Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إنشاء عضويات بطانة الرحم 3D من رحم الفأر

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجيات إنشاء عضويات ظهارية بطانة الرحم للفأر للتعبير الجيني والتحليلات النسيجية.

Abstract

تبطن أنسجة بطانة الرحم التجويف الداخلي للرحم وتخضع للسيطرة الدورية للإستروجين والبروجستيرون. وهو نسيج يتكون من ظهارة لمعية وغدية ، ومقصورة انسجة ، وشبكة أوعية دموية ، ومجموعة معقدة من الخلايا المناعية. كانت نماذج الفئران أداة قوية لدراسة بطانة الرحم ، وكشفت عن الآليات الحاسمة التي تتحكم في الزرع والمشيمة والسرطان. يقدم التطور الأخير للثقافات العضوية البطانية 3D نموذجا حديثا لتشريح مسارات الإشارات التي تكمن وراء بيولوجيا بطانة الرحم. يعد إنشاء عضويات بطانة الرحم من نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، وتحليل نسخها ، وتصور مورفولوجيتها بدقة خلية واحدة أدوات حاسمة لدراسة أمراض بطانة الرحم. تحدد هذه الورقة طرق إنشاء ثقافات 3D لظهارة بطانة الرحم من الفئران وتصف تقنيات لتحديد التعبير الجيني وتحليل أنسجة الكائنات العضوية. الهدف هو توفير مورد يمكن استخدامه لإنشاء وزراعة ودراسة التعبير الجيني والخصائص المورفولوجية للعضويات الظهارية البطانية.

Introduction

بطانة الرحم - النسيج المخاطي المبطن الداخلي لتجويف الرحم - هي نسيج فريد وديناميكي للغاية يلعب أدوارا حاسمة في الصحة الإنجابية للمرأة. خلال العمر الإنجابي ، يحمل بطانة الرحم القدرة على الخضوع لمئات الدورات من الانتشار والتمايز والانهيار ، بتنسيق من العمل المتضافر لهرمونات المبيض - الاستروجين والبروجستيرون. كشفت الدراسات التي أجريت على الفئران المعدلة وراثيا عن آليات بيولوجية أساسية تدعم استجابة بطانة الرحم للهرمونات والتحكم في زرع الجنين ، ونزع الخلايا اللحمية ، والحمل1. ومع ذلك ، كانت الدراسات في المختبر محدودة بسبب الصعوبات في الحفاظ على أنسجة بطانة الرحم الأولية غير المحولة للفأر في مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية2،3. تقدم التطورات الحديثة في ثقافة أنسجة بطانة الرحم كأنظمة أعضاء 3D ، أو عضويات ، فرصة جديدة للتحقيق في المسارات البيولوجية التي تتحكم في تجديد خلايا بطانة الرحم والتمايز. تم تطوير أنظمة عضوية بطانة الرحم للفأر والإنسان من ظهارة بطانة الرحم النقية المغلفة في مصفوفات مختلفة4،5 ، في حين تم استزراع بطانة الرحم البشرية كمزارع ظهارية / انسجة خالية من السقالات6،7 ، ومؤخرا كمجموعات ظهارية / انسجة مغلفة بالكولاجين8 . يتم دعم النمو والإمكانات التجديدية للثقافات العضوية الظهارية من خلال مزيج محدد من عوامل النمو ومثبطات الجزيئات الصغيرة التي تم تحديدها تجريبيا لزيادة نمو وتجديد المواد العضوية4،5،9. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على تجميد وإذابة عضويات بطانة الرحم تسمح بتخزين عضويات بطانة الرحم على المدى الطويل من الفئران والبشر للدراسات المستقبلية.

كشفت الفئران المعدلة وراثيا عن مسارات الإشارات المعقدة التي تتحكم في الحمل المبكر وإزالة الترسبات ، وقد تم استخدامها كنماذج لفقدان الحمل وسرطان بطانة الرحم وبطانة الرحم. تم تحقيق هذه الدراسات الجينية إلى حد كبير مع حذف خاص بالخلية للأليلات الجانبية loxP ("floxed") باستخدام cre recombinases التي تنشط بشكل خاص في الأنسجة التناسلية الأنثوية. تتضمن نماذج الفئران هذه مستقبلات البروجسترون10 المستخدمة على نطاق واسع ، والتي لها نشاط إعادة اتحاد قوي في الأنسجة الظهارية واللحمية البطانية ، اللاكتوفيرين i-cre ، الذي يحفز إعادة التركيب الظهاري البطاني الرحمي في الفئران البالغة11 ، أو Wnt7a-cre ، مما يؤدي إلى حذف خاص بالظهارة في الأنسجة المشتقة من مولريان12 . وفرت زراعة أنسجة بطانة الرحم من نماذج الفئران المعدلة وراثيا مثل الكائنات العضوية ثلاثية الأبعاد فرصة ممتازة للتحقيق في بيولوجيا بطانة الرحم وتسهيل تحديد عوامل النمو ومسارات الإشارات التي تتحكم في تجديد خلايا بطانة الرحم والتمايز13,14. يتم وصف طرق عزل وثقافة أنسجة بطانة الرحم للفأر في الأدبيات والإبلاغ عن استخدام استراتيجيات إنزيمية مختلفة لعزل ظهارة الرحم للزراعة اللاحقة للعضويات الظهارية البطانية4. بينما توفر الأدبيات السابقة إطارا نقديا لبروتوكولات الثقافة العضوية الظهارية البطانية4،5،6 ، توفر هذه الورقة طريقة واضحة وشاملة لتوليد هذه الكائنات العضوية وصيانتها ومعالجتها وتحليلها. توحيد هذه التقنيات مهم لتسريع التقدم في مجال البيولوجيا الإنجابية للمرأة. هنا ، نبلغ عن منهجية مفصلة للتنقية الأنزيمية والميكانيكية للأنسجة الظهارية البطانية للفأر للثقافة اللاحقة من عضويات بطانة الرحم في سقالة مصفوفة هلام. كما نصف منهجيات التحليلات النسيجية والجزيئية النهائية للعضويات الظهارية بطانة الرحم المغلفة بمصفوفة الهلام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء التعامل مع الفئران والدراسات التجريبية بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لكلية بايلور للطب والمبادئ التوجيهية التي وضعها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

1. عزل ظهارة الرحم من الفئران باستخدام الطرق الأنزيمية والميكانيكية

ملاحظة: يصف هذا القسم الخطوات المطلوبة لإنشاء عضويات بطانة الرحم الظهارية ومرورها وتجميدها وإذابتها من الفئران باستخدام سقالة مصفوفة هلامية. وقد حددت الدراسات السابقة أن الثقافات المثلى من عضويات بطانة الرحم الفئران يتم تأسيسها من الفئران خلال مرحلة شبق4 ، والتي يمكن تحديدها عن طريق الفحص الخلوي لمسحة المهبل15. تم استخدام إناث الفئران WT البالغة (6-8 أسابيع ، الهجين C57BL / 6J و 129S5 / SvEvBrd) لجميع التجارب. تم القتل الرحيم للفئران بشكل إنساني وفقا للإرشادات المعتمدة من IACUC باستخدام التخدير الأيزوفلوران متبوعا بتفكيك عنق الرحم. بمجرد القتل الرحيم للفئران ، يجب اتباع الخطوات التالية. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بالمواد والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. اترك مصفوفة الجل تذوب على الثلج لمدة 1-2 ساعة تقريبا قبل الاستخدام.
  2. لتشريح الفأر ، استخدم المقص لعمل شق في منتصف خط البطن وقشر الجلد برفق لكشف الطبقة البريتونية الأساسية. استخدم الملقط لتثبيت الطبقة البريتونية وقم بعمل شقوق جانبية بالمقص لكشف محتويات البطن.
    1. حدد موقع قرون الرحم عن طريق تحريك ضمادات الدهون في البطن جانبا برفق. قم بتشريحها عن طريق إمساكها أولا عند تقاطع عنق الرحم واستخدام المقص لقطع الدهون المساريقية على طول. بعد تشريح رحم الفأر ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية تماما من قرن الرحم بمقص صغير.
      ملاحظة: الحفاظ على العقم أثناء عزل الخلية عن طريق تعقيم جميع أدوات الجراحة قبل الاستخدام ، ورش بطن الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وتنفيذ جميع الخطوات التالية للتشريح تحت غطاء زراعة الأنسجة المعقمة.
  3. قطع كل قرن الرحم إلى أجزاء صغيرة ، كل قياس حوالي 4-5 ملم.
  4. ضع جميع شظايا الرحم من رحم واحد في بئر واحد من صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 0.5 مل من 1٪ تربسين. اسمح للمحلول الأنزيمي بدخول تجويف الرحم ، مما تسبب في فصل إنزيمي لظهارة بطانة الرحم عن السدى الأساسي.
  5. احتضان اللوحة المكونة من 24 بئرا في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تقريبا.
  6. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، انقل شظايا الرحم إلى صفيحة زراعة الأنسجة مقاس 35 مم تحتوي على 1 مل من محلول دولبيكو المخزن بالفوسفات (DPBS).
  7. تحت مجهر التشريح ، استخدم ملقط دقيق وماصة 1 مل لفصل ظهارة الرحم ميكانيكيا عن أنبوب الرحم. أثناء الضغط باستمرار على أحد طرفي جزء الرحم بالملقط ، مرر طرف الماصة برفق طوليا عبر الجزء ، مع الضغط على الظهارة من الطرف الآخر من أنبوب الرحم. مراقبة الأوراق الظهارية المنفصلة من جزء الرحم تحت مجهر التشريح.
  8. استخدم ماصة سعة 1 مل لجمع الصفائح الظهارية ونقلها برفق إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
  9. كرر العملية لشظايا الرحم المتبقية ، ونقل جميع الأوراق الظهارية إلى نفس أنبوب التجميع.
  10. بيليه الأوراق الظهارية المنفصلة عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 375 × غرام.
  11. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لتجنب إزعاج حبيبات الخلية.
  12. أعد تعليق حبيبات الخلية في 0.5 مل من 2.5 مجم / مل كولاجيناز + 2 مجم / مل محلول DNase. ماصة لأعلى ولأسفل حوالي 10 أضعاف ، أو حتى يتم تحقيق تعليق أحادي الخلية.
  13. أضف 0.5 مل من DMEM / F12 + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) + مضادات حيوية ، وقم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 375 × جم.
    ملاحظة: للحصول على معلومات إضافية حول المضادات الحيوية واسعة الطيف المستخدمة في زراعة الخلايا ، راجع جدول المواد.
  14. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من DMEM / F12 + 10٪ FBS + المضادات الحيوية. أجهزة الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 375 × جم.

2. تجهيز المقصورة اللحمية

ملاحظة: يوضح هذا القسم البروتوكولات اللازمة لعزل المقصورة اللحمية في بطانة الرحم للفأر. نظرا للاهتمام المتزايد بتجارب الاستزراع المشترك الظهاري / اللحمي ، من المهم أن تكون قادرا على معالجة مجموعات الخلايا اللحمية بالإضافة إلى الخلايا الظهارية التي ستولد الكائنات العضوية.

  1. بمجرد فصل كل الظهارة إنزيميا وميكانيكيا عن شظايا الرحم ، فإن الهياكل المتبقية الشبيهة بالأنبوب هي مقصورات "اللحمية / عضل الرحم". اجمع هذا النسيج في كولاجيناز 2.5 ملغم/مل + 2 ملغم/مل DNase في محلول HBSS.
  2. احتضان عينة اللحمية / عضل الرحم على شاكر 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من DMEM / F12 + 10٪ FBS + المضادات الحيوية لكل فأر ، وقم بتصفية الأجزاء غير المنفصلة من خلال مرشح خلية 40 ميكرومتر.
  4. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 375 × غرام.
  5. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM / F12 + 10٪ FBS + المضادات الحيوية. أضف الخليط بالتنقيط إلى 10 مل من DMEM / F12 + 10٪ FBS + المضادات الحيوية في طبق زراعة خلايا 10 سم. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة.
  6. لتوليد ثقافات مشتركة للخلايا الظهارية واللحمية البطانية للفأر ، اتبع الطرق الموضحة لعضويات بطانة الرحم البشرية باستخدام أنظمة مصفوفة خالية من السقالات أو الكولاجين 6,8.
    ملاحظة: في حين أن هذه التقنيات لم يتم نشرها بعد للفئران ، إلا أنه يمكن تكييفها بناء على البروتوكولات المنشورة مع بطانة الرحم البشرية.

3. تغليف ظهارة الرحم في مصفوفة هلام لإنشاء المواد العضوية

ملاحظة: احتفظ بمصفوفة الجل على الثلج حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

  1. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في حجم مصفوفة هلام يبلغ 20 ضعفا من حبيبات الخلية (على سبيل المثال ، إذا كانت حبيبات الخلية 20 ميكرولتر ، فأعد تعليق الخلايا ب 400 ميكرولتر من مصفوفة الهلام). أعد تعليق الحبيبات بعناية لتجنب إدخال الفقاعات.
  2. اسمح لمصفوفة الهلام / تعليق الخلية بالاستقرار في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 10 دقائق.
  3. بمجرد أن تصبح مصفوفة الهلام / تعليق الخلية هلاما شبه صلب ، استخدم ماصة دقيقة P200 بطرف عريض 200 ميكرولتر لشفط 25 ميكرولتر من مصفوفة الهلام / تعليق الخلية برفق. قم بتوزيع ثلاث قباب منفصلة سعة 25 ميكرولتر لكل بئر من لوحة مكونة من 12 بئرا ، واترك مصفوفة الهلام تعالج لمدة 15 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  4. بعد معالجة مصفوفة الهلام ، أضف 750 ميكرولتر من الوسط العضوي إلى كل بئر يحتوي على قباب مصفوفة هلامية. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة.
    ملاحظة: تمت الإشارة إلى تركيبة الوسائط العضوية في جدول المواد. تتشكل الكائنات العضوية عادة في غضون 4 أيام من الثقافة الأولية.

4. تحليل التعبير الجيني للعضويات بطانة الرحم بعد العلاج مع استراديول

ملاحظة: يصف هذا القسم الطرق المستخدمة لتحديد التعبير الجيني للعضويات الظهارية البطانية باستخدام qPCR في الوقت الفعلي بعد العلاج بالإستراديول (E2 ؛ انظر الجدول 1). نظرا لأن بطانة الرحم تخضع للتحكم الدوري لهرمون المبيض E2 ، فإن اختبار استجابة الكائنات العضوية ل E2 يعد مقياسا مهما للوظيفة الفسيولوجية. لقد حصلنا على الحمض النووي الريبي عالي الجودة وأنتجنا ما يكفي من الحمض النووي الريبوزي المرسال لتحديد التعبير الجيني باستخدام qPCR و / أو تسلسل الحمض النووي الريبي من الكائنات العضوية الظهارية البطانية. يصف هذا القسم كيفية جمع المواد العضوية ومعالجتها لتحليل التعبير الجيني. يعكس وسيط العلاج المختار الوسيط المستخدم لعلاج خلايا بطانة الرحم المزروعة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تحسين وسيلة العلاج هذه وفقا لذلك ، كما هو الحال لعلاج ثقافات بطانة الرحم البشرية 3D مع الهرمونات8،16،17.

  1. ثقافة عضويات بطانة الرحم كما هو موضح أعلاه.
  2. قم بإزالة الوسط العضوي واستبدله ب 750 ميكرولتر من وسط الجوع بعد أربعة أيام من البذر. احتضان بين عشية وضحاها.
  3. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة وسط الجوع. أضف 750 ميكرولتر من وسط المعالجة الذي يحتوي إما على مركبة أو 10 نانومتر E2. احتضان لمدة 48 ساعة.
  4. تابع عزل الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة للمجموعة.

5. التحليل النسيجي للعضويات بطانة الرحم

ملاحظة: يعد تصوير السمات المورفولوجية لعضويات بطانة الرحم أمرا بالغ الأهمية لتقييم التأثير الخلوي لعوامل النمو أو التلاعب الجيني أو مثبطات الجزيئات الصغيرة. يصف هذا القسم التقنيات المستخدمة لإصلاح ومعالجة وتصوير الكائنات العضوية الظهارية البطانية باستخدام البقع النسيجية وتلطيخ الأجسام المضادة المناعي.

  1. قم بإعداد أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل تحتوي على 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS. ضعها على الثلج.
  2. استنشاق الوسط من آبار الصفيحة المكونة من 12 بئرا والتي تحتوي على المواد العضوية.
  3. باستخدام طرف ماصة 1 مل مع طرف مقطوع ، انقل 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر وافصل قباب مصفوفة الهلام برفق من أسفل اللوحة.
  4. قم بشفط قباب مصفوفة الهلام بالكامل برفق في طرف الماصة وانقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
  5. ثبت المواد العضوية عن طريق وضعها على دوار عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  6. في صباح اليوم التالي ، قم بجهاز طرد مركزي للأنبوب بسرعة 600 × جم لمدة 5 دقائق لتكوير المواد العضوية. قم بإزالة محلول بارافورمالدهيد 4٪ برفق باستخدام ماصة وتخلص منه. اغسل المواد العضوية 2x بنسبة 70٪ إيثانول.
  7. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة كل الإيثانول باستثناء 50-100 ميكرولتر من الأنبوب. ضع الأنبوب جانبا.
  8. ضع أنبوبا من هلام معالجة العينات في حمام مائي وميكروويف لمدة ~ 30 ثانية لإذابة الجل. تأكد من أن هلام معالجة العينات لا يغلي من خلال مراقبة اتساق الجل.
    ملاحظة: بمجرد ذوبان هلام معالجة العينات ، ولكن ليس غليانا ساخنا ، اعمل بسرعة على تغليف المواد العضوية.
  9. نقل ما يكفي من هلام معالجة العينات لتغطية كامل سطح القالب (حوالي 250 ميكرولتر).
  10. في حين أن هلام معالجة العينات لا يزال منصهرا ، انقل بسرعة 50 ميكرولتر من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ الذي يحتوي على المواد العضوية. تأكد من أن المواد العضوية غارقة أو مدفوعة إلى الجزء السفلي من القالب.
  11. ضع قالب الأنسجة على دلو من الثلج واترك جل معالجة العينة يبرد ويتصلب.
  12. بمجرد أن يجف جل معالجة العينات تماما ، انقل بعناية مربع هلام معالجة العينات إلى كيس عينة ، مع تتبع الطائرة التي توجد بها الكائنات العضوية.
  13. ضع الكيس في كاسيت الأنسجة وقم بمعالجته باستخدام الطرق القياسية المستخدمة لتثبيت الفورمالين وتضمين البارافين للأنسجة18.
  14. بعد التثبيت والتضمين في البارافين ، قسم إلى أقسام 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم19. تابع إجراءات تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) القياسية أو تلطيخ المناعة ، كما هو موضح أدناه.

6. الهيماتوكسيلين وتلطيخ يوزين

  1. إزالة المقاطع على النحو التالي: زيلين ، 2 × 10 دقائق ؛ 100٪ إيثانول ، 2 × 3 دقائق ؛ 80٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 60٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ dH2O ، 2 × 3 دقائق ؛ 1 دقيقة في الهيماتوكسيلين. ماء الصنبور (3 × 5 ثوان) ؛ 1 دقيقة في يوزين.
  2. جفف الأقسام على النحو التالي: 60٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 80٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 95٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 100٪ إيثانول ، 2 × 3 دقائق ؛ زيلين، 2 × 15 دقيقة.
  3. جبل باستخدام تصاعد المتوسطة.

7. تلطيخ المناعي

  1. قم بإزالة المقاطع كما هو موضح في الخطوة 6.1.
  2. إجراء استرجاع المستضد
    1. اغمر الشرائح في محلول استرجاع المستضد في حاوية آمنة للاستخدام في الميكروويف.
    2. ضعه في الميكروويف على نار عالية لمدة 20 دقيقة ، باستخدام فواصل زمنية مدتها 5 دقائق لضمان عدم غليان المحلول.
  3. بعد اكتمال خطوة استرجاع المستضد لمدة 20 دقيقة ، اترك الشرائح تبرد على الجليد لمدة 40 دقيقة بينما لا تزال مغمورة في المخزن المؤقت لاسترجاع المستضد.
  4. اغسل الشرائح باستخدام 1x TBST لمدة 3 دقائق
  5. منع الشرائح عن طريق احتضان في 3 ٪ BSA في TBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. تمييع الجسم المضاد في 3٪ BSA في TBST (1: 50-1: 1000 ، اعتمادا على Ab).
    2. احتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
    3. اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام TBST.
  7. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
    1. تمييع الجسم المضاد في 3٪ BSA (في TBST) (1: 250) ، أو في 5٪ مصل حمار طبيعي.
    2. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام ، حيث يتم اقتران الجسم المضاد بالفلوروفور.
  8. تلطيخ نووي
    1. تمييع 4 ′ ، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) 1: 1,000 في TBST.
    2. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
    3. اغسل 2 × 5 دقائق باستخدام TBST.
  9. تصاعد
    1. استخدم قطرة واحدة من وسيط التثبيت لتركيب غطاء الغطاء.
    2. أغلق الغطاء باستخدام طلاء الأظافر في اليوم التالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

صور تباين المرحلة من عضويات بطانة الرحم الماوس
أنشأنا عضويات من ظهارة بطانة الرحم للفأر WT ، كما هو موضح في البروتوكول المرفق (انظر الرسم البياني في الشكل 1). بعد التفكك الأنزيمي لظهارة بطانة الرحم للفأر ، تم فصل الصفائح الظهارية ميكانيكيا عن الخلايا اللحمية الرحمية وفصلها عن كولاجيناز لتوليد تعليق أحادي الخلية. إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، يجب أن تسفر طريقة فصل الخلايا الظهارية واللحمية هذه عن عينات ملوثة لا تزيد عن 10٪ -15٪ من نوع الخلية المعاكسة (انظر صور التألق المناعي في الشكل 2). ثم تم إعادة تعليق حبيبات الخلية الظهارية في مصفوفة هلامية ، وسمح لها بالهلام في درجة حرارة الغرفة ، ومطلية في قباب 25 ميكرولتر على ألواح زراعة الأنسجة. بعد تصلب قباب مصفوفة الهلام ، تم تغطيتها بوسط عضوي وسمح لها بالنمو. لاحظنا عادة أن الخلايا الطلائية البطانية الرحمية تتجمع في صورة عضويات في غضون 3-4 أيام، كما هو موضح في الشكل 3. تم الحفاظ على المواد العضوية في الثقافة ، مع حدوث تغييرات في الوسائط كل 3 أيام ، وتمريرها كل 5-7 أيام.

تصوير عضويات بطانة الرحم للفأر باستخدام تلطيخ نسيجي ومناعي
لتحليل مورفولوجيا الكائنات العضوية الظهارية للفأر ، قمنا بتكييف الطرق المستخدمة لتغليف شفاطات الإبرة الدقيقة الخلوية باستخدام هلام معالجة العينات20. وهذا يسمح بالحفاظ على مورفولوجيا بطانة الرحم العضوية وتغليفها في مصفوفة يمكن إخضاعها للمعالجة استعدادا لتضمين البارافين. جل معالجة العينات هو أجار معدل يستخدم على نطاق واسع في مختبرات علم الأمراض السريرية لتحليل شفاطات الإبرة الدقيقة وقد استخدم لتغليف المواد العضوية المهبلية21,22. بعد أن يصلب خليط الجل / العضوي لمعالجة العينات ، يمكن معالجته وتلطيخه وتصويره باستخدام التقنيات المستخدمة عادة لتحليل الأنسجة. في الشكل 4 أ ، ب ، نوضح أنه يمكن تصور عضويات بطانة الرحم المضمنة بالبارافين المجزأة بالفورمالين بواسطة بقع الهيماتوكسيلين والإيوزين ، والتي تعرض طبقة واحدة من الظهارة والمراكز المجوفة - لومن - من الكائنات العضوية. تحتوي بعض المواد العضوية أيضا على إفرازات في التجويف ، مما يشير إلى أن الكائنات العضوية تكتسب الخصائص الوظيفية للخلايا الظهارية الغدية. نصف أيضا تقنيات تصور الكائنات العضوية باستخدام التلوين المناعي (الشكل 4C ، D) ؛ تم تحضين عضويات بطانة الرحم المجزأة بجسم مضاد أولي Cytokeratin 8 (TROMA-1) وجسم مضاد ثانوي مقترن بالفلوروفور (مضاد ثانوي للفئران -594). ثم تم تصور النوى باستخدام DAPI ، وتم تصوير الشرائح باستخدام مجهر مضان. لاحظنا أن جميع الخلايا الموجودة في المواد العضوية كانت إيجابية Cytokeratin 8 وتحتوي على DAPI ، مما يشير إلى أن تثبيت وتضمين ومعالجة عضويات بطانة الرحم متوافق مع التلطيخ المناعي القائم على الأجسام المضادة.

استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني
لتحديد استجابة التعبير الجيني لعضويات بطانة الرحم ، سمحنا لعضويات بطانة الرحم من الفئران WT بالنمو لمدة 4 أيام بعد الممر الأول. في المساء قبل العلاج ، تم تغيير وسط عضوي بطانة الرحم إلى وسط الجوع. ثم تمت معالجة المواد العضوية في آبار ثلاثية (كل بئر تحتوي على ثلاث قباب) مع مركبة (إيثانول ؛ حجم متساو في المحلول كما هو مستخدم في استراديول) أو 10 نانومتر استراديول (E2) لما مجموعه 48 ساعة. بعد 48 ساعة ، تمت إزالة الوسط ، وتمت معالجة المواد العضوية لاستخراج الحمض النووي الريبي. يمكن الحصول على ما يقرب من 4 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي من إجمالي قبتين من كل بئر ، وتم استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لعكس نسخ cDNA. تم إجراء تضخيم الجينات التي تشفر ليبوكالين 2 (Lcn2) ، واللاكتوفيرين (Ltf) ، ومستقبلات البروجسترون (Pgr) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (الشكل 5 والجدول 1) 23،24،25. كما هو متوقع ، لاحظنا أن تعبير Lcn2 و Ltf و Pgr زاد في الكائنات العضوية الظهارية بعد التحفيز باستخدام 10 نانومتر E2 (الشكل 5). وبالتالي ، تظهر هذه النتائج أنه يمكن استخدام الكائنات العضوية الظهارية البطانية بنجاح لقياس تغيرات التعبير الجيني استجابة ل E2.

Figure 1
الشكل 1: الإجراءات المستخدمة لإنشاء عضويات بطانة الرحم. يوضح الرسم البياني الخطوات الرئيسية التي تم اتباعها من أجل (أ) إنشاء و (ب) مرور الكائنات العضوية الظهارية من بطانة الرحم للفأر. (أ) تشمل الطرق التفكك الأنزيمي والميكانيكي لظهارة بطانة الرحم من رحم الفأر، يليه تشتت الخلية المفردة وتغليف الظهارة في مصفوفة هلامية. للحصول على أنسجة الرحم للتفكك الأنزيمي ، تتم إزالة المبايض وقنوات البيض من قرون الرحم بمقص ناعم ، مقطعة بشكل جانبي إلى شظايا 4-5 مم ، ثم توضع في محلول الإنزيم. بعد الحضانة الأنزيمية ، يتم فصل ظهارة بطانة الرحم ميكانيكيا عن السدى الأساسي تحت المجهر باستخدام ملقط وماصة "للضغط" على الظهارة من أنبوب الرحم. يتم هضم الظهارة بشكل أكبر في الخلايا الظهارية باستخدام حضانة قصيرة في كولاجيناز ، تليها تغليف في مصفوفة هلامية. (ب) يتطلب تمرير عضويات بطانة الرحم تفككا ميكانيكيا في وسط بارد وطرد مركزي لتحرير الكائنات العضوية من المصفوفة وتوليد شظايا عضوية أصغر. بمجرد إطلاق الكائنات العضوية من المصفوفة وتفكيكها ميكانيكيا إلى أجزاء أصغر ، يتم تغليفها في مصفوفة وإعادة طلائها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: التلوين المناعي لظهارة بطانة الرحم المعزولة ومجموعات الخلايا اللحمية. تظهر صور التألق المناعي مجموعات الخلايا الظهارية واللحمية للخلية الظهارية (A ، B) وكسور الخلايا اللحمية (C ، D) بعد الفصل الأنزيمي والميكانيكي للرحم. يظهر Cytokeratin 8 (علامة الخلية الظهارية) باللون الأحمر ، ويظهر vimentin (علامة الخلية اللحمية) باللون الأخضر ، ويظهر DAPI (علامة نووية) باللون الأزرق. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (A ، C) ، 20 ميكرومتر (B ، D). الاختصارات: CK8 = سيتوكيراتين 8 ؛ VIM = فيمنتين. DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تكوين عضويات بطانة الرحم من الفئران WT على مدار 4 أيام. تم عزل ظهارة بطانة الرحم من فأر WT واستخدمت لتوليد المواد العضوية. (أ) صورة تباين الطور للخلايا الطلائية المغلفة في المصفوفة الهلامية بعد الهضم مباشرة (اليوم 0). (ب، ج) يمكن ملاحظة بعض الكائنات العضوية الصغيرة في اليوم 1 (ب) واليوم 2 (ج) من الثقافة. (د) يمكن ملاحظة الكائنات العضوية الطلائية الأكبر حجما والناضجة في اليوم 3 من الزرعة. تم التقاط الصور بهدف 5x ؛ قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. اختصار: WT = نوع البرية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: التحليل النسيجي للعضويات البطانية . (أ ، ب) تم تقسيم الكائنات العضوية الظهارية البطانية FFPE وتلطيخها ب H&E. (C ، D) كانت الكائنات العضوية الظهارية FFPE ملطخة بالمناعة مع علامة الخلية الظهارية cytokeratin 8 (أحمر). كانت نوى الخلية ملطخة ب DAPI (أزرق). قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (أ) ، 100 ميكرومتر (ج) ، 50 ميكرومتر (ب ، د). الاختصارات: FFPE = البارافين الثابت بالفورمالين المضمن ؛ H&E = الهيماتوكسيلين & يوزين. CK8 = سيتوكيراتين 8 ؛ DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تحليل التعبير الجيني للعضويات البطانية الرحمية للفأر. تم استزراع الكائنات العضوية الظهارية البطانية للفأر من الفئران WT لمدة 4 أيام في وسط نمو عضوي ، تليها المعالجة بالمركبة أو 10 نانومتر E2 لمدة 48 ساعة في DMEM / F12 مكملة ب 2٪ FBS المجرد من الفحم. (أ، ب) صور تباين الطور لعضويات الماوس WT بعد المعالجة بالمركبة (A) أو 10 نانومتر E2 (B). (جيم - ه) تحليل qPCR في الوقت الحقيقي من عضويات بطانة الرحم الظهارية المعالجة بالمركبة أو 10 نانومتر E2. التعبير عن الجينات المنظمة E2 ، ليبوكالين 2 (Lnc2) ، لاكتوفيرين (Ltf) ، ومستقبلات البروجسترون (Pgr). تمثل الأشرطة متوسط ± SEM ، يتم تحليلها بواسطة اختبار t ثنائي الذيل ؛ * p < 0.033 ، ** p < 0.002 ، ***p < 0.001. يتكرر مع الكائنات العضوية المشتقة من n = 3 WT الفئران لكل حالة. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (أ ، ب). الاختصارات: WT = النوع البري ؛ E2 = استراديول. qPCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تسلسل التمهيدي إلى الأمام (5'-3') الرجوع للخلف (5'-3')
ليبوكالين 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
لاكتوفيرين (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCTCTCGTTC
البروجسترون (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
غليسيرالدهيد 3 نازعة هيدروجين الفوسفات (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTCTT
يحتوي خليط PCR على:
2x سيبر أخضر
0.5 ميكرومتر دفع أمامي التمهيدي
0.5 ميكرومتر القس التمهيدي
سي دي إن إيه
الحمض النووي الريبي / الحمض النووي H2O الخالي من الحمض النووي
شروط الدراجة:
درجة الحرارة الوقت دورات
مسك 95 درجة مئوية 10 دقائق 1
الانحراف 95 درجة مئوية 15 ثانية 40
بسط 60 درجة مئوية 60 ثانية

الجدول 1: تسلسل التمهيدي وشروط تفاعل البوليميراز المتسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، نصف طرق توليد عضويات ظهارية بطانة الرحم من بطانة الرحم للفأر والبروتوكولات المستخدمة بشكل روتيني لتحليلها في المراحل النهائية. تعتبر عضويات بطانة الرحم أداة قوية لدراسة الآليات التي تتحكم في الأمراض المرتبطة ببطانة الرحم ، مثل التهاب بطانة الرحم وسرطان بطانة الرحم وفشل الزرع. ذكرت الدراسات التاريخية المنشورة في عام 2017 عن ظروف زراعة الثقافات طويلة الأجل والمتجددة من عضويات بطانة الرحم من الفئران والظهارة البشرية 4,5. على الرغم من أن المواد العضوية قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة المسارات البيولوجية في أنظمة أخرى ، إلا أن دراسة أنسجة بطانة الرحم في المختبر كانت محدودة بسبب عدم وجود نموذج مناسب لدراسة الظهارة الأولية غير المحولة في الثقافة26. تم إنشاء عضويات بطانة الرحم المشتقة من بطانة الرحم البشرية والفأرية بنجاح باستخدام الظروف المستخدمة عادة لزراعة الكائنات العضوية من أنسجة الأعضاء الأخرى ، مثل الأمعاء والكلى والرئة ، وعن طريق تضمينها في سقالة مصفوفة خارج الخلية تتكون من مصفوفة هلام4. منذ هذه التقارير الأولية ، زاد استخدام عضويات بطانة الرحم لدراسة بيولوجيا بطانة الرحم بشكل كبير في المجتمع العلمي.

من خلال تعديل طريقة منشورة مسبقا للعزل الظهاري من رحم الفأر27,28 ، يسلط هذا البروتوكول الضوء بشكل فريد على الخطوات الرئيسية لعزل رحم الفأر عن طريق وضع الأنسجة مباشرة في محلول إنزيم ، وتجاوز الحاجة إلى عبور الرحم ، أو استخدام الترشيح. باستخدام هذه الطريقة ، حصلنا على ظهارة بنقاوة ~ 85٪ -90٪ ، على النحو الذي يحدده السيتوكيراتين 8 و vimentin المناعي (الشكل 2). يحدد هذا البروتوكول أيضا بوضوح التفاصيل الأساسية لتغليف الخلايا الظهارية المعزولة في مصفوفة النمو لتوليد وصيانة وتمرير المواد العضوية. حددت الصور في الشكل 4 ودراساتنا غير المنشورة وجود الميوسين والخلايا الغدية (أي FOXA2-positive) في ثقافاتنا العضوية29. تشير هذه إلى أن الطريقة المقدمة هنا فعالة لعزل كل من مجموعات الخلايا الغدية والظهارية اللمعية من بطانة الرحم للفأر.

تشمل القيود الرئيسية لنمو هذه الكائنات العضوية استخدام المصفوفة التجارية (أي Matrigel) ، والتي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات من دفعة إلى أخرى وتحتوي على عوامل نمو يمكن أن تؤثر على نمو الكائنات العضوية. علاوة على ذلك ، في حين أن هذه الكائنات العضوية تحتوي على ظهارة رحمية نقية ، فقد تم وصف استخدام أنواع إضافية من خلايا بطانة الرحم (أي المناعة واللحمية) مؤخرا في الأنظمة العضوية البشرية في بطانة الرحم 8,30. أظهرت مجموعات أخرى القدرة على عزل كل من الخلايا الظهارية اللمعية والغدية للثقافات العضوية من رحم الفأر14.

يستخدم هذا النهج أنسجة من نموذج حيواني صغير شائع نسبيا ومتاح لمعظم الباحثين. قد يشكل توليد عضويات بطانة الرحم من نماذج حيوانية أكبر ، أو البشر ، تحديات أخلاقية أو تقنية ، والتي يمكن التغلب عليها باستخدام التقنيات القائمة على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). تم وصف هذه التقنيات سابقا لأنسجة بطانة الرحم31 ، والأنسجة الأخرى في الجهاز التناسلي 32 وتم استخدامها بشكل فعال لدراسة تفاعلات بطانة الرحم / المشيمة في المختبر33. ومن ثم ، فإن استخدام iPSCs كمصدر للخلايا اللحمية البطانية والظهارية في بطانة الرحم من البشر ونماذج الحيوانات الكبيرة الأخرى يشكل مصدرا متجددا ويمكن الوصول إليه لتوليد عضويات بطانة الرحم.

في حين أن الفأر هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الزرع ، إلا أن هناك اختلافات تطورية رئيسية في آلية الزرع بين الفئران والبشر يجب ملاحظتها. على سبيل المثال ، في حين أن الزرع الخلالي يتميز بغزو الأرومة الغاذية العميقة من خلال ظهارة لمعية في السدى الأساسي ، فإن آلية عملية الغزو تختلف بين الفئران والرئيسيات34. في الفئران ، يتضمن غزو الأرومة الغاذية من خلال ظهارة لمعية موت الخلايا المبرمج أو الحشرة 35,36 ، بينما تهاجر الأرومة الغاذية بين الظهارة اللمعية إلى السدى الأساسي في الرئيسيات 34,35.

يعد تزويد عضويات بطانة الرحم بعوامل النمو اللازمة لدعم التجميع الذاتي والتجديد طويل الأجل أمرا ضروريا للحصول على ثقافات عضوية بطانة الرحم التي تلخص الأنسجة الأصلية. يشير تكوين الوسائط المعقدة لعضويات بطانة الرحم إلى مسارات الإشارات المتعددة التي تساهم في خصائص الخلايا الظهارية ، وستنشأ من كل من مصادر paracrine و autocrine. المقصورة اللحمية في بطانة الرحم عبارة عن مجموعة معقدة من أنواع الخلايا العديدة ، بما في ذلك الخلايا اللحمية الشبيهة بالخلايا الليفية ، والبطانة ، والبلاعم ، وغيرها من الخلايا المناعية المتخصصة التي تتغير باستمرار استجابة للإستروجين والبروجستيرون37.

على سبيل المثال ، يحتوي وسط الاستزراع العضوي على عوامل تنشط إشارات WNT / β-catenin في الكائنات العضوية ، مثل WNT3a و R-Spondin. أظهرت الدراسات التي أجريت على الفئران أن روابط WNT ضرورية لنمو الرحم والوظيفة الغدية. لذلك ، يعد تنشيط مسار الإشارات هذا أمرا بالغ الأهمية لتطوير وصيانة المواد العضوية38,39. يضخم R-Spondin إشارات WNT وهو يجند مستقبل البروتين G الغني بالليوسين (LGR5) 40. تتطلب الثقافات العضوية البطانية أيضا تثبيط β مسارات إشارات عامل النمو المحول (TGFβ) والبروتين المورفولوجي العظمي (BMP). على سبيل المثال ، يحتوي وسط الثقافة العضوية البطانية على مثبط BMP ، Noggin ، وهو بروتين مفرز يرتبط ب BMP2 و BMP4 و BMP741 ويعطل مفعوله. المانع الدوائي ، A83-01 ، موجود أيضا في وسط عضوي بطانة الرحم. A83-01 هو مثبط جزيء صغير ذو خصوصية عالية للمستقبلات ALK4 و ALK5 و ALK742. ALK4 / 5/7 هي مستقبلات من النوع 1 من عائلة إشارات TGFβ التي ترتبط بالإشارات التي تثيرها الروابط مثل TGFβ أو activin أو العقدية وتنقلها. إشارات BMP ضرورية لصيانة الخلايا الجذعية في الأنسجة مثل الأمعاء43 وبصيلات الشعر44. يساهم تثبيط إشارات TGFβ في القدرة التكاثرية وكفاءة تكوين مستعمرة الخلايا الجذعية الوسيطةالبطانية الرحمية 45 ، والتي تحدث عن طريق إعادة تشكيل المناطق الرئيسية في الكروماتين46. وبالتالي ، فإن تعديل هذين المسارين الرئيسيين للإشارات ، BMP و TGFβ ، ضروري للحفاظ على الثقافات العضوية مع قدرة التجديد الذاتي.

على الرغم من عدم عرضها هنا ، وجدنا أن الثقافة طويلة المدى لعضويات الفأر مع مثبط ALK4 / 5/7 ، A83-01 ، أدت إلى تغييرات مورفولوجية في الكائنات العضوية الظهارية بعد ثلاثة أو أربعة مقاطع مستمرة (Kriseman et al. ، قيد المراجعة). كانت التغيرات المورفولوجية في الكائنات العضوية الظهارية تذكرنا بالكائنات العضوية الظهارية "الكثيفة" التي وصفها بوريتو وآخرون 4 ، حيث حدث تطور المزيد من الخلايا الشبيهة بالإفراز بسبب انخفاض إفراز الباراكرين من روابط WNT. وبالتالي ، فمن المحتمل أن تتقاطع مسارات إشارات TGFβ و WNT للتحكم في تجديد العضوية الظهارية البطانية والتمايز.

وقد ولدت الدراسات الحديثة 3D بطانة الرحم الظهارية / نظم الزراعة المشتركة من الأنسجة البشرية7،8،16. تستخدم إحدى طرق الاستزراع المشترك نظاما خاليا من السقالات ، حيث يتم دمج الخلايا الظهارية واللحمية البطانية والسماح لها بالتجميع في هياكل 3D في بئر خال من السقالات باستخدام وسيط استزراع محدد. هذه العضوية الظهارية / اللحمية بطانة الرحم 3D لا تعبر فقط عن مستقبلات هرمون الاستروجين والبروجسترون والأندروجين ، ولكن أيضا تلخص بأمانة الاستجابة لهرمونات المبيض - الاستروجين والبروجستيرون 6,7. في طريقة أخرى للزراعة المشتركة ، استخدمت في دراسة أجراها Rawlings et al. ، يتم دمج الكائنات العضوية الظهارية البطانية مع الخلايا اللحمية في مصفوفة الكولاجين وتنمو في وسط عضوي معدل8. هذه العضويات الظهارية / اللحمية المستزرعة ، أو التجمعات ، تنظم في نظام 3D معلق ، حيث تحيط الخلايا اللحمية بهياكل تشبه الغدة الظهارية.

يتم استزراع غالبية عضويات بطانة الرحم في مصفوفة هلام مخفضة عامل النمو. ومع ذلك ، فإن وجود المركبات النشطة في المصفوفة قد يمارس استجابات خلوية غير مرغوب فيها داخل الكائنات العضوية. للتغلب على هذا القيد ، تم إنشاء المواد العضوية في سقالات خالية من مصفوفة الهلام ، مثل قوالب الأغاروز المطبوعة 3D التي يسمح فيها للعضويات الفردية بالتجميع الذاتي6. طورت مجموعات أخرى الهلاميات المائية الاصطناعية لتكون بمثابة مصفوفات 3D لثقافة عضويات بطانة الرحم47. تتجمع هذه الكائنات العضوية في هياكل 3D مع قطبية apicobasal ويمكن أيضا دمجها مع الخلايا اللحمية في بطانة الرحم لتشكيل عضويات معقدة48. نظرا لأنه يمكن استخدام الكائنات العضوية بنجاح لزراعة أنسجة بطانة الرحم البشرية والفأرية الأولية غير المحولة بطرق لا تستطيع ثقافات الخلايا 2D القيام بها ، فلا شك أن عضويات بطانة الرحم ستقدم مجال الصحة الإنجابية للمرأة وتكون أداة رائعة لدراسة الأمراض الإنجابية مثل فقدان الحمل المتكرر ، وبطانة الرحم ، وسرطان بطانة الرحم16 ، 49,50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتورة ستيفاني بانجاس والدكتور مارتن إم ماتزوك (M.M.M.) على القراءة النقدية وتحرير مخطوطتنا. تم دعم الدراسات من قبل منح معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية R00-HD096057 (DM) و R01-HD105800 (DM) و R01-HD032067 (M.M.M.) و R01-HD110038 (M.M.M.) ، ومنحة دعم مركز السرطان NCI- P30 (NCI-CA125123). ديانا مونسيفيس ، دكتوراه حاصلة على جائزة الحمل من الجيل التالي من صندوق بوروز ويلكوم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Tags

علم الأحياء ، العدد 191 ، بطانة الرحم ، المواد العضوية ، العقم ، الرحم ، التجديد
إنشاء عضويات بطانة الرحم 3D من رحم الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter