En optimalisert protokoll presenteres som muliggjør uttømming av cytoplasmatiske mikrotubuliorganiseringssentre i museoocytter under metafase I ved hjelp av en nær-infrarød femtosekundlaser.
Troskapen til oocytmeiose er kritisk for å generere utviklingskompetente euploide egg. Hos pattedyr gjennomgår oocytten en lang arrestasjon ved profase I av den første meiotiske divisjonen. Etter puberteten og ved meiotisk gjenopptakelse demonteres kjernemembranen (kjernefysisk konvoluttbrudd), og spindelen monteres hovedsakelig ved oocytsenteret. Initial sentral spindelposisjonering er viktig for å beskytte mot unormale kinetochore-mikrotubuli (MT) vedlegg og aneuploidi. Den sentralt plasserte spindelen migrerer på en tidsfølsom måte mot cortex, og dette er en nødvendig prosess for å ekstrudere en liten polarkropp. I mitotiske celler er spindelposisjonering avhengig av samspillet mellom sentrosommedierte astrale MT-er og cellebarken. Tvert imot mangler museoocytter klassiske sentrosomer og inneholder i stedet mange acentriolar MT-organiseringssentre (MTOC). På metafase I-stadiet har museoocytter to forskjellige sett med MTOC: (1) MTOC-er som er gruppert og sortert for å montere spindelpoler (polare MTOC), og (2) metafase cytoplasmatiske MTOCer (mcMTOCs) som forblir i cytoplasma og ikke bidrar direkte til spindeldannelse, men spiller en avgjørende rolle i regulering av spindelposisjonering og rettidig spindelmigrasjon. Her beskrives en multi-foton laserablasjonsmetode for selektivt å tømme endogent merkede mcMTOCer i oocytter samlet fra Cep192-eGfp reportermus. Denne metoden bidrar til forståelsen av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for spindelposisjonering og migrasjon i pattedyrs oocytter.
Haploide gameter (sæd og oocytt) produseres gjennom meiose, noe som innebærer en runde DNA-replikasjon etterfulgt av to påfølgende divisjoner som er nødvendige for kromosomnummerreduksjon før befruktning. Hos pattedyr, under tidlig fosterliv, gjennomgår oocytten en lang arrestasjon (til puberteten) på diplotenstadiet av profase I i den første meiotiske divisjonen, et stadium som kalles germinal vesikkel (GV) stadium. Etter meiotisk gjenopptakelse gjennomgår GV-oocytten kjernefysisk konvoluttbrudd (NEBD), og spindelen monteres hovedsakelig på oocytsenteret 1,2,3. Senere, drevet av F-aktin, migrerer spindelen i tide fra oocyttsenteret til cortex for å sikre svært asymmetrisk deling, noe som resulterer i et egg med en liten polarkropp (PB) 4,5,6.
I mitotiske celler består sentrosomene av et par sentrioler omgitt av peri-sentriolære materialkomponenter (PMC), som pericentrin, γ-tubulin, Cep152 og Cep1927. Disse sentriolholdige sentrosomene bidrar til troskapen til bipolar spindeldannelse8. Imidlertid går sentrioler tapt under tidlig oogenese hos forskjellige arter, inkludert gnagere9. Derfor vedtar museoocytter en sentrioleuavhengig spindelmonteringsvei ved hjelp av mange acentriolar mikrotubuli (MT) organisasjonssentre (MTOCs) 9,10. Ved meiotisk gjenopptakelse gjennomgår de perinukleære MTOC-ene tre forskjellige trinn med rekondensering, strekking og fragmentering i et stort antall mindre MTOC-er11,12. De fragmenterte MTOC-ene blir deretter gruppert og sortert for å organisere en bipolar spindel10,13,14. Et annet basseng av MTOC er lokalisert i cytoplasma under NEBD. Noen av disse cytoplasmatiske MTOCene migrerer og danner spindelpoler (polare MTOC, pMTOCs) 10,11. Nylig ble det oppdaget en annen undergruppe av cytoplasmatiske MTOC, kalt metafase cytoplasmatiske MTOC (mcMTOCs), som ikke bidrar til spindelpoledannelse, men forblir i oocytcytoplasma under metafase I (Met I) 15. Nedbryting av mcMTOC ved multifotonlaserablasjon eller unormalt økning av antallet ved autofagihemming forstyrrer spindelposisjonering og migrasjon og øker forekomsten av aneuploidi i metafase II-oocytter15.
Interessant nok skiller mcMTOC-er seg fra pMTOC-er i mange aspekter15. For eksempel, i motsetning til pMTOC, som hovedsakelig stammer fra perinukleære MTOC, stammer mcMTOC fra oocyt cortex. Når spindelen fortsatt er i oocyttsenteret, lokaliseres mcMTOCene asymmetrisk motsatt siden som spindelen migrerer til for PB-ekstrudering15. Astrallignende MT kan ikke nå cortex i den relativt store oocytcellen. Derfor nkler disse mcMTOC-ene for å forankre spindelen (via astrallignende MTOC) til cortex. Disse funnene antyder en modell der mcMTOC-nukleert MT-kraft motvirker F-aktinmediert kraft som driver spindelmigrasjon mot cortex. Balansen mellom disse to motstridende kreftene er avgjørende for å regulere den sentrale spindelposisjoneringen og rettidig spindelmigrasjon15.
Til dags dato lokaliserer alle de undersøkte PMC-proteinene (pericentrin, g-tubulin, Cep192 og Aurora kinase A) til begge MTOC-bassengene: mcMTTOCs og pMTOCs15. Derfor er det ingen kjemisk eller genetisk tilnærming for selektivt å forstyrre mcMTOC uten forstyrrende pMTOCs. Disse begrensningene kan omgås ved selektiv målretting av mcMTOC-ene med laserablasjon. Blant de laserbaserte teknologiene utviklet for mikroablasjon, viser pulserende multi-foton femtosekundlasere stort potensial på grunn av deres presisjonspåvirkning begrenset til fokalplanet, den høye penetrasjonsdybden til nær-infrarødt lys og redusert fototoksisitet og termisk skade på cellen16,17,18. Dette arbeidet beskriver en selektiv tilnærming til ablate mcMTOCs i museoocytter ved hjelp av en multi-foton laser koblet til et omvendt mikroskop.
Det finnes ulike metoder for å forstyrre cytoskjelettrelaterte strukturer i celler22,23,24,25. Det er imidlertid utfordrende å finne effektive teknikker for å selektivt forstyrre den målrettede strukturen uten å kompromittere cellens levedyktighet. Multi-foton laser ablasjon metoden presenteres her er en effektiv strategi for å indusere en selektiv mekanisk forstyrrelse til mcMTOCs innenfor oocyte uten å endre oocytt levedyktighet.
Laserablasjon har blitt mye brukt til å forstå de molekylære mekanismene som kontrollerer kromosomsegregering under mitose og meiose22,23,26,27. På grunn av den relativt store størrelsen (>80 mm i diameter) av pattedyrs oocytter sammenlignet med somatiske celler28, representerer ablasjonen av deres intracellulære strukturer en utfordring. Videre er gjennomsnittlig mcMTOC-volum i metafase I-oocytter ~ 20 μm15, noe som representerer en ekstra utfordring. En effektiv metode som gir dypere vevspenetrasjon må tas i bruk for å overvinne disse utfordringene. Den største fordelen med å bruke multifotonlaseren til ablasjon er dens evne til å nå dypere inn i cellen mens du minimerer off-target effekter29.
For å verifisere effekten og effektiviteten av laserablasjonsmetoden for å tømme den målrettede strukturen, anbefales det å bruke et fluorescerende merket protein for å identifisere den målrettede strukturen over tid (før og etter ablasjon)23. Det er viktig å legge merke til at laserablasjon tømmer hele mcMTOC som en struktur, og selv om mindre mcMTOC-er bare krever en enkelt lasereksponering for å bli utarmet, kan større mcMTOC-er kreve mer enn én lasereksponering på forskjellige fokalplan. Det anbefales også å fikse og immunmerke en delmengde av kontroll- og mcMTOC-ablated oocytter med en MTOC-markør (for eksempel γ-tubulin, pericentrin eller Cep192) for å bekrefte effektiviteten av mcMTOC-ablasjonen ytterligere. I kontrolloocytter vil områder av cytoplasma like ved siden av, men ikke overlappende med mcMTOC, bli utsatt for laseren.
Dette eksperimentet krever flere mcMTOC-ablasjoner mens du beveger deg mellom forskjellige fokalplan i oocyttene. Derfor anbefales det sterkt å øve på denne teknikken flere ganger før du utfører eksperimentet for å minimere eksperimenttiden, og dermed øke oocytens levedyktighet. Videre er det viktig å bruke den minste laserkraften som er tilstrekkelig til å tømme mcMTOC-ene uten å påvirke oocytens levedyktighet.
Denne teknikken har noen begrensninger. For det første er multi-foton konfokale mikroskoper relativt dyrere enn vanlige konfokale mikroskoper. For det andre er det mer tidkrevende å forstyrre alle mcMTOC-er på forskjellige fokalplan enn kjemiske eller genetiske forstyrrelser. For det tredje krever denne protokollen tekniske ferdigheter for å ablate alle mcMTOC-er på kortest mulig tid. Men når den er mestret, gir bruken av multifotonlaseren en utmerket strategi for å forstyrre flere intracellulære strukturer i museoocytter, inkludert mcMTOC, noe som bidrar til forståelsen av molekylære mekanismer som regulerer spindelposisjonering og dens rettidige migrasjon i pattedyrs oocytter.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke alle medlemmer av Balboula-laboratoriet for deres verdifulle hjelp og diskusjoner. Forfatterne takker Melina Schuh for vennlig deling av mCherry-Cep192-konstruksjonen. Denne studien ble støttet av R35GM142537 (NIGMS, NIH) til AZB.
4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
Medium Essential Medium Eagle – MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 – 1L | |
Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |