Summary
En optimalisert protokoll presenteres som muliggjør uttømming av cytoplasmatiske mikrotubuliorganiseringssentre i museoocytter under metafase I ved hjelp av en nær-infrarød femtosekundlaser.
Abstract
Troskapen til oocytmeiose er kritisk for å generere utviklingskompetente euploide egg. Hos pattedyr gjennomgår oocytten en lang arrestasjon ved profase I av den første meiotiske divisjonen. Etter puberteten og ved meiotisk gjenopptakelse demonteres kjernemembranen (kjernefysisk konvoluttbrudd), og spindelen monteres hovedsakelig ved oocytsenteret. Initial sentral spindelposisjonering er viktig for å beskytte mot unormale kinetochore-mikrotubuli (MT) vedlegg og aneuploidi. Den sentralt plasserte spindelen migrerer på en tidsfølsom måte mot cortex, og dette er en nødvendig prosess for å ekstrudere en liten polarkropp. I mitotiske celler er spindelposisjonering avhengig av samspillet mellom sentrosommedierte astrale MT-er og cellebarken. Tvert imot mangler museoocytter klassiske sentrosomer og inneholder i stedet mange acentriolar MT-organiseringssentre (MTOC). På metafase I-stadiet har museoocytter to forskjellige sett med MTOC: (1) MTOC-er som er gruppert og sortert for å montere spindelpoler (polare MTOC), og (2) metafase cytoplasmatiske MTOCer (mcMTOCs) som forblir i cytoplasma og ikke bidrar direkte til spindeldannelse, men spiller en avgjørende rolle i regulering av spindelposisjonering og rettidig spindelmigrasjon. Her beskrives en multi-foton laserablasjonsmetode for selektivt å tømme endogent merkede mcMTOCer i oocytter samlet fra Cep192-eGfp reportermus. Denne metoden bidrar til forståelsen av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for spindelposisjonering og migrasjon i pattedyrs oocytter.
Introduction
Haploide gameter (sæd og oocytt) produseres gjennom meiose, noe som innebærer en runde DNA-replikasjon etterfulgt av to påfølgende divisjoner som er nødvendige for kromosomnummerreduksjon før befruktning. Hos pattedyr, under tidlig fosterliv, gjennomgår oocytten en lang arrestasjon (til puberteten) på diplotenstadiet av profase I i den første meiotiske divisjonen, et stadium som kalles germinal vesikkel (GV) stadium. Etter meiotisk gjenopptakelse gjennomgår GV-oocytten kjernefysisk konvoluttbrudd (NEBD), og spindelen monteres hovedsakelig på oocytsenteret 1,2,3. Senere, drevet av F-aktin, migrerer spindelen i tide fra oocyttsenteret til cortex for å sikre svært asymmetrisk deling, noe som resulterer i et egg med en liten polarkropp (PB) 4,5,6.
I mitotiske celler består sentrosomene av et par sentrioler omgitt av peri-sentriolære materialkomponenter (PMC), som pericentrin, γ-tubulin, Cep152 og Cep1927. Disse sentriolholdige sentrosomene bidrar til troskapen til bipolar spindeldannelse8. Imidlertid går sentrioler tapt under tidlig oogenese hos forskjellige arter, inkludert gnagere9. Derfor vedtar museoocytter en sentrioleuavhengig spindelmonteringsvei ved hjelp av mange acentriolar mikrotubuli (MT) organisasjonssentre (MTOCs) 9,10. Ved meiotisk gjenopptakelse gjennomgår de perinukleære MTOC-ene tre forskjellige trinn med rekondensering, strekking og fragmentering i et stort antall mindre MTOC-er11,12. De fragmenterte MTOC-ene blir deretter gruppert og sortert for å organisere en bipolar spindel10,13,14. Et annet basseng av MTOC er lokalisert i cytoplasma under NEBD. Noen av disse cytoplasmatiske MTOCene migrerer og danner spindelpoler (polare MTOC, pMTOCs) 10,11. Nylig ble det oppdaget en annen undergruppe av cytoplasmatiske MTOC, kalt metafase cytoplasmatiske MTOC (mcMTOCs), som ikke bidrar til spindelpoledannelse, men forblir i oocytcytoplasma under metafase I (Met I) 15. Nedbryting av mcMTOC ved multifotonlaserablasjon eller unormalt økning av antallet ved autofagihemming forstyrrer spindelposisjonering og migrasjon og øker forekomsten av aneuploidi i metafase II-oocytter15.
Interessant nok skiller mcMTOC-er seg fra pMTOC-er i mange aspekter15. For eksempel, i motsetning til pMTOC, som hovedsakelig stammer fra perinukleære MTOC, stammer mcMTOC fra oocyt cortex. Når spindelen fortsatt er i oocyttsenteret, lokaliseres mcMTOCene asymmetrisk motsatt siden som spindelen migrerer til for PB-ekstrudering15. Astrallignende MT kan ikke nå cortex i den relativt store oocytcellen. Derfor nkler disse mcMTOC-ene for å forankre spindelen (via astrallignende MTOC) til cortex. Disse funnene antyder en modell der mcMTOC-nukleert MT-kraft motvirker F-aktinmediert kraft som driver spindelmigrasjon mot cortex. Balansen mellom disse to motstridende kreftene er avgjørende for å regulere den sentrale spindelposisjoneringen og rettidig spindelmigrasjon15.
Til dags dato lokaliserer alle de undersøkte PMC-proteinene (pericentrin, g-tubulin, Cep192 og Aurora kinase A) til begge MTOC-bassengene: mcMTTOCs og pMTOCs15. Derfor er det ingen kjemisk eller genetisk tilnærming for selektivt å forstyrre mcMTOC uten forstyrrende pMTOCs. Disse begrensningene kan omgås ved selektiv målretting av mcMTOC-ene med laserablasjon. Blant de laserbaserte teknologiene utviklet for mikroablasjon, viser pulserende multi-foton femtosekundlasere stort potensial på grunn av deres presisjonspåvirkning begrenset til fokalplanet, den høye penetrasjonsdybden til nær-infrarødt lys og redusert fototoksisitet og termisk skade på cellen16,17,18. Dette arbeidet beskriver en selektiv tilnærming til ablate mcMTOCs i museoocytter ved hjelp av en multi-foton laser koblet til et omvendt mikroskop.
Protocol
Alle metodene beskrevet her ble godkjent av University of Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Nummer 9695). Cep192-eGFP reporter kvinnelige mus i alderen 6-8 uker gammel ble brukt i denne studien. For å generere Cep192-eGFP reportermus ble CRISPR/Cas9-mediert homologi-rettet reparasjon brukt til å integrere EGFP-reportergenet i CF-1-musegenomet. EGFP-reporteren ble smeltet sammen på C-enden av Cep192 (en integrert del av MTOCs)15. For å opprettholde musekolonien ble homozygote Cep192-eGfp reportermus brukt. Alle dyrene ble opprettholdt i bur (opptil fire dyr/bur) ved 21 °C og 55 % fuktighet, med 12 timers lys/mørk syklus og ad libitum tilgang til mat og vann.
1. Innsamling av oocytter fra mus
- Forbered kulturmediet (Chatot, Ziomek og Bavister, CZB19, se materialtabellen), og inkuber det ved 37 ° C og 5% CO2 over natten.
MERK: CZB-mediet kan oppbevares ved 4 °C i 1 måned (se tilleggsfil 1 for mediesammensetningen). - Suppler CZB-mediet med glutamin (1 mM) og milrinon (2,5 mM) (CZB + M) (se materialtabell), og legg det i inkubatoren.
MERK: Milrinone er en fosfodiesterasehemmer som opprettholder oocytter arrestert ved profase I og forhindrer meiotisk gjenopptakelse20. - Klargjør oppsamlingsmediet (bikarbonatfritt minimalt essensielt medium, MEM) som inneholder 3 mg/ml polyvinylpyrolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (tilleggsfil 1) og milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, se materialtabellen).
- Tilbered kolleksjons- og kulturrettene, lag fire mikrodråper (100 μL) av samlingsmedium (MEM/PVP + M) og to mikrodråper (100 μL) kultur (CZB + M) medium i henholdsvis 60 mm og 35 mm petriskåler, og dekk dem med mineralolje (se Materialtabell). Hold oppsamlingsfatet på lysbildevarmeren, og legg kulturskålen i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- Injiser intraperitonealt 5 IE av gravid hoppes serumgonadotropin (PMSG, se materialtabellen) i seksuelt moden (6-8 uker gammel) Cep192-eGFP reporter kvinnelige mus 44-48 timer før oocytsamling.
- Ofre musene ved cervikal dislokasjon, identifiser og fjern eggstokkene21, og overfør dem til et klokkeglass som inneholder forvarmet oppsamlingsmedium (MEM / PVP + M) ved 37 ° C.
- Fest eggstokken ved å berøre en 1 ml sprøyte til bunnen av klokkeglasset og punktere den flere ganger (~ 40 ganger per eggstokk) ved hjelp av sy nåler samlet sammen for å frigjøre oocytter i mediet.
- Bruk et plastoverføringsrør til å overføre alt mediet som inneholder cumulus-oocyttkompleksene (COC) fra trinn 1.7 til en tom 100 mm petriskål av plast.
- Under et stereomikroskop samler du COC-ene ved hjelp av en Pasteur-glasspipetter, og overfører dem til oppsamlingsfatet som inneholder MEM/PVP + M.
- Ved hjelp av en smal Pasteur glasspipet (ca. 100 μm i diameter), denude oocyttene mekanisk ved forsiktig repeterende pipettering, etterfulgt av overføring og vasking av dem i fire mikrodråper (100 μL) MEM / PVP + M (samlingsskålen) før de overføres til CZB + M kulturskålen.
- Inkuber de denuderte oocytter i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2 i luften.
2. Mikroinjeksjon av oocytt
- Legg en 250 μL dråpe MEM/PVP + M i et 100 mm petriskållokk i plast, og dekk det til med mineralolje.
MERK: Petriskållokket har en nedre kant som gir mer plass til å justere mikromanipulatoren. - Slå på mikroinjeksjonssystemet (se materialtabellen).
- Plasser mikroinjeksjonsskålen på oppvarmingsstadiet (37 °C) i mikroskopet.
- Legg injeksjonsnålen med 0,5 μL mCh-Cep192cRNA ved hjelp av mikroloaderpipettespisser (se materialtabell), og fest injeksjonsnålen til mikromanipulatoren.
- Overfør de denuderte oocytter (trinn 1.11) til 250 μL mikrodrop (trinn 2.1).
- Under en 20x eller 40x objektivlinse, juster posisjonen og fokuset på injeksjonen og hold nålene i henhold til oocyttposisjonen (figur 1).
- Sett opp mikroinjeksjonsenheten, og still inn injeksjonstrykket (p i), kompensasjonstrykket (pc) og injeksjonstiden (ti) for å kunne injisere 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA (for å eksogent merke MTOC-ene).
- Injiser forsiktig oocyttene uten å berøre kjernen.
- Når alle oocytter er injisert, vask dem i tre mikrodråper CZB + M, overfør dem til kulturskålen (CZB + M), og inkuber dem i 3 timer ved 37 ° C for å tillate mCh-Cep192 uttrykk.
3. Oocytt modning
- Forbered modningsmediet ved å tilsette glutamin (1 mM) til CZB-medium forhåndsutjevnet i en inkubator med 5 % CO2 i luft ved 37 °C i minst 3 timer.
- Lag to mikrodråper (100 μL) av modningsmediet i en 35 mm petriskål, og dekk dem med mineralolje (modningsfat).
- Vask profase I-arresterte oocytter minst tre ganger i 100 μL milrinonefrie CZB-mikrodråper for å fjerne milrinonen helt og tillate meiotisk gjenopptakelse.
- Overfør oocyttene til modningsskålen, og inkuber dem i 5 timer (prometafase I-trinn) i en fuktet inkubator med 5% CO2 i luft ved 37 ° C.
4. Oocyttpreparat for ablasjon og avbildning
- Overfør prometafase I-oocytter (trinn 3.4) til en glassbunnskulturskål som inneholder 100 μL modningsmedium (trinn 3.1) dekket med mineralolje.
5. Mikroskop forberedelse for ablasjon
- Minst 30 minutter før ablasjon, slå på temperaturregulatoren for sceneinkubatoren (se materialtabell) og sett den på 37 °C.
- Slå på CO 2-kontrolleren og sett den til 5 % CO2.
- Velg et apokromatisk mål for nedsenking av 40x olje, og påfør en liten dråpe nedsenkningsolje.
- Monter glassbunnkulturskålen med oocyttene på en scene-topp inkubator, og dekk inkubatoren med et gasslokk.
- I bildeinnhentingsprogramvaren (se materialtabellen) velger du et alternativ som gjør det mulig å lagre flere trinnposisjoner (for eksempel "Definer merke og finn eksperiment"). Ved hjelp av overført lysfeltbelysning, sentrer deg om de enkelte oocytter og lagre posisjonene deres.
- I programvaren for bildeopptak velger du XYZ-skannemodus , setter bildeformatet til 256 x 256 piksler, setter zoomfaktoren til 2,5x - 3,0x og velger en skannefrekvens på 600 Hz. Dette tilsvarer en pikseloppholdstid på ca. 1,6 μs.
- Sett en 488 nm eksitasjonslaserlinje på omtrent 10% av lasereffekten (som tilsvarer 4,0 μW på prøvenivå) (se materialtabell), og bruk en spektral båndbredde på 500-550 nm for å observere GFP-signalet fra MTOC-ene. For samtidig observasjon av fluorescens fra mCherry-merket Cep192, sett en 585 nm eksitasjonslaserlinje på omtrent 8% av lasereffekten (som tilsvarer 10,7 μW på prøvenivå), og bruk en annen detektor satt til en spektral båndbredde på 595-645 nm.
MERK: Det er nyttig å bruke konfokalmikroskopets overførte lysdetektor (TLD) for samtidig å oppdage oocytgrenser. - Ved hjelp av en live skanningsmodus og manuell kontroll av z-stasjonen, skjerm oocytten for MTOC.
- Når en mcMTOC er oppdaget, tegner du et firkantet interesseområde (ROI) rundt det.
6. Ablasjon av mcMTOC
- Sett en femtosekund laser til en bølgelengde på 740 nm.
MERK: Laserbølgelengden kan endres i henhold til mikroskopet og laserforholdene. - Bruk den elektrooptiske modulatoren til multifotonmikroskopet (se materialtabell) for å sette lasereffekten til 70% -80%, tilsvarende 60-70 mW effekt ved prøveplanet.
MERK: Hvis laseren er utstyrt med en femtosekund pulskompensator, bruk den til å korrigere for gruppeforsinkelsesdispersjon (GDD). GDD-korreksjon reduserer mengden laserkraft som kreves for effektiv mcMTOC-ablasjon og minimerer fotoskader på oocytten. GDD-kontrollen er vanligvis integrert med bildeoppkjøpsprogramvaren til kommersielle multifotonmikroskoper. - Bruk samme bildeformat, zoomfaktor og skannefrekvens som i trinn 5.6. Sett linje- og rammegjennomsnittsparametrene til 1.
- Klikk på Scan-knappen i programvaren for å utføre ablasjonen av mcMTOC ved å utføre en enkelt laserskanning av den valgte avkastningen.
- Bruk kanalinnstillingene fra trinn 5.7 til å se gjennom resultatene av ablasjonen ved å sammenligne bildene av de GFP-merkede strukturene som ble tatt før og etter multifotonlasereksponeringen. Hvis ablasjonen er vellykket, reduseres intensiteten av GFP-fluorescensen i den målrettede mcMTOC til nivåene observert i bakgrunnen.
- Hvis noen fragmenter av en GFP-merkingsstruktur forblir, gjenta trinn 6.4 en eller flere ganger ved å fokusere på forskjellige z-plan i mcMTOC.
- Bruk kanalinnstillingene fra trinn 5.7 til å kontrollere ablasjonseffektiviteten ved fullstendig tap av mcMTOC-assosierte mCherry-signaler (mCh-Cep192).
- Gjenta trinn 5.8 til trinn 6.7 til alle MTOCs av en oocytt (ved forskjellige fokalplan) er ablatert.
MERK: Denne protokollen bruker mCh-Cep192 mikroinjeksjon som en strategi for å bekrefte mcMTOC-uttømming etter multifotonlasereksponering og utelukke muligheten for at tapet av GFP-fluorescens skyldes GFP-fotobleking. Mikroinjeksjonen av denne sonden er imidlertid valgfri og ikke nødvendig for ablasjonsprosedyren.
Representative Results
Multi-foton laser ablasjon gir en effektiv metode for å selektivt ablate intracellulære strukturer. Den nåværende studien benyttet multi-foton laser ablasjon for å tømme mcMTOCs i mus oocytter selektivt. Laserablasjon utarmet mcMTOC-ene effektivt, som vist ved reduksjonen i den endogene GFP-fluorescensen i de målrettede mcMTOCene til et nivå som er sammenlignbart med bakgrunnen. Eksogen mCh-Cep192 i de målrettede mcMTOCene ble også avskaffet etter laserablasjon. Laserablasjonen av mcMTOC bør utføres på forskjellige fokale plan i oocytten (hvor mcMTOC er lokalisert, figur 2) for å sikre at alle mcMTOC-ene i oocytten er utarmet (figur 3).
Figur 1: Oocytt mikroinjeksjon. Mikroinjeksjon av en profase I-arrestert museoocytt med mCh-Cep192 cRNA. Skala bar: 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Uttømming av mcMTOC i museoocytter. Representative bilder av enkle fokalplan. De hvite firkantene indikerer en mcMTOC før og etter multi-foton laser ablasjon. Skala bar: 40 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Uttømming av mcMTOC ved forskjellige fokalplan i en museoocytt. Representative maksimale projeksjonsbilder av en mcMTOC-ablated mus oocyte. Skala bar: 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Sammensetninger av Chatot, Ziomek og Bavister (CZB) og bikarbonatfritt minimalt essensielt medium (MEM/PVP). Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Det finnes ulike metoder for å forstyrre cytoskjelettrelaterte strukturer i celler22,23,24,25. Det er imidlertid utfordrende å finne effektive teknikker for å selektivt forstyrre den målrettede strukturen uten å kompromittere cellens levedyktighet. Multi-foton laser ablasjon metoden presenteres her er en effektiv strategi for å indusere en selektiv mekanisk forstyrrelse til mcMTOCs innenfor oocyte uten å endre oocytt levedyktighet.
Laserablasjon har blitt mye brukt til å forstå de molekylære mekanismene som kontrollerer kromosomsegregering under mitose og meiose22,23,26,27. På grunn av den relativt store størrelsen (>80 mm i diameter) av pattedyrs oocytter sammenlignet med somatiske celler28, representerer ablasjonen av deres intracellulære strukturer en utfordring. Videre er gjennomsnittlig mcMTOC-volum i metafase I-oocytter ~ 20 μm15, noe som representerer en ekstra utfordring. En effektiv metode som gir dypere vevspenetrasjon må tas i bruk for å overvinne disse utfordringene. Den største fordelen med å bruke multifotonlaseren til ablasjon er dens evne til å nå dypere inn i cellen mens du minimerer off-target effekter29.
For å verifisere effekten og effektiviteten av laserablasjonsmetoden for å tømme den målrettede strukturen, anbefales det å bruke et fluorescerende merket protein for å identifisere den målrettede strukturen over tid (før og etter ablasjon)23. Det er viktig å legge merke til at laserablasjon tømmer hele mcMTOC som en struktur, og selv om mindre mcMTOC-er bare krever en enkelt lasereksponering for å bli utarmet, kan større mcMTOC-er kreve mer enn én lasereksponering på forskjellige fokalplan. Det anbefales også å fikse og immunmerke en delmengde av kontroll- og mcMTOC-ablated oocytter med en MTOC-markør (for eksempel γ-tubulin, pericentrin eller Cep192) for å bekrefte effektiviteten av mcMTOC-ablasjonen ytterligere. I kontrolloocytter vil områder av cytoplasma like ved siden av, men ikke overlappende med mcMTOC, bli utsatt for laseren.
Dette eksperimentet krever flere mcMTOC-ablasjoner mens du beveger deg mellom forskjellige fokalplan i oocyttene. Derfor anbefales det sterkt å øve på denne teknikken flere ganger før du utfører eksperimentet for å minimere eksperimenttiden, og dermed øke oocytens levedyktighet. Videre er det viktig å bruke den minste laserkraften som er tilstrekkelig til å tømme mcMTOC-ene uten å påvirke oocytens levedyktighet.
Denne teknikken har noen begrensninger. For det første er multi-foton konfokale mikroskoper relativt dyrere enn vanlige konfokale mikroskoper. For det andre er det mer tidkrevende å forstyrre alle mcMTOC-er på forskjellige fokalplan enn kjemiske eller genetiske forstyrrelser. For det tredje krever denne protokollen tekniske ferdigheter for å ablate alle mcMTOC-er på kortest mulig tid. Men når den er mestret, gir bruken av multifotonlaseren en utmerket strategi for å forstyrre flere intracellulære strukturer i museoocytter, inkludert mcMTOC, noe som bidrar til forståelsen av molekylære mekanismer som regulerer spindelposisjonering og dens rettidige migrasjon i pattedyrs oocytter.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke alle medlemmer av Balboula-laboratoriet for deres verdifulle hjelp og diskusjoner. Forfatterne takker Melina Schuh for vennlig deling av mCherry-Cep192-konstruksjonen. Denne studien ble støttet av R35GM142537 (NIGMS, NIH) til AZB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
| Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
| Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
| Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
| Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
| Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
| CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
| CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
| DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
| DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
| EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
| Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
| Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
| Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
| Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
| Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
| Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
| Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
| Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
| L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
| Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
| MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
| mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
| Medium Essential Medium Eagle - MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
| Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
| Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 - 1L | |
| Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
| Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
| Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
| Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
| Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
| Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
| Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
| Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
| Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
| Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
| Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
| Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
| Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
| The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |
References
- Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
- Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
- Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
- Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
- Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M.
- Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
- Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217 (2015).
- Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
- Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
- Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
- Pavin, N., Tolic, I. M.
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
- Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
- Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
- Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
- Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
