Summary
该协议描述了建立小鼠子宫内膜上皮类器官以进行基因表达和组织学分析的方法。
Abstract
子宫内膜组织排列在子宫内腔，并受到雌激素和孕激素的周期性控制。它是一种由管腔和腺体上皮、基质隔室、血管网络和复杂免疫细胞群组成的组织。小鼠模型一直是研究子宫内膜的有力工具，揭示了控制植入、胎盘和癌症的关键机制。3D子宫内膜类器官培养的最新发展提供了一个最先进的模型来剖析子宫内膜生物学的信号通路。从基因工程小鼠模型中建立子宫内膜类器官，分析其转录组并以单细胞分辨率可视化其形态是研究子宫内膜疾病的关键工具。本文概述了建立小鼠子宫内膜上皮3D培养的方法，并描述了量化基因表达和分析类器官组织学的技术。目标是提供可用于建立、培养和研究子宫内膜上皮类器官的基因表达和形态特征的资源。
Introduction
子宫内膜 - 子宫腔的内衬粘膜组织 - 是一种独特且高度动态的组织，在女性的生殖健康中起着关键作用。在生殖寿命期间，子宫内膜有可能经历数百个增殖，分化和分解的循环，由卵巢激素 - 雌激素和孕激素的协调作用协调。对基因工程小鼠的研究揭示了支撑子宫内膜对激素反应和控制胚胎植入、基质细胞蜕膜化和怀孕的基本生物学机制1。然而，由于难以在传统的2D细胞培养物中维持未转化的原代小鼠子宫内膜组织，体外研究受到限制2，3。子宫内膜组织培养为3D器官系统或类器官的最新进展为研究控制子宫内膜细胞再生和分化的生物学途径提供了新的机会。小鼠和人子宫内膜类器官系统已由封装在各种基质中的纯子宫内膜上皮4，5开发而人子宫内膜已培养为无支架上皮/基质共培养物6，7，最近作为胶原封装的上皮/基质组合8 .上皮类器官培养物的生长和再生潜力得到了生长因子和小分子抑制剂的定义混合物的支持，这些生长因子和小分子抑制剂已被经验确定为最大化类器官的生长和再生4，5，9。此外，冷冻和解冻子宫内膜类器官的能力允许长期储存来自小鼠和人类的子宫内膜类器官，用于未来的研究。
基因工程小鼠揭示了控制早期怀孕和蜕膜化的复杂信号通路，并已被用作妊娠丢失，子宫内膜癌和子宫内膜异位症的模型。这些遗传研究主要是通过使用在女性生殖组织中特别活跃的cre重组酶对loxP侧翼等位基因（“floxed”）的细胞特异性缺失来实现的。这些小鼠模型包括广泛使用的黄体酮受体-cre10，其在子宫内膜上皮和基质组织中具有很强的重组酶活性，乳铁蛋白i-cre，诱导成年小鼠子宫内膜上皮重组11，或Wnt7a-cre，在Müllerian衍生组织中触发上皮特异性缺失12.将基因工程小鼠模型中的子宫内膜组织培养为3D类器官为研究子宫内膜生物学提供了绝佳的机会，并促进了控制子宫内膜细胞更新和分化的生长因子和信号通路的鉴定13，14。文献中描述了小鼠子宫内膜组织的分离和培养方法，并报道了使用各种酶促策略分离子宫上皮以随后培养子宫内膜上皮类器官4。虽然以前的文献为子宫内膜上皮类器官培养方案提供了关键框架4，5，6，但本文为生成，维持，处理和分析这些类器官提供了一种清晰，全面的方法。这些技术的标准化对于加速妇女生殖生物学领域的进步非常重要。在这里，我们报告了一种酶促和机械纯化小鼠子宫内膜上皮组织的详细方法，用于随后在凝胶基质支架中培养子宫内膜类器官。我们还描述了凝胶基质封装的小鼠子宫内膜上皮类器官的下游组织学和分子分析方法。
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Protocol
小鼠处理和实验研究是根据贝勒医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议以及NIH实验动物护理和使用指南制定的指南进行的。
1.使用酶和机械方法从小鼠中分离子宫上皮
注意：本节描述了使用凝胶基质支架建立，传代，冷冻和解冻小鼠上皮子宫内膜类器官所需的步骤。先前的研究已经确定，小鼠子宫内膜类器官的最佳培养物是在发情期4期间从小鼠身上建立的，这可以通过阴道拭子的细胞学检查来确定15。成年雌性WT小鼠（6-8周龄，杂交C57BL / 6J和129S5 / SvEvBrd）用于所有实验。根据IACUC批准的指南，使用异氟醚镇静剂对小鼠进行人道安乐死，然后进行宫颈脱节。一旦小鼠被安乐死，应遵循以下步骤。有关此协议中使用的材料和溶液的详细信息，请参阅 材料表 。
- 使用前让凝胶基质在冰上解冻约1-2小时。
- 要解剖小鼠，请使用剪刀在腹部做一个中线切口，然后轻轻剥开皮肤以露出下面的腹膜层。用镊子支撑腹膜层，用剪刀做侧切口，露出腹部内容物。
- 通过将腹部脂肪垫轻轻移到一边来定位子宫角。首先将它们放在颈交处并用剪刀沿着肠系膜脂肪切割来解剖它们。解剖小鼠子宫后，用小剪刀彻底去除子宫角上的脂肪组织。
注意：通过使用前对所有手术工具进行消毒，在细胞分离期间保持无菌，用70%乙醇喷洒小鼠腹部，并在无菌组织培养罩下执行解剖后的所有步骤。
- 通过将腹部脂肪垫轻轻移到一边来定位子宫角。首先将它们放在颈交处并用剪刀沿着肠系膜脂肪切割来解剖它们。解剖小鼠子宫后，用小剪刀彻底去除子宫角上的脂肪组织。
- 将每个子宫角切成小碎片，每个碎片尺寸约为4-5毫米。
- 将来自一个子宫的所有子宫碎片放入含有 0.5 mL 1% 胰蛋白酶的 24 孔板的一个孔中。允许酶溶液进入子宫腔，导致子宫内膜上皮与底层基质的酶促分离。
- 将24孔板在37°C加湿的组织培养箱中孵育约1小时。
- 孵育1小时后，将子宫碎片转移到含有1mL Dulbecco磷酸盐缓冲溶液（DPBS）的35mm组织培养板中。
- 在解剖显微镜下，使用细镊子和 1 mL 移液管将子宫上皮与子宫管机械分离。用镊子按住子宫碎片的一端时，轻轻地将移液器尖端纵向穿过碎片，将上皮从子宫管的另一端挤出。在解剖显微镜下观察从子宫碎片分离的上皮片。
- 使用 1 mL 移液器收集上皮片并将其轻轻转移到 1.5 mL 管中。
- 对剩余的子宫碎片重复该过程，将所有上皮片转移到同一收集管中。
- 通过以375× g离心5分钟来沉淀解离的上皮片。
- 小心地除去上清液以避免干扰细胞沉淀。
- 将细胞沉淀重悬于 0.5 mL 2.5 mg/mL 胶原酶 + 2 mg/mL 脱氧核糖核酸酶溶液中。上下移液约10倍，或直到达到单细胞悬液。
- 加入 0.5 mL DMEM/F12 + 10% 胎牛血清 （FBS） + 抗生素，并以 375 × g 离心细胞 5 分钟。
注意：有关用于细胞培养的广谱抗生素的更多信息，请参阅 材料表。 - 小心地除去上清液并将细胞重悬于1mL DMEM / F12 + 10%FBS +抗生素中。将细胞以375× g离心5分钟。
2. 基质隔室的处理
注意：本节概述了分离小鼠子宫内膜基质室所需的方案。鉴于对上皮/基质共培养实验的兴趣日益浓厚，除了产生类器官的上皮细胞外，能够处理基质细胞群非常重要。
- 一旦所有的上皮通过酶和机械方式与子宫碎片分离，剩下的管状结构就是“基质/肌层”隔室。在HBSS溶液中收集2.5mg / mL胶原酶+ 2mg / mL脱氧核糖核酸酶中的组织。
- 将基质/肌层样品在37°C摇床上孵育15分钟。
- 孵育后，每只小鼠加入 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素，并通过 40 μm 细胞过滤器过滤未解离的片段。
- 通过以375× g离心5分钟来沉淀细胞。
- 小心地除去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL DMEM / F12 + 10%FBS +抗生素中。将混合物滴加到 10 cm 细胞培养板中的 10 mL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素中。将板在37°C下在加湿的细胞培养箱中孵育。
- 为了产生小鼠子宫内膜上皮和基质细胞的共培养物，请遵循使用无支架或胶原基质系统描述的人子宫内膜类器官的方法6，8。
注意：虽然这些技术尚未在小鼠中发表，但它们可以根据已发表的人子宫内膜方案进行调整。
3.将子宫上皮包封成凝胶基质以建立类器官
注意：将凝胶基质放在冰上，直到准备好使用。
- 除去上清液并将细胞沉淀重悬于细胞沉淀20倍的凝胶基质中（即，如果细胞沉淀为20μL，则用400μL凝胶基质重悬细胞）。小心地重悬颗粒以避免引入气泡。
- 让凝胶基质/细胞悬液在室温下沉降~10分钟。
- 一旦凝胶基质/细胞悬液变成半固体凝胶，使用宽口径 200 μL 吸头的 P200 微量移液器轻轻吸出 25 μL 凝胶基质/细胞悬液。在 12 孔板的每个孔中分配三个独立的 25 μL 圆顶，并使凝胶基质在 37 °C 加湿组织培养箱中固化 15 分钟。
- 凝胶基质固化后，向每个含有凝胶基质圆顶的孔中加入 750 μL 类器官培养基。在37°C的加湿组织培养箱中孵育。
注意：类器官培养基配方在 材料表中注明。类器官通常在初始培养后 4 天内形成。
4.雌二醇治疗后子宫内膜类器官的基因表达分析
注意：本节描述了在雌二醇治疗后使用实时qPCR分析子宫内膜上皮类器官基因表达的方法（E2;见表1）。由于子宫内膜处于卵巢激素E2的周期性控制之下，因此测试类器官对E2的反应性是生理功能的重要衡量标准。我们已经获得了高质量的RNA，并产生了足够的mRNA，可以使用来自子宫内膜上皮类器官的qPCR和/或RNA测序来分析基因表达。本节介绍如何收集类器官并对其进行处理，以便对基因表达进行下游分析。所选的治疗培养基反映了用于治疗培养的子宫内膜细胞的培养基。然而，应该注意的是，这种治疗培养基可以相应地优化，就像用激素8，16，17治疗人子宫内膜3D培养物一样。
- 如上所述培养子宫内膜类器官。
- 取出类器官培养基，并在接种四天后用 750 μL 饥饿培养基替换。孵育过夜。
- 第二天早上，取出饥饿介质。加入 750 μL 含有载体或 10 nM E2 的处理培养基。孵育48小时。
- 按照试剂盒制造商的方案进行RNA分离。
5. 子宫内膜类器官的组织学分析
注意：对子宫内膜类器官的形态特征进行成像对于评估生长因子，遗传操作或小分子抑制剂的细胞效应至关重要。本节介绍使用组织学染色和抗体免疫荧光染色固定、处理和成像子宫内膜上皮类器官的技术。
- 在 1x PBS 中制备含有 1 mL 4% 多聚甲醛的 1.5 mL 微量离心管。将它们放在冰上。
- 从含有类器官的 12 孔板的孔中吸出培养基。
- 使用带有切头的 1 mL 移液器吸头，将 500 μL 4% 多聚甲醛转移到每个孔中，并从板底部轻轻分离凝胶基质圆顶。
- 将整个凝胶基质圆顶轻轻吸出到移液器吸头中，然后转移到 1.5 mL 微量离心管中。
- 通过将类器官放在4°C的旋转器上过夜来固定类器官。
- 第二天早上，将试管以600× g 离心5分钟以沉淀类器官。用移液管轻轻除去4%多聚甲醛溶液并丢弃。用70%乙醇洗涤类器官2倍。
- 最后一次洗涤后，从管中取出除 50-100 μL 乙醇以外的所有乙醇。将试管放在一边。
- 将一管样品处理凝胶放入水浴和微波炉中~30秒以熔化凝胶。通过监测凝胶的稠度，确保样品处理凝胶不会沸腾。
注意：一旦样品处理凝胶融化，但不是沸腾的热，请快速封装类器官。 - 转移足够的样品处理凝胶以覆盖模具的整个表面（约 250 μL）。
- 当样品处理凝胶仍熔融时，快速转移含有类器官的 50 μL 70% 乙醇溶液。确保类器官凹陷或推到模具的底部。
- 将组织学模具放在一桶冰上，让标本处理凝胶冷却并凝固。
- 一旦样品处理凝胶完全干燥，小心地将样品处理凝胶方块转移到样品袋中，跟踪类器官所在的平面。
- 将袋子放入组织学盒中，并使用用于福尔马林固定和组织石蜡包埋的标准方法进行处理18.
- 固定并包埋在石蜡中后，使用切片机切成5μm切片19。继续进行标准的苏木精和伊红（H&E）染色或免疫染色程序，如下所述。
6. 苏木精和伊红染色
- 脱蜡切片如下：二甲苯，2 x 10分钟;100%乙醇，2 x 3分钟;80%乙醇，3分钟;60%乙醇，3分钟;dH 2 O，2x 3 分钟;苏木精1分钟;自来水（3 x 5 秒）;在伊红1分钟。
- 脱水部分如下：60%乙醇，3分钟;80%乙醇，3分钟;95%乙醇，3分钟;100%乙醇，2 x 3分钟;二甲苯，2 x 15 分钟
- 使用封片剂安装。
7. 免疫荧光染色
- 按照步骤 6.1 中所述对切片进行脱蜡。
- 进行抗原修复
- 将载玻片浸没在抗原修复溶液中，放入微波安全容器中。
- 微波高温20分钟，间隔5分钟，以确保溶液不会沸腾。
- 20分钟抗原修复步骤完成后，让载玻片在冰上冷却40分钟，同时仍浸没在抗原修复缓冲液中。
- 用 1x TBST 清洗载玻片 3 分钟
- 通过在室温下在TBST中的3%BSA中孵育1小时来封闭载玻片。
- 一抗孵育
- 在TBST中用3%BSA稀释抗体（1：50-1：1，000，取决于Ab）。
- 在加湿室中于4°C孵育过夜。
- 用TBST洗涤3 x 5分钟。
- 二抗孵育
- 用 3% BSA（TBST）（1：250）或 5% 普通驴血清稀释抗体。
- 在室温（RT）下在黑暗中孵育1小时，因为抗体与荧光团偶联。
- 核染色
- 在TBST中以1：1，000的比例稀释4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。
- 在室温下孵育5分钟。
- 用TBST洗涤2 x 5分钟。
- 安装
- 使用一滴封片剂安装盖玻片。
- 第二天用指甲油密封盖玻片。
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Representative Results
小鼠子宫内膜类器官的相衬图像
我们从WT小鼠子宫内膜上皮建立了类器官，如所附方案所述（见 图1中的图表）。在对小鼠子宫内膜上皮进行酶解离后，将上皮片与子宫基质细胞机械分离，并进一步与胶原酶解离以产生单细胞悬液。如果正确执行，这种上皮和基质细胞分离方法应产生污染不超过相反细胞类型10%-15%的样品（参见 图2中的免疫荧光图像）。然后将上皮细胞沉淀重悬于凝胶基质中，在室温下凝胶，并接种到组织培养板上的25μL圆顶中。凝胶基质圆顶凝固后，用类器官培养基覆盖它们并使其生长。我们通常观察到子宫内膜上皮细胞在3-4天内组装成类器官，如图 3所示。类器官在培养物中保持，每3天更换一次培养基，每5-7天传代一次。
使用组织学和免疫荧光染色对小鼠子宫内膜类器官进行成像
为了分析小鼠上皮类器官的形态，我们调整了使用标本处理凝胶20包封细胞细针抽吸物的方法。这允许保留子宫内膜类器官形态并封装到可以进行处理以准备石蜡包埋的基质中。标本处理凝胶是一种改良琼脂，广泛用于临床病理学实验室，用于分析细针抽吸物，并已用于包封阴道类器官21，22。样品处理凝胶/类器官混合物凝固后，可以使用通常用于分析组织的技术对其进行处理、染色和成像。在图4A，B中，我们显示切片的福尔马林固定石蜡嵌入的子宫内膜类器官可以通过苏木精和伊红染色剂可视化，其显示单层上皮和类器官的空心中心 - 管腔。某些类器官在管腔中还含有分泌物，表明类器官获得了腺上皮细胞的功能特性。我们还描述了使用免疫染色可视化类器官的技术（图4C，D）;切片子宫内膜类器官与细胞角蛋白8一抗（TROMA-1）和荧光团偶联二抗（二抗大鼠-594）一起孵育。然后用DAPI观察细胞核，并使用荧光显微镜对载玻片进行成像。我们观察到类器官中的所有细胞都是细胞角蛋白8阳性，并且含有DAPI，这表明子宫内膜类器官的固定，包埋和处理与基于抗体的免疫染色兼容。
RNA提取和基因表达分析
为了确定子宫内膜类器官的基因表达反应，我们允许WT小鼠的子宫内膜类器官在第一次传代后生长4天。在治疗前一天晚上，将子宫内膜类器官培养基改为饥饿培养基。然后将类器官在一式三份孔（每个孔包含三个圆顶）中用载体（乙醇;用于雌二醇的溶液中等体积）或10nM雌二醇（E2）处理总共48小时。48小时后，除去培养基，并处理类器官以进行RNA提取。从每个孔的总共两个圆顶中可以获得大约 4 μg RNA，并且使用 1 μg RNA 逆转录 cDNA。使用实时定量PCR扩增编码脂质运载蛋白2（Lcn2），乳铁蛋白（Ltf）和孕酮受体（Pgr）的基因（图5和表1）23，24，25。正如预期的那样，我们观察到在用10nM E2刺激后，Lcn2，Ltf和Pgr在上皮类器官中的表达增加（图5）。因此，这些结果表明，子宫内膜上皮类器官可以成功地用于测量响应E2的基因表达变化。
图 1：用于建立子宫内膜类器官的程序。 该图概述了（A）从小鼠子宫内膜建立和（B）传代上皮类器官所遵循的关键步骤。（A）方法包括子宫内膜上皮与小鼠子宫的酶促和机械解离，然后单细胞分散并将上皮包封成凝胶基质。为了获得用于酶解离的子宫组织，用细剪刀将卵巢和输卵管从子宫角上取出，横向切成4-5mm的碎片，然后放入酶溶液中。酶孵育后，使用镊子和移液管在显微镜下将子宫内膜上皮与下面的基质机械分离，以从子宫管中“挤出”上皮。通过在胶原酶中短孵育，将上皮进一步消化成上皮细胞，然后封装到凝胶基质中。（B）传代子宫内膜类器官需要在冷培养基中进行机械解离并离心以从基质中释放类器官并产生较小的类器官片段。一旦类器官从基质中释放出来并机械地解离成更小的片段，它们就会被封装到基质中并重新铺板。 请点击此处查看此图的大图。
图2：分离的子宫内膜上皮和基质细胞群的免疫染色。 免疫荧光图像显示子宫酶法和机械分离后（A，B）上皮细胞和（C，D）基质细胞组分的上皮和基质细胞群。细胞角蛋白8（上皮细胞标志物）显示为红色，vimentin（基质细胞标志物）显示为绿色，DAPI（核标志物）显示为蓝色。比例尺 = 100 μm （A，C）， 20 μm （B，D）。缩写：CK8 = 细胞角蛋白 8;VIM = 维门汀;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。
图3：WT小鼠在4天内子宫内膜类器官的形成。 从WT小鼠中分离子宫内膜上皮并用于产生类器官。（A）消化后立即封装在凝胶基质中的上皮细胞的相差图像（第0天）。（乙，丙）在培养的第1天（B）和第2天（C）可以观察到一些小的类器官。（D）在培养的第3天可以观察到更大和成熟的上皮类器官。图像是用5倍物镜拍摄的;比例尺 = 200 μm。缩写：WT = 野生类型。 请点击此处查看此图的大图。
图4：子宫内膜类器官的组织学分析 。 （A，B）FFPE子宫内膜上皮类器官切片并用H&E染色。 （C，D）FFPE上皮类器官用上皮细胞标志物细胞角蛋白8（红色）免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 200 μm （A）， 100 μm （C）， 50 μm （B，D）。缩写：FFPE = 福尔马林固定石蜡包埋;H&E = 苏木精和伊红;CK8 = 细胞角蛋白 8;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。
图5：小鼠子宫内膜类器官的基因表达分析。WT小鼠的小鼠子宫内膜上皮类器官在类器官生长培养基中培养4天，然后在补充有2%木炭剥离FBS的DMEM / F12中用载体或10nM E2处理48小时。（一，二）用载体（A）或10nM E2（B）处理后WT小鼠类器官的相衬图像。（中欧）用载体或 10 nM E2 处理的上皮子宫内膜类器官的实时 qPCR 分析。E2调节基因，脂质运载蛋白2（Lnc2），乳铁蛋白（Ltf）和孕酮受体（Pgr）的表达。条形表示 SEM 的平均值±通过双尾 t 检验进行分析;*p < 0.033， **p < 0.002， ***p < 0.001。用每个条件从n = 3 WT小鼠衍生的类器官重复。比例尺 = 200 μm （A，B）。缩写：WT = 野生类型;E2=雌二醇;qPCR = 定量聚合酶链反应。请点击此处查看此图的大图。
| 引物序列 | 前锋 （5'-3'） | 反向 （5'-3'） |
| 脂卡林 2 （Lcn2） | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC |
| 乳铁蛋白 | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC |
| 黄体酮 | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG |
| 甘油醛 3 磷酸脱氢酶 （Gapdh） | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
| PCR混合物含有： |
| 2x 海上鞘翅绿 |
| 0.5 μM 前驱底漆 |
| 0.5 μM 修订底漆 |
| cDNA |
| 无脱氧核酸酶/脱氧核糖核酸酶H 2O |
| 循环仪条件： | |||
| 温度 | 时间 | 周期 | |
| 拿 | 95 °C | 10 分钟 | 1 |
| 变性 | 95 °C | 15 秒 | 40 |
| 扩展 | 60 °C | 60 秒 |
表1：引物序列和PCR条件。
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Discussion
在这里，我们描述了从小鼠子宫内膜生成子宫内膜上皮类器官的方法以及常规用于其下游分析的方案。子宫内膜类器官是研究控制子宫内膜相关疾病（如子宫内膜异位症、子宫内膜癌和植入失败）的机制的有力工具。2017年发表的具有里程碑意义的研究报告了长期和可再生培养小鼠和人类上皮子宫内膜类器官的条件4，5。尽管类器官已被广泛用于研究其他系统中的生物学途径，但由于缺乏合适的模型来研究培养物中未转化的原代上皮，体外子宫内膜组织的研究受到限制26。使用通常用于培养来自其他器官组织（如肠道、肾脏和肺）的类器官的条件，并将它们嵌入由凝胶基质组成的细胞外基质支架中，成功建立了源自人和小鼠子宫内膜的子宫内膜类器官4。自这些初步报告以来，科学界使用子宫内膜类器官研究子宫内膜生物学的情况显着增加。
通过修改先前发表的从小鼠子宫27，28中分离上皮的方法，该协议独特地突出了通过将组织直接放入酶溶液中来分离小鼠子宫的关键步骤，绕过了横断子宫或使用过滤的需要。使用这种方法，我们获得了纯度为~85%-90%的上皮，如细胞角蛋白8和vimentin免疫染色所测定的那样（图2）。该协议还清楚地概述了将分离的上皮细胞封装到生长基质中以生成，维持和传代类器官的关键细节。图4中的图像和我们未发表的研究已经确定了类器官培养物中粘蛋白和腺细胞（即FOXA2阳性）的存在29。这些表明，这里介绍的方法对于从小鼠子宫内膜中分离腺和管腔上皮细胞群是有效的。
这些类器官生长的主要限制包括使用商业基质（即基质胶），这可能导致批次间的变化，并包含可能影响类器官生长的生长因子。此外，虽然这些类器官含有纯子宫上皮，但最近在子宫内膜8，30的人类类器官系统中描述了使用其他子宫内膜细胞类型（即免疫，基质）。其他小组已经显示出从小鼠子宫中分离腔内和腺体上皮细胞以进行类器官培养的能力14。
这种方法使用来自小动物模型的组织，该模型相对常见且可供大多数研究人员使用;从较大的动物模型或人类生成子宫内膜类器官可能会带来伦理或技术挑战，这可以通过使用基于诱导多能干细胞（iPSC）的技术来克服。这些技术先前已描述用于子宫内膜组织31，生殖道的其他组织32，并已有效地用于体外研究子宫内膜/胎盘相互作用33。 因此，使用iPSCs作为来自人类和其他大型动物模型的子宫内膜基质和子宫内膜上皮细胞的来源，为产生子宫内膜类器官提供了一种可再生且可访问的来源。
虽然小鼠是研究植入的广泛使用的模型，但应该注意小鼠和人类之间植入机制的关键进化差异。例如，虽然间质植入的特征是通过管腔上皮侵入底层基质的深滋养层，但入侵过程的机制在小鼠和灵长类动物之间有所不同34。在小鼠中，滋养层通过管腔上皮侵袭涉及细胞凋亡或内翻35，36，而滋养层在管腔上皮之间迁移到灵长类动物34，35的底层基质中。
为子宫内膜类器官提供必要的生长因子以支持自我组装和长期更新对于获得概括天然组织的子宫内膜类器官培养物至关重要。子宫内膜类器官的复杂培养基组成表明了有助于上皮细胞特征的多种信号通路，并且来自旁分泌和自分泌来源。子宫内膜的基质区室是多种细胞类型的复杂组合，包括成纤维细胞样基质细胞、内皮细胞、巨噬细胞和其他响应雌激素和孕激素而不断变化的特殊免疫细胞37。
例如，类器官培养基含有激活类器官中WNT/β-连环蛋白信号传导的因子，例如WNT3a和R-Spondin。小鼠研究表明，WNT配体对子宫发育和腺体功能至关重要;因此，该信号通路的激活对于类器官的发育和维持至关重要38，39。R-Spondin扩增WNT信号传导，是富含亮氨酸的重复蛋白G蛋白偶联受体（LGR5）40的配体。子宫内膜类器官培养还需要抑制转化生长因子β （TGFβ） 和骨形态发生蛋白 （BMP） 信号通路。例如，子宫内膜类器官培养基含有BMP抑制剂Noggin，这是一种分泌蛋白，可结合并灭活BMP2，BMP4和BMP741。药物抑制剂A83-01也存在于子宫内膜类器官培养基中。A83-01 是一种小分子抑制剂，对受体 ALK4、ALK5 和 ALK742 具有高度特异性。ALK4/5/7 是 TGFβ 信号传导家族的 1 型受体，可结合并传递由配体（如 TGFβ、激活素或淋巴结）引发的信号。BMP信号对于肠道43 和毛囊44等组织中的干细胞维持至关重要。TGFβ信号传导的抑制有助于子宫内膜间充质干细胞45的增殖能力和集落形成效率，这是通过重塑染色质46中的关键区域发生的。因此，调节这两种关键信号通路BMP和TGFβ对于维持具有自我更新能力的类器官培养物是必要的。
虽然这里没有显示，但我们发现用ALK4 / 5 / 7抑制剂A83-01长期培养小鼠类器官在连续三到四次传代后导致上皮类器官的形态变化（Kriseman等人，正在审查中）。上皮类器官的形态变化让人想起Boretto等人描述的“致密”上皮类器官4，其中由于WNT配体的旁分泌分泌减少，发生了更多分泌样细胞的发育。因此，TGFβ和WNT信号通路可能相交以控制子宫内膜上皮类器官的再生和分化。
最近的研究已经从人体组织产生了3D子宫内膜上皮/基质共培养系统7，8，16。一种共培养方法利用无支架系统，其中子宫内膜上皮细胞和基质细胞结合，并允许使用定义的培养基在无支架孔中组装成 3D 结构。这些3D子宫内膜上皮/基质类器官不仅表达雌激素，孕激素和雄激素的受体，而且还忠实地概括了对卵巢激素（雌激素和孕激素6，7）的反应。在Rawlings等人的一项研究中使用的另一种共培养方法中，子宫内膜上皮类器官与胶原基质中的基质细胞结合，并在修饰的类器官培养基中生长8。这些上皮/基质共培养的类器官或组合物组织成悬浮的3D系统，其中基质细胞围绕上皮腺样结构。
大多数子宫内膜类器官在生长因子还原凝胶基质中培养;然而，基质中活性化合物的存在可能会在类器官内产生不希望的细胞反应。为了克服这一限制，类器官已经在无凝胶基质支架中建立，例如3D打印琼脂糖模具，其中允许单个类器官自组装6。其他小组已经开发出合成水凝胶，作为子宫内膜类器官培养的3D基质47。这些类器官组装成具有顶基底极性的3D结构，也可以与子宫内膜的基质细胞结合形成复杂的类器官48。由于类器官可以以2D细胞培养无法成功的方式培养未转化的原代人和小鼠子宫内膜组织，因此毫无疑问，子宫内膜类器官将推动女性生殖健康领域的发展，并成为研究生殖病理学（如复发性流产，子宫内膜异位症和子宫内膜癌）的令人难以置信的工具16，49，50.
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢Stephanie Pangas博士和Martin M. Matzuk博士（M.M.M.）对我们手稿的批判性阅读和编辑。研究得到了 Eunice Kennedy Shriver 国家儿童健康与人类发展研究所拨款R00-HD096057（D.M.），R01-HD105800（D.M.），R01-HD032067（M.M.M.）和R01-HD110038（M.M.M.）以及NCI-P30癌症中心支持补助金（NCI-CA125123）的支持。Diana Monsivais博士持有Burroughs Wellcome Fund颁发的下一代怀孕奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid Media Formulation | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
| Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| Other supplies and reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
| Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
| Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
| Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
| Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
| Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
| VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
| Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
| Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
| ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
| Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
| Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
| Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
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