3D-естественной локальной среде обитания38,39. Будучи относительно простыми и легкими в получении, эти хрящевые эксплантаты также могут быть использованы для изучения гетерогенности ОА, которая является ограничивающим фактором при разработке и тестировании препаратов, модифицирующих заболеваниеОА 43. Следует также отметить, что масштабируемость и зависимость от пациентов, перенесших операцию по замене сустава, являются двумя недостатками модели.

Хорошо известно, что суставной хрящ проявляет своеобразное поведение в зависимости от исследуемого уровня чешуи. Как указали Loparic et al., на микроуровне хрящ ведет себя как неструктурированный и однородный материал35, и такой подход дает приблизительное представление о локализованной общей жесткости хряща. Что касается вопроса о том, что лучше подходит: микро- или наноиндентирование, то в исследовании 2004 года, проведенном Stolz et al.44, сравнивались микро- и наноразмерные вмятины при оценке структурно-механических свойств суставного хряща. Авторы подчеркнули, что при микромасштабном сферическом углублении суставного хряща наноразмерные тонкие структурные компоненты (т.е. отдельные коллагеновые волокна и протеогликаны) обычно разделяют задачу несущей нагрузки. При этом агрегатные механические свойства заметно отличаются от таковых у отдельных нанокомпонентов. Те же авторы предположили, что комбинация микро- и наноуглублений может быть использована для оценки общих локальных профилей жесткости суставного хряща, а также жесткости, связанной с тонкими структурными компонентами44.

В многочисленных экспериментах по индентированию на основе АСМ для оценки механики хряща использовались острые пирамидальные консоли (радиус = 15-20 нм)22,36,44. Хотя наноуглубления с острыми консолями в настоящее время считаются более подходящими для оценки тончайших механических свойств, сферические консольные наконечники дают результаты, которые более последовательны и легче моделируются и интерпретируются при испытании мягких биологических образцов44,45. Кроме того, Stolz et al. продемонстрировали, что АСМ нановмятины ферментативно (т.е. эластазы) деградированного суставного хряща невозможны, потому что ткань становится настолько липкой, что адгезия кончика к образцу доминирует на кривых силы-расстояния, что делает данные невыполнимыми.

В настоящих АСМ измерениях использовался кантилевер со сферическим консольным наконечником радиусом 5 мкм. Выбор кантилевера был мотивирован стремлением усреднить механические свойства ткани на достаточно большой поверхности при минимизации повреждений поверхности хряща. Зависимость между приложенной кантилевой силой и результирующим вдавливанием образца была подогнана с помощью модели аппроксимации Герца. При использовании сферических инденторов рекомендуется использовать модель соответствия по Герцу, при которой силами притяжения, действующими между консольным наконечником и поверхностью образца, пренебрегают46. Уравнения для модели Герца приведены в уравнениях 1 и 2.

Equation 1Уравнение 1

Equation 2Уравнение 2

Где F = сила; E = модуль Юнга; v = коэффициент Пуассона; δ = отступ; a = радиус контактной окружности; и Rs = радиус сферы.

В конечном итоге модель вычисляет эластичность клетки/ткани47, формально выраженную в виде модуля Юнга (E). Модель посадки Герца учитывает несколько характеристик, таких как форма и размер зонда, вмятина и деформируемость образца. Если эти требования не выполняются идеально, модель может дать неточную оценку модуля Юнга46.

Модель посадки Герца предполагает, что деформация и упругое напряжение линейно зависят от модуля упругости, из чего следует, что вмятина в образце остается намного меньше, чем толщина самого образца46. Это предположение было легко выполнено в этой схеме, где хрящевые экспланты имели толщину 1 мм по сравнению с углублениями в несколько микрометров.

Суставной хрящ может быть смоделирован как пористый вязкоупругий материал48,49. Вязкоупругое поведение является результатом трения между внутриклеточными/цитоплазматическими или матриксными компонентами, такими как молекулы, органеллы и коллаген-протеогликановая сеть50,51. Как следует из названия, вязкоупругие материалы сочетают в себе два различных свойства: вязкое - материал медленно деформируется при воздействии внешней нагрузки - и упругое - материал возвращается к своей первоначальной конфигурации после снятия приложенной нагрузки52,53. Вязкоупругое поведение проявляется в виде гистерезиса между кривыми приближения (расширения) и втягивания в кривых сила-расстояние46,52, аналогичных тем, которые получены в данном исследовании (рис. 4С). Кроме того, характерной чертой вязкоупругих материалов является то, что их механические свойства зависят от скорости деформации, при этом жесткость материала возрастает с увеличением скорости приложения нагрузки (скорости вдавливания)54. Таким образом, путем выбора различных скоростей нагружения генерируется семейство кривых сила-расстояние, каждая из которых представляет механические свойства испытуемого образца при каждой скорости нагружения52. Таким образом, при попытке сравнения результатов различных работ очень важно учитывать все параметры отступов. В целом, при измерении в микрометровом масштабе (как в этом исследовании со сферическим консольным наконечником 5 мкм) суставной хрящ ведет себя как неструктурированный и однородный материал, генерируя кумулятивный модуль упругости, который включает как упругий, так и вязкий вклад в жесткость из-за поровисто-упругой природы ткани35.

Другое предположение модели Герца состоит в том, что глубина вдавливания меньше, чем радиус сферического консольного наконечника55. Глубина вдавливания представляет собой максимальное смещение кончика кантилевера после первого контакта с образцом. При максимальной нагрузке максимальная глубина вдавливания равна общему смещению образца и консольного наконечника. В рекомендациях Бюкле указано, что максимальная глубина вдавливания составляет 10% от общей толщины образца с одинаковой структурой на протяжении56 лет, в противном случае результаты варьируются в зависимости от соотношения глубины к толщине. При радиусе кончика кантилевера 5 мкм хрящевые экспланты в этом исследовании были вдавлены в среднем на 1,1 мкм, с несколькими пиками в 3 мкм в некоторых случаях, особенно для сильно дегенеративных хрящевых эксплантов. В данном случае был найден компромисс, так как в экспериментальных условиях для нейтрализации поверхностных неровностей дегенеративного хряща требуются относительно высокие силы, связанные с большими углублениями. Более мягкое углубление привело бы к исследованию поверхностной фибрилляции и трещины коллагена, которые являются общими признаками сильно дегенеративного хряща57.

Решающее значение для модели соответствия Герца имеет также правильная идентификация точки, в которой консольный наконечник вступает в непосредственный контакт с образцом, обычно называемой точкой контакта. Однако это может оказаться проблематичным при вдавливании слишком липких или слишком мягких образцов, так как это может привести к образованию нескольких точек контакта зонда с образцом58,59. На самом деле, как прекрасно подчеркивают A-Hassan et al., для мягких биологических тканей точное определение точки контакта является одной из самых неприятныхпроблем. Этот эффект наблюдался также у эксплантов нативного остеоартритного хряща, так как в зависимости от стадии дегенерации поверхность ткани теряет свои естественные механические характеристики и часто бывает неровной, проявляя поверхностную фибрилляцию и расщепление (рис. 3Б, В). Это явление было особенно отмечено в хрящевых эксплантах, где преобладающим клеточным рисунком были большие скопления (рис. 2C). Эти неоднородности на поверхности хряща могут привести к появлению нескольких точек контакта зонда с образцом и, следовательно, к ошибочным результатам. В некоторых случаях наблюдались значительные прогибы, за которыми следовало быстрое восстановление исходной линии перед окончательным растяжением кривой «сила-расстояние» (рис. 5А). Это может быть связано с большим препятствием на пути кончика кантилевера (например, запущенные участки фибрилляции с изнашивающимся и расщепляющимся хрящом). В других случаях окончательный наклон кривой зависимости силы от расстояния был рассеян с более мелкими неровностями (рис. 5B), что указывает на контакт с последовательно уменьшающимися препятствиями (например, микрофибрилляцией ткани). В таких случаях место измерения должно быть повторно измерено или даже изменено, чтобы обеспечить надежность и воспроизводимость данных. С этой целью также важно внимательно осмотреть выход кривой «сила-расстояние» АСМ для правильной идентификации точки контакта. Это очень важный момент, о котором следует знать, так как было показано, что неправильная идентификация точки контакта по 50 нм приводит к неверной оценке значения E на порядок61. В ряде исследований начали использоваться автоматизированные подходы для определения точки контакта кривых «сила-расстояние» с целью обхода субъективного ввода данных пользователем при оценке точки контакта путем визуального осмотра и повышения точности. Это становится еще более важным, когда мы имеем дело с большим количеством кривых силы-перемещения, таких как те, которые генерируются в измерениях клеточной механики47,62. Несмотря на то, что было предложено несколько стратегий для автоматизации определения точки контакта 47,63,64,65, оптимальная стратегия в значительной степени зависит от экспериментальных условий и факторов, таких как модель, используемая для анализа данных, форма зонда, (не)адгезивное механическое взаимодействие между наконечником кантилевера и образцом, а также (не)герцово поведение образца 63.

Дрейф образца — еще одна распространенная проблема, которая может привести к появлению артефактов и ошибочному определению точки контакта (рис. 3E). По сути, это означает, что образец неправильно установлен в держателе образца (чашке Петри) и образец перемещается во время измерений АСМ. Этот эффект особенно выражен при перемещении кантилевера АСМ на новое место измерения. Этот аспект можно легко наблюдать во время реальных измерений по внезапному изменению фокальной плоскости. Результирующие кривые зависимости силы от расстояния обычно имеют двухфазный протяженный наклон с небольшим подъемом вначале, соответствующим сужению пустого пространства между дном диска и чашкой Петри по мере того, как диск толкается вниз консолью (см. рис. 3E), за которым следует более сильный наклон во втором участке склона. указывает на то, что диск имеет дальнейшее углубление теперь, когда он находится в непосредственном контакте со дном чашки Петри (рис. 5C, D). Чтобы преодолеть искажения, можно попытаться лучше зафиксировать образцы, используя соответствующий клей для образцов (рис. 3D), поддерживая постоянную температуру, отключая внешние источники тепла (свет), чтобы избежать теплового дрейфа, и проводя быстрые сканирующие измерения. В приведенных здесь экспериментах мы наблюдали дрейф прогиба кантилевера, который возникал в течение первых 15 минут погружения консоли в среду (из-за резких изменений температуры). После этого промежутка дрейф обычно незначителен. В результате, мы советуем экспериментатору внимательно изучить базовую линию после погружения в кантилевер и начать измерение, как только она стабилизируется. Продолжительность этого процесса может сильно варьироваться в зависимости от используемой кантилевера.

Другим важным параметром для любого измерения АСМ является заданное значение, которое, упрощенно говоря, является мерой силы, приложенной кантилевером к образцу. Для контактного режима (используемого в данном исследовании) уставка представляет собой определенный прогиб консоли. При выполнении нескольких сканирований или нескольких повторений на месте, как в данном протоколе, консольный наконечник может адсорбировать частицы с поверхности образца, что иногда приводит к необходимости снятия консоли, ее надлежащей очистки66, а затем повторной калибровки перед продолжением измерений.

Несмотря на то, что микровдавливания АСМ предоставляют новые и интересные возможности для сбора данных, в частности, в контексте остеоартритного хряща, согласованность и воспроизводимость полученных данных в значительной степени зависят от нескольких параметров, как указано выше. При использовании этого подхода для оценки механических изменений, вызванных дегенерацией хрящевой ткани, необходимо сначала выполнить некоторые пилотные измерения на различных пространственных паттернах, чтобы масштабировать результаты в соответствии с конкретным дизайном эксперимента. Пилотные измерения АСМ должны выполняться с использованием наиболее стандартизированной процедуры, при которой отбирается достаточное количество образцов (например, пять дисков) с одинаковой диаграммой направленности, чтобы обеспечить представление о степени изменчивости данных. Это особенно важно при попытке количественно оценить и оценить самые ранние соответствующие изменения жесткости OA (например, между одинарными и двойными струнами, рис. 4A). Фактически, в предыдущем исследовании, используя аналогичный подход, мы показали, что размер выборки в 30 человеческих образцов требовался для оценки биомеханических изменений в матриксе в зависимости от пространственной организации клеток37.

Кроме того, многие шаги, представленные в этом протоколе, подвержены человеческим ошибкам и в значительной степени зависят от опыта оператора. Учитывая все факторы, которые могут повлиять на фактические результаты АСМ, абсолютные значения E, представленные в этом исследовании, не поддаются обобщению и являются довольно специфичными для данной экспериментальной установки. Тем не менее, представленная здесь взаимосвязь между различными модулями Юнга и эксплантами хряща, основанными на клеточном паттерне (чем более патологический пространственный рисунок, тем ниже модуль упругости [EM] хряща), не затрагивается, поскольку полученные результаты согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими изменения жесткости в зависимости от организации клеточного паттерна23,37.

В целом, этот пошаговый протокол демонстрирует функциональность стандартизированных 3D-нативных эксплантов суставного хряща, которые не только являются репрезентативными для событий клеточной реорганизации, вызванных ОА, начиная от начала до прогрессирования, но также связаны с постепенным снижением жесткости. Экспланты могут отражать надежную биомиметическую модель для изучения возникновения и прогрессирования ОА, что позволяет тестировать и разрабатывать различные методы лечения ex vivo. Использование такой модели эксплантата человека в сочетании с биомеханической оценкой на основе АСМ может привести к смене парадигмы в биомедицинских исследованиях и фармацевтической промышленности, прокладывая путь к новым способам идентификации столь необходимых эффективных препаратов для лечения ОА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Благодарим хирургов-ортопедов отделения ортопедической хирургии Университетской клиники Тюбингена за предоставленные образцы тканей.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102 (2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955 (2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247 (2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116 (2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783 (2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409 (2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467 (2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001 (2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851 (2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Tags

Ретракция выпуск 188 эксплантаты суставного хряща атомно-силовая микроскопия модули упругости модель ex vivo индентирование модели Герца подготовка тканей
Решение практических вопросов микроиндентирования на основе атомно-силовой микроскопии на эксплантах суставного хряща человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, C., Alexander, D., Umrath,… More

Daniel, C., Alexander, D., Umrath, F., Danalache, M. Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (188), e64371, doi:10.3791/64371 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter