Summary
이 프로토콜은 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위한 마우스 자궁내막 상피 오가노이드를 확립하는 방법론을 설명합니다.
Abstract
자궁 내막 조직은 자궁의 내강을 따라 늘어서 있으며 에스트로겐과 프로게스테론의 주기적 통제하에 있습니다. 그것은 내강 및 선 상피, 간질 구획, 혈관 네트워크 및 복잡한 면역 세포 집단으로 구성된 조직입니다. 마우스 모델은 자궁 내막을 연구하는 강력한 도구였으며 이식, 태반 및 암을 제어하는 중요한 메커니즘을 밝혀 냈습니다. 최근 3D 자궁내막 오가노이드 배양의 개발은 자궁내막 생물학의 기초가 되는 신호 전달 경로를 해부하는 최첨단 모델을 제시합니다. 유전자 조작 마우스 모델에서 자궁내막 오가노이드를 확립하고, 전사체를 분석하고, 단일 세포 분해능으로 형태를 시각화하는 것은 자궁내막 질환 연구에 중요한 도구입니다. 이 논문은 마우스에서 자궁 내막 상피의 3D 배양을 확립하는 방법을 설명하고 유전자 발현을 정량화하고 오가노이드의 조직학을 분석하는 기술을 설명합니다. 목표는 자궁내막 상피 오가노이드의 유전자 발현 및 형태학적 특성을 확립, 배양 및 연구하는 데 사용할 수 있는 리소스를 제공하는 것입니다.
Introduction
자궁강의 내부 안감 점막 조직인 자궁내막은 여성의 생식 건강에 중요한 역할을 하는 독특하고 매우 역동적인 조직입니다. 생식 수명 동안 자궁 내막은 난소 호르몬 인 에스트로겐과 프로게스테론의 공동 작용에 의해 조정 된 수백 번의 증식, 분화 및 분해주기를 겪을 가능성이 있습니다. 유전자 조작 마우스에 대한 연구는 호르몬에 대한 자궁 내막 반응과 배아 이식, 기질 세포 탈락 및 임신 조절을 뒷받침하는 기본적인 생물학적 메커니즘을 밝혀 냈습니다1. 그러나 시험관 내 연구는 전통적인 2D 세포 배양 2,3에서 형질전환되지 않은 일차 마우스 자궁내막 조직을 유지하는 데 어려움이 있기 때문에 제한적이었습니다. 최근 3D 장기 시스템 또는 오가노이드와 같은 자궁내막 조직 배양의 발전은 자궁내막 세포 재생 및 분화를 제어하는 생물학적 경로를 조사할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. 마우스 및 인간 자궁내막 오가노이드 시스템은 다양한 매트릭스4,5에 캡슐화된 순수한 자궁내막 상피로부터 개발되었으며, 인간 자궁내막은 스캐폴드가 없는 상피/기질 공동 배양6,7로, 보다 최근에는 콜라겐 캡슐화된 상피/기질 집합체8로 배양되었습니다. . 상피 오가노이드 배양의 성장 및 재생 잠재력은 오가노이드 4,5,9의 성장 및 재생을 최대화하기 위해 경험적으로 결정된 성장 인자 및 소분자 억제제의 정의된 칵테일에 의해 뒷받침됩니다. 또한, 자궁내막 오가노이드를 동결 및 해동하는 능력은 향후 연구를 위해 생쥐와 인간의 자궁내막 오가노이드의 장기 뱅킹을 허용합니다.
유전자 조작 마우스는 임신 초기와 탈락을 제어하는 복잡한 신호 전달 경로를 밝혀 냈으며 임신 손실, 자궁 내막 암 및 자궁 내막증의 모델로 사용되었습니다. 이러한 유전 연구는 여성 생식 조직에서 특이적으로 활성인 cre 재조합 효소를 사용하여 loxP 측면 대립 유전자 ( "플록스")의 세포 특이 적 결실로 크게 달성되었습니다. 이러한 마우스 모델에는 자궁 내막 상피 및 기질 조직에서 강력한 재조합 효소 활성을 갖는 널리 사용되는 프로게스테론 수용체 -cre10, 성인 마우스에서 자궁 내막 상피 재조합을 유도하는 락토페린 i-cre11 또는 뮐러 유래 조직에서 상피 특이 적 결실을 유발하는 Wnt7a-cre 12가 포함됩니다. . 유전자 조작 마우스 모델에서 자궁내막 조직을 3D 오가노이드로 배양하는 것은 자궁내막 생물학을 조사하고 자궁내막 세포 재생 및 분화를 제어하는 성장 인자 및 신호 전달 경로의 식별을 용이하게 할 수 있는 훌륭한 기회를 제공했습니다13,14. 마우스 자궁 내막 조직의 분리 및 배양 방법은 문헌에 기재되어 있으며 자궁 내막 상피 유기체의 후속 배양을위한 자궁 상피의 분리를위한 다양한 효소 전략의 사용을보고한다4. 이전 문헌이 자궁내막 상 피 오가노이드 배양 프로토콜 4,5,6에 대한 중요한 프레임워크를 제공했지만, 이 백서는 이러한 오가노이드를 생성, 유지, 처리 및 분석하기 위한 명확하고 포괄적인 방법을 제공합니다. 이러한 기술의 표준화는 여성 생식 생물학 분야의 발전을 가속화하는 데 중요합니다. 여기에서, 우리는 겔 매트릭스 스캐폴드에서 자궁내막 오가노이드의 후속 배양을 위한 마우스 자궁내막 상피 조직의 효소적 및 기계적 정제를 위한 상세한 방법론을 보고한다. 또한 겔 매트릭스 캡슐화 마우스 자궁내막 상피 오가노이드의 다운스트림 조직학적 및 분자 분석을 위한 방법론을 설명합니다.
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Protocol
마우스 취급 및 실험 연구는 Baylor College of Medicine의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 한 프로토콜과 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 가이드에서 수립 한 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 효소 및 기계적 방법을 사용한 마우스에서 자궁 상피 분리
참고: 이 섹션에서는 겔 매트릭스 스캐폴드를 사용하여 마우스로부터 상피 자궁내막 오가노이드를 확립, 계대, 동결 및 해동하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 이전 연구에서는 발정기4상 동안 마우스에서 마우스 자궁내막 오가노이드의 최적 배양이 확립되는 것으로 확인되었으며, 이는 질 면봉(15)의 세포학적 검사에 의해 결정될 수 있습니다. 성체 암컷 WT 마우스 (6-8주령, 하이브리드 C57BL/6J 및 129S5/SvEvBrd)를 모든 실험에 사용하였다. 마우스는 이소플루란 진정 작용과 자궁 경부 관절 분리를 사용하여 IACUC 승인 지침에 따라 인도적으로 안락사되었습니다. 마우스가 안락사되면 다음 단계를 따라야합니다. 이 프로토콜에 사용되는 재료 및 솔루션과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 사용하기 전에 젤 매트릭스가 얼음에서 약 1-2시간 동안 해동되도록 두십시오.
- 마우스를 해부하려면 가위를 사용하여 복부에 중간 선 절개를하고 피부를 부드럽게 벗겨 기본 복막층을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 복막층을 지탱하고 가위로 옆으로 절개하여 복부 내용물을 노출시킵니다.
- 복부 지방 패드를 부드럽게 옆으로 움직여 자궁 뿔을 찾습니다. 먼저 자궁 경부 접합부에 잡고 가위를 사용하여 장간막 지방을 따라 잘라서 해부하십시오. 마우스 자궁을 해부 한 후 작은 가위로 자궁 뿔에서 지방 조직을 철저히 제거하십시오.
참고: 사용하기 전에 모든 수술 도구를 멸균하여 세포 분리 중에 멸균을 유지하고 마우스 복부에 70% 에탄올을 뿌리고 멸균 조직 배양 후드 아래에서 해부 후 모든 단계를 수행합니다.
- 복부 지방 패드를 부드럽게 옆으로 움직여 자궁 뿔을 찾습니다. 먼저 자궁 경부 접합부에 잡고 가위를 사용하여 장간막 지방을 따라 잘라서 해부하십시오. 마우스 자궁을 해부 한 후 작은 가위로 자궁 뿔에서 지방 조직을 철저히 제거하십시오.
- 각 자궁 뿔을 각각 약 4-5mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
- 한 자궁의 모든 자궁 조각을 1 % 트립신 0.5mL가 들어있는 24 웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 효소 용액이 자궁 내강으로 들어가도록 하여 자궁내막 상피를 밑에 있는 간질에서 효소적으로 분리합니다.
- 24웰 플레이트를 37°C 가습 조직 배양 인큐베이터에서 약 1시간 동안 배양합니다.
- 1시간 배양 후 자궁 단편을 Dulbecco의 인산염 완충 용액(DPBS) 1mL가 포함된 35mm 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.
- 해부 현미경에서 미세한 집게와 1mL 피펫을 사용하여 자궁관에서 자궁 상피를 기계적으로 분리합니다. 집게로 자궁 조각의 한쪽 끝을 누른 상태에서 피펫 팁을 조각을 가로질러 세로로 부드럽게 움직여 자궁관의 다른 쪽 끝에서 상피를 짜냅니다. 해부 현미경으로 자궁 단편으로부터 분리 된 상피 시트를 관찰하십시오.
- 1mL 피펫을 사용하여 상피 시트를 수집하고 1.5mL 튜브에 부드럽게 옮깁니다.
- 나머지 자궁 조각에 대해이 과정을 반복하여 모든 상피 시트를 동일한 수집 튜브로 옮깁니다.
- 해리된 상피 시트를 375 × g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화한다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않도록 상청액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 세포 펠릿을 0.5mL의 2.5mg/mL 콜라게나제 + 2mg/mL DNase 용액에 재현탁합니다. 약 10배 위아래로 또는 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 피펫팅합니다.
- 0.5mL의 DMEM/F12 + 10% 소 태아 혈청(FBS) + 항생제를 추가하고 375×g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
참고: 세포 배양에 사용되는 광범위한 항생제에 대한 추가 정보는 재료 표를 참조하십시오. - 상청액을 조심스럽게 제거하고 1mL의 DMEM/F12 + 10% FBS + 항생제에 세포를 재현탁시킵니다. 세포를 375 × g에서 5분 동안 원심분리합니다.
2. 기질 구획의 가공
참고: 이 섹션에서는 마우스 자궁내막의 기질 구획을 분리하는 데 필요한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 상피/기질 공동 배양 실험에 대한 관심이 증가함에 따라 오가노이드를 생성할 상피 세포 외에 기질 세포 집단을 처리할 수 있는 것이 중요합니다.
- 모든 상피가 자궁 조각에서 효소 적으로 기계적으로 분리되면 나머지 튜브와 같은 구조는 "기질 / 자궁 내막"구획입니다. HBSS 용액에서 2.5 mg/mL 콜라게나제 + 2 mg/mL DNase에 이 조직을 수집합니다.
- 기질/자궁내막 샘플을 37°C 쉐이커에서 15분 동안 배양합니다.
- 배양 후 마우스당 500μL의 DMEM/F12 + 10% FBS + 항생제를 추가하고 40μm 세포 필터를 통해 해리되지 않은 단편을 필터링합니다.
- 세포를 375 × g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한다.
- 상청액을 조심스럽게 제거하고 1mL의 DMEM/F12 + 10% FBS + 항생제에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 혼합물을 10cm 세포 배양 플레이트에 DMEM/F12 + 10% FBS + 항생제 10mL에 적가합니다. 플레이트를 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
- 마우스 자궁내막 상피 및 기질 세포의 공동-배양을 생성하려면, 스캐폴드-프리 또는 콜라겐 매트릭스 시스템 6,8을 사용하여 인간 자궁내막 오가노이드에 대해 기재된 방법을 따른다.
참고: 이러한 기술은 아직 마우스에 대해 발표되지 않았지만 인간 자궁내막과 함께 게시된 프로토콜을 기반으로 조정할 수 있습니다.
3. 자궁 상피를 겔 매트릭스로 캡슐화하여 오가노이드 설정
알림: 사용할 준비가 될 때까지 젤 매트릭스를 얼음 위에 보관하십시오.
- 상청액을 제거하고 세포 펠릿의 20배인 부피의 겔 매트릭스로 세포 펠릿을 재현탁시킨다(즉, 세포 펠릿이 20μL인 경우, 세포를 400μL의 겔 매트릭스로 재현탁시킨다). 기포가 발생하지 않도록 펠릿을 조심스럽게 다시 매달아 놓으십시오.
- 겔 매트릭스/세포 현탁액이 실온에서 ~10분 동안 침전되도록 합니다.
- 겔 매트릭스/세포 현탁액이 반고체 겔이 되면 넓은 구멍의 200μL 팁이 있는 P200 마이크로피펫을 사용하여 25μL의 겔 매트릭스/세포 현탁액을 부드럽게 흡입합니다. 12웰 플레이트의 웰당 3개의 개별 25μL 돔을 분주하고 겔 매트릭스가 37°C 가습 조직 배양 인큐베이터에서 15분 동안 경화되도록 합니다.
- 겔 매트릭스가 경화된 후 겔 매트릭스 돔을 포함하는 각 웰에 750μL의 오가노이드 배지를 추가합니다. 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
알림: 오가노이드 배지 제형은 재료 표에 나와 있습니다. 오가노이드는 일반적으로 초기 배양 후 4일 이내에 형성됩니다.
4. 에스트라디올 처리 후 자궁내막 오가노이드의 유전자 발현 분석
참고: 이 섹션에서는 에스트라디올로 치료한 후 실시간 qPCR을 사용하여 자궁내막 상피 오가노이드의 유전자 발현을 프로파일링하는 데 사용되는 방법을 설명합니다(E2; 표 1 참조). 자궁 내막은 난소 호르몬 E2의 주기적 제어하에 있기 때문에 E2에 대한 유기체의 반응성을 테스트하는 것은 생리 기능의 중요한 척도입니다. 우리는 고품질 RNA를 얻었고 자궁내막 상피 오가노이드에서 qPCR 및/또는 RNA 시퀀싱을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기에 충분한 mRNA를 생성했습니다. 이 섹션에서는 유전자 발현의 다운스트림 분석을 위해 오가노이드를 수집하고 처리하는 방법을 설명합니다. 선택된 치료 배지는 배양된 자궁내막 세포를 치료하기 위해 사용된 배지를 반영한다. 그러나, 이러한 치료 배지는 호르몬 8,16,17로 인간 자궁내막 3D 배양물의 치료에 대해 행해진 바와 같이, 그에 따라 최적화될 수 있다는 것에 유의해야 한다.
- 상기 기재된 바와 같이 자궁내막 오가노이드를 배양한다.
- 오가노이드 배지를 제거하고 파종 4일 후 750μL의 기아 배지로 교체합니다. 밤새 배양하십시오.
- 다음날 아침, 기아 배지를 제거하십시오. 비히클 또는 10 nM E2를 포함하는 750 μL의 처리 배지를 추가합니다. 48 시간 동안 배양하십시오.
- 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 분리를 진행합니다.
5. 자궁내막 오가노이드의 조직학적 분석
참고: 자궁내막 오가노이드의 형태학적 특징을 영상화하는 것은 성장 인자, 유전자 조작 또는 소분자 억제제의 세포 효과를 평가하는 데 중요합니다. 이 섹션에서는 조직학적 염색 및 항체 면역형광 염색을 사용하여 자궁내막 상피 오가노이드를 고정, 처리 및 이미지화하는 데 사용되는 기술을 설명합니다.
- 1x PBS에 1mL의 4% 파라포름알데히드가 포함된 1.5mL 미세 원심분리 튜브를 준비합니다. 얼음 위에 놓으십시오.
- 오가노이드를 함유하는 12-웰 플레이트의 웰로부터 배지를 흡인한다.
- 절단 팁이 있는 1mL 피펫 팁을 사용하여 500μL의 4% 파라포름알데히드를 각 웰로 옮기고 플레이트 바닥에서 겔 매트릭스 돔을 부드럽게 분리합니다.
- 전체 겔 매트릭스 돔을 피펫 팁으로 부드럽게 흡입하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 오가노이드를 4°C의 회전 장치에 밤새 놓아 고정합니다.
- 다음날 아침, 튜브를 600×g에서 5 분 동안 원 심분리하여 오가노이드를 펠릿화합니다. 피펫으로 4% 파라포름알데히드 용액을 부드럽게 제거하고 버립니다. 유기체를 70 % 에탄올로 2 배 세척하십시오.
- 마지막 세척 후 튜브에서 50-100 μL의 에탄올을 제외한 모든 것을 제거합니다. 튜브를 따로 보관하십시오.
- 표본 처리 젤 튜브를 수조에 넣고 전자레인지에 ~30초 동안 가열하여 젤을 녹입니다. 겔의 일관성을 모니터링하여 시편 처리 젤이 끓지 않는지 확인하십시오.
알림: 시편 처리 젤이 녹았지만 뜨겁게 끓지 않으면 신속하게 작업하여 오가노이드를 캡슐화합니다. - 금형의 전체 표면을 덮을 만큼 충분한 시편 처리 젤을 옮깁니다(약 250μL).
- 시편 처리 겔이 여전히 용융된 동안, 오가노이드를 함유한 50 μL의 70% 에탄올 용액을 신속하게 옮깁니다. 오가노이드가 가라앉거나 금형의 바닥 부분으로 밀려 있는지 확인하십시오.
- 조직학 몰드를 얼음 양동이에 놓고 시편 처리 젤이 냉각되고 응고되도록합니다.
- 시편 처리 젤이 완전히 건조되면 표본 처리 젤을 표본 백에 조심스럽게 옮기고 오가노이드가 있는 평면을 추적합니다.
- 백을 조직학 카세트에 넣고 포르말린 고정 및 조직의 파라핀 매립에 사용되는 표준 방법을 사용하여 처리한다(18).
- 파라핀에 고정하고 매립한 후, 마이크로톰19를 사용하여 5 μm 섹션으로 절편화하였다. 아래에 설명된 대로 표준 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 또는 면역염색 절차를 진행합니다.
6. 헤마톡실린 & 에오신 염색
- 다음과 같이 섹션을 탈파라핀화합니다: 크실렌, 2 x 10분; 100 % 에탄올, 2 x 3 분; 80 % 에탄올, 3 분; 60 % 에탄올, 3 분; dH2O, 2 x 3분; 헤마톡실린에서 1분; 수돗물 (3 x 5 초); 에오신에서 1분.
- 다음과 같이 섹션을 탈수하십시오 : 60 % 에탄올, 3 분; 80 % 에탄올, 3 분; 95 % 에탄올, 3 분; 100 % 에탄올, 2 x 3 분; 자일렌, 2 x 15분
- 장착 매체를 사용하여 장착하십시오.
7. 면역형광염색
- 6.1단계에 설명된 대로 섹션을 분리합니다.
- 항원 검색 수행
- 슬라이드를 항원 검색 용액에 전자 레인지 용 용기에 담그십시오.
- 용액이 끓지 않도록 20분 간격으로 5분 동안 전자레인지에 돌립니다.
- 20분 항원 회수 단계가 완료된 후, 슬라이드를 항원 회수 완충액에 잠긴 상태에서 40분 동안 얼음 위에서 식히도록 합니다.
- 1x TBST로 슬라이드를 3분 동안 세척합니다.
- 실온에서 1시간 동안 TBST 중 3% BSA에서 인큐베이션하여 슬라이드를 차단합니다.
- 1차 항체 배양
- 항체를 TBST에서 3% BSA로 희석합니다(Ab에 따라 1:50-1:1,000).
- 가습 챔버에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
- TBST로 3 회 5 분 동안 씻으십시오.
- 2차 항체 배양
- 항체를 3% BSA(TBST) (1:250) 또는 5% 정상 당나귀 혈청으로 희석합니다.
- 항체가 형광단에 접합되기 때문에 어둠 속에서 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
- 핵 염색
- TBST에서 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌 (DAPI) 1 : 1,000을 희석하십시오.
- RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
- TBST로 2 회 5 분 동안 씻으십시오.
- 장착
- 장착 매체 한 방울을 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
- 다음날 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하십시오.
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Representative Results
마우스 자궁내막 오가노이드의 위상차 이미지
첨부된 프로토콜에 설명된 대로 WT 마우스 자궁내막 상피에서 오가노이드를 확립했습니다( 그림 1의 다이어그램 참조). 마우스 자궁 내막 상피의 효소 해리에 이어, 상피 시트를 자궁 기질 세포로부터 기계적으로 분리하고 콜라게나제로 더 해리시켜 단일 세포 현탁액을 생성시켰다. 올바르게 수행되면 이 상피 및 기질 세포 분리 방법은 반대 세포 유형의 10%-15% 이하의 오염을 가진 샘플을 생성해야 합니다( 그림 2의 면역형광 이미지 참조). 이어서, 상피 세포 펠렛을 겔 매트릭스에 재현탁시키고, 실온에서 겔화시키고, 조직 배양 플레이트 상의 25 μL 돔으로 플레이팅하였다. 겔 매트릭스 돔이 응고 된 후, 이들은 유기체 배지로 겹쳐서 성장시켰다. 우리는 일반적으로 자궁 내막 상피 세포가 그림 3과 같이 3-4 일 이내에 유기체로 조립되는 것을 관찰했습니다. 오가노이드는 배양에서 유지되었으며, 배지 변화는 3일마다 발생하고 5-7일마다 계대배양되었습니다.
조직학적 및 면역형광 염색을 사용한 마우스 자궁내막 오가노이드의 이미징
마우스 상피 오가노이드의 형태를 분석하기 위해, 우리는 표본 처리 겔20을 사용하여 세포 미세 바늘 흡인물의 캡슐화에 사용되는 방법을 채택했습니다. 이것은 자궁 내막 오가노이드 형태의 보존을 허용하고 파라핀 임베딩을 준비하기 위해 처리를 거칠 수있는 매트릭스로 캡슐화합니다. 표본 처리 젤은 미세 바늘 흡인물 분석을 위해 임상 병리학 실험실에서 널리 사용되는 변형 된 한천이며 질 오가노이드21,22를 캡슐화하는 데 사용되었습니다. 검체 처리 겔/오가노이드 혼합물이 응고된 후 일반적으로 조직 분석에 사용되는 기술로 처리, 염색 및 이미징할 수 있습니다. 그림 4A, B에서 우리는 절편된 포르말린 고정 파라핀 포매 자궁내막 오가노이드가 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 시각화될 수 있음을 보여주며, 이는 오가노이드의 상피 및 중공 중심(내강)의 단일 층을 표시합니다. 특정 유기체는 또한 내강에 분비물을 함유하는데, 이는 오가노이드가 선 상피 세포의 기능적 특성을 획득한다는 것을 나타냅니다. 또한 면역염색을 사용하여 오가노이드를 시각화하는 기술도 설명합니다(그림 4C, D). 절편화된 자궁내막 오가노이드를 시토케라틴 8 1차 항체 (TROMA-1) 및 형광단-접합된 2차 항체 (2차 항-rat-594)와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 핵을 DAPI로 시각화하고 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지화했습니다. 우리는 오가노이드의 모든 세포가 사이토케라틴 8 양성이고 DAPI를 함유하고 있음을 관찰했으며, 이는 자궁내막 오가노이드의 고정, 매립 및 처리가 항체 기반 면역염색과 양립할 수 있음을 나타냅니다.
RNA 추출 및 유전자 발현 분석
자궁내막 오가노이드의 유전자 발현 반응을 결정하기 위해, 우리는 WT 마우스의 자궁내막 오가노이드가 첫 번째 계대 후 4일 동안 성장하도록 허용했습니다. 치료 전날 저녁에, 자궁내막 오가노이드 배지를 기아 배지로 변경하였다. 이어서, 오가노이드를 총 48시간 동안 비히클(에탄올; 에스트라디올에 사용되는 것과 동일한 부피의 용액) 또는 10nM 에스트라디올(E2)로 삼중 웰(3개의 돔을 포함하는 각 웰)에서 처리하였다. 48시간 후, 배지를 제거하고, 오가노이드를 RNA 추출을 위해 처리하였다. 각 웰의 총 2개의 돔으로부터 약 4μg의 RNA를 얻을 수 있고, 1μg의 RNA를 사용하여 cDNA를 역전사하였다. 리포칼린 2(Lcn2), 락토페린(Ltf) 및 프로게스테론 수용체(Pgr)를 코딩하는 유전자의 증폭은 실시간 정량 PCR을 사용하여 수행되었습니다(그림 5 및 표 1)23,24,25. 예상대로, 우리는 10 nM E2로 자극 한 후 상피 오가노이드에서 Lcn2, Ltf 및 Pgr의 발현이 증가하는 것을 관찰했습니다 (그림 5). 따라서, 이들 결과는 자궁내막 상피 오가노이드가 E2에 반응하는 유전자 발현 변화를 측정하는데 성공적으로 사용될 수 있음을 보여준다.
그림 1: 자궁내막 오가노이드를 확립하는 데 사용되는 절차. 다이어그램은 마우스 자궁내막에서 (A) 상피 오가노이드를 확립하고 (B) 통과시키기 위해 따랐던 주요 단계를 간략하게 설명합니다. (A) 방법은 마우스 자궁에서 자궁 내막 상피의 효소 적 및 기계적 해리에 이어 단일 세포 분산 및 상피를 겔 매트릭스로 캡슐화하는 것을 포함한다. 효소 해리를위한 자궁 조직을 얻기 위해 난소와 난관을 미세한 가위로 자궁 뿔에서 제거하고 옆으로 4-5mm 조각으로 자른 다음 효소 용액에 넣습니다. 효소 배양 후, 자궁 내막 상피는 집게와 피펫을 사용하여 자궁관에서 상피를 "압착"하는 현미경으로 밑에있는 간질과 기계적으로 분리됩니다. 상피는 콜라게나 제에서 짧은 배양을 사용하여 상피 세포로 더 분해 된 다음 겔 매트릭스로 캡슐화됩니다. (B) 자궁내막 오가노이드를 계대하려면 차가운 배지에서 기계적 해리와 매트릭스에서 오가노이드를 방출하고 더 작은 오가노이드 단편을 생성하기 위한 원심분리가 필요합니다. 오가노이드가 매트릭스에서 방출되고 기계적으로 더 작은 조각으로 해리되면 매트릭스로 캡슐화되고 다시 도금됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 분리된 자궁내막 상피 및 기질 세포 집단의 면역염색. 면역형광 이미지는 자궁의 효소적 및 기계적 분리 후 (A,B) 상피 세포 및 (C,D) 기질 세포 분획의 상피 및 기질 세포 집단을 보여줍니다. 사이토케라틴 8(상피 세포 마커)은 빨간색, 비멘틴(기질 세포 마커)은 녹색, DAPI(핵 마커)는 파란색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm (A, C), 20 μm (B, D). 약어: CK8 = 사이토케라틴 8; VIM = 비 멘틴; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 4 일 동안 WT 마우스에서 자궁 내막 오가노이드 형성. 자궁 내막 상피는 WT 마우스로부터 분리되었고, 유기체를 생성하는데 사용되었다. (a) 소화 직후 겔 매트릭스에 캡슐화된 상피 세포의 위상차 이미지(제0일). (ᄃ,씨) 몇 가지 작은 유기체가 배양 1일(B)과 2일(C)에 관찰될 수 있습니다. (D) 더 크고 성숙한 상피 오가노이드는 배양 3일째에 관찰될 수 있다. 이미지는 5x 대물렌즈로 캡처되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. 약어 : WT = 야생형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 자궁내막 오가노이드의 조직학적 분석. (A,B) FFPE 자궁내막 상피 오가노이드를 절편화하고 H&E로 염색하였다. (C,D) FFPE 상피 오가노이드는 상피 세포 마커인 사이토케라틴 8(적색)로 면역염색하였다. 세포핵은 DAPI(청색)로 염색하였다. 스케일 바 = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B, D). 약어 : FFPE = 포르말린 고정 파라핀 내장; H & E = hematoxylin & eosin; CK8 = 사이토케라틴 8; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 마우스 자궁내막 오가노이드의 유전자 발현 분석. WT 마우스로부터의 마우스 자궁내막 상피 오가노이드를 오가노이드 성장 배지에서 4일 동안 배양한 후, 2% 숯-박리 FBS가 보충된 DMEM/F12에서 48시간 동안 비히클 또는 10 nM E2로 처리하였다. (ᄀ,ᄂ) 비히클 (A) 또는 10 nM E2 (B)로 처리한 후의 WT 마우스 오가노이드의 위상차 이미지. (씨-에) 비히클 또는 10 nM E2로 처리된 상피 자궁내막 오가노이드의 실시간 qPCR 분석. E2 조절 유전자, 리포칼린 2(Lnc2), 락토페린(Ltf) 및 프로게스테론 수용체(Pgr)의 발현. 막대는 양측 t-검정으로 분석된 평균 ± SEM을 나타냅니다. *p < 0.033, **p < 0.002, ***p < 0.001. 조건당 n=3 WT 마우스로부터 유래된 오가노이드로 반복하였다. 스케일 바 = 200 μm (A, B). 약어 : WT = 야생형; E2 = 에스트라디올; qPCR = 정량적 PCR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프라이머 서열 | 앞으로 (5'-3') | 후진(5'-3') |
| 리포 칼린 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC |
| 락토페린 (LTF) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC |
| 프로게스테론 (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG |
| 글리세르알데히드 3 인산 탈수소효소(Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCCTCTT |
| PCR 혼합물은 다음을 포함합니다 : |
| 2x 시브르 그린 |
| 0.5 μM Fwd 프라이머 |
| 0.5 μM 레브 프라이머 |
| 씨디엔 |
| RNAse/DNAse-free H2O |
| 사이클러 조건: | |||
| 온도 | 시간 | 사이클 | |
| 들다 | 95 °C | 10 분 | 1 |
| 변성 | 95 °C | 15초 | 40 |
| 뻗치다 | 60 °C | 60초 |
표 1: 프라이머 서열 및 PCR 조건.
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Discussion
여기에서는 마우스 자궁내막에서 자궁내막 상피 오가노이드를 생성하는 방법과 다운스트림 분석에 일상적으로 사용되는 프로토콜에 대해 설명합니다. 자궁내막 오가노이드는 자궁내막증, 자궁내막암 및 착상 실패와 같은 자궁내막 관련 질병을 제어하는 메커니즘을 연구하는 강력한 도구입니다. 2017년에 발표된 획기적인 연구에서는 마우스와 인간 상피 4,5에서 자궁내막 오가노이드의 장기 및 재생 가능한 배양 조건을 보고했습니다. 오가노이드가 다른 시스템에서 생물학적 경로를 연구하기 위해 널리 사용되었지만, 시험관 내 자궁내막 조직의 연구는 배양물에서 형질전환되지 않은 1차 상피를 연구하기에 적합한 모델의 부재로 인해 제한되었습니다26. 인간 및 마우스 자궁내막에서 유래한 자궁내막 오가노이드는 장, 신장 및 폐와 같은 다른 장기 조직의 오가노이드를 배양하는 데 일반적으로 사용되는 조건을 사용하고 겔 매트릭스4로 구성된 세포외 매트릭스 스캐폴드에 내장함으로써 성공적으로 확립되었습니다. 이러한 초기 보고서 이후 자궁 내막의 생물학을 연구하기 위해 자궁 내막 오가노이드를 사용하는 것이 과학계에서 크게 증가했습니다.
이전에 발표된 마우스 자궁으로부터의 상피 분리 방법을 수정함으로써(27,28), 이 프로토콜은 조직을 효소 용액에 직접 넣거나, 자궁을 트랜스펙트하거나, 여과를 사용할 필요성을 우회함으로써 마우스 자궁을 분리하는 주요 단계를 독특하게 강조한다. 이 방법을 사용하여 사이토케라틴 8 및 비멘틴 면역염색에 의해 측정된 ~85%-90% 순도의 상피를 얻었습니다(그림 2). 이 프로토콜은 또한 분리된 상피 세포를 오가노이드의 생성, 유지 및 계대배양을 위해 성장 매트릭스로 캡슐화하기 위한 주요 세부 사항을 명확하게 설명합니다. 그림 4의 이미지와 미공개 연구는 오가노이드 배양에서 뮤신과 선 세포(즉, FOXA2 양성)의 존재를 확인했습니다29. 이들은 여기에 제시된 방법이 마우스 자궁 내막으로부터 선 및 내강 - 상피 세포 집단의 분리에 효과적이라는 것을 나타낸다.
이러한 오가노이드의 성장에 대한 주요 제한 사항에는 배치 간 변동을 초래할 수 있고 오가노이드 성장에 영향을 줄 수 있는 성장 인자를 포함하는 상업용 매트릭스(즉, Matrigel)의 사용이 포함됩니다. 더욱이, 이들 오가노이드는 순수한 자궁 상피를 함유하지만, 추가의 자궁내막 세포 유형(즉, 면역, 기질)의 사용은 최근 자궁내막 8,30의 인간 오가노이드 시스템에서 기술되었다. 다른 그룹들은 마우스 자궁으로부터 오가노이드 배양을 위한 내강 및 선 상피 세포 둘 다를 단리하는 능력을 보여주었다14.
이 접근법은 비교적 일반적이며 대부분의 연구자가 사용할 수있는 작은 동물 모델의 조직을 사용합니다. 더 큰 동물 모델 또는 인간으로부터 자궁내막 오가노이드를 생성하는 것은 윤리적 또는 기술적 문제를 제기할 수 있으며, 이는 유도만능줄기세포(iPSC) 기반 기술을 사용하여 극복할 수 있습니다. 이러한 기술은 이전에 자궁내막 조직(31), 생식기관(32)의 다른 조직에 대해 기술되었고, 시험관내(33)에서 자궁내막/태반 상호작용을 연구하는데 효과적으로 사용되어 왔다. 따라서 iPSC를 인간 및 기타 대형 동물 모델에서 자궁내막의 자궁내막 기질 및 상피 세포의 공급원으로 사용하는 것은 자궁내막 오가노이드를 생성하기 위한 재생 가능하고 접근 가능한 공급원이 됩니다.
마우스는 이식 연구에 널리 사용되는 모델이지만 마우스와 인간 사이의 이식 메커니즘에는 주목해야 할 주요 진화적 차이가 있습니다. 예를 들어, 간질 이식은 내강 상피를 통해 기저 기질로의 깊은 영양막 침윤을 특징으로 하는 반면, 침습 과정의 메커니즘은 마우스와 영장류 사이에서 상이하다(34). 마우스에서, 내강 상피를 통한 영양막 세포 침범은 세포 사멸 또는 엔토 시스 (entosis) 35,36을 포함하는 반면, 영양 세포 세포는 영장류(34,35)의 내강 상피 사이에서 기저 기질로 이동한다.
자궁내막 오가노이드에 자가 조립 및 장기 재생을 지원하는 데 필요한 성장 인자를 제공하는 것은 천연 조직을 요약하는 자궁내막 오가노이드 배양을 얻는 데 필수적입니다. 자궁내막 오가노이드에 대한 복잡한 배지 구성은 상피 세포 특성에 기여하는 다중 신호 전달 경로를 나타내며 파라크린 및 자가분비 공급원 모두에서 발생합니다. 자궁 내막의 간질 구획은 섬유 아세포와 같은 기질 세포, 내피, 대 식세포 및 에스트로겐 및 프로게스테론37에 반응하여 지속적으로 변화하는 기타 특수 면역 세포를 포함한 수많은 세포 유형의 복잡한 집합체입니다.
예를 들어, 오가노이드 배양 배지에는 WNT3a 및 R-스폰딘과 같은 오가노이드에서 WNT/β-카테닌 신호 전달을 활성화하는 요인이 포함되어 있습니다. 생쥐를 대상으로 한 연구에 따르면 WNT 리간드는 자궁 발달과 선 기능에 중요합니다. 따라서, 이 신호전달 경로의 활성화는 오가노이드 발달 및 유지에 매우 중요하다38,39. R-Spondin은 WNT 신호 전달을 증폭하고 류신이 풍부한 반복 함유 G- 단백질 결합 수용체 (LGR5) 40의 리간드입니다. 자궁내막 오가노이드 배양은 또한 형질전환 성장 인자 β(TGFβ) 및 골형성 단백질(BMP) 신호 전달 경로의 억제를 필요로 합니다. 예를 들어, 자궁내막 오가노이드 배양 배지는 BMP2, BMP4 및 BMP741에 결합하고 불활성화시키는 분비 단백질인 BMP 억제제 노긴을 함유한다. 약리학 적 억제제 인 A83-01은 자궁 내막 오가노이드 배지에도 존재합니다. A83-01은 수용체 ALK4, ALK5 및 ALK742에 대해 높은 특이성을 갖는 소분자 억제제이다. ALK4/5/7은 TGFβ, 액티빈 또는 노드와 같은 리간드에 의해 유도된 신호에 결합하고 전달하는 TGFβ 신호 패밀리의 유형 1 수용체입니다. BMP 신호는 장(43) 및 모낭(44)과 같은 조직에서 줄기 세포 유지에 중요합니다. TGFβ 신호전달의 억제는 염색질46의 주요 영역을 리모델링함으로써 발생하는 자궁내막 중간엽 줄기세포(45)의 증식 능력 및 콜로니-형성 효율에 기여한다. 따라서, 이들 두 가지 주요 신호 전달 경로인 BMP 및 TGFβ의 조절은 자가 재생 능력을 가진 오가노이드 배양을 유지하는 데 필요하다.
여기에 표시되지는 않았지만 ALK4/5/7 억제제 A83-01을 사용한 마우스 오가노이드의 장기 배양이 3-4회 연속 계대 후에 상피 오가노이드의 형태학적 변화를 일으킨다는 것을 발견했습니다(Kriseman et al., 검토 중). 상피 오가노이드의 형태학적 변화는 Boretto et al.4에 의해 기술된 "조밀한" 상피 오가노이드를 연상시켰으며, 여기서 WNT 리간드의 파라크린 분비 감소로 인해 더 많은 분비 유사 세포의 발달이 발생했습니다. 따라서, TGFβ 및 WNT 신호 전달 경로가 교차하여 자궁 내막 상피 오가노이드 재생 및 분화를 조절할 가능성이 있다.
최근 연구는 인간 조직 7,8,16으로부터 3D 자궁 내막 상피 / 기질 공동 배양 시스템을 생성했다. 공동 배양의 한 가지 방법은 자궁내막 상피 및 기질 세포를 결합하고 정의된 배양 배지를 사용하여 스캐폴드가 없는 웰에서 3D 구조로 조립할 수 있는 스캐폴드가 없는 시스템을 이용합니다. 이 3D 자궁 내막 상피 / 기질 유기체는 에스트로겐, 프로게스테론 및 안드로겐에 대한 수용체를 발현 할뿐만 아니라 난소 호르몬 (에스트로겐 및 프로게스테론 6,7)에 대한 반응을 충실하게 요약합니다. Rawlings et al.의 연구에서 사용된 또 다른 공동 배양 방법에서, 자궁내막 상피 오가노이드는 콜라겐 매트릭스 내의 기질 세포와 결합되고 변형된 오가노이드 배지8에서 성장한다. 이러한 상피/기질 공동 배양 오가노이드 또는 집합체는 기질 세포가 상피선과 같은 구조를 둘러싸고 있는 부유된 3D 시스템으로 구성됩니다.
자궁내막 오가노이드의 대부분은 성장인자 환원 겔 매트릭스에서 배양되고; 그러나, 매트릭스 내의 활성 화합물의 존재는 유기체 내에서 바람직하지 않은 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 오가노이드는 개별 오가노이드가 자가 조립할 수 있는 3D 프린팅된 아가로스 주형과 같은 겔 매트릭스가 없는 스캐폴드에 확립되었다(6). 다른 그룹들은 자궁내막 오가노이드(47)의 배양을 위한 3D 매트릭스로서 기능하는 합성 하이드로겔을 개발하였다. 이들 오가노이드는 apicobasal 극성을 갖는 3D 구조로 조립되고, 또한 자궁내막의 기질 세포와 결합되어 복잡한 오가노이드(48)를 형성할 수 있다. 오가노이드는 2D 세포 배양이 할 수 없는 방식으로 형질전환되지 않은 1차 인간 및 마우스 자궁내막 조직을 배양하는 데 성공적으로 사용될 수 있기 때문에 자궁내막 오가노이드가 여성의 생식 건강 분야를 발전시키고 재발성 임신 손실, 자궁내막증 및 자궁내막암과 같은 생식 병리를 연구하는 놀라운 도구가 될 것이라는 데는 의심의 여지가 없습니다.16, 49,50.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
스테파니 팡가스 박사와 마틴 M. 마추크 박사(M.M.M.)에게 우리 원고를 비판적으로 읽고 편집해 주신 데 대해 감사드립니다. 연구는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 보조금 R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) 및 R01-HD110038 (M.M.M.) 및 NCI-P30 암 센터 지원 보조금 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund에서 차세대 임신 상을 수상했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid Media Formulation | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
| Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| Other supplies and reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
| Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
| Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
| Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
| Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
| Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
| VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
| Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
| Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
| ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
| Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
| Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
| Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
References
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